Спосіб флуориметричного визначення концентрації аденозин-5′-трифосфату (атф) у розчині

УКРАЇНА (19) UA (11) 75448 (13) C2 (51) МПК (2006) G01N 21/64 G01N 33/52 C07D 221/06 (2006.01) C07D 311/30 (2006.01) МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (54) СПОСІБ ФЛУОРИМЕТРИЧНОГО ВИЗНАЧЕННЯ КОНЦЕНТРАЦІЇ АДЕНОЗИН-5'-ТРИФОСФАТУ (АТФ) У РОЗЧИНІ де R1 і R2 кожен незалежно є С1-С6-алкілом, який відрізняється тим, що зі спектра отримують числові значення відношення інтенсивностей флуоресценції I1/І2 (де I1 - інтенсивність флуоресценції при збудженні на 430-510 нм, І2 - те саме, при збудженні на 360-430 нм), отримані дані наносять на калібрувальну криву та визначають загальну концентрацію АТФ у розчині. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що як похідне 3-гідроксі-4'-амінофлавону використовують 3-гідрокси-4'-(диметиламіно)флавон. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що калібрувальну криву отримують шляхом вимірювання серії спектрів збудження флуоресценції розчинів похідного 3-гідроксі-4'-амінофлавону в розчинах з заданою концентрацією АТФ (САТФ), обчислення параметрів І1/І2 (де I1 - інтенсивність флуоресценції при збудженні у межах 430-510 нм, І2 - те саме, при збудженні у межах 360-430 нм), та нанесення отриманих пар даних на графік у координатах I1/I2 - lg( САТФ). Даний винахід стосується нового флуориметричного способу визначення концентрації аденозин-5'-трифосфату (АТФ) у водному розчині за допомогою похідного 3-гідрокси-4'-амінофлавону як флуоресцентного барвника. Відомо, що флавоноли (3-гідроксифлавони) є сполуками, параметри флуоресценції яких залежать від фізико-хімічних параметрів середовища, таких як концентрація іонів, діелектрична проникненість, показник заломлення світла, здатність до утворення водневих зв'язків (протонодонорність), кислотність (показник рН) тощо. Зокрема, ці сполуки мають дві смуги випромінення у розчинах, що спричинюється ефектом внутрішньомолекулярного фотопереносу протону (ВФП або ESIPT-ефект). Ці смуги відносяться відповідно до емісії нормальної (N*) та таутомерної (Т*) форми сполуки. [У статті Klymchenko A.S., Demchenko A.P., Phys. Chem. Chem. Phys., 2003, 5, с.461-468] показано, що для 3-гідрокси-4'-(диетиламіно)флавона (19) UA (11) 75448 (21) 2004031886 (22) 15.03.2004 (24) 17.04.2006 (46) 17.04.2006, Бюл. № 4, 2006 р. (72) Пивоваренко Василь Георгійович, Вадзюк Ольга Богданівна, Костерін Сергій Олексійович (73) Пивоваренко Василь Георгійович, Вадзюк Ольга Богданівна, Костерін Сергій Олексійович (56) Klymchenko A.S., Demchenko A.P., Phys. Chem. Chem. Phys., 2003, 5, c.461-468 WO 9715832 CN 1374366 (57) 1. Спосіб визначення загальної концентрації аденозин-5'-трифосфату (АТФ) у водному розчині, згідно з яким у даному розчині вимірюють спектр збудження флуоресценції похідного 3-гідроксі-4'амінофлавону загальної формули (1) C2 2 (13) 1 3 75448 4 стоксів зсув смуги емісії форми N*, а також різниця інтенсивностей флуоресценції I1/I2 (де І1 - інтенсиу положеннях максимумів емісії обох смуг випровність флуоресценції при збудженні на 430-510нм, І2 - інтенсивність флуоресценції при збудженні на мінення в розчинах ( N*- T*) та логарифм співвід360-430нм), з наступним нанесенням отриманих ношення їх інтенсивностей (IN*/IT*) мають прямо пар даних на графік у координатах I1/I2 - lg(CATФ). пропорційну залежність від показника діелектричКалібровочна крива, отримана за методикою, що ної проникненості розчинника, що дає змогу за описана в прикладі 1, зображена на Фіг.1. З пракспектральними даними отримувати цю інформатичної точки зору важливо, що графік є близьким цію. до лінійного у діапізоні фізіологічних концентрацій [У статті Leach F.R., J. Appl Biochem., 1981, 3, АТФ: 0.1-1.0ммоль/л. с.473-478] показано, що концентрацію АТФ у розДля ілюстрації винаходу наводяться наступні чині можна визначити за допомогою ферменту приклади. люциферази у присутності молекулярного кисню. Усі спектри флуоресценції були зняті на спекДаний спосіб є незручним, тому що вимагає ствотрофлуориметрі "HITACHI MPF-4" при температурі рення спеціальних умов для проведення аналізу. 37°С з наступною цифровою обробкою результатів Зокрема, він не працює в анаеробних умовах, при низьких концентраціях кисню в системі, або ж за за допомогою програми Origin 5.0. Усі спектри відсутності фермента люциферази. збудження флуоресценції були отримані при довМетою даного винаходу було створення новожині хвилі флуоресценції λfl=540нм. го способу визначення концентрації АТФ, що не Приклад 1 має вищенаведених недоліків. Побудова калібровочної кривої. Отже, даний винахід стосується флуориметДля побудови калібровочної кривої використоричного способу визначення АТФ у розчині за довували водний розчин (1), що містить 0,2моль/л помогою флуоресцентного барвника - похідного 3сахарози 1 10-2моль/л буферу HEPES рН7.4, та -6 гідрокси-4'-амінофлавону (3ГАФ). У межах концен5 10 моль/л 3-гідрокси-4'-(диметиламіно)флавону -5 -3 трацій АТФ від 10 до 10 моль/л умови способу (формула 1, R1=R2=CH3), а також водний розчин дозволяють кількісне визначення концентрації (2), що містить 0,25моль/л сахарози 1 10-2моль/л АТФ у розчині. Даний спосіб полягає в буферу HEPES рН7.4, 5 10-6моль/л 3-гідрокси-4'а) реєстрації спектру збудження флуоресцен(диметиламіно)флавону та 4 10-2моль/л АТФ. Зації розчину похідного 3ГАФ загальної формули (1) дану концентрацію АТФ у аналітичному розчині (3) отримували шляхом додавання до 1.5мл розчину (1) розрахованої кількості розчину (2). Після цього розчин (3) переносили у флуориметричну кювету з (1) метою подальшого отримання спектру збудження флуоресценції. Інтенсивність флуоресценції вимірювали на довжині хвилі 540нм. Отримані числові дані відношення інтенсивностей емісії при збуде R1 і R2 кожен незалежно є С1-С6-алкілом, дженні на 480 та 405нм (І480/І405) та десятковий в досліджуваному водному розчині при невілогарифм концентрації АТФ lg(CATФ) у розчині надомій концентрації АТФ у ньому, носили на графік, який зображено на Фіг.1. б) отриманні зі спектра числових значень відПриклад 2 ношення інтенсивності флуоресценції ЗГАФ при Визначення концентрації АТФ у розчинах збудженні на двох довжинах хвиль, А1-А4. в) побудові калібровочної кривої залежності Використовуючи розчини (1) та (2) (див. Приквідношення інтенсивності флуоресценції 3ГАФ при лад 1), приготували розчини А1, А2, A3 та А4 з збудженні на двох довжинах хвиль від концентраконцентрацією АТФ 0.00004 (С1), 0.00012 (С2) ції АТФ у розчині шляхом отримання спектрів 0.00044 (С3) та 0.00084моль/л (С4). Далі вимірювафлуоресценції 3ГАФ при відомих концентраціях ли спектри збудження флуоресценції при довжині АТФ, хвилі емісії 540нм. З отриманих спектрів обчислиг) визначенні за допомогою калібровочної крили відношення інтенсивностей емісії І480/І405 для вої вмісту АТФ у досліджуваному розчині. розчинів А1-А4. Після нанесення цих даних на каКалібровочна крива будується шляхом реєстлібровочну криву (Фіг.1) визначили концентрацію рації серії спектрів збудження флуоресценції 3ГАФ АТФ X1-Х2 у розчинах (Таблиця 1). у водних розчинах з відомою концентрацією АТФ (САТФ) та наступним вимірюванням відношення Таблиця 1 Номер розчи- Задана концентрація АТФ, ну моль/л А1 С1=0.00004 А2 С2=0.00012 A3 С3=0.00044 А4 С4=0.00084 Відношення І480/І405 0.44 0.56 1.06 1.56 lg [АТФ] -4.22 -3.92 -3.29 -2.92 Визначена концентрація АТФ, моль/л Х1=0.00006 Х1=0.00012 Х2=0.00051 Х2=0.00121 5 Комп’ютерна верстка Т. Чепелева 75448 6 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601