Спосіб кріоконсервування тканини плаценти

Реферат: Спосіб кріоконсервування тканини плаценти передбачає поетапне заморожування тканини плаценти до -196 °C у середовищі, що містить кріопротектор диметилсульфоксид. В середовище додатково вводять кріопротектор гідроксіетилкрохмаль, при цьому кріопротектори беруть у концентрації 5 %, а заморожування здійснюють спочатку до -6 °C зі швидкістю 1 °С/хв, потім застосовують режим ініціації кристалоутворення в тканині плаценти шляхом зниження температури в камері заморожувача до - 90 °C протягом 1,5 хв, далі стабілізують температуру протягом 7 хв при температурі -20 °C і заморожують зі швидкістю 10 °С/хв до -70 °C, після чого занурюють у рідкий азот. UA 79009 U (54) СПОСІБ КРІОКОНСЕРВУВАННЯ ТКАНИНИ ПЛАЦЕНТИ UA 79009 U UA 79009 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до кріобіології і може бути використана для створення запасів біологічного матеріалу з метою подальшого використання в експериментальній та клінічній медицині. Відомий спосіб кріоконсервування тканини плаценти, в якому її заморожують у середовищі, що містить 3-молярний диметилсульфоксид, шляхом занурення у рідкий азот [1]. Недоліком цього способу є те, що він не забезпечує високу збереженість цілісності структури міжклітинних зв'язків тканини плаценти через те, що в процесі кріоконсервування відбуваються грубі морфологічні зміни: відшарування трофобласту, розриви ембріональної мезенхіми, порушення структури клітинних ядер, порушення активності ферментів [1]. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб кріоконсервування тканини плаценти шляхом заморожування до -196 °C у середовищі, яке містить 10 % диметил сульфоксиду та 10 % поліетиленоксиду молекулярної маси 400. Заморожування здійснюють спочатку зі швидкістю 1-2 °C/хв до 0 °C, потім зі швидкістю 5-6 °C/хв до -10 °C, далі витримують при -10 °C протягом 1,5-2 годин після чого занурюють у рідкий азот і заморожують до -196 °C [2]. Недоліками цього способу є, по-перше, те, що він не забезпечує високої збереженості цілісності структури міжклітинних зв'язків тканини плаценти, що знижує її функціональну здатність. По-друге, процес кріоконсервування триває надто довго, більше 3 годин. В основу корисної моделі поставлено задачу створити такий спосіб кріоконсервування тканини плаценти, у якому б за рахунок зміни режиму заморожування та застосування додаткового кріопротектору забезпечувалась можливість підвищити збереженість цілісності структури міжклітинних зв'язків тканини плаценти та зменшити час кріоконсервування. Поставлена задача вирішується тим, що в способі кріоконсервування тканини плаценти, який передбачає поетапне заморожування тканини до - 196 °C у середовищі, яке містить кріопротектор диметилсульфоксид, згідно з корисною моделлю, в середовище додатково вводять кріопротектор гідроксіетилкрохмаль, при цьому кріопротектори беруть у концентрації 5 %, а заморожування здійснюють спочатку до -6 °C зі швидкістю 1 °C/хв, потім застосовують режим ініціації кристалоутворення в тканині плаценти шляхом зниження температури в камері заморожувача до - 90 °C протягом 1,5 хв, далі стабілізують температуру протягом 7 хв при температурі -20 °C і заморожують зі швидкістю 10 °C/хв до -70 °C, після чого занурюють у рідкий азот. Зміна режиму заморожування тканини плаценти і використання додаткового кріопротектору дає можливість підвищити збереженість цілісності структури міжклітинних зв'язків тканини плаценти на 80-85 %. При цьому весь процес кріоконсервування триває 70 хв. Спосіб пояснюється наступним прикладом. Плаценту людини отримували з інформованої згоди жінки під час операції кесаревого розтину. Після цього плаценту відмивали від елементів крові, готували фрагменти розміром 0,5×0,5 см, поміщали на 20 хв у середовище, що містить 5 % диметилсульфоксиду та 5 % гідроксіетилкрохмалю, далі переносили до пластикового контейнера, що містить таке ж середовище. Заморожували у програмному заморожувачі спочатку до -6 °C зі швидкістю 1 °C/хв. Потім застосовували режим ініціації кристалоутворення в тканині плаценти шляхом зниження температури в камері заморожувача до - 90 °C протягом 1,5 хв і стабілізували температуру протягом 7 хв при температурі -20 °C, далі охолоджували зі швидкістю 10 °C/хв до -70 °C, після чого заморожували до -196 °C зануренням у рідкий азот. Зберігали у рідкому азоті протягом 1 місяця. Розморожували тканину плаценти на водяній бані при температурі 37 °C. Збереженість цілісності структури міжклітинних зв'язків тканини плаценти визначали гістологічним дослідженням, функціональну здатність оцінювали з використанням вітального барвника трипанового синього та за секрецією хоріонічного гонадотропіну. Результати гістологічного дослідження наведені в таблиці. З таблиці видно, що після кріоконсервування заявленим способом зберігається структурна цілісність ворсин тканини плаценти в більшому ступеню, ніж в прототипі: повністю збережених ворсин більше на 84 %, повністю зруйнованих ворсин в 2,5 рази менше. Значно зменшувались такі показники як відшарування трофобласту, розриви мезінхими, пікноз ядер, зміна форми клітин. При дослідженні площі забарвлення трипановим синім в нативній тканині цей показник був менше 2 %, при кріоконсервуванні без кріопротектору - більш 90 %, за прототипом - дорівнював 10-11,5 %, за способом, що заявляється - 9-10 %. При дослідженні секреції хоріонічного гонадотропіну людини після культивування протягом доби в нативній тканині цей показник був 20,5±1,2 МЕ/мл, при кріоконсервуванні без кріопротектору - 10,3±2,1, за прототипом дорівнював 40,6±1,6, за способом, що заявляється 37,5±2,1 %, що свідчить про збереженість секреторної активності клітин кріоконсервованої тканини плаценти. 1 UA 79009 U Таким чином тканина плаценти, кріоконсервована за способом, що заявляється, характеризується більш високим ступенем збереженості структури і функції у порівнянні з прототипом та наближується до показників, характерних для нативного стану. Таблиця Гістологічні зміни структури фрагментів плаценти після кріоконсервування (% ворсин) Біологічні показники Ворсини без патологічних змін Зруйновані ворсини Набряк ворсин Відшарування трофобласту Розриви мезенхіми Пікноз ядер Зміна форми клітин Нативна тканина Заморожування без Прототип Заявлений спосіб кріопротектору 94,1±2,1