Спосіб стерилізації екстракту плаценти людини

Реферат: Спосіб стерилізації екстракту плаценти людини включає нагрів контейнерів з екстрактом плаценти в герметично закритій ємкості в суміші водяної пари з повітрям при температурі 120122 °C і тиску 1,8-2,0 атм. Використовують екстракт попередньо замороженої плаценти, а нагрів екстракту здійснюють у 2 етапи, причому на першому етапі нагрів здійснюють при температурі 65 °C і тиску 1 атм протягом 30 хвилин, а на другому - при температурі 120-122 °C і тиску 1,8-2,0 атм протягом 10 хвилин. UA 80674 U (54) СПОСІБ СТЕРИЛІЗАЦІЇ ЕКСТРАКТУ ПЛАЦЕНТИ ЛЮДИНИ UA 80674 U UA 80674 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біології і медицини і може бути використана для збереження і наступного застосування біологічних матеріалів з плаценти людини в наукових дослідженнях і клінічній практиці. Відомий спосіб стерилізації розчинів біологічних речовин шляхом автоклавування [1]. Згідно зі способом герметичні контейнери, заповнені розчином з біологічною речовиною, розміщують у автоклаві, де стерилізують при температурі 100 °C, тиску 1 атм водяними парами протягом 3 діб. Недоліком цього способу є його ненадійність, оскільки він не дає 100 % гарантії стерильності обробленого біологічного матеріалу. Згідно з існуючим стандартом стерильність біологічного матеріалу забезпечується його нагрівом до температури 120-122 °C і подальшим витримуванням протягом 20-30 хвилин. На відміну від режимів з пролонгованим часом автоклавування - цей режим призводить до денатурації частки білків і нуклеїнових кислот, розпаду сахарози на глюкозу і фруктозу, не визиваючи їх наступної деградації [2]. Відомий спосіб стерилізації екстракту плаценти у закритих полімерних контейнерах шляхом нагріву в суміші водяної пари з повітрям у герметично закритій ємкості при температурі 120122 °C і тиску 1,8-2 атм протягом 30 хвилин [3]. Недоліком цього способу є суттєва втрата біологічно активних білків і нуклеотидів з молекулярними масами 10-15 кДа і недостатня їх кількість з молекулярною масою 4 кДа (див. таблицю), що призводить до значної втрати антиоксидантних властивостей екстрактів плаценти і біологічної активності по відношенню до еритроцитів людини. В основу корисної моделі поставлено задачу створити такий спосіб стерилізації екстракту плаценти людини, в якому, за рахунок попередньої низькотемпературної обробки плаценти і введення додаткового етапу нагріву екстракту, забезпечується можливість зниження втрати біологічно активних білків і нуклеотидів з молекулярними масами 10-15 та 4 кДа зі збереженням антиоксидантних властивостей і біологічної активності по відношенню до еритроцитів людини. Поставлена задача вирішується тим, що в відомому способі стерилізації екстракту плаценти, який включає нагрів контейнерів з екстрактом плаценти в герметично закритій ємкості в суміші водяної пари з повітрям при температурі 120-122 °C і тиску 1,8-2.0 атм, згідно з корисною моделлю, використовують екстракт попередньо замороженої плаценти, а нагрів екстракту здійснюють у 2 етапи, причому на першому етапі нагрів здійснюють при температурі 65 °C і тиску 1 атм протягом 30 хвилин, а на другому - при температурі 120-122 °C і тиску 1,8-2,0 атм протягом 10 хвилин. Попереднє заморожування плаценти людини у рідкому азоті і нагрів в 2 етапи дає можливість знизити втрату білків і нуклеотидів з молекулярними масами 10-15 кДа на 75±5 %, а з м.м. 4 кДа - на 50±5 %. На першому етапі нагріву при 65 °C і тиску 1 атм протягом 30 хвилин стимулюється проростання спор термостійких бактерій, які потім на другому етапі гинуть, а також частково денатурують білки і нуклеотиди з великими м.м., збільшуючи їх відносну частку у порівнянні з низькою. Приклад здійснення способу. Плаценту людини, отриману від породіль з їх інформованої згоди і яка пройшла тестування на наявність вірусних інфекцій (ВІЛ та RW) і гепатиту та зберігалася не більше 24 годин при 4 °C, ретельно відмивали фізіологічним розчином від слизу і крові, який змінювали кілька раз. Відмиту плаценту переносили у обробний лоток і ножицями відділяли плідні оболонки (амніотичну й хоріальну), після чого шматками 32 см зрізали тонкий шар тканини в ділянці котиледонів. Одержані фрагменти заморожували шляхом занурення у рідкий азот (Т=-196 °C) на 10 хвилин. Потім розрізали на шматки і 5 хвилин подрібнювали у високошвидкісному гомогенізаторі MPW-302 (Польща), після чого додавали фізіологічний розчин в об'ємному співвідношенні 1:1 і витримували при 4 °C протягом 12 годин для екстрагування. Далі центрифугували при 1500 g протягом 15 хвилин. Надосад являв собою водно-сольовий екстракт плаценти людини. Далі екстракт фасували у плівкові контейнери об'ємом 20 мл, які потім герметично запаювали. Нагрів проводили у герметично закритій ємкості в суміші водяної пари з повітрям в 2 етапи. Спочатку нагрівали до температури 65 °C і тиску 1 атм і витримували протягом 30 хвилин, а потім - до температури 120-122 °C і тиску 1,8-2 атм. протягом 10 хвилин. Після розкриття контейнерів розчинені компоненти фільтрували через мембранний фільтр 0,45 мкм. Бактеріологічні дослідження стерильності екстрактів показали відсутність аеробної і анаеробної мікрофлори та грибів. Антиоксидантні властивості автоклавованих екстрактів плаценти людини розраховували за їх здібністю відновлювати тривалентне залізо, хелатувати іони металів змінної валентності і відновлювати вільні радикали. Біологічну активність відносно еритроцитів людини оцінювали за 1 UA 80674 U 5 впливом експозиції з екстрактами на спонтанний гемоліз, осмотичну і кислотну стійкість клітин [5]. Як показали результати наших досліджень (таблиця), використання запропонованого способу стерилізації дає 15±3 % вмісту білка і нуклеотидів від їх вмісту в екстракті до стерилізації на відміну від 5±1 % у прототипі, а також зниження втрати білків і нуклеотидів з молекулярними масами 10-15 кДа на 75±5 %, а з м.м. 4 кДа на 50±5 % при цьому, на 50±5 % зберігаються біологічна активність і антиоксидантні властивості стерилізованого матеріалу по відношенню до еритроцитів людини на відміну від прототипу, де вони складають лише 25±5 %. Таблиця Показники схоронності екстракту плаценти після стерилізації відносно вихідного екстракту плаценти людини в %, n=8 Спосіб стерилізації прототип заявлюваний спосіб 5±1 Білки і нуклеотиди з м.м. 10-15 кДа 25±5 15±3 100±5 Загальні білки і нуклеотиди Білки і Антиоксидантна нуклеотиди з активність м.м. 4 кДа 50±5 25±5 100±5 Біологічна активність 50±5 25±5 50±5 10 15 20 25 30 Джерела інформації: 1. БМЭ. / Под ред. Б.В. Петровского, Т. 24. - М. Изд-во: Советская энциклопедия, 1985. С.252. 2. T.J. Msogoya, A.P. Maerere, Y. Nzogela, P.M. Kusolwa Changes in acidity of plant growth media during heat sterilization// J. Applied Biosciences.-2008. - Vol.10. - P.488-490. 3. Патент України № 28605 А, МПК A61L 2/06, опубл. 16.10.2000р. Спосіб стерилізації біоматеріалу у закритих полімерних контейнерах (прототип). 4. Грищенко О.В., Морозова Т.Ф., Лахно И.В., Розанова Е.Д., Воротилин А.М… Улучшение функциональных свойств тканевых препаратов в програмне КТПЧ (криоконсервированная ткань плаценты человека)// Вісник проблем біології і медицини.-1998. - Вип.19. - С.20-27. 5. Розанова С.Л., Розанова Е.Д., Нардид О.А., Карпенко В.Г. Антиоксидантная активность экстрактов плаценты после низкотемпературного и гипотермического хранения// Проблемы криобиологии.-2011. - Т. 21, № 3. - С.291-300. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб стерилізації екстракту плаценти людини, що включає нагрів контейнерів з екстрактом плаценти в герметично закритій ємкості в суміші водяної пари з повітрям при температурі 120122 °C і тиску 1,8-2,0 атм, який відрізняється тим, що використовують екстракт попередньо замороженої плаценти, а нагрів екстракту здійснюють у 2 етапи, причому на першому етапі нагрів здійснюють при температурі 65 °C і тиску 1 атм протягом 30 хвилин, а на другому - при температурі 120-122 °C і тиску 1,8-2,0 атм протягом 10 хвилин. Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2