Пристрій для аналізу біомолекулярних середовищ

Пристрій для аналізу біомолекулярних середовищ, який містить освітлювальну систему поляризованого монохроматичного світла, призму повного внутрішнього відбивання світла з нанесеним на її робочу поверхню плівковим робочим елементом, розташовану таким чином, щоб випромінювання падало на робочий елемент з боку призми, пристрій повороту призми відносно освітлювальної системи та фо топриймач відбитого від робочого плівкового елементу світла, який відрізняє ться тим, що між призмою та фотоприймачем додатково розташований аналізатор стану поляризації відбитого світла, який складається з модулятора поляризації та лінійного поляризатора, причому модулятор поляризації встановлений з боку призми, а лінійний поляризатор з боку фотоприймача. Запропонований винахід відноситься до області оптоелектронних сенсорних пристроїв для хімічного і біологічного аналізу середовища. Ці прилади дозволяють проводити моніторинг навколишнього середовища, складу продуктів харчової, фармацевтичної промисловості, біологічних препаратів та інше. Відомий аналог - пристрій для аналізу біологічних середовищ на основі явища поверхневого плазменного резонансу (111 IP) [1]. Прилад містить призму повного внутрішнього відбивання з металевою плівкою, джерело монохроматичного випромінювання, що має Р поляризацію і опромінює металеву плівку з боку призми, та фотоприймач, який вимірює інтенсивність відбитого світла. При певному куті падіння, коли проекція вектора Е світлової хвилі на поверхню металевої плівки збігається з імпульсом плазмону в плівці (поверхневий плазмонний резонанс), інтенсивність відбитого світла є мінімальною. Якщо на поверхню плівки осадити молекули якоїсь речовини, то кут падіння світла, якому відповідає мінімум інтенсивності відбитого світла, при цьому зміниться. Принцип роботи цього пристрою полягає у вимірюванні залежності інтенсивності відбитого від металевої плівки монохроматичного поляризованого світла від зміни кута падіння світла (резонансна крива ППР) і дослідженні цієї залежності в умовах адсорбції чи взаємодії молекул, що відбуваються на протилежній стороні металевої плівки. Вимірювання вказаної залежності у аналогу здійснюється з використанням широкого світлового променя, що покриває певний інтервал кутів падіння і знаходиться в одній точці на металевій поверхні. При цьому відбите сві тло спрямовується на фотоприймач, який виконаний у вигляді лінійки фотодіодів. В цьому випадку кожний фотодіод відповідає певному куту падіння. Процес адсорбції органічних молекул на металеву поверхню аналогічний формуванню шару молекул з певним коефіцієнтом заломлення та товщиною. При цьому форма кривої ППР та положення мінімуму інтенсивності відбитого світла будуть (19) UA (11) 80876 (13) (21) a200510697 (22) 14.11.2005 (24) 12.11.2007 (72) БЕРЕЖИНСЬКИЙ ЛЕОНІД ЙОСИПОВИЧ, UA, ВЕНГЕР ЄВГЕН ФЕДОРОВИЧ, UA, КОЛОМЗАРОВ ЮРІЙ ВІКТОРОВИЧ, U A, МАСЛОВ ВОЛОДИ МИР ПЕТРОВИЧ, UA, ПОЛТОРЕЙКО СВІТЛАНА ПЕТРІВНА, UA, СЕРДЕГА БОРИС КИРИЛОВИЧ, UA (73) ІНСТИТУТ ФІЗИКИ НАПІВПРОВІДНИКІВ ІМ. В.Є. ЛАШКАРЬОВА Н АЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ, UA (56) UA 46018 12.11.2002 US 6480282 12.11.2002 SU 1789938 23.01.1993 WO 97/34139 18.09.1997 US 5255075 19.10.1993 JP 6003269 11.01.1994 RU 2123176 10.12.1998 C2 1 3 80876 змінюватися, що й буде зареєстровано відповідним фотодіодом. Таким чином, прилад дозволяє з високою швидкістю аналізувати процеси адсорбції і взаємодії молекул, що відбуваються на протилежній стороні металевої плівки. Головним недоліком описаного аналогу є малий кут сканування, який дозволяє досліджувати шари зі значеннями коефіцієнту заломлення у вузькому діапазоні (від 1,33 до 1,38), що обмежує вибір середовищ для дослідження. Істотним недоліком є також складність і висока вартість приладу. Найбільш близьким до пристрою, що заявляється у винаході, можна вважати прилад для виявлення та визначення концентрації біомолекул [2]. Прилад містить призму повного внутрішнього відбиття, на відбиваючій грані якої нанесено послідовно металеву плівку із золота, плівку робочого елементу, чутливого до біомолекул, концентрацію яких треба визначити, джерело поляризованого монохроматичного світла, яке розташоване з боку призми повного внутрішнього відбиття, механізм повороту призми відносно джерела випромінювання та фотоприймач. Принцип роботи пристрою так само, як і у аналогу, полягає у вимірі залежності інтенсивності відбитого світла від кута падіння і визначення кута, при якому інтенсивність відбитого світла має мінімум. У випадку, коли на робочий елемент осідають біомолекули, кут, що відповідає мінімуму інтенсивності відбитого світла, змінюється. Знаючи величину зміну кута, за допомогою відповідних математичних обчислень можна визначити кількість біомолекул, що осіла на робочий елемент. Отже, детектування і визначення концентрації біомолекул і молекулярних комплексів полягає в опромінюванні металевої плівки монохроматичним поляризованим світлом з боку призми в широкому діапазоні кутів падіння, який забезпечується механічним поворотом призми, реєстрації фотоприймачем інтенсивності відбитого світла для всього набору кутів падіння і математичну обробку даних вимірювань по спеціально розробленому алгоритму. При цьому механічна система сканування призми діє в широкому діапазоні кутів і не накладає обмежень на характер середовища і досліджуваних молекул. Основним недоліком прототипу є ускладненість відстеження перебігу у реальному часі досить швидких процесів, оскільки для визначення мінімуму кривої ППР необхідно зняти всю криву чи відповідну її частину, а на одне сканування та обробку результатів звичайно витрачається кілька хвилин. Це також знижує точність визначення мінімуму кривої ППР для таких процесів. До того ж точність розрахунків обумовлюється точністю кутових вимірів, які здійснюються механічно. Крім того, наявність електронної системи автоматичного слідкування за механізмом повороту призми ускладнює конструкцію приладу. Таким чином, задачею запропонованого винаходу є створення приладу більш простої 4 конструкції, яка підвищує експресність аналізу у реальному часі, та підвищує його точність і чутливість. Поставлена задача вирішується тим, що в пристрої для аналізу бімолекулярних середовищ, який містить призму повного внутрішнього відбивання світла з нанесеним на її робочу поверхню плівковим робочим елементом, освітлювальну систему поляризованого монохроматичного світла, розташовану таким чином, щоб випромінювання падало на робочий елемент з боку призми, пристрій повороту призми відносно освітлювальної системи та фотоприймач відбитого від робочого плівкового елементу світла, який відрізняється тим, що між призмою та фотоприймачем на шляху відбитого світла додатково розташовують аналізатор стану поляризації відбитого світла, який складається з модулятора поляризації та лінійного поляризатора. Завдяки тому, що між поверхнею призми та плівковим робочим елементом відсутній шар золота, який є в прототипі, в нашому винаході реалізується явище повного внутрішнього відбиття світла на границі призма-плівковий робочий елемент. Як відомо, при повному внутрішньому відбиванні інтенсивність S і Р компонент (тобто світових хвиль, поляризованих відповідно перпендикулярно та паралельно до площини падіння) однакова і дорівнює строго 100%. Але при цьому між цими компонентами існує різниця фаз d, яку можна обчислити за формулою: æ 2 2 ö ç cos qi (sinqi ) - (n 2 / n1 ) ÷ (1) d = arctgç ÷, (sinq i )2 ç ÷ è ø де qi - кут падіння світла на діагональну поверхню призми повного внутрішнього відбиття, n1 - показник заломлення матеріалу призми, n2 показник заломлення оточуючого середовища (повітря, досліджувані гази або плівковий робочий елемент). Це означає, що коли на робочу грань призми повного внутрішнього відбивання падає лінійно поляризоване світло з азимутом 45° до площини падіння, то після повного внутрішнього відбивання світло буде еліптично поляризованим. Модулятор поляризації і лінійний поляризатор виділяють з цього еліптично поляризованого світла циркулярне поляризовану компоненту, інтенсивність якої реєструється фотоприймачем. Різниця фаз d між S і Р компонентами світлового променя є надзвичайно чутливою до зміни показника заломлення середовища на границі розділу з робочою поверхнею призми. Наприклад, якщо повітря, яке оточує робочу поверхню призми, замінити на середовище з іншим показником заломлення, це призведе до зміни величини d при тому ж самому куті qi , яке, в свою чергу, приведе до того, що форма еліпсу поляризації випромінювання і його просторове положення зміняться. Тобто, величина сигналу циркулярне поляризованої складової зміниться, що буде зареєстровано фотоприймачем. Розрахунки різниці фаз між S і Р компонентами були проведені за формулою 1 при таких вихідних 5 80876 даних: qi=41°49'35'' (41,8265°), n1=\,5. Значення n2 змінювались від 1,000290 до 1,000312 (крок зміни значень - 2 одиниці у шостому знаку після десяткової коми), що приводило до зміни різниці фаз від 0,008 до 0,002 радіан, як показано на фіг.1. Пристрій повороту призми відносно освітлювальної системи використовується один раз тільки для встановленнязначення кута qi, а при проведенні вимірювань призма фіксується і є нерухомою. Це спрощує конструкцію приладу та алгоритм проведення вимірювань, бо відпадає потреба в електронній системі слідкування за зміною кута плазмового резонансу, як це робиться в прототипі. Враховуючи високу швидкодію модулятора поляризації, який входить до складу аналізатора стану поляризації відбитого світла, виміри здійснюються експресне і у реальному часі. Більш того, на відміну від прототипу, в запропонованому пристрої замість кутових вимірів проводяться виміри інтенсивності циркулярне поляризованого світла. При налипанні біомолекул на плівковий робочий елемент змінюється різниця фаз між S і Р компонентами (вона теж може бути 2p виражена у кутовому вимірі j = L Dn , де l l довжина хвилі падаючого світла, L - товщина приповерхневого шару, що формує відбиваюче світло, Dn - різниця показників заломлення для S і Р компонент). Але ця різниця фаз призводе до того, що падаюче плоскополяризоване світло після відбиття стає еліптично поляризованим, інтенсивність циркулярної складової якого і вимірюється фотодіодом. Таким чином запропонований пристрій має більш високу точність і чутливість порівняно з прототипом, оскільки чутливість фотоелектричних вимірів достатньо висока, а самі фотоелектричні виміри більш точні порівняно з механічними вимірами кута. Схема пристрою приведена на Фіг.2. Поляризоване монохроматичне світло від лазера 1 спрямовується на призму повного внутрішнього відбивання 2, виконану у формі напівциліндра, робочу поверхню якого 3 або безпосередньо використовують для досліджень, або на неї наносять плівковий робочий елемент 4, чутливий до певних речовин. Відбите світло проходить через аналізатор стану поляризації 7, який складається з модулятора поляризації 5 та лінійного поляризатора 6, та потрапляє на фотоприймач 8. Запропонована конструкція працює наступним чином. Лінійно поляризований промінь лазера з азимутом 45° по відношенню до площини падіння спрямовується на робочу поверхню призми повного внутрішнього відбивання світла. На границі розділу "скло - повітря" (n1-n2) відбувається повне внутрішнє відбивання променю лазера і обидва промені S і Р поляризацій спрямовуються на аналізатор стану поляризації. Завдяки зсуву фаз між S і Р компонентами світла, що виникає при відбиванні, обидва промені інтерферують і утворюють в загальному випадку промінь еліптично поляризованого світла. Модулятор 6 поляризації і лінійний поляризатор виділяють з цього еліптично поляризованого світла тільки циркулярне поляризовану компоненту, інтенсивність якої реєструється фотоприймачем. Якщо на робочу поверхню призми нанести робочий плівковий елемент з речовини для реєстрації біомолекул за реакцією ген-антиген, або тіло-антитіло, то, враховуючи показану вище високу чутливість пристрою, можна реєструвати наявність та концентрацію певних біомолекул в газі або в розчині. Приклад реалізації Було реалізовано пристрій у відповідності до фіг.2 з використанням таких деталей та приладів: 1 - лазер ЛГН-113, довжина хвилі випромінювання l=0.63 або 1.15мкм, виготовлення підприємства «Укрлазер», м. Львів; 2 - напівциліндр, виготовлений із скла К-8 традиційними методами оптичного виробництва, діаметр циліндру становив 20мм, оптична однорідність і відбиваюча поверхня циліндру виконані таким чином, що внутрішні напруження і двопроменезаломлення, наведене технологічними процесами при виготовленні циліндру, знаходяться у межах, коли на 1см товщини набігає різниця фаз між хвилями S і Р поляризацій не більше 10-4рад на довжині хвилі l=0.63мкм; 3 - проточна кювета з досліджуваним середовищем; 4 - модулятор поляризації у вигляді пластинки з ізотропного матеріалу, з'єднаної з пластинкою із кристалічного кварцу, до якого прикладається електрична напруга амплітудою від 100 до 200В з частотою 50кГц; 5 - поляризатор, виконаний у вигляді призми Глана з ісландського шпату; 6 – модулятор поляризації, який складається з деталей 4 і 5; 7 фотодіод ФД-9К (кремнієвий) або ФД-7Г (германієвий), в залежності від довжини хвилі випромінювання. Як показали результати експериментів, заміна речовини з показником заломлення п 2 (повітря з оточуючого середовища) на речовину з показником заломлення n'2 (повітря видиху людини), призводить до появи сигналу фотоприймача, що перевищує у 5 разів сигнал від оточуючого повітря. З наших оцінок показник заломлення повітря, що видихає людина, відрізняється від аналогічного параметра повітря оточуючого середовища на кілька одиниць у шостому знаку після коми. Заміна оточуючого середовища на гелій призводить до збільшення сигналу фотоприймача у 30 разів. Середній показник заломлення повітря має значення 1,000294, газоподібного водню - 1,000138, вуглекислого газу - 1,000449. Отже, значення показника заломлення гелію можна вважати більше, ніж у водню (@ у 2 рази), але менше, ніж у повітря. При нанесенні на робочу поверхню напівциліндра робочого плівкового елементу з речовин для реєстрації біомолекул за реакцією ген-антиген або тіло-антитіло, можна реєструвати наявність та концентрацію певних біомолекул в газі або в розчині. При умові використання відповідних біосенсорних робочих шарів пристрій може визначати концентрації таких біологічно 7 80876 активних та токсичних сполук, як антибіотики, протипухлинні та лікарські препарати, важкі метали, білки, біологічно активні добавки, діоксини, пестициди, отруйні речовини, депресанти, наркотики тощо. Об'єктами дослідження можуть бути кров, плазма крові, сеча, вода, різні фізіологічні та технологічні розчини, газові суміші різних складів. Тому можливі області застосування запропонованого приладу - медична клінічна діагностика, біохімічний аналіз, фармакологія, біотехнологічна та харчова промисловість, екологічний контроль, наукові дослідження, учбові лабораторії. Такий прилад є практично необхідним для навчання студентів на різноманітних фізичних кафедрах ви щих учбових закладів. Джерела інформації: 1. Chinowsky T.M., Yee S.S. Capillary surface plasmon resonance sensor and multisensors. US Patent 6.480.282. November, 12, 2002. 2. Патент України № 46018 "Спосіб детектування та визначення концентрації біомолекул та молекулярних комплексів та пристрій для його здійснення". Ширшов Ю.М., Венгер Є.Ф., Прохорович А.В., Ушенін Ю.В., Мацас Є.П., Чегель B.I., Самойлов А.В. 15.05.2002, бюл. № 5. 8