Терапевтичне застосування кон’югатів білка з полімером

Реферат: Винахід стосується способу лікування ідіопатичного мієлофіброзу, істинної поліцитемії і ідіопатичної тромбоцитемії із застосуванням кон'югату, що має поліетиленглікольну складову, білкову складову і лінкер. UA 109646 C2 5 10 15 20 25 Перехресне посилання на споріднену заявку Ця заявка претендує на пріоритет за попередньою заявкою США № 61/285,411, поданій 10 грудня 2009, зміст якої повністю включається в опис шляхом посилання. Рівень техніки Успіхи клітинної біології і методів рекомбінантних білків спричиняють за собою розвиток білкових терапевтичних засобів. Проте, все ще існують значні перешкоди. Більшість білків є чутливими до протеолітичної деградації і тому мають короткий період напівжиття в системі циркуляції. Інші недоліки включають низьку водорозчинність і стимулювання нейтралізуючих антитіл. Приєднання полімеру, наприклад, поліетиленгліколю (PEG), до білку перешкоджає доступу протеолітичних ферментів до білкового остову, що призводить до збільшення стабільності білку. Крім того, це покращує водорозчинність і зводить до мінімуму імуногенність. Є необхідність в ефективних методах приєднання полімеру до білку. Розкриття винаходу Один аспект цього винаходу має відношення до застосування кон’югата білку з полімером для лікування різних хвороб. Кон’югат містить, щонайменше, одину полімерну складову, складову інтерферону- і лінкер. Загальна молекулярна маса кон’югата складає 2-200 кДа (переважно 40 кДа), а кількість полімерних складових в кон’югаті складає не більше, ніж 10. Полімерна складова або складові прикріпляються до лінкера; атом азоту N -кінця складвої інтерферону- з'єднується з лінкером; а лінкер є ковалентним зв'язком, C 1-10 алкілен, C2-10 алкенілен або C2-10 алкинілен. Переважно, кон’югат є практично чистим, наприклад, має чистоту більш ніж 70%, 80% або 90%. Хвороби, які можна лікувати за допомогою кон’югата, включають розсіяний склероз, хронічну вірусну інфекцію (таку як, інфекція вірусом гепатиту B, інфекція вірусом гепатиту C і інфекція вірусом папіломи людини), рак, ідіопатичний мієлофіброз, істинна поліцитемія і ідіопатична тромбоцитемія. Інший аспект заявленого винаходу має відношення до застосування кон’югата білку з полімером формули I, представленої нижче, для лікування перелічених вище хвороб : A1 G1 R1 G2 A2 R2 30 35 G3 m R3 R4 n P R5 формула I у якій кожен R1, R2, R3, R4 і R5 незалежно є H, C1-5 алкіл, C2-5 алкеніл, C2-5 алкиніл, арил, гетероарил, C3-8 циклоалкіл або C3-8 гетероциклоалкіл; кожен A1 і A2 незалежно є полімерною складовою; кожен G1, G2 і G3 незалежно є хімічним зв'язком або лінкерною функціональною групою; P є складовою інтерферону-; m є 0 або ціле число 1-10; і n є цілим числом 1-10. Відносно наведеної вище формули, кон’югат білка з полімером може мати одну або більше з наступних особливостей: G3 є хімічним зв'язком, а P є складовою інтерферону-, в якому аміногрупа на N-кінці з'єднується з G3; A1 і A2 є поліалкіленоксидними складовими, що мають O молекулярну масу 2-100 кДа (переважно 10-30 кДА), кожний G1 і G2 є (у якому O 40 45 50 N H O приєднується до A1 або A2, а NH приєднується до атома вуглецю, як показано у формулі I), або кожен G1 і G2 є сечовиною, сульфонамідом або амідом (у якому N приєднується до атома вуглецю, як показано у формулі I); m є 4, n є 2, кожен R 1, R2, R3, R4 і R5 є H; а P є модифікованою складовою інтерферону-, що містить 1-4 додаткових амінокислотних залишків. Термін "алкіл" відноситься до одновалентного вуглеводневого радикала з прямим або розгалуженим ланцюгом. Приклади алкільних груп включають метил, етил, н-пропіл, ізопропіл, терт-бутил і н-пентил. Аналогічно, термін "алкеніл" або "алкиніл" відноситься до одновалентного вуглеводневого радикала з прямим або розгалуженим ланцюгом, що містить один або більше подвійних зв'язків C=C або одну або більше потрійних зв'язків CC. Термін "алкілен" відноситься до двовалентного радикала з прямим або розгалуженим ланцюгом. Аналогічно, термін "алкенілен" або "алкинілен" відноситься до двовалентного вуглеводневого радикала з прямим або розгалуженим ланцюгом, що містить один або більше подвійних зв'язків C=C або один або більше потрійних зв'язків CC. 1 UA 109646 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Термін "арил" відноситься до системи вуглеводневих кілець (моноциклічній або біциклічній), що має, щонайменше, одне ароматичне кільце. Приклади арильних складовихвключають, але не обмежуються цим, феніл, нафтил і піреніл. Термін "гетероарил" відноситься до системи вуглеводневих кілець (моноциклічної або біциклічної), що має, щонайменше, одне ароматичне кільце, що містить, щонайменше, один гетероатом, такий як O, N або S, як частину кільцевої системи, а інші атоми в кільці є вуглецем. Приклади гетероарильних складових включають, але не обмежуються цим, фурил, піроліл, тієніл, оксазоліл, імідазоліл, тіазоліл, піридиніл, піримідиніл, хіназолиніл і індоліл. Термін "циклоалкіл" відноситься до частково або повністю насиченої моноциклічної або біциклічної кільцевої системи, що має в кільці тільки атоми вуглецю. Приклади включають, але не обмежуються цим, циклопропаніл, циклопентаніл і циклогеканіл. Термін "гетероциклоалкіл" відноситься до частково або повністю насиченої моноциклічної або біциклічної кільцевої системи, що має на додаток до вуглецю один або більше гетероатомів (наприклад, O, N або S), в якості кільцевих атомів. Приклади включають, але не обмежуються цим, піперидин, піперазин, морфолін, тіоморфолін і 1,4-оксазепан. Згадані в описі алкіл, алкеніл, алкініл, арил, гетероарил, циклоалкіл і гетероциклоалкіл включають і заміщені і незаміщені складові. Приклади замісників включають C 1-C10 алкіл, C2-C10 алкеніл, C2-C10 алкініл, C3-C8 циклоалкіл, C5-C8 циклоалкеніл, C1-C10 алкоксигрупу, арил, арилоксигрупу, гетероарил, гетероарилоксигрупу, аміногрупу, C 1-C10 алкіламіногрупу, C1-C20 диалкіламиногрупу, ариламіногрупу, диариламіногрупу, гідроксиаміногрупу, алкоксиаміногрупу, C1-C10 алкілсульфонамід, арилсульфонамід, гідроксигрупу, галоген, тіогрупу, C 1-C10 алкілтіогрупу, арилтіогрупу, ціаногрупу, нітрогрупу, ацил, ацилоксигрупу, карбоксил і складний ефір карбонової кислоти. Термін "складова поліалкіленоксиду" відноситься до одновалентного радикала, отриманого від лінійного, розгалуженого або зіркоподібного поліалкіленоксиду. Молекулярна маса складової поліалкіленоксиду може складати 2-100 кДа. Складова поліалкіленоксиду є насиченим або ненасиченим. Приклади складових поліалкиленоксиду включають, але не обмежуються цим, поліетиленоксид, поліетиленгліколь, поліізопропіленоксид, полібутиленоксид і їх сополімери. Також можуть використовуватися інші полімери, такі як декстран, полівінілові спирти, поліакриламіди або полімери на вуглеводній основі, щоб замінити поліалкіленоксиднускладову, за умови, що вони не є алергенними, токсичними або такими, що викликають імунну відповідь. Поліалкіленоксидна складова є заміщеним або незаміщеним. Наприклад, він може бути метоксиполіетиленгліколем (mPEG). Термін "складова інтерферону-" відноситься до одновалентного радикала, отриманого від будь-якого інтерферону-. "Інтерферон-" відноситься до сімейства високогомологічних видоспецифічних білків, інгібуючих реплікацію вірусів і клітинну проліферацію і модулюючих імунну відповідь. Див. Bonnem et al., J. Biol. Response Mod., 1984,3(6) :580-598; і Finter, J. Hepatol., 1986, 3 Suppl 2: S157-160. Він може знаходитися в природній або модифікованій формі. Модифікований інтерферон- може бути, наприклад, білком, що містить інтерферон- і 1-4 додаткових амінокислотних залишків на N -кінці інтерферону. Прикладом такого модифікованого інтерферону є IFN O , IFN представляє складову інтерферону-2b, аміногрупа N 45 50 55 якого на N-кінці з'єднується з карбонільною групою. Багато типів інтерферонів- є комерційно доступними, включаючи інтерферон Інтрон-A, що надається компанією Schering Corporation, Kenilworth, N.J., інтерферон Роферон, що надається компанією Hoffmann, - La Roche, Nutley, N.J., Берофор інтерферон альфа 2, що надається компанією Boehringer Ingelheim Pharmaceutical, Inc., Ridgefield, Conn., Суміферон, що надається компанією Sumitomo, Japan, і Велферон інтерферон альфа-n1 (INS), що надається компанією Glaxo, - Wellcome Ltd., London, Great Britain. Нижче перераховані амінокислотні послідовності п'яти типових людських білківінтерферонів- або у формі попередника або в зрілій формі: maltfallva llvlsckssc svgcdlpqth slgsrrtlml laqmrrislf sclkdrhdfg fpqeefgnqf qkaetipvlh emiqqifnlf stkdssaawd etlldkfyte lyqqlndlea cviqgvgvte tplmkedsil avrkyfqrit lylkekkysp cawevvraei mrsfslstnl qeslrske SEQ ID NO.: 1 (см Krasagakis et al., Cancer Invest. 26 (6), 562-568, 2008) cdlpqthslg srrtlmllaq mrkislfscl kdrhdfgfpq eefgnqfqka etipvlhemi qqifnlfstk dssaawdetl ldkfytelyq qlndleacvi qgvgvtetpl mkedsilavr kyfqritlyl kekkyspcaw evvraeimrs fslstnlqes lrske SEQ ID NO.: 2 (см Klaus, et al., J. Mol. Biol. 274 (4), 661-675, 1997) mcdlpqthsl gsrrtlmlla qmrrislfsc lkdrhdfgfp qeefgnqfqk aetipvlhem iqqifnlfst kdssaawdet lldkfytely 2 UA 109646 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 qqlndleacv iqgvgvtetp lmkedsilav rkyfqritly lkekkyspca wevvraeimr sfslstnlqe slrske SEQ ID NO.: 3 (см GenBank Accession Number AAP20099, the 30 - APR - 2003 version.) mallfpllaa lvmtsyspvg slgcdlpqnh gllsrntlvl lhqmrrispf lclkdrrdfr fpqemvkgsq lqkahvmsvl hemlqqifsl fhterssaaw nmtlldqlht elhqqlqhle tcllqvvgeg esagaisspa ltlrryfqgi rvylkekkys dcawevvrme imkslflstn mqerlrskdr dlgss SEQ ID NO.: 4 (см Capon et al., J. Mol. Cell. Biol. 5 (4) :768-779, 1985) lsyksicslg cdlpqthslg nrralillaq mgrispfscl kdrhdfglpq eefdgnqfqk tqaisvlhem iqqtfnlfst edssaaweqs llekfstely qqlnnleacv iqevgmeetp lmnedsilav rkyfqritly ltekkyspca wevvraeimr slsfstnlqk rlrrkd SEQ ID NO.: 5 (см Lund et al., J. Interferon Res. 5 (2), 229-238, 1985) У одному прикладі білок інтерферон-, використаний для отримання кон’югата цього винаходу, має амінокислотну послідовність, щонайменше, на 80% (наприклад, 85%, 90%, 95% або 99%) ідентичну одній з перелічених вище амінокислотних послідовностей, або її складову, відповідному зрілому інтерферону альфа. "Відсоток ідентичності" двох амінокислотних послідовностей визначається за допомогою алгоритму Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990, модифікованого, як вказано в Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993. Такий алгоритм вбудовується в програми NBLAST і XBLAST (версія 2.0) Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990. Пошук білків BLAST може бути здійснений з використанням програми XBLAST оцінка=50 довжина слова=3 для отримання амінокислотних послідовностей, гомологічних білковим молекулам винаходу. Коли між двома послідовностями існують розбіжності, можна використати Gapped BLAST, як описано в Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17) :3389-3402, 1997. При застосуванні програм BLAST і Gapped BLAST можуть використовуватися параметри за умовчанням відповідних програм (наприклад, XBLAST і NBLAST). Термін "сполучаюча функціональна група" відноситься до двовалентної функціональної групи, сполученої одним кінцем з складовою полімеру, а іншим кінцем з складовою білка. Приклади включають, але не обмежуються цим, -O-, -S-, ефір карбонової кислоти, карбоіл, карбонат, амід, карбамат, сечовину, сульфоніл, сульфініл, аміногрупу, іміногрупу, гідроксиаміногрупу, фосфонат або фосфатну групу. Описаний вище кон’югат білку з полімером може знаходитися у вільній формі або у формі солі, якщо необхідно. Сіль, наприклад, може бути утворена між аніоном і позитивно зарядженою групою (наприклад, аміногрупою) на кон’югаті білок-полімер цього винаходу. Відповідні аніони включають хлорид, бромід, йодид, сульфат, нітрат, фосфат, цитрат, метансульфонат, трифторацетат і ацетат. Аналогічно цьому, сіль також може бути утворена між катіоном і негативно зарядженою групою (наприклад, карбоксилатом) на кон’югаті білок-полімер цього винаходу. Відповідні катіони включають іон натрію, іон калію, іон магнію, іон кальцію і катіон амонію, такий як іон тетраметиламонію. Крім того, кон’югат білок-полімер може мати одну або більше подвійних зв'язків, або один або більше центрів асиметрії. Такий кон’югат може зустрічатися у вигляді рацематів, рацемічних сумішей, окремих енантіомерів, поодиноких діастереомерів, сумішей діастереомерів і цис- або транс- ізомерних форм з E - або Z - подвійним зв'язком. Приклад кон’югата білку з полімером цього винаходу показаний нижче: O IFN O O mPEGO NH mPEGO 45 50 55 N N H у якому mPEG має молекулярну масу 20 кДа, а IFN є складовою інтерферону-2b. Крім того, у рамках цього винаходу знаходиться застосування кон’югата для виробництва медикаменту для лікування одного із згаданих вище захворювань. Подробиці одного або більше варіантів здійснення винаходу викладені в описі нижче. Інші ознаки, цілі і переваги винаходу стануть зрозумілі з опису і пунктів формули винаходу. Детальний опис Кон’югати білку з полімером, вживані з метою здійснення на практиці заявленого винаходу, можна отримати синтетичними методами, добре відомими в області хімії, наприклад, методами, описаними в US 12/192,485. Схема 1 показує приклад отримання кон’югатів білку з полімером цього винаходу. Диамінове з'єднання 1, що містить ацетальну групу, взаємодіє з Nгідроксисукцинімідил карбонатом mPEG (тобто, з'єднання 2) з утворенням ди-PEGілованого з'єднання 3, яке пізніше перетворюється в альдегід 4. Цей альдегід взаємодіє білком, що має вільну аміногрупу, шляхом відновного алкілування з отриманням кон’югата білок-полімер цього 3 UA 109646 C2 винаходу. 5 10 15 20 25 30 Схема 1 Синтезований таким чином кон’югат білок-полімер може бути додатково очищений, наприклад, за допомогою іонообмінної хроматографії, гельфільтраційної хроматографії, електрофорезу, діалізу, ультрафільтрації або ультрацентрофугування. Описані вище хімічні реакції включають використання розчинників, реактивів, каталізаторів, захисних груп і реагентів, що знімають захист, і певні умови реакції. Вони можуть включати додаткові стадії (до або після спеціально описаних тут стадій), призначені для додавання або видалення відповідних захисних груп, кінець кінцем, з метою створення можливості для синтезу кон’югата білок-полімер. Крім того, різні стадії синтезу можуть проводитися в змінній послідовності або порядку, щоб отримати бажані кон’югати білка з полімером. Синтетичні хімічні перетворення і методи застосування захисних груп (захист і зняття захисту), використовувані в синтезі відповідних кон’югатів білок-полімер, відомі в цій області техніки і включають, наприклад, методи, описані в R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); і L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995) і їх подальші редакції. Кон’югат винаходу може мати дуже високу чистоту. А саме, 60% або більше (наприклад, 70%, 80% або 90%) за молекули кон’югата є ідентичними в усіх аспектах, включаючи послідовність білкової складової і її місце зв'язування з полімерною складовою. Кон’югат цього винаходу може бути фармацевтично активним у формі кон’югата. Альтернативно, він може вивільняти фармацевтично активний інтерферон- in vivo (наприклад, за допомогою гідролізу) при ферментативному розщеплюванні зв'язку між білковою складовою і полімерною складовою. Приклади ферментів, що беруть участь в розщеплюванні зв'язків in vivo, включають окислювальні ферменти (наприклад, пероксидази, аміноксидази або дегідрогеназа), відновні ферменти (наприклад, кеторедуктази) і гідролітичні ферменти (наприклад, протеази, естерази, сульфатази і фосфатази). Кон’югат цього винаходу можна використати для лікування розсіяного склерозу, хронічної вірусної інфекції (такий як, інфекція вірусу гепатиту B, інфекція вірусу гепатиту C і інфекція вірусу папіломи людини), раку, ідіопатичного мієлофіброзу, істинної поліцитемії і ідіопатичної тромбоцитемії. Він має несподівано тривалий період напівжиття, зменшену лікувальну дозу 4 UA 109646 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 і/або тривалий інтервал дозування. При використанні в описі термін "лікування" визначається як застосування або введення композиції, що включає кон’югат білок-полімер, суб'єктові (людині або тварині), у якого є порушення, симптом порушення або хвороба або порушення на тлі захворювання або схильність до захворювання з метою поліпшити стан, вилікувати, полегшити, ослабити або виправити порушення, симптом порушення або хворобу або порушення на тлі захворювання або схильність до захворювання. "Ефективна кількість" відноситься до кількості кон’югата білокполімер, що дає терапевтичний ефект у суб'єкта, якого лікують. Терапевтичний ефект може бути об'єктивним (тобто може бути виміряний за допомогою деяких тестів або маркерів) або суб'єктивним (тобто, у суб'єкта з'являються ознаки ефекту або пацієнт відчуває ефект). Крім того, у рамках цього винаходу знаходиться фармацевтична композиція, що містить ефективну кількість, щонайменше, одного з кон’югатів білок-полімер, описаних вище, і фармацевтично прийнятний носій. Крім того, цей винахід включає спосіб введення ефективної кількості однієї або більше з кон’югатів білку з полімером пацієнтові, що має одне або більше за захворювання. Як встановлено фахівцями в цій області техніки, ефективні дози варіюватимуть, наприклад, залежно від швидкості гідролізу кон’югата білок-полімер, типів захворювань, які треба лікувати, способу введення, використання допоміжних речовин (інертних наповнювачів) і можливості спільного застосування з іншою терапевтичною дією. Для застосування на практиці способу заявленого винаходу композиція, що містить одне або більше з вищезгаданих сполук, може бути введена парентерально, перорально, назально, ректально, місцево або трансбуккально. Термін "парентерально" при використанні в описі відноситься до підшкірного, внутрішньошкірного, внутрішньовенного, внутрішньом'язового, внутрішньосуглобового, внутрішньоартеріального, внутрішньогрудинного, підоболонкового, внутрішньоосередкового (введенню всередину уражених тканин), внутрішньоочеревинного, внутрішньотрахеального або внутрішньочерепного введення, а також до будь-якого відповідного методу вливання. Стерильна композиція, що ін'єктується, може бути розчином або суспензією в нетоксичному парентеральному прийнятному розчиннику або розчиннику, такому як розчин в 1,3-бутандіолі. До кількості прийнятних носіїв і розчинників, які можуть використовуватися, відносяться манітол, вода, розчин Рінгера і ізотонічний розчин хлориду натрію. На додаток до цього в якості розчинника або середовища, що суспендує, зазвичай використовують нелетючі олії (наприклад, синтетичні моно- і дигліцериди). Жирні кислоти, такі як олеїнова кислота і її гліцеридні похідні, є придатними для приготування ін'єкційних препаратів, як і природні фармацевтично прийнятні олії, такі як маслинова олія або касторова олія, особливо в їх поліоксиетилованих варіантах. Ці масляні розчини або суспензії можуть також містити розчинник на основі спирту з довгим ланцюгом або диспергуючу речовину, або карбоксиметилцелюлозу або подібні диспергуючі речовини. При приготуванні лікарських форм також можна використати зазвичай вживані поверхнево-активні речовини, такі як твіни, спани або інші подібні емульгатори або речовини, що підвищують біодоступність, які зазвичай використовуються у виробництві фармацевтично прийнятних твердих, рідких або інших лікарських форм. Композиція для перорального введення може бути будь-якою прийнятною для перорального введення лікарською формою, включаючи капсули, пігулки, емульсії, водні суспензії, дисперсії і розчини. У разі пігулок носії, які зазвичай використовують, включають лактозу і кукурудзяний крохмаль. Також зазвичай додають змащуючі речовини, такі як стеарат магнію. Для перорального введення у вигляді капсул придатні розчинники включають лактозу і сухий кукурудзяний крохмаль. У тому випадку, коли для перорального застосування потрібно водні суспензії або емульсії, активний інгредієнт можна суспендувати або розчинити в масляній фазі у поєднанні з емульгаторами або агентами, що суспендують. Якщо бажано, то також можна додати певні підсолоджувачі, смакові речовини або барвники. Назальний аерозоль або композицію для інгаляції можна приготувати з використанням способів, добре відомих в області приготування фармацевтичних препаратів. Наприклад, такі композиції можна приготувати у вигляді розчину у фізіологічному розчині з використанням бензилового спирту або інших відповідних консервантів, речовин, сприяючих всмоктуванню для підвищення біодоступності, фторуглеродів і/або інших звичайних солюбілізуючих або диспергуючих агентів, відомих в цій області техніки. Композиція, що містить одну або більше з перелічених вище сполук, також може бути введена у вигляді супозиторіїв для ректального застосування. Разом з однією або більше згаданими вище активними сполуками зазвичай використовується фармацевтично прийнятний носій. Носій у фармацевтичній композиції має бути "прийнятним" в тому сенсі, що він є сумісним з активним інгредієнтом композиції (і 5 UA 109646 C2 5 10 15 переважно, в змозі стабілізувати активний інгредієнт) і не є шкідливим для суб'єкта, якого лікують. В якості фармацевтичних допоміжних речовин (ексципієнтів) для доставки вищезгаданої сполуки можна використати один або більше злюбілізуючих агентів. Приклади інших носіїв включають колоїдний двоокис кремнію, стеарат магнію, целюлозу, лаурилсульфат натрію і D&C Yellow # 10. Для попередньої оцінки описаних вище кон’югатів при лікуванні різних хвороб можуть використовуватися відповідні методи дослідження. Наприклад, можна оцінити ефективність кон’югата при лікуванні істинної поліцитемії і ідіопатичної тромбоцитемії, наслідуючи способи, описані в Kiladjian et al., Blood 2008; 112(8) : 3065-72 and Langer et al., Haetatologica 2005; 90: 1333-1338, відповідно. Представлені далі приклади слід розглядати тільки як ілюстративні і не обмежуючі іншу частину розкриття, яким би то не було чином. Передбачається, що фахівець в цій області, виходячи з представленого опису, може без додаткових уточнень використати заявлений винахід в повному обсязі. Усі цитовані тут публікації повністю включаються в опис шляхом посилання. Отримання ди-PEG альдегіда O H2N mPEGO(C=O)OSu O O H 2N DIPEA, CH2Cl 2 O mPEGO mPEGO NH O O N H Su = сукцинімідил Su = succinimidyl 20 25 30 20 кДа PEGO(C=O) OSu був отриманий з 20 кДа mPEGOH, купленого у (SunBio Inc., Каліфорнія, США) згідно із способом, описаним в Bioconjugate Chem. 1993, 4, 568-569. Розчин 6-(1,3-диоксолан-2-іл) гексан-1,5-диаміна в дихлорметані (11,97 г розчину, що містить 9,03 міліграм диаміна, 47,8 мкмоль) додали в колбу з 20 кДа PEGO(C=O) OSu (1,72 г; 86,0 мкмоль). Після того, як PEGO(C=O) OSu повністю розчинився, додали N,Nдиізопропілетиламін (79 мкл, 478 мкмоль). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі впродовж 24 годин, а потім додали по краплях метил-трет-бутиловий ефір (200 мл) при перемішуванні. Осад, що вийшов, зібрали і висушили під вакуумом з отриманням ди-PEG ацеталя (1,69 г; 98%) у вигляді білої твердої речовини. 1 H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO)  7.16 (t, J = 5.2 Hz, 1 H), 7.06 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 4.76 (t, J = 4.8 Hz, 1 H), 4.10-3.95 (m, 4 H), 1.80-1.65 (m, 1 H), 1.65-1.50 (m, 1 H), 1.48-1.10 (m, 6 H). O O mPEGO 35 40 mPEGO N H O NH O O O mPEGO mPEGO N H NH CHO Ди-PEG ацеталь (4,0 г; 0.2 ммоль) суспендували у буфері pH 2,0 (лимонна кислота, 40 мл). Реакційну суміш перемішували при 35°C впродовж 24 годин і потім екстрагували дихлорметаном (3 x 50 мл). Об'єднані органічні шари висушували над сульфатом магнію, концентрували, а потім знову розчиняли в дихлорметані (20 мл). Розчин додали по краплях до метил-трет-бутилового ефіру (400 мл) при перемішуванні. Осад, що вийшов, зібрали і висушили при зниженому тиску з отриманням ди-PEG альдегіду (3,8 г; 95%) у вигляді білої твердої речовини. 1 H ЯМР (400 MHz, d6-DMSO)  9.60 (s, 1 H), 7.24(d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.16 (t, J = 5.2 Hz, 1 H), 4.10-3.95 (m, 4 H), 3.95-3.80 (m, 1 H), 3.00-2.85 (m, 2 H), 2.58-2.36 (m, 2 H), 1.46-1.15 (m, 6 H). Отримання модифікованого інтерферону IFN O HN 45 Модифікований рекомбінантний людський інтерферон-2b клонували за допомогою методу ПЦР з використанням людської геномної ДНК в якості матриці. Олігонуклеотиди були синтезовані на основі фланкуючих послідовностей людського інтерферону-2b (GenBank Accession # J00207, January 8, 2008). Отримані ПЦР-продукти субклонували у вектор pGEM-T (Promega). IFN-вариант знову ампліфікували за допомогою ПЦР за рахунок використання клонів pGEM-T і потім субклонували у вектор експресії білку pET - 24a (Novagen), вектор, що запускається промотором РНК-полімерази T7, використовуючи NdeI/BamHI як сайти 6 UA 109646 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 клонування. Потім вектор pET-24a був трансформований в штам E. coli BL21 - CodonPlus (DE 3) - RIL (Stratagene). Клони з високою експресією відібрали шляхом культивування трансформованих E. coli BL21 - CodonPlus (DE 3) - RIL у присутності караміцина (50 мкг/мл) і хлорамфеніколу (50 мкг/мл). Бульйонне поживне середовище (BD, 200 мл) використали для розмноження BL21 CodonPlus (DE 3) - RIL з Pro-IFN геном в 1000 мл колбі. Колбу струшували при 37°C і 230 об/хв впродовж 16 годин. Періодичну ферментацію і періодичну ферментацію з додаванням субстрату проводили в 5-літровій посудині для ферментації (Bioflo 3000; New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ). Для періодичної ферментації використали 150 мл інокулума прекультури і 3 л бульйонного поживного середовища з караміцином (50 мкг/мл), хлорамфеніколом (50 мкг/мл), 0,4% гліцерином і 0,5% (о./о.) мікроелементами (10 г/л FeSO47H2O; 2,25 г/л ZnSO47H2O; 1 г/л CuSO45H2O; 0,5 г/л MnSO4H2O; 0,3 г/л H3BO3; 2 г/л CaCl22H2O; 0,1 г/л (NH4)6Mo7O24; 0,84 г/л EDTA, 50 мл/л HCl). Концентрацію розчиненого кисню забезпечували на рівні 35% і підтримували значення pH 7,2 шляхом додавання 5N водного розчину NaOH. Приготували поживний розчин, що містить 600 г/л глюкози і 20 г/л MgSO 47H2O. Коли значення pH піднімалося до значення більше, ніж задане, додавали відповідний об'єм поживного розчину, щоб збільшити концентрацію глюкози в культуральній рідині. Експресію гена Pro-IFN індукували додаванням IPTG до остаточної концентрації 1 мM, і збирали культуральну рідину після інкубації впродовж 3 годин. Зібраний клітинний осад ресуспендировали з буфером TEN (50 мM Трис-HCl (pH 8,0), 1 мM ЕДТА, 100 мM NaCl) в приблизному співвідношенні 1:10 (суха вага г/мл) і розбивали за допомогою мікрофлюідайзера, а потім центрифугували при 10000 об/хв впродовж 20 хвилин. Осад, що містить тільця включення (IB), двічі промили буфером TEN і центрифугували, як описано вище. Потім осад, що містить IB, суспендували в 150 мл 4M водного розчину гуанідинHCl (GuHCl) і центрифугували при 20000 об/хв впродовж 15 хвилин. Потім IB солюбілізували в 50 мл 6M розчину GuHCl. Солюбілізований GuHCl матеріал центрифугували при 20000 об/хв впродовж 20 хвилин. Рефолдінг викликали розбавленням денатурованих IB в 1,5 л свіжоприготовленого буфера для рефолдінга (100 мM Трис-HCl (pH 8,0), 0,5 M L-аргінин, 2 мM ЕДТА), який перемішували тільки під час додавання. Реакційну суміш для рефолдінга витримували впродовж 48 годин без перемішування. Підданий рефолдінгу рекомбінантний людський інтерферон-2b (т.е., Pro-IFN) був діалізований проти 20 мM Трис-буфера (з 2 мM ЕДТА і 0,1M сечовиною, pH 7,0) з метою додаткового очищення за допомогою колоночної хроматографії на Q-Сефарозе. Підданий рефолдінгу рекомбінантний людський білок Pro-IFN завантажували в колонку з Qсефарозою (GE Amersham Pharmacia, Pittsburgh, PA). Колонка була заздалегідь урівноважена і промита 20 мM буфером Трис-HCl (pH 7,0). Продукт елюювали сумішшю 20 мM буфера ТрисHCl (pH 7,0) і 200 мM NaCl. Фракції, що містять Pro-IFN, збирали, виходячи з їх оптичної щільності при 280 нм. Концентрацію Pro-IFN визначали за допомогою набору для аналізу білків, використовуючи метод Бредфорда (Pierce, Rockford, IL). Отримання кон’югата білка з полімером O O mPEGO 45 50 55 mPEGO N H O NH O mPEGO NH IFN O CHO mPEGO N H N До розчину отриманого раніше ди-PEG альдегіду (1,2 г; 0,03 ммоль) у воді (72 мл) додали 2 M натрій-фосфатний буфер (pH 4,0; 5 мл) і Pro-IFN (200 міліграм у буфері 22,2 мл pH 7,0, що містить 20 мM Трис-HCl і 0,2M NaCl, 0,01 ммоль). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі впродовж 10 хвилин, потім додали водний розчин натрій цианоборогідрида (400 мM; 1,25 мл; 0,5 ммоль). Реакційну суміш перемішували в темряві впродовж 16 годин і очищали за допомогою хроматографії на SP XL сефарозі. Фракції, що містять бажаний кон’югат білокполімер збирали, виходячи з часу їх утримування і оптичної щільності при 280 нм. Концентрацію кон’югата визначали за допомогою набору для аналізу білків, використовуючи метод Бредфорда (Pierce, Rockford, IL). Практичний вихід кон’югата складав приблизно 40% або вище. Інші варіанти здійснення Усі ознаки, розкриті в цьому детальному описі, можуть поєднуватися у будь-якій комбінації. Кожна ознака, розкрита в цьому детальному описі, може бути замінена альтернативною ознакою, що служить тій самій, рівноцінній або аналогічній меті. Таким чином, якщо недвозначним чином не встановлене інше, кожна розкрита ознака є тільки прикладом характерного ряду рівноцінних або аналогічних ознак. 7 UA 109646 C2 5 З наведеного вище опису фахівець в цій області техніки може легко встановити важливі характеристики цього винаходу і без відхилення від його обсягу і суті може робити різні зміни і модифікації винаходу, щоб пристосувати його до різних способів застосування і умов. Таким чином, інші варіанти здійснення також знаходяться у рамках наступних пунктів формули винаходу. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 1. Спосіб лікування хвороби, що включає введення суб'єктові, що потребує цього, ефективної кількості кон'югата, чистота якого складає 70 % або більше, що має поліетиленглікольну складову, білкову складову і лінкер, де кон'югат є O IFN O mPEGO O 20 N N H mPEGO 15 NH , де білкова складова є залишком модифікованого інтерферону-α2b, який містить 1-4 додаткових амінокислотних залишків на N-кінці, а хвороба є ідіопатичним мієлофіброзом, істинною поліцитемією і ідіопатичною тромбоцитемією. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що хвороба є ідіопатичним мієлофіброзом. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що хвороба є істинною поліцитемією. 4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що хвороба є ідіопатичною тромбоцитемією. 5. Спосіб лікування хвороби, який включає введення суб'єктові, що потребує цього, ефективної кількості кон'югата формули: O IFN O mPEGO O mPEGO 25 30 N H NH N , де IFN є залишком модифікованого інтерферону-α2b, який містить 1-4 додаткових амінокислотних залишків на N-кінці, хвороба є ідіопатичним мієлофіброзом, істинною поліцитемією і ідіопатичною тромбоцитемією. 6. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що складова mPEG, має молекулярну масу 10-30 кДа. 7. Спосіб за п. 6, який відрізняється тим, що mPEG має молекулярну масу 20 кДа. 8. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що хвороба є ідіопатичним мієлофіброзом. 9. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що хвороба є істинною поліцитемією. 10. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що хвороба є ідіопатичною тромбоцитемією. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 8