Застосування n-(9-флуореніліден)-n’-ізонікотиногідразиду (флуренізиду) як антивірусного засобу щодо рнк-геномних вірусів

Застосування N-(9-флуореніліден)-N'ізонікотиногідразиду (Флуренізиду) формули O N як антивірусного вірусів. N H N засобу щодо РНК-геномних N N-(9-флуореніліден)-N'-ізонікотиногідразид (Флуренізид), формула 1. [Рестр галузеви х нововведень 173/15/01. Флуренізид - новий оригінальний український препарат протитуберкульозної та протимікробної дії]. Флуренізид числиться в «Національному переліку основних лікарських засобів і виробів медичного призначення» відповідно до постанов KM України від 16.11.2001 p. №1482 та 29.03.2006 p. №400, м.Київ. Виробником Флуренізиду є ЗАТ "Київський вітамінний завод" за патентом на винахід України №24790С2 "Спосіб промислового одержання субстанції флуренізиду". У ветеринарній медицині відомий засіб для лікування репродуктивних органів Хламіцид, який містить як діючу речовину N-(9-флуореніліден)-N' (11) N H UA N 81084 O (19) Винахід належить до галузі фармацевтичної хімії, ветеринарної медицини і може бути використаний для лікування інфекційних захворювань у тварин. У даний час в клініці застосовують незначне число низькомолекулярних синтетичних препаратів для профілактики й лікування вірусних інфекцій у тварин, спричинених, зокрема, РНК-вмісними вірусами - вірусом грипу птахів і вірусом хвороби Ньюкасла (avion paramyxo virus 1), який уражає респіраторний і шлунково-кишковий тракт птахів. Пошук нових стр уктур лікарських засобів антивірусної дії є актуальним і перспективним для ветеринарної медицини. За основу винаходу поставлено задачу розширити спектр противірусних препаратів для потреб ветеринарної медицини. Поставлену задачу вирішують таким чином, що як лікарський засіб антивірусної дії використовують N-(9-флуореніліден)-N-ізонікотиногідразид (Флуренізид). Відомо про лікарський засіб Флуренізид, хем. N-(9флуореніліден)-N'-ізонікотиногідразид, формула 1 (13) C2 (21) a200610006 (22) 18.09.2006 (24) 26.11.2007 (72) ПЕТРУХ ЛЮБОВ ІВАНІВНА, U A (73) ПЕТРУХ ЛЮБОВ ІВАНІВНА, U A (56) UA U 10860, 15.11.2005. UA A 53518, 15.01.2003. UA U 10859, 15.11.2005. UA C2 78126, 15.02.2007. RU C1 2185165, 20.07.2002. Компендиум. Лекарственные препараты 2005. Под. ред. член-кор. АМН Украины, проф. В.Н. Коваленко и проф. А.П. Викторова. - К.: Морион, 2005. (ФЛУРЕНІЗИДУ) 3 81084 4 ізонікотино-гідразид (Флуренізид) [Пат. 23628 А, Україна, МКВ А 61 К 39/118. Супозиторії хламіциду для лікування генітальних форм хламідіозів у корів]. Розроблені нормативно-технічні документи, які затверджені Головним управлінням ветеринарної медицини з держветінспекцією МСГП України (ТУ У 46.15.477-2000). Для N-(9-флуореніліден)-N'-ізонікотиногідразиду (Флуренізиду) противірусні властивості не відомі. Винахідницький рівень полягає в неочевидності створення вказаного засобу. Найближчим аналогом за протигрипозною дією заявленого об'єкту є відомий Ремантадин, який сильно інгібує віруси грипу типу А, забезпечує профілактичний і ранній терапевтичний ефект [Ме ханизмы антивирусного действия производных адамантана / Под ред. М.К.Индулен]. Важливою є вибірковість пригнічення репродукції віруса без побічної дії на метаболізм клітинигосподаря. Найближчим структурним аналогом заявленого об'єкту є низькомолекулярний індуктор ендогенного інтерферону Аміксин, формули 2 ("Интерхим", Росія; син. Тилорон "Sigma", США), який призначають для лікування інфекційних захворювань, спричинених ДНК-вмісними вірусами Herpes simplex 1 і 2 типів, Varicella zoster, цитомеґаловірусної та хламідійної інфекції [Перший Г.Н., Богданова Н.С. Химиотерапия вирусных ин фекций]. лікарського засобу має особливо важливе значення. Противірусну дію N-(9-флуореніліден)-N'ізонікотиногідразиду (Флуренізиду) вивчено in vitro та in ovo щодо вірусу грипу птиці (ВГП) типу Росток/34 (H7N1) та вірусу хвороби Ньюкасла (ВХН). Приклад 1. Вивчення антивірусної активності N-(9флуореніліден)-N'-ізонікотиногідразиду (Флуренізид) щодо вірусу грипу птиці ГП7-А Росток/34 (H7N1). Інгібуючу дію досліджено в системах in vitro та in ovo. Інфекційний титр 5,8 lg ТЦД50. В експерименті використано дози 50 і 100 ТЦД (ВГП). Активність N-(9-флуореніліден)-N'ізонікотиногідразиду (Флуренізид) вивчено відповідно до стандартної методики. N-(9-флуореніліден)-N’-ізонікотиногідразид (Флуренізид) розчиняли в Димексиді (диметилсульфоксиді) розчиннику, який нетоксичний для клітин. Розчин вносили в біосистему в концентрації 1/2 від максимально переносимої (МПК) через 30 хв. після зараження вірусом у дозах, які спричиняли 100%-ний ефект інфікування. Вірус-репродукуючу систему інкубували при 37°С протягом 24 год. Здійснені були відповідні контрольні заходи. У контролі використовували рівний об'єм розчинника. Противірусну дію біологічно активної сполуки H 3C CH3 характеризує її вплив на життєздатність інфікованих вірусом клітин. H3C N N CH3 Пробірки щоденно досліджували мікроскопічне на O O наявність ЦПД. Протягом 72 год у дослідних O зразках та у контролі з ремантадином ЦПД не Аміксин, формула 2 було, тоді як у пробірках "контроль вірусу грипу Найближчі аналоги за дією та структурою - відомі птиці" через 1-2 дні з'являлась ЦПД, що лікарські засоби Ремантадин і Аміксин нагадувала спонтанну дегенерацію клітин. відрізняються своїми фармакологічними Встановлено, що Флуренізид сильно впливає на властивостями, показником гострої токсичності репродукцію вірусу грипу пта хів ГП7-А, штам LD50 на організм (білі безпородні миші). Росток/34 (H7N1) в системах in vitro та in o vo. Порівняльні дані безпечності препаратів подані в При інфікуванні in vitro системи "клітина-вірус ГП7таблиці 1. А" в дозі 50 ТЦД50 показники захисту (lg) для ремантадину дорівнюють 3,50; для флуренізиду Таблиця 1 3,25; у дозі 100 ТЦД50 показники захисту (lg) для ремантадину становлять 4,80; для флуренізиду Порівняльні показники 4,67. Порівняльні дані антивірусної дії безпечності противірусних препаратів досліджуваних препаратів наведені у таблиці 1. Препарати Ремантадин Аміксин N-(9-флуореніліден)-N'-ізонікотиногідразид (Флуренізид) За безпечністю для макроорганізму заявлений об'єкт переважає ремантадин у 32,4 рази при внутрішньоочеревинному введенні і в 9,35 разів при пероральному введенні. Аміксин у 50,9 разів менш безпечний при внутрішньоочеревинному введенні і в 6,04 рази - при пероральному введенні. Для ветеринарної медицини безпечність Спосіб введення LD50, мґ/кг внутрішньоочеревинно 179,0 перорально 620,0 Порівняльні дані антивірусної дії in vitro внутрішньоочеревинно на репродукцію віруса грипу птахів ГП7114,0 препаратів перорально 960,0 внутрішньоочеревинно 5800,0 Ефективність пр вірусом грипу Концентрація Назва досліджуваного препарату препаратів, 50 ТПД мг/мл показник захисту, lg ІД 50 т Ремантадин еталон за 2,5 3,50 протигрипозною дією Флуренізид (N-(9-флуореніліден)1,6 3,25 N'-ізонікотиногідразид) 5 81084 Зниження титру вірусу свідчить про інгібуючу дію досліджуваного препарату. Різниця в 1 lg означає пригнічення приблизно 90% вірусу. При збільшенні доз вірусу з 50 до 100 ТЦД50 ступінь інгібіції знижується. Встановлено, що N-(9-флуореніліден)-N’ізонікотиногідразид (Флуренізид) пригнічує in vitro репродукцію вірусу грипу пта хів ГП7-А, штам Росток/34 (H7N1). Для досліджень in ovo використані 10-ти добові ембріони курей. Після інкубації, за допомогою реакції гемаглютинації встановлювали наявність вірусу. N-(9-флуореніліден)-N' -ізонікотиногідразид (Флуренізид) не викликав загибелі ембріонів курей протягом 96 год. При інфікуванні in ovo дозою вірусу 50 ЕІДзо показники захисту (lg) для ремантадину становили 3,7; для флуренізиду - 3,5; у дозі 100 ЕІД50 показники захисту (lg) для ремантадину дорівнювали 4,80; для флуренізиду - 4,67. Порівняльні дані антивірусної дії досліджуваних препаратів на репродукцію вірусу грипу пта хів in ovo наведені у таблиці 2. 6 тоді як у пробірках "контроль вірусу хвороби Ньюкасла" ЦПД з'являлась на 2-3 день з утворенням симпластів. Встановлено, що Флуренізид пригнічує репродукцію вірусу хвороби Ньюкасла, штам La Сота в системах in vitro та in ovo. При інфікуванні in vitro системи "клітина-ВХН" в дозі 50 ТЦД5о показники захисту (lg) для аміксину дорівнюють 3,65; для флуренізиду - 3,52; у дозі 100 ТЦД50 показники захисту (lg) для аміксину дорівнюють 4,72; для флуренізиду -4,53. Порівняльні дані антивірусної дії in vitro досліджуваних препаратів, наведені у таблиці 3. Встановлено значне зниження інфекційного титру при 50 і 100 ТЦД вірусу хвороби Ньюкасла. Реакції гемаглютинації з 5% суспензією еритроцитів півня у контролі вірусу хвороби Ньюкасла були позитивними, тоді як у досліджуваних зразках та в контрольні з Аміксином - негативними. N-(9-флуореніліден)-N'-ізонікотиногідразид (Флуренізид) пригнічує in vitro репродукцію вірусу хвороби Ньюкасла, штам La Соmа, який спричиняє важке ураження респіраторного та шлунковокишкового тракту пта хів. Таблиця 2 Порівняльні дані антивірусної дії досліджуваних препаратів на репродукцію вірусу грипу пта хів in ovo Порівняльні дані Ефективність препаратів in ovo при інфікуванні антивірусної дії дослід препаратів на Росток/34 біосистеми вірусом грипу птахів ГП7-А, штамрепродукцію віруса хвороби Нь (H7N1) Концентрація Ефективність препаратів Назва досліджуваного препарату препаратів, 50 ЕІД50 100ЕІД50 вірусом хвороби мг/емб. показник показник зниження зниження захисту, lg захисту, lg Концентрація 50 ТПД50 титру вірусу титру вірусу ІД50 Назва препаратів ІД50 препаратів, Ремантадин - еталон за показник 2,5 3.7 2,1 4,76мґ/мл 1,04 зниження ти протигрипозною дією захисту, вірусу Флуренізид (N-(9lg ІД50 1,6 3,5 2,3 4,72 1,08 флуореніліден)-N'Аміксин - еталон за ізонікотиногідразид) 1,6 3,65 1,85 структурою і дією За результатами досліджень N-(9-флуореніліден)Флуренізид (N-(9N'-ізонікотиногідразид (Флуренізид) пригнічує in 1,6 3,52 1,98 флуореніліден)-Novo репродукцію вірусу грипу птахів ГП7-А, штам ізонікотиногідразид) Росток/34 (H7N1). Показники антивірусної дії N-(9-флуореніліден)-N’При інфікуванні in ovo дозою вірусу 50 ЕІД 50 ізонікотиногідразиду (Флуренізид) на репродукцію показники захисту (lg) для аміксину становили вірусу грипу птахів у системах in vitro та in ovo 3,40; для флуренізиду - 3,35; у дозі 100 ЕІД50 перевищують такі для ремантадину - еталону за показники захисту (lg) для аміксину дорівнювали протигрипозною дією. 4,82; для флуренізиду - 4,78. Приклад 2. Вивчення антивірусної дії N-(9Реакції гемаглютинації з 5% суспензією флуореніліден)-N'-ізонікотиногідразиду еритроцитів півня у контролі вірусу хвороби (Флуренізиду) на вірус хвороби Ньюкасла (ВХН). Ньюкасла були позитивними, тоді як у Інгібуючу дію N-(9-флуореніліден)-N'досліджуваних зразках та в контрольні з аміксином ізонікотиногідразиду (Флуренізид) на вірус хвороби - негативними. Ньюкасла, штам La Сота досліджено в системах in Порівняльні дані антивірусної дії in ovo vitro та in o vo. Ін фекційний титр 5,5 lg ТЦД50. Дози досліджуваних препаратів на репродукцію вірусу 50 і 100 ТЦД (ВХН). хвороби Ньюкасла наведені у таблиці 4. Антивір усну дію N-(9-флуореніліден)-N'Зниження інфекційного титру при 50 і 100 ТЦД ізонікотиногідразиду (Флуренізид) вивчали вірусу хвороби Ньюкасла доказує ефективну дію відповідно до стандартної методики. N-(9-флуореніліден)-N'-ізонік6тиногідразиду Препаратом порівняння вибрано Аміксин. (Флуренізид) in ovo на репродукцію ВХН. Пробірки щоденно досліджували мікроскопічно на наявність ЦПД. Протягом 96 год у дослідних зразках та у контролі з Аміксином ЦПД не було; 7 81084 8 Таблиця 4 Порівняльні дані антивірусної дії досліджуваних препаратів на репродукцію вірусу хвороби Ньюкасла in ovo Назва препаратів Аміксин - еталон за структурою і дією Флуренізид (N-(9флуореніліден)-N'ізонікотиногідразид) Концентрація препаратів, мґ/емб. Ефективність препаратів in ovo при інфікуванні біосистеми вірусом хвороби Ньюкасла, штам La Соmа 50 ЕІД50 100ЕІД50 показник зниження показник зниження захисту, lg титру вірусу захисту, lg ІД 50 титру вірусу ІД50 1,6 3,40 2,10 4,82 0,68 1,6 3,35 2,15 4,78 0,72 Показники антивірусної дії N-(9-флуореніліден)-N'ізонікотиногідразиду (Флуренізид) на репродукцію вірусу грипу птахів у системах in vitro та in ovo перевищують такі для аміксину - еталону за структурою та дією. Таким чином, задачу, поставлену за основу винаходу, вирішує N-(9-флуореніліден)-N’ізонікотиногідразиду (Флуренізид), який дозволяє розширити спектр противірусних препаратів для потреб ветеринарної медицини. Вперше встановлено антивірусну дію in vitro та in ovo флуренізиду щодо РНК-ґеномних вірусів: вірусу грипу птиці і вірусу хвороби Ньюкасла. Література: 1. Ме ханизмы антивирусного действия производных адамантана / М.К.Индулен, В.А.Калныня, Г.М.Рязанцева, В.И.Бубович // Под ред. М.К.Индулен. - Рига: Зинатне, 1981.-168 с. 2. Пат. 23628 А, Україна, МКВ А61КЗ 9/118. Супозиторії хламіциду для лікування генітальних форм хламідіозів у корів / Косенко М.В., Петрух Л.І., Авдосьєва І.К., Лук'янчук О.В., Петрух А.В., Смольська У.І.// заявл. 05.12.96; опубл. 31. 08. 1998.-Бюл.№4,1998. 3. Петрух Л.І. Інноваційні продукти й оригінальний український препарат Флуренізид. Проблеми. Пошук. Рішення. - Науково-практичний журн. Фармаком, 2005. - № 4. - С. 67-73. 4. Петрух Л.І. Флуренізид для ветеринарної практики // Матер. Міжнародної науково-практ. конф. "Сучасні проблеми ветеринарної медицини, зооінженерії та технологій продуктів тваринництва". - Львів, 1997. - С. 216-217. 5. Перший Г.Н., Богданова Н.С. Химиотерапия вирусных ин фекций. - М.: Медицина, 1973. - 143 с. 6. Рестр галузевих нововведень 173/15/01. Флуренізид - новий оригінальний український препарат протитуберкульозної та протимікробної дії / В.М.Борис, Л.І.Петрух, О.А. Ткач, О.П.Шило, Н.Р.Гречуха. К.Д.Мажак, Л.І.Ільницька. 7. Супозиторії хламіциду - ефективний препарат при генітальних формах хламідіозу корів / М.В.Косенко, Л.І.Петрух, І.К.Авдосьєва, В.О.Лук'янчук, В.В. Регенчук, М.М. Піскун // Ветеринарна медицина України. - 2001. - № 5. - С. 35.