Спосіб одержання субстанції меланіну

Спосіб одержання субстанції меланіну, що передбачає використання як продуцента гриба Inonotus obliquus (чага), складається з приготування посівного матеріалу на 3 al. Melanin Complex from Medicinal Mushroom Inonotus obliquus (Pers.: Fr.) Pilat (Chaga) (Aphyllophoracetideae) //International Journal of Medicinal Mushrooms, V. 4, P. 139]. Гриб вирощували глибинним способом на рідкому середовищі, у яке як стимулятори синтезу меланінових пігментів додавали іони міді, пирокатехол і тирозин. Максимальний вихід меланінових пігментів (сумарно в культуральній рідині й у міцелії) при цьому складав 4,16г/л культуральноі рідини. Найбільш близьким по результату, що досягається, є спосіб виробництва меланіну при використанні штаму гриба Aspergillus niger БМП97/2 [патент BY 5057 С1, С12 N 1/14, 2003]. Гриб є факультативним анаеробом, росте в інтервалі температур від 18 до 40°С. Оптимальна температура для росту культури - 28°С, біосинтезу меланіну - 37°С. Оптимальний рН - 6,5±0,5. Синтезує меланін усередині та поза клітиною. Ферментацію культури ведуть в анаеробних умовах при температурі 37±1°С протягом 20 діб. Тривалість усього циклу одержання меланінової субстанції - 48 діб. Одержують 20г/л меланіну технічного, після розчинення якого в 40% розчині їдкого натру, нейтралізації і сушіння одержують 8г/л субстанції меланіну. Однак спосіб має ряд недоліків: - тривалий процес одержання посівного спорового матеріалу гриба (два пересівання по 14 доби) - всього 28 доби; - тривалий період ферментації культури гриба (20 доби); - анаеробні умови культивування, що ускладнює технологічність процесу вирощування культури; - синтез меланіну при високій температурі 37±1°С; - використання культури, яка утворює велику кількість спор, що забруднює навколишнє середовище і може викликати алергію в працюючих; гриба, який використовується для - вид одержання меланіну, відомий як умовно патогенний і токсиноутворюючий і може за певних умов (сприятливе середовище перебування; знижений імунітет у працюючих, спонтанні мутації гриба) викликати аспергильози дихальних шляхів і ін. органів, токсикози. Найбільш близьким за технічною сутністю є спосіб одержання меланінового комплексу з міцелію і культуральної рідини Inonotus obliquus [V.G. Babitskaya, V.V. Scherba et. al. Melanin Complex from Medicinal Mushroom Inonotus obliquus (Pers.: Fr.) Pilat (Chaga) (Aphyllophoracetideae) //International Journal of Medicinal Mushrooms, V. 4, P. 139]. Гриб вирощували при температурі 25°С на качалочних колбах на рідкому середовищі, до якого додавали як стимулятори синтезу меланинових пігментів іони міді, пирокатехол і тирозин. Тривалість процесу одержання меланінів 29-35 доби. Максимальний вихід меланінових пігментів (сумарно в культуральній рідині й у міцелії) при цьому складав 4,16г/л культуральної рідини. Недоліками цього способу є тривалість процесу одержання субстанції меланіну і відносно невисокий вихід кінцевого продукту. 82960 4 В основу винаходу способу одержання субстанції меланіну поставлена задача удосконалення способу, у якому шляхом нового використання фотозахисних властивостей меланінів, синтезованих грибом Inonotus obliquus, нових режимів підготовки процесу ферментації, порядку здійснення операцій і режиму їхнього ведення, забезпечується скорочення тривалості одержання субстанції меланіну і збільшення виходу кінцевого продукту. Для забезпечення вирішення задачі Спосіб одержання субстанції меланіну передбачає використання як продуцента гриба Inonotus obliquus (чага), що включає приготування посівного матеріалу на агаризованому пивному суслі, приготування інокулюму на рідкому середовищі, культивування та стимуляцію росту продуцента.в способі є те, що при приготуванні Новим посівного матеріалу для стимуляції росту продуцента застосовують опромінення гриба червоним світлом (довжина хвилі 660нм) у дозі 230мДж/см2; а при приготуванні інокулюму на рідкому середовищі, культивування ведуть поверхнево на рідкому середовищі при опромінюванні червоним світлом (довжина хвилі 660нм) інтенсивністю 10мкмоль м-2 с-1, а потім гомогенізують; здійснюють глибинне культивування, яке ведуть при опромінюванні синім світлом - (довжина хвилі 488нм) інтенсивністю 10мкмоль м-2 с-1 протягом усього періоду ферментації. режими здійснення способу Нові операції і застосування виявлених емпіричним шляхом фотозахисних властивостей меланінів, синтезованих грибом Inonotus obliquus, дозволяють поліпшити технічні характеристики способу одержання субстанції меланіну: на 10 діб скорочується тривалість одержання субстанції меланіну і вихід кінцевого продукту збільшується в 2,65Сутність рази. винаходу, що заявляється, пояснюється прикладами (табл. 1). В наведених нижче прикладах поставлена задача вирішувалася шляхом спеціальної підготовки інокулюма гриба й активації світлом у спеціально підібраних режимах фотозахисних властивостей гриба. У результаті цього відбувається збільшення швидкості і кількості накопичення біомаси і синтезу меланінової субстанції, що виконує фотозахисні функції в різних живих організмів. Посівний міцелій вирощували на агаризованому пивному суслі (8°) у чашках Петрі 8 доби. Вирослий міцелій опромінювали червоним світлом (660нм) у дозі 230мДж/див2 для прискорення його росту на наступних етапах культивування. Для одержання інокулюма в рідке поживне середовище (рН 6,07,0) Глюкоза такого складу (г/л): 30 КН2РО4 1,0 К2НРО4 1,0 MgSO4 0,25 (NH4 )2SO4 1,4 Пептон 3,0 CuSO4*5H2O 0,08 Тирозин 0,2 Тіамін 300мкг Кукурудзяний екстракт 2,0мол 5 Вода дистильована до 1,0л стерильно поміщали нарізані спеціальним свердлом агарові диски (діаметр 1см) з активізованим міцелієм гриба, вирощеним вищевказаним способом на чашках Петрі, з розрахунку 5 дисків на 100мл середовища. Культивування проводили поверхневим способом при температурі 25°С. Протягом всього періоду вирощування гриба поверхню середовища опромінювали червоним світлом (660нм) низької інтенсивності - 10мкмоль м-2 с-1. Далі отриману біомасу гриба разом з культуральною рідиною поміщали в стерильний гомогенізатор і гомогенізували до одержання однорідної суспензії. Отриманим інокулятом (5%) засівали рідке ферментаційне середовище вищевказаного складу. Культивування вели глибинним способом у колбах Ерленмейєра об'ємом 750мл з 150мл середовища на круговий качалці при 180 про/хв. при опроміненні синім світлом довжиною хвилі 488нм і інтенсивністю 10мкмоль м-2с-1. Приклад 1. Контроль 1. Посівний міцелій вирощували на агаризованому пивному суслі (8°) у чашках Петрі. Для одержання інокулюму в рідке поживне середовище (рН 6,0-7,0) зазначеного вище складу стерильно поміщали нарізані спеціальним свердлом агарові диски (діаметр 1см) з міцелієм гриба, вирощеним вищевказаним способом на чашках Петрі, з розрахунку 5 дисків на 100мл середовища. Культивування проводили поверхневим способом при температурі 25°С. Далі отриману біомасу гриба разом з культуральної рідиною поміщали в стерильний гомогенізатор і гомогенізували до одержання однорідної суспензії. Отриманим інокулятом (5%) засівали рідке ферментаційне середовище вищевказаного складу. Культивування вели глибинним способом у колбах Ерленмейєра обсягом 750млл з 150мл середовища на круговий качалці при 180 об/хв.- 10 Тривалість одержання посівного міцелію діб; інокулюма - 10 діб; ферментація - 10 діб, весь період одержання субстанції меланіну - 30 діб. Швидкість накопичення біомаси - 0,67г/л/добу. Вміст субстанції меланіну в 1л культуральной рідини - 6,05г/л. Приклад 2. Дослід 1. Біотехнологічний процес одержання субстанції меланіну проводять так само, як і в контролі (приклад 1), тільки посівний міцелій гриба, що виріс на агаризованому середовищі, перед перенесенням в рідке середовище опромінювали червоним світлом з довжиною хвилі 660нм у дозі 230мДж/см2. Тривалість одержання посівного міцелію - 8 діб; інокулюму - 6 діб; ферментація - 8 діб, весь період одержання субстанції меланіну - 22 доби. Швидкість накопичення біомаси - 0,82г/л/добу. Вміст субстанції меланіну в 1л культуральної рідини - 6,89г/л, % збільшення субстанції меланіну - 13,88 Приклад 3. Дослід 2. Біотехнологічний процес одержання субстанції меланіну проводять так само, як і в контролі (приклад 1), тільки посівний міцелій гриба, що виріс на агаризованому середовищі перед перенесенням в рідке середовище опромінювали червоним світлом з довжиної хвилі 660нм у дозі 230мДж/см2 і протягом 82960 6 усього періоду одержання інокулюму на рідкому середовищі (довжина хвилі 660нм, інтенсивність 10мкмоль м-2с-1) Тривалість одержання посівного міцелію - 8 діб; інокулюму - 6 діб; ферментація - 6 діб, весь період одержання субстанції меланіну - 20 доби. Швидкість накопичення біомаси - 1,25 г/л/добу. Вміст субстанції меланіну в 1л культуральної рідини - 8,53г/л, % збільшення субстанції меланіну - 40,76 Приклад 4. Дослід 3. Біотехнологічний процес одержання субстанції меланіну проводять так само, як і в контролі (приклад 1), тільки посівний міцелій гриба опромінювали на агаризованому середовищі (довжина хвилі 660нм у дозі 230мДж/див2), протягом усього періоду одержання інокулюму на рідкому середовищі (довжина хвилі 660нм, інтенсивність - 10мкмоль м-2 з-1) і протягом усього процесу ферментації (довга хвилі 488нм і інтенсивністю 10мкмоль м-2с-1). Тривалість одержання посівного міцелію - 8 діб; інокулюму - 6 діб; ферментація - 6 діб, весь період одержання субстанції меланіну - 20 доби. Швидкість накопичення біомаси - 1,87г/л/добу. Вміст субстанції меланіну в 1л культуральної рідини - 10,5г/л, % збільшення субстанції меланіну - 66,12. Приклад 5. Дослід 4. Біотехнологічний процес одержання меланіну субстанції проводять так само, як і в контролі (приклад 1), тільки посівний міцелій гриба, що виріс на агаризованому середовищі перед перенесенням в рідке середовище опромінювали червоним світлом з довгої хвилі 660нм у дозі 230мДж/див2 і) і протягом усього процесу ферментації (довга хвилі 488нм і інтенсивністю 10мкмоль м-2с-1. Тривалість одержання посівного міцелію - 8 діб; інокулюма - 8 діб; ферментація - 6 діб, весь період одержання субстанції меланіну - 22 доби. Швидкість накопичення біомаси - 0,94г/л/добу. Вміст субстанції меланіну в 1л культуральной рідини - 9,17г/л, % збільшення субстанції меланіну - 51,57. Приклад 6. Дослід 5. Біотехнологічний процес одержання субстанції меланіну проводять так само, як і в контролі (приклад 1), тільки культуру гриба опромінювали протягом усього періоду одержання інокулюму на рідкому середовищі (довжина хвилі 660нм, інтенсивність - 10мкмоль м2 -1 с ) Тривалість одержання посівного міцелію - 10 діб; інокулюму - 8 діб; ферментація - 8 діб, весь період одержання субстанції меланіну - 26 доби. Швидкість накопичення біомаси - 1,07г/л/добу. Вміст субстанції меланіну в 1л культуральної рідини - 7,34г/л, % збільшення субстанції меланіну - 21,32. Приклад 7. Дослід 6. Біотехнологічний процес одержання субстанції меланіну проводять так само, як і в контролі (приклад 1), тільки культуру гриба опромінювали протягом усього процесу ферментації (довга хвилі 488нм і інтенсивністю 10мкмоль м-2с-1). Тривалість одержання посівного міцелію - 10 діб; інокулюму - 10 діб; ферментація - 6 діб, весь період одержання субстанції меланіну - 26 доби. 7 82960 Швидкість накопичення біомаси - 0,76г/л/добу. Вміст субстанції меланіну в 1л культуральної рідини - 8,07г/л, % збільшення субстанції меланіну - 33,39. Приклад 8. Дослід 7. Біотехнологічний процес одержання субстанції меланіну проводять так само, як і в контролі (приклад 1), тільки культуру гриба опромінювали протягом усього періоду одержання інокулюму на рідкому середовищі (довжина хвилі 660нм, інтенсивність - 10мкмоль м2 с-1) і протягом усього процесу ферментації (довжина хвилі 488нм і інтенсивністю 10мкмоль м2 -1 с ). ривалість одержання посівного міцелію - 10 Т доби; инокулюма - 8 доби; ферментація - 6 доби, весь період одержання меланинсодержащей субстанції - 24 доби. Швидкість нагромадження біомаси - 0,99г/л/доба. Зміст субстанції меланіну в 8 1л культуральної рідини - 8,11г/л, % збільшення субстанції меланіну - 34,05. Приклад 9. Дослід 8. Біотехнологічний процес одержання субстанції меланіну проводять так само, як і в Прикладі 4 Досліді 3. Відмінністю є тільки те, що інокулюм гриба вирощують не поверхнево на рідкому середовищі, а глибинним способом у колбах Ерленмейєра обсягом 750мл з 150мл середовища на круговий качалці при 180 об/хв. Тривалість одержання посівного міцелію - 8 діб; інокулюму - 8 діб; ферментація - 6 діб, весь період одержання субстанції меланіну - 22 доби. Швидкість накопиченя біомаси - 1,27г/л/добу. Зміст субстанції меланіну в 1л культуральної рідини 8,21г/л, % збільшення субстанції меланіну - 39,70. Результати представлені в таблицях. Таблиця 1 Варіанти світлової обробки міцелію при одержанні Триваліст Швидкість Меланін, % Варіанти субстанції меланіну ь проце- накопичен г/л збільшен ня біоня На У процесі Протягом усього су, доба маси, агаризованому одержання інокупроцесу г/л/добу середовищі, люму на рідкому ферментації (довжина хвилі середовищі (дов- (довжина хвилі 660нм у дозі жина хвилі 488нм, інтенсив230мДж/см2 660нм, інтенсив- ність 10мкмоль ність - 10мкмоль м-2 с-1. -2 -1 м (10) ) - (10) - с - (10) 30 0,67 6,05 Контроль 1 + (8) - (6) - (8) 22 0,82 6,89 13,88 Дослід 1 + (8) + (6) - (6) 20 1,25 8,53 40,76 Дослід 2 + (8) + (6) + (6) 20 1,87 10,5 66,12 Дослід 3 + (8) - (8) + (6) 22 0,94 9,17 51,57 Дослід 4 - (10) + (8) - (8) 26 1,07 7,34 21,32 Дослід 5 - (10) - (10) + (6) 26 0,76 8,07 33,39 Дослід 6 - (10) + (8) + (6) 24 0,99 8,11 34,05 Дослід 7 Примітка: у дужках тривалість етапу одержання субстанції меланіну, доба; (+) - світлова обробка проводилась; (-) - світлова обробка не проводилась Таблиця 2 Тривалість вирощування на агаризованому середовищі, доба Тривалість одержання інокулюму, доба Тривалість ферментації (одержання субстанції меланіну), доба Тривалість усього процесу одержання субстанції меланіну, доба Температура культивування Загальний вихід субстанції меланіну, г/л Комп’ютерна верстка В. Клюкін Новий спосіб одержання меланіну 8 Прототип 1 Прототип 2 10 14 6 6 10 10 14 20 20 зо 48 25°С 10,9 25°С 4,16 37°С 8,0 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601