Спосіб отримання діагностичної гіперімунної сироватки крові до метапневмовірусу птиці

Реферат: Спосіб отримання діагностичної гіперімунної сироватки крові до метапневмовірусу птиці 3 шляхом підшкірного введення кролям антигену в області стегон та лопаток в об'ємі 1 см та наступного відбору крові із серця через 14 діб після останнього введення антигену. Тваринам на 1, 8, 15 та 29 добу вводять суміш антигену польового ізоляту МПВ - PV-3 з неповним ад'ювантом Фрейда у рівних об'ємах та додатково - сполуку супроводу з імуномодулюючою активністю морфолінію 2-(5-(піридил-4-іл)-4-(2-метоксифеніл)-1,2,4-триазол-3-ілтіо)ацетат 3 внутрішньом'язево по 1 см . UA 83484 U (12) UA 83484 U UA 83484 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до ветеринарної імунології, вірусології, епізоотології та біотехнології, зокрема до способів одержання специфічних імунних сироваток, і може використовуватися у діагностиці метапневмовірусної інфекції (МПВІ) птиці. Серологічна діагностика (МПВІ) є найбільш поширеною як у аспекті ретроспективного відстеження можливих спалахів захворювання, так і оцінки ефективності специфічної профілактики захворювань сільськогосподарських птахів. Існує ряд способів отримання гіперімунної сироватки для реалізації діагностики. D. Rubbenstroth (2009) отримував гіперімунну сироватку із титром віруснейтралізуючих антитіл 7-9,6 log2 на 56-добових індичатах. В якості антигену було використано живу вакцину зі 5.0 3 штаму 8544 інтраокулярно в дозі 10 ТЦД50/см . У 90-120 добовому віці додатково індичатам 3 уводили внутрішньом'язово інактивовану вакцину зі штаму 8544 МПВ у дозі 0,5 см . Через 7 діб після останнього введення індичат знекровлювали для отримання сироватки, яку зберігали за температури – 70 °C (Rubbenstroth D. Investigations on the protective role of passively transferred antibodies against avian Metapneumovirus (Ampv) infection in turkeys / D. Rubbenstroth [et al.] // Avian Pathol.-2009. - №38.-Vol. 6. - P.427-436). Така методика спрямована на отримання високого титру віруснейтралізуючих антитіл до вакцинного штаму МПВ, є достатньо тривалою, потребує більшої кількості птиці для отримання необхідного об'єму сироватки крові. Найбільш близьким до пропонованої корисної моделі за технічною суттю та результатом, що досягається, є спосіб, який полягає в отриманні гіперімунної сироватки на кролях з використанням як антигену інактивованої вакцини зі штаму 8544, підтип A Nobilis TRT для використання у РДП з титром антитіл від 1:8 до 1:64. Антиген вводять підшкірно в ділянці стегон -1 та лопаток, в об'ємі 1 см . Відбір крові здійснюють із серця через 14 діб після останнього введення антигену (Оптимізація схеми гіперімунізації кролів до пташиного метапневмовірусу та первинна детекція вакцинного штаму МПВ у РДП / Ю.О. Ховяков // Збірник наук. праць Луганського національного аграрного університету. - Луганськ.-2007.-С. 650-654). Спільними суттєвими ознаками прототипу і корисної моделі, що заявляється, є наступні: - тваринами-продуцентами є кролі; 3 - підшкірне введення антигену в області стегон та лопаток, в об'ємі 1 см ; - відбір крові із серця через 14 діб після останнього введення антигену. Однак такий спосіб має певні недоліки, а саме, сироватки, отримані зазначеним чином, мають нижчий титр преципітуючих специфічних антитіл, тварин при реалізації такої методики піддають додатковому навантаженню антигенами, що робить спосіб занадто довгим, коштовним, отримана сироватка не завжди є достатньо ефективною. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу отримання діагностичної гіперімунної сироватки крові до метапневмовірусу (МПВ) птиці шляхом використання як антигену епізоотичного штаму МПВ PV-3 із додатковим одночасним введенням сполуки триазолінового ряду морфолінію 2-(5-(піридил-4-іл)-4-(2-метоксифеніл)-1,2,4-триазол-3ілтіо)ацетат як такої, що має імуномодулюючу активність, під час імунізації тварин-продуцентів, що забезпечить підвищення діагностичної ефективності отриманої сироватки внаслідок підвищення титру преципітуючих антитіл. Поставлена задача вирішується тим, що у способі, який полягає у підшкірному введенні 3 кролям антигену в області стегон та лопаток в об'ємі 1 см та наступному відборі крові з серця через 14 діб після останнього введення антигену новим є те, що тваринам на 1, 8, 15 та 29 добу вводять суміш антигену польового ізоляту МПВ - PV-3 з неповним ад'ювантом Фрейда у рівних об'ємах та додатково - сполуку супроводу з імуномодулюючою активністю морфолінію 2-(53 (піридил-4-іл)-4-(2-метоксифеніл)-1,2,4-триазол-3-ілтіо)ацетат внутрішньом'язово по 1 см . Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає у такому. Сполука супроводу морфолінію 2-(5-(піридил-4-іл)-4-(2-метоксифеніл)-1,2,4-триазол-3ілтіо)ацетату має імуномодулюючу активність, завдяки чому зменшується необхідність у додатковому навантаженні тварин антигенами. Гіперімунна сироватка, отримана запропонованим способом, має високий титр преципітуючих антитіл та скорочує термін гіперімунізації на 6-8 тижнів. Морфолінію 2-(5-(піридил-4-іл)-4-(2-метоксифеніл)-1,2,4-триазол-3ілтіо)ацетат додатково впливає на підвищення неспецифічної резистентності організму, таким чином взагалі підвищується стійкість організму до вірусних захворювань. Використаний польовий ізолят МПВ (метапневмовірусу) та сполуки триазолінового ряду підвищують як титр преципітуючих специфічних антитіл, так і якість реакції імунної дифузії. 1 UA 83484 U 5 10 15 20 25 Спосіб здійснюють таким чином. Приклад Ізолят МПВ PV-3 після культивування в культурі клітин Vero піддавали очищенню та концентрації сульфатом амонію та ПЕГ-600. Як тварин-продуцентів використовували кролів. Гіперімунізацію кролів проводили очищеним антигеном МПВ - PV-3. Вірусний матеріал змішували з неповним ад'ювантом Фрейда (НАФ) у 3 рівних об'ємах і вводили кролям підшкірно в дозі 1 см у ділянці лопаток та стегон, а сполуку супроводу морфолінію 2-(5-(піридил-4-іл)-4-(2-метоксифеніл)-1,2,4-триазол-3-ілтіо)ацетат 3 вводили внутрішньом'язово по 1 см . Зазначені субстанції уводили на 1, 8, 15 та 29 добу. Через 14 діб після останнього введення антигену кролів знекровлювали і отриману сироватку зберігали за температури -20 °C. Визначення рівня антигену у гіперімунній сироватці та індикацію МПВ у вірусутримуючих зразках проводили у реакції дифузної преципітації (РДП) в агаровому гелі, використовуючи 1,5 % концентрацію агару, пофарбованого метилоранжем та консервованого мертіолятом натрію. Розплавлений на водяній бані агар заливали у чашки Петрі завтовшки 3 мм, після чого пробійником в агарі робили отвори діаметром 5 мм. Інкубацію проводили за температури +37 °C у вологій камері впродовж 24 годин. За позитивну реакцію вважали утворення смуги преципітації між лунками в агарі з антигеном і сироваткою, що мала вигляд прямої одинарної лінії. Відсутність лінії вважали за негативний результат. Специфічність сироватки крові, отриманої до МПВ, встановлювали у перехресній РДП із вакцинним штамом Ла-Сота, вірусу Ньюкаслської хвороби та неінфікованими зразками екстраембріональної рідини куриних ембріонів, культуральної рідини клітин Vero та фібробластах перепелиних ембріонів. Гіперімунна сироватка, отримана на фоні використання сполуки супроводу морфолінію 2-(5(піридил-4-іл)-4-(2-метоксифеніл)-1,2,4-триазол-3-ілтіо)ацетату, специфічно реагувала із антигеном МПВ PV-3, виявляючи його титр на рівні 7 Iog2. Таким чином, спосіб є високоефективним і дозволяє виявляти вірус як у нативному вірусутримуючому матеріалі, так і після культивування у різних біологічних системах. 30 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 Спосіб отримання діагностичної гіперімунної сироватки крові до метапневмовірусу птиці шляхом 3 підшкірного введення кролям антигену в області стегон та лопаток в об'ємі 1 см та наступного відбору крові із серця через 14 діб після останнього введення антигену, який відрізняється тим, що тваринам на 1, 8, 15 та 29 добу вводять суміш антигену польового ізоляту МПВ - PV-3 з неповним ад'ювантом Фрейда у рівних об'ємах та додатково - сполуку супроводу з імуномодулюючою активністю морфолінію 2-(5-(піридил-4-іл)-4-(2-метоксифеніл)-1,2,4-триазол3 3-ілтіо)ацетат внутрішньом'язово по 1 см . 40 Комп’ютерна верстка М. Ломалова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2