Спосіб концентрації вірусів із рідких середовищ

1. Спосіб концентрації вірусів із рідких середовищ, що складається з розміщення сорбенту у пробі рідкого вірусовмісного середовища, витри C2 2 83942 1 3 83942 приготовлених безпосередньо перед застосуванням, розчинів 2% HCI та 10% NaCI. Тривалість обробки 24 години. Після цього смолу відмивають дистильованою водою до нейтрального рН=7,0. Перед концентруванням pH досліджуваної проби води (5 або 10л) доводять до значень 5,5-6,0. Підготовленим сорбентом заповнюють колонку діаметром 1,2-1,3см товщиною шару сорбенту 10-12см. Колонку урівноважують розчином суспензії смоли з рН=5,5-6,0. Пробу води (5л) пропускають через колонку із швидкістю 10-12мл/хв. Тривалість концентрування - 12-16 год. Після закінчення концентрування здійснюють десорбцію вірусів із смоли за допомогою фосфатного буферу. Недоліками цього способу с тривалість підготовки сорбенту, додаткове застосування колонки, тривалість процесу концентрування 12-16 год., застосування великого об'єму води - 5л. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб концентрування ентеровірусів із води за допомогою природних сорбентів, а саме, 5% гелю бентоніту [Широбоков В.П., Гирин В.Н., Якименко А.И. и др. Применение бентонита для выявления энтеровирусов у человека и во внешней среде. // Методические рекомендации. Киев, 1986, 23с]. Схема концентрації ентеровірусів із водного середовища наведена в таблиці №1. Спосіб виконується так. Сухий бентоніт диспергують у деіонізованій воді. Для переведення бентоніту у натрієву форму до суспензії додають вуглекислий натрій. Суміш залишають на одну добу при кімна 4 тній температурі для набухання, після чого суміш кип'ятять протягом 1 години. Охолоджену суміш центрифугують 10 хвилин при 3000об./хв., надосад зливають, а осад ресуспендують в 1л дистильованої води і центрифугують при 4000об./хв. протягом 20 хвилин. Надосадовий розчин видаляють. Відбирають приблизно 2/3 верхньої частини осаду, яка містить однорідну суспензію гелю бентоніту, решту суспензії видаляють. Відібрану суспензію ресуспендують віл деіонізованої води і знову центрифугують протягом 20 хвилин при 4000об./хв. Відмитий осад бентоніту заливають 3л води і струшують у штудтельапараті 3-4 години. Після цього суспензію центрифугують протягом 5 хвилин при 1000об./хв., 2/3 верхньої частини осаду відбирають, ще раз суспендують у воді, надосад декантують. Відбирають 2/3 однорідної частини гелю бентоніту, яку суспендують у 0,14M розчині хлористого натрію і знову осаджують, як вказано вище. Фракціонування повторюють тричі, збільшуючи тривалість центрифугування і видаляючи нижню частину осаду. Після такої обробки бентоніт являє собою дрібнодисперсну суспензію. її суспендують у 95 об'ємах деіонізованої води, отримуючи 5% суспензію гелю бентоніту. Одержаний гель автоклавують при 136°C протягом 20 хвилин. Термін зберігання такого гелю не обмежений. Одержаний 5% гель бентоніту використовують для концентрації вірусів із води, водних розчинів, культуральної рідини. Таблиця 1 Етап Адсорбція Знесолювання Елюція Дослідний матеріал Обробка 1) вносять 3,0г NaCl до 0,1M кон-ції; 2) вносять 0,5мл 5% гелю бентоніту; Стічна вода (250мл) 3) вносять 1M р-н HCl до рН=4,5-5,0; 4) струшування 4-5 хв.; 5) центрифугування при 3000об./хв. 7-10хв. Осад (комплекс ві- 1) вносять 10мл дист. води (рН=4,5); 2) струшування 4-5хв.; рус+бентоніт) 3) центрифугування при 3000об./хв. 7-10хв. 1) вносять 1мл 0,05М р-ну трис-буфера (рН=8,2-9,0); 2) струшування 4-5хв.; Осад(комплекс ві3) центрифугування 3000об./хв.. 10хв.; рус+бентоніт) 4) відбирають елюат, деконтамінують і досліджують на наявність у ньому вірусів чи вірусни х антигенів. Відомий спосіб включає розміщення сорбента у пробі рідкого середовища, витримування часового інтервалу з подальшим центрифугуванням проби, яка досліджується, видалення надосадової рідини, отримання комплексу вір ус+сорбент та подальшу елюцію вірусів. Недоліками способу є тривалість і трудомісткість виготовлення гелю бентоніту, нестандартизованість сорбенту, яка залежить від місця його видобування. В основу винаходу покладене завдання удосконалення способу концентрації вірусів із рідких середовищ, в якому використання гідрогелю метилкремнієвої кислоти скорочує тривалість і трудомісткість способу, забезпечує точність проведення способу та підвищення відсотку виявлення вірусів при дослідженні різноманітних рідких сере довищ. Поставлене завдання вирішується тим, що в способі концентрації вірусів із рідких середовищ, що складається з розміщення сорбенту у пробі рідкого середовища, витримування часового інтервалу з подальшим центрифугуванням проби, що досліджується, видалення надосадової рідини, отримання комплексу вірус+сорбент та подальшої елюції вірусів, згідно з винаходом, у якості сорбенту використовують гідрогель метилкремнієвої кислоти (ГГМКК), що має адсорбційні властивості відносно біологічних об'єктів вірусної природи, часовий інтервал витримують від 20 хвилин до 24 годин за температури від + 4°C до + 22°C, а отримання комплексу вірус+сорбент здійснюють без проведення етапу обезсолювання. 5 83942 Згідно з винаходом, ГГМКК, який здатний в концентрації не менше 30мг/мл адсорбувати не менше 96% вірусних частин із водних середовищ, розміщують у пробі водного середовища, при цьому досліджувану пробу підкислюють розчином кислоти до pH = 5,0. Згідно з винаходом, ГГМКК, який здатний в концентрації не менше 2мг/мл адсорбувати не менше 90% вірусних частин із біологічних середовищ, розміщують у пробі біологічного середовища. Заявники винаходу є винахідниками і заявниками способу отримання сорбенту на основі гідрогелю метилкремнієвої кислоти [заявка №а200610083], в якому, завдяки новому способу отримання, вказаний сорбент має питомий об'єм пор не менше ніж 0,8см 3/г та виявляє високу адсорбційну дію по відношенню до речовин з великою молекулярною масою (5кД-900кД) та різних біологічних об'єктів, в тому числі вірусної природи. Зазначений спосіб включає проведення процесу поліконденсації розчину метилсиліконату натрію або калію концентрацією 2,35-2.95моль/л шляхом додавання до нього розчину сильної кислоти до утворення гідрогелю, який витримують до визрівання, подрібнюють і активують дією розведеного розчину сильної кислоти з наступним відмиванням водою до нейтральної реакції. Додатково додають хімічні й/або біологічні добавки. При зміні кількості молекул води (після диспергування й наступної гомогенізації суміші) одержують суспензійну або пастоподібну, або порошкоподібну (після висушування продукту до постійної маси) форму продукту). Гідрогель метилкремнієвої кислоти - це новий ефективний сорбент, що має глобулярну стр уктуру пористої кремнійорганічної матриці. На її поверхні присутні гідроксильні групи, завдяки чому поверхня глобул і пор активно сольватується полярними молекулами води, та метильні групи, що обумовлюють гідрофобні властивості та спорідненість до тканин та біосубстратів організму. Сорбент ГГМКК цілком безпечний, має високу селективність, адсорбційна ємкість за конто червоним сягає 3,03,5мг/г (або 4,5-5,0мкмоль/г). Використовується як сорбент у різних галузях медицини і ветеринарії. Мета винаходу полягає у підвищенні ефективності концентрації вірусів із проб рідких середовищ, зменшення стадій у процедурі виконання, зменшення часу концентрування, надання можливості концентрації вірусів з мінімальних об'ємів рідких середовищ, використання для концентрування готової речовини (сорбенту), склад та якість якої гарантується відповідною ФС та ТУ. Спосіб виконується наступним чином. ГГМКК, отриманий по способу за заявкою №а200610083, який має адсорбційні властивості відносно біологічних об'єктів вірусної природи, розміщують у пробі рідкого середовища і витримують від 20 хвилин до 24 годин за температурою від + 4°С до + 22°С. ГГМКК, здатний у концентрації 30мг/мл адсорбувати не менше 96% вірусних частин із водного середовища, розміщують у пробі водного середовища і також у пробі біологічного середовища, забрудненого вірусами. Проводять адсорбцію вірусів, після чого ГГМКК концентрують центрифугуванням і видаляють надосадову рідину. Далі проводять 6 елюцію вірусів і відділяють ГГМКК від розчину центрифугуванням. В надосадовій рідині проводять індикацію та ідентифікацію вірусів. Приклад 1. Концентрація вірусів із проб стічної води. Спосіб виконується як описано в п.п.1,2, при цьому пробу води (500мл попередньо освітленої стічної води) підкислюють за допомогою 1М HCI до pH = 5,0, в підкисленій пробі розміщують сорбент ГГМКК у кількості 1г і витримують 20 хвилин при температурі 20°C. Після експозиції пробу з сорбентом центрифугують при 1000об./хв. протягом 20 хвилин. Надосадову рідину видаляють і отримують комплекс вірус+сорбент, процес знесолювання відсутній. Приклад 2. Концентрація вірусів із проб питної води. Спосіб виконується як описано в п.п.1,2, при цьому пробу води підкислюють за допомогою 1M HCI до рН=5,0, в підкисленій пробі (10л питної води) розміщують сорбент ГГМКК у кількості 20г і витримують до 20 годин при температурі 20°C, надосад обережно зливають через край, залишають на дні скляного посуду 200мл нещільного білого осаду. Отриманий осад (осад+невелика кількість надосаду) струшуютьі переносять в центрифужні склянки або флакони по 250мл і центрифугують при 1000об./хв. протягом 20 хвилин. Білий осад, що утворився, також нещільний, тому надосадову рідину знову зливають через край, залишаючи на дні флакону 20мл. Цей осад струшують, переносять у дві центрифужні пробірки і повторно центрифугують. Після другого центрифугування щільний осад формується на дні пробірок, надосадову рідину видаляють пастерівскою піпеткою і отримують комплекс вірус+сорбент, процес знесолювання відсутній. Пример 3. Концентрація вірусів із проб води відкритих водойм і підземних джерел. Спосіб виконується як описано в п.п. 1,2, при цьому пробу води (2л) підкислюють за допомогою 1M HCI до рН=5,0, в підкисленій пробі розміщують сорбент ГГМКК у кількості 4г і витримують до 20 хвилин при температурі 20°C. Після експозиції пробу з сорбентом центрифугують при 1000об/хв. протягом 20 хвилин. Надосадову рідину видаляють і отримують комплекс вірус+сорбент, процес знесолювання відсутній. Приклад 4.1. Концентрація вірусів із проб культуральної рідини. Спосіб виконується як описано в п.п. 1,3, при цьому до культуральної вірусвмісної рідини (KBP), що містить ротавірус мавп SA-11 з інфекційним титром 7,5 Ig ТЦД 50/мл, додають сорбент ГГМКК із розрахунку 2мг на 1мл рідини. Формування комплексу ротавірус+сорбент проводять при температурі 20°C протягом 10 годин при періодичному перемішуванні. Утворений комплекс ротавірус+сорбент видаляють низькошвидкісним центрифугуванням. В надосадовій рідині відсутність вірусу контролюють визначаючи інфекційний титр ротавірусу титр уванням за ЦПД в чутливій культурі клітин. Результати виконання способу представлені в таблиці 2. Приклад 4.2. Спосіб виконують як у прикладі 7 83942 4.1., але ГГМКК розміщують у культуральній рідині з розрахунку 1,5мг/мл. Результати виконання способу представлені в таблиці 2. Приклад 4.3. Спосіб виконують як у прикладі 4.1., але ГГМКК розміщують у культуральній рідині з розрахунку 2,5мг/мл. Результати виконання способу представлені в таблиці 2. Приклад 4.4. Спосіб виконують як у прикладі 4.1., але ГГМКК розміщують у культуральній рідині з розрахунку 5,0мг/мл. Результати виконання способу представлені в таблиці 2. Приклад 4.5. Спосіб виконують як у прикладі 4.1., але ГГМКК розміщують у культуральній рідині з розрахунку 10,0мг/мл. Результати виконання 8 способу представлені в таблиці 2. Приклади 4.6.-4.10. Спосіб виконують як у прикладах 4.1.-4.5., але використовують культуральну рідину, що містить вірус поліомієліту II типу штам Себіна з інфекційним титром 10,5 Ig ТЦД 50/мл. Результати виконання способу представлені в таблиці 2. Приклади 5.1.-5.5. Концентрація вірусів із проб плазми крові людини. Спосіб виконують як у п.3 та прикладах 4.1.-4.5., але замість вірусвмісної рідини використовують плазму крові людини, яка містить вірус везикулярного стоматиту (ВВС), штам Індіана. Результати виконання способу представлені в таблиці 2. Таблиця Ефективність концентрації вірусів з культуральної рідини і плазми крові в залежності від кількості сорбента ГГМКК № ч/ч прикладу 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 4.6. 4.7. 4.8. 4.9. 4.10. 5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 5.5. Інфекційний титр вірусу в Інфекційний титр вірусу в Ефективність очиКонцентрація KBP до концентрації, Ig сорбента, мг/мл KBP після концентрації, щення, % ТЦД 50/мл Ig ТЦД 50/мл Концентрація ротавірусу мавп SA-11 з культуральної рідини 7,5 2,0 0,75 91,0 7,5 1,5 3,0 73,9 7,5 2,5 0,75 >91,0 7,5 5,0 91,0 7,5 10,0 0,5 >91,0 Концентрація вірусу поліомієліту II тип у штам Себіна із культуральної рідини 10,5 2,0 1,0 90,5 10,5 1,5 4,0 61,9 10,5 2,5 0,75 92,9 10,5 5,0 0,5 >93,0 10,5 10,0 0,5 >93,0 Концентрація вірусу везикулярного стоматиту штам Індіана із плазми крові 8,0 2,0 1,0 87,5 8,0 1,5 3,5 56,3 8,0 2,5 0,75 90,6 8,0 5,0 0,5