Похідні гуанідину з антимікробною дією на основі діаміну

1. Застосування полімерного похідного гуанідину на основі діаміну, який містить оксіалкіленові ланцюги між двома аміногрупами, причому похідне гуанідину являє собою продукт поліконденсації між C2 2 (13) 1 3 84418 для одержання лікарської композиції з антимікробною дією. Далі, винахід стосується застосування поліоксиалкіленових солей гуанідину. одержаних із використанням триетиленглікольдіаміну (відносна молекулярна маса 148), поліоксипропилендіаміну (відносна молекулярна маса 230), а також поліоксиетилендіаміну (відносна молекулярна маса 600). Найбільш прийнятним у якості діючої речовини є полі-[2-(етоксиетоксиетил)гуанідиній гідрохлорид], який має принаймні 3 гуанідинієві групи, із середньою молекулярною масою, зокрема, від 500 до 3000. Полімерні похідні гуанідину згідно з винаходом є відомі з РСТ/АТ01/00134. Зміст зазначеного джерела включено до цього опису як посилальний матеріал. Далі описується одержання переважного представника сполук, застосованих згідно з винаходом, а також докази його антимікробної дії. Як приклад класу сполук, застосованих згідно з винаходом, далі наводиться антимікробна дія полі-[2(етоксиетоксиетил)гуанідиній гідрохлориду]із середньою молекулярною масою 1000 (№CAS 374572-91-5). Для приготування зазначеної сполуки 4,43 моля гуанідиній гідрохлориду розчиняють у 4,03 молях триетиленглікольдіаміну при 50°C. Після того розчин нагрівають до 120°C та перемішують дві години при зазначеній температурі. Цю температуру підтримують ще 2 години, далі застосовують вакуум (0,1 бар) і продовжують перемішування під вакуумом ще дві години при 170°C. Далі суміш аерують до нормального тиску, дають охолонути до 120°C та розбавляють демінералізованою водою до приблизно 50%. її нейтралізують до рН біля 6 фосфорною кислотою, дають охолонути та розбавляють до потрібної концентрації. Молекулярна маса визначена рівною 1000. Лікарська речовина полі-[2(етоксиетоксиетил)гуанідиній гідрохлорид] посідає потрібні фармакодинамічні властивості при малій токсичності та гарній переносності з фармакологічної точки зору, отже, може використовуватися як антимікробний терапевтичний засіб. Лікарська речовина виявляє, зокрема, відмінну антимікробну дію, що можна довести випробуваннями на багатьох мікроорганізмах, таких, як мультирезистентних бактеріях (стійких до звичайних антибіотиків), грибків (бластоміцетів, дерматофітів, пліснявих грибків) та вірусів, як Herpes simplex. Завдяки швидкій мікробіцидній дії немає підстав очікувати, що розів'ється стійкість, як доводять випробування на порівняно великій кількості штамів бактерій (30 видів бактерій та 30 переносів штамів). Після (внутрішньовенного або внутрішньочеревного) системного введення полі-[2(етоксиетоксиетил)гуанідиній гідрохлориду] у кількості до 15мг/кг маси тіла за 2 години у сироватці крові щурів помічені концентрації до 100мкг/мл, причому переносність виявилася гарною. Ці концентрації значно вище, ніж потрібний рівень, якого можна чекати при терапевтичному застосуванні. Водночас навіть такі великі дози добре перено 4 сяться, випадків смерті або серйозних бічних ефектів не було. Отже, полі-[2(етоксиетоксиетил)гуанідиній гідрохлорид] може застосовуватися як антимікробний засіб. Лікарську речовину можна застосовувати у прийнятній фармаційній формі поодинці або у сполученні з неорганічними або органічними фармаційно нейтральними добавками. Цю речовину можна вживати, наприклад, як компонент мазі або розчину, причому в мазі вміст діючої речовини може становити від біля 0,01 до 5г речовини на г мазі, а у розчині концентрація може доходити до 15мг/кг маси тіла. Завдяки зазначеним сприятливим фармакологічним властивостям застосування мазі або розчину можна вважати доцільним за багатьма показами. Зокрема, у цьому відношенні треба зазначити інфекції шкіри, слизових оболонок або шлунково-кишкового тракту. У цих випадках діюча речовина згідно з винаходом може зробити великий внесок до подолання стійкості до антибіотиків. Антимікробна дія З метою оцінки антимікробної дії 334 мікроорганізми, клінічно релевантні ізоляти та штами Американської колекції типових культур піддають випробуванням на мінімальні інгібувальні концентрації (MIK). Також вивчають руйнацію патогенів (криві знищення) у залежності від часу та концентрації, а також потенціал розвитку стійкості. 1. Мікроорганізми Усього використано 323 бактерії різних видів, 10 бластоміцетів та один дерматофіт. Мікроорганізми для досліджень виділяють із дихальних шляхів, урогенітального тракту, із крові та інших біологічних матеріалів хворих у відповідності до стандартних лабораторних методик і точно визначають. 2. Дослідна речовина Зазначений полі-[С2-(2-етокси)етоксиетил)гуанідиній гідрохлорид] (молекулярна маса 1000) використовують як вихідний розчин у 25% водному розчині. Цей розчин розбавляють стерильною водою до відповідної робочої концентрації. Дослідні речовини зберігають при кімнатній температурі. 3. Визначення мінімальної інгібувальної концентрації (MIK) Дію дослідної речовини досліджують методом мікророзбавлення у бульйоні Мюллера-Гінтона згідно з указівками Національної колекції типових культур. Ви хідний мікробний матеріал інокулюють до принаймні 5×105 СУО (сінцитійутворюючих одиниць) на мл та інкубують протягом 16-20 годин при 36°C або температурі оточення. Дослідну речовину використовують у концентраціях від 1000 до 0,001мкг/мл. Найнижча концентрація лікарської речовини, за якої не спостерігається зростання бактерій, визначається як MIK. У кожній дослідній партії використовують контрольні штами, що пройшли контроль якості Американської колекції типових культур, із відомою MIK. 4. Розвиток стійкості Виходячи з величин MIK, досліджують 30 штамів бактерій на розвиток стійкості: 5 84418 Грам-позитивні патогени: MSSA (n=1), MRSA (n=2), MRSE (n=4), VRE (n=5), S.aureus ATCC 29213. Грам-негативні патогени: мультирезистентна E.coli (n=4), Klebsiella pneumoniae (n=1), Klebsiella oxytoca (n=1), Pseudomonas aeruginosa (n=4), мультирезистентна Pseudomonas aeruginosa (n=4), Acinetobacter sp. (n=2) та E.coli ATCC 35218 і 25922. Усі штами інкубують із дослідною речовиною при концентраціях від 1000 до 0,001мкг/мл протягом 24 годин. Трубки, у яких помічають зростання бактерій після першого переносу, слугують інокулятом для другого переносу. Для кожного штаму бактерій виконують 30 переносів, кожного разу порівнюючи нову MIK із визначеною на початку досліду (1-й перенос). 5. Руйнування патогенів у залежності від часу та концентрації Для визначення мікробіцидного потенціалу лікарської речовини у кожному випадку використовують два мультирезистентні штами Staphylococci, Enterococci, E.coli та Pseudomonas aeruginosa. Швидкість руйнування визначають з моменту додання (час 0) бактеріальної суспензії (1×106 5×106 СУО/мл) через 2, 5, 10 та 30 хвилин. У цих дослідженнях кількісне скорочення патогенів відбувається у будь-який час і за будь-якої концентрації. Лікарську речовину використовують у концентраціях 10%, 1 %, 0,1% та 0,001%. Контролем завжди слугує серія без лікарської речовини. 6. Мінімальна інгібувальна концентрація (MIK) Результати досліджень MIK наведені у таблицях 1-5. У випадку Staphylococcus aureus та Staphylococcus epidermidis лікарська речовина демонструє дуже активну дію зі значеннями MIK від 4 до 32мкг/мл незалежно від характеристик стійкості ізолятів до антибіотиків. MIK для мультирезистентних стафілококів (MRSA) також знаходяться у цих межах (табл.1). Значення MIK для Enterococcus faecalis становлять 16-32мкг/мл, причому немає відмінності між мультирезистентним та стійким до ванкоміцину штамами ентерококу (n=5) та чутливими ізолятами. Ентеробактерії: щодо E.coli, виду Klebsiella, виду Enterobacter та Proteus mirabilis лікарська речовина виявляє дуже гарні результати з величинами MIK від 4 до 32мкг/мл (табл.2). Досліди з Salmonella, Shigella та Yersinia enterocolitica виявляються дуже вдалими (табл.3). Неферментуючі бактерії Pseudomonas aeruginosa та вид Acinetobacter також показують високу чутливість до лікарської речовини з MIK від 4 до 32мкг/мл (табл.3). Високу ефективність лікарської речовини, одержаної згідно з винаходом, демонструють п'ять ізолятів Pseudomonas, які були стійкі проти всіх застосованих у клініці антибіотиків. Ефективним виявився засіб і проти Mycobacterium tuberculosis, avium complex, kansaii та Gordonae (табл.4) із значеннями MIK 1632мкг/мл. 6 Випробування на клінічно суттєвих видах грибків, як Candida albicans, Candida tropicalis та Candida parapsilosis (бластоміцети), а також Trichophyton mentagrophytes (дерматофіт) показали відмінну протигрибкову дію (значення MIK від 8 до 32мкг/мл) (табл.5). 7. Розвиток стійкості Випробують разом 30 патогенів дев'яти різних бактеріальних видів - грам-позитивні патогени, як Staphylococcus aureus та epidermidis, та грамнегативні, як Е.соIі, вид Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa та вид Acinetobacter. Досліджують як чутливі штами Американської колекції типових культур, так і мультирезистентні клінічні ізоляти. Після 30 переносів в обох групах не спостерігається жодних ознак розвитку стійкості, тобто збільшення значень MIK. 8. Руйнування патогенів у залежності від часу та концентрації З метою оцінки бактерицидних властивостей лікарської речовини визначають швидкість руйнування бактерій. У кожному випадку використовують два штами Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Е.соlі та Pseudomonas aeruginosa. У випадку Staphylococcus aureus, Е.соIі та Pseudomonas aeruginosa руйнувальна могутність лікарської речовини починається від концентрації 0,01% негайно після введення первинного матеріалу (0-30с). Для ентерококів потрібний період 10-30 хвилин для знищення патогенів при концентрації лікарської речовини 0,01%. Таблиця 1 Ефективність проти грам-позитивних бактерій Кількість штамів (%), що мають величину MIK (мг/л) 4 8 16 32 MSSA (n=35) 0(0) 6(17,1) 20(57,1) 9(25,8) MRSA (n=60) 3(5) 10(16,7) 38(63,3) 9(15) Entericoccus 0(0) 0(0) 16(50) 16(50) faecalis (n=32) Вид Таблиця 2 Ефективність проти ентеробактерій Вид Klebsilla spp. (n=43) Escherichia соlі (n=59) Enterobacter spp. (n=17) Proteus spp. (n=7) Кількість штамів (%),що мають величину MIK (мг/л) 4 8 16 32 0(0) 5(11,6) 18(41,9) 20(46,5) 2(3,4) 17(28,8) 39(66,1) 1(5,9) 1(5,9) 0(0) 0(0) 1(1,7) 12(70,6) 3(17,6) 3(42,9) 4(57,1) 7 84418 Candida spp. 0(немає 1(немає 3(немає 6(немає (n=10) дан.) дан.) дан.) дан.) Trichophyton 0(немає 0(немає 1(немає 0(немає mentagrophyte дан.) дан.) дан.) дан.) s (n=1) Таблиця 3 Ефективність проти грам-негативних бактерій Кількість штамів (%), що мають величину MIK (мг/л) 4 8 16 32 Вид Pseudomonas spp. (n=55) Acinetobacter spp. (n=2) Salmonella spp. (n=6) Shigella spp. (n=2) Yersinia enterocolitica (n=1) 1(1,8) 5(9,1) Клінічна дія Для того, щоб підтвердити in vivo гарні характеристики дії лікарського засобу, що спостерігалися in vitro, речовину випробують у клінічних умовах на хворих-добровольцях, які страждають від відповідних інфекцій. Речовину використовують у водному розчині або у вигляді гелю з концентрацією 0,5%. Пацієнти Лікування лікарською речовиною одержують 12 хворих у віці від 35 до 62 років. 2 хворих страждають на хронічний гастрит (Helicobacter pylori-позитивні) 3 хворих страждають на хронічні запалення ясен та слизової ротової порожнини 3 хворих страждають на хронічні запалення вагинальної слизової 1 хворий страждає на гангрену стоп 3 хворих страждають на оніхомікоз (1 на мікоз рук, 2 на мікоз стоп) Результати Дані про клінічну ефективність лікарського засобу у 12 обраних хворих підсумовані у табл.6. Там також наводяться тип та тривалість лікування, основні клінічні ознаки та клінічна успішність. У цілому в усіх 12 випадках спостерігається переконливе клінічне поліпшення після лікування, яке триває від 2 до 28 діб. Має місце помітне поліпшення основних симптомів при чудовій локальній переносності. У жодному випадку не спостерігається таких бічних явищ, як почервоніння, роздратування або нудота. 32(58,2) 17(30,9) 0(немає 0(немає 1(немає 1 (немає дан.) дан.) дан.) дан.) 0(немає 2(немає 4(немає 0 (немає дан.) дан.) дан.) дан.) 0(немає 0(немає 1(немає 1 (немає дан.) дан.) дан.) дан.) 0(немає 0(немає 0(немає 1 (немає дан.) дан.) дан.) дан.) Таблиця 4 Ефективність проти мікобактерій Кількість штамів (%), що мають величину MIK (мг/л) 4 8 16 32 Micobacterium 0(немає 0(немає 5(немає 1(немає spp (n=6) дан.) дан.) дан.) дан.) Вид Таблиця 5 Ефективність проти грибків Кількість штамів (%), що мають величину MIK (мг/л) 4 8 16 32 Вид 8 Таблиця 6 Число хворих 2 3 3 Діагноз Клінічні симптоми Тип лікув ання хронічний гастрит м'якість шлунку при 0,5% розчин ора(H.pylori натисканні, опік серця льно дв ічі на добу позитив ні) запалення ясен та сли- болісні центри запа- 0,5% розчин оразов ої ротов ої порожни- лення, кров отеча з льно дв ічі на добу ни ясен хронічні запалення печіння, в иділення, 0,5% розчин орав агинальної слизов ої св ербіж льно дв ічі на добу 1 гангрена стоп в иразков і зміни, проникнення набряків , 0,5% розчин орапоганий запах, опера- льно тричі на добу ція прот ипоказана 3 мікоз рук та стоп св ерблячка, дефор- 0,5% розчин орамація та знеформ- льно тричі на добу лення нігтів Комп’ютерна в ерстка О. Рябко Підписне Трив алість лікув ання (діб) Клінічна успішність 14 скарг немає 2 поміт не поліпшення, болів немає, кров отеча з ясен зупинена 5 скарг немає 28 поміт не поліпшення локальних показників , запах не посилюється, почато підготовку до операції 28 не св ербить, в ідростають здоров і нігті Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601