Спосіб визначення здатності lactobacillus до продукції перекису водню з використанням еритроцитів крові

Реферат: Спосіб визначення здатності Lactobacillus до продукції перекису водню з використанням еритроцитів крові вирішується шляхом виявлення лактобацил, здатних продукувати перекис водню. У пробірки з суспензією лактобацил, виділених з піхви жінок, або інших біотопів, вносять еритроцити крові барана в різних розведеннях та візуально оцінюється мінімальне розведення еритроцитів крові, які в суміші з лактобацилами утворюють пухирці газу. Результати оцінюють відповідно наступним критеріям: якщо в пробірці з лактобацилами та еритроцитами крові 6 барана в розведенні 10 відбувається сильне газоутворення - даний штам лактобацил є активним продуцентом перекису водню. 4 Якщо в пробірці з лактобацилами та еритроцитами крові барана в розведенні 10 відбувається слабке газоутворення - даний штам лактобацил є слабким продуцентом перекису водню. 2 Якщо в пробірці з лактобацилами та еритроцитами крові барана в розведенні 10 газоутворення не відбувається - даний штам лактобацил не проявляє здатність до продукції перекису водню. UA 84574 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ ЗДАТНОСТІ LACTOBACILLUS ДО ПРОДУКЦІЇ ПЕРЕКИСУ ВОДНЮ З ВИКОРИСТАННЯМ ЕРИТРОЦИТІВ КРОВІ UA 84574 U UA 84574 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до області медицини, зокрема до клінічної мікробіології, і може бути використана для визначення фізіологічної активності лактобактерій за їх здатністю продукувати перекис водню. Продукція перекису водню є одним з важливих факторів антагонізму по відношенню до транзиторних мікроорганізмів, за допомогою якого лактобацили здатні регулювати баланс між індигенною та умовно - патогенною мікрофлорою в піхві жінки. Але не всі лактобацили продукують перекис водню. Крім цього наявність статевих інфекцій може приводити до зниження кількості лактобацил, які продукують перекис водню та підвищення колонізації піхви лактобацилами, які не продукують перекис водню. Відсутність перекис-продукуючих видів лактобацил є первинним чинником, який сприяє розростанню умовно - патогенних мікроорганізмів, особливо анаеробів у генітальних органах жінки. В літературних джерелах описані декілька способів визначення перекису водню. Один з них це перманганатометричний спосіб. Визначення проводять титруванням підкисленого розчину перекису водню розчином перманганата калію до момента, коли розчин стає блідо - рожевим. (Торосян В.Ф.Аналитическая химия и физико-химические методы анализа. Практическое руководство. - 2010.) Недоліками способу є те, що він потребує тривалої підготовки та є титрометричним. Йодометричний метод визначення перекису водню оснований на взаємодії його з йодистим калієм в кислому середовищі, виділенням йоду, який дає з крохмалем синє забарвлення. (ГОСТ 24067-80*от 4.04.1980г № 1536. Молоко. Метод определения перекиси водовода). Даний спосіб є біохімічним та дозволяє визначати перекис водню молочнокислих бактерій титрометричним методом. Найбільш близьким до об'єкта, що заявляється, є спосіб визначення здатності лактобацил продукувати перекис водню методом розкладання перекиси водню ферментом пероксидазою з окисленням тетраметилбензидину, який міститься в поживному середовищі, що передбачає посів лактобацил на поживне середовище MRS, яке містить 5мг тетраметилбензидину (ТМБ) і 0,20 мг пероксидази хрону. Після інкубації при температурі 37 °C в анаеробних умовах протягом 48-72 годин оцінюють результати: колонії лактобацил, які виробляють перекис водню забарвлюються в блакитний колір, а колонії лактобацил, що не виробляють перекис водню безбарвні (Черкасов С.В.Автореферат д.мед.н., Оренбург - 2011.; Глушанова Н.А. Автореферат д.мед.н., Москва - 2006; Strus M, Kucharska A, Kukla G, Brzychczy-Wloch M, Maresz K, Heczko PB.The in vitro activity of vaginal Lactobacillus with probiotic properties against Candida Infect Dis Obstet Gynecol. 2005 Jun;13(2):69-75.; Mohammad Sabri A. Razzak, Alaa H. Al-Charrakh, et al.Relationship between lactobacilli and opportunistic bacterial pathogens associated with vaginitis. North American Journal of Medical Sciences, 2011. - №.4. - Vol. 3.- Р. 185-192). Недоліками способу є те, що для отримання результатів потрібен тривалий час. Це обумовлено тим, що для росту лактобацил потрібно від 48 до 72 годин. Ще одним недоліком способу є те, що для дослідження потрібні складні реактиви та спеціальне обладнання для постановки дослідження. В основу корисної моделі поставлена задача визначення здатності Lactobacillus до продукції перекису водню з використанням еритроцитів крові шляхом виявлення у жінок з дисбіозом піхви штамів Lactobacillus здатних продукувати перекис водню, що дасть можливість застосовувати спосіб, як експрес-метод та оперативно призначати лікування. Поставлена задача способу визначення здатності Lactobacillus до продукції перекису водню з використанням еритроцитів крові вирішується шляхом виявлення лактобацил, здатних продукувати перекис водню, згідно з корисною моделлю, додатково в пробірки з суспензією лактобацил, виділених з піхви жінок, або інших біотопів, вносяться еритроцити крові барана в різних розведеннях та візуально оцінюється мінімальне розведення еритроцитів крові, які в суміші з лактобацилами утворюють пухирці газу. Результати оцінюють відповідно наступним критеріям: 6 якщо в пробірці з лактобацилами та еритроцитами крові барана в розведенні 10 відбувається сильне газоутворення - даний штам лактобацил є активним продуцентом перекису водню. 4 якщо в пробірці з лактобацилами та еритроцитами крові барана в розведенні 10 відбувається слабке газоутворення - даний штам лактобацил є слабким продуцентом перекису водню. 2 якщо в пробірці з лактобацилами та еритроцитами крові барана в розведенні 10 газоутворення не відбувається - даний штам лактобацил не проявляє здатність до продукції перекису водню. 1 UA 84574 U 5 10 15 20 25 При контакті перекису водню, що продукують лактобацил і з еритроцитами крові, за рахунок ферменту каталази, який містять еритроцити, перекис водню швидко розкладається з виділенням кисню. Одержані дані можуть бути використані для визначення фізіологічної активності лактобацил за їх здатністю продукувати перекис водню, а також як критерій до призначення належної терапії, що забезпечує підвищення ефективності лікування дисбіотичних порушень статевих шляхів у жінок. Спосіб визначення здатності лактобацил до продукції перекису водню з використанням еритроцитів крові здійснюється наступним чином: з чистої культури виділених з статевих шляхів жінки штамів Lactobacillus spp. готують на фізіологічному розчині суспензію бактерій 8 концентрацією 1,510 КУО/мл, що візуально відповідає стандарту мутності 0,5 за Мак Фарландом. По 0,5 мл суспензії лактобацил розливаємо у ряд пробірок. Для дослідження змішують 0,9 мл крові барана з 0,1 мл 3,8 % розчином цитрату натрію (співвідношення 9:1) та центрифугують 10 хвилин на швидкості 3000 об./хв. Еритроцити барана тричі відмивають охолодженим фізіологічним розчином. Далі проводять підрахунок кількості 6 еритроцитів в камері Гаряєва. З робочої суспензії еритроцитів з концентрацією 4,210 кл./мл 6 5 4 3 2 готують ряд серійних розведень: 10 , 10 , 10 ,10 ,10 . З кожного розведення еритроцитів беруть по 0,5 мл суспензії та додають до 0,5 мл суспензії Lactobacillus. З метою контролю паралельно ставлять дослід з Lactobacillus, які не продукують перекис водню. Результати оцінюють протягом 5 хвилин за наявністю пухирців газу (кисню), що виділяються при розкладанні перекису водню при взаємодії з еритроцитами та враховують найменше розведення еритроцитів, що при взаємодії з перекис-продукуючими лактобацилами виділяють кисень. Оцінка результатів: якщо в пробірці з лактобацилами та еритроцитами крові барана в 6 розведенні 10 відбувається сильне газоутворення - даний штам лактобацил є активним продуцентом перекису водню, якщо в пробірці з лактобацилами та еритроцитами крові барана в 4 розведенні 10 відбувається слабке газоутворення - даний штам лактобацил є слабким продуцентом перекису водню, якщо в пробірці з лактобацилами та еритроцитами крові барана в 2 розведенні 10 газоутворення не відбувається - даний штам лактобацил не проявляє здатність до продукції перекису водню. 30 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 Спосіб визначення здатності Lactobacillus до продукції перекису водню з використанням еритроцитів крові, що вирішується шляхом виявлення лактобацил, здатних продукувати перекис водню, який відрізняється тим, що в пробірки з суспензією лактобацил, виділених з піхви жінок, або інших біотопів, вносять еритроцити крові барана в різних розведеннях та візуально оцінюється мінімальне розведення еритроцитів крові, які в суміші з лактобацилами утворюють пухирці газу, результати оцінюють відповідно наступним критеріям: 6 якщо в пробірці з лактобацилами та еритроцитами крові барана в розведенні 10 відбувається сильне газоутворення - даний штам лактобацил є активним продуцентом перекису водню, 4 якщо в пробірці з лактобацилами та еритроцитами крові барана в розведенні 10 відбувається слабке газоутворення - даний штам лактобацил є слабким продуцентом перекису водню, 2 якщо в пробірці з лактобацилами та еритроцитами крові барана в розведенні 10 газоутворення не відбувається - даний штам лактобацил не проявляє здатність до продукції перекису водню. 45 Комп’ютерна верстка С. Чулій Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2