Спосіб моделювання глобальної церебральної ішемії у мишей

1. Спосіб моделювання глобальної церебральної ішемії у мишей шляхом штучного порушення мозкового кровообігу, який відрізняється тим, що мишей піддають впливу гравітаційного перевантаження при обертанні у радіальному положенні головою до центра обертання. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що мишей піддають впливу гравітаційного перевантаження 6g. 3. Спосіб за п. 1, п. 2, який відрізняється тим, що ступінь ішемічних порушень у мишей регулюють тривалістю часу обертання. 4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, який відрізняється тим, що час обертання становить від 10 до 60 секунд. (19) UA (11) (21) a200714636 (22) 24.12.2007 (24) 10.08.2009 (46) 10.08.2009, Бюл.№ 15, 2009 р. (72) ШТРИГОЛЬ СЕРГІЙ ЮРІЙОВИЧ, ШТРИГОЛЬ В'ЯЧЕСЛАВ СЕРГІЙОВИЧ, ЄСЄВА ОЛЬГА АНДРІЇВНА, ТІМАНЮК ВОЛОДИМИР ОЛЕКСАНДРОВИЧ (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ (56) Мирзоян Р.С., Саратиков А.С., Плотников М.Б. и др. Методические указания по экспериментальному изучению препаратов для лечения нарушений мозгового кровообращения // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., 2000 UA, 25489, G09B 23/28, 30.10.1998 SU, 1554007, G09B 23/28, 30.03.1990 RU, 2083000, G09B 23/28, 27.06.1997 Суфианова Г.З., Усов Л.А., Суфианов А.А. и др. Малоинвазивная модель фокальной ишемии головного мозга у крыс // Эксперим. и клинич. фармакология. - 2001. - №4 Макарова Л.М., Погорелый В.Е. Экспериментальная оценка эффективности глицина и его фосфорилированного производного при ишемических повреждениях головного мозга // Эксперим. и клинич. фармакология. - 2006. - №6 C2 2 87759 1 3 у тварин залишається до 30% мозкового кровообігу за рахунок анастомозів між інтра- та екстракраніальними судинами. Тому дана модель не є достатньо регламентованою, що утруднює уніфікацію даних. Більш регламентована модель локальної церебральної ішемії при оклюзії середньої мозкової артерії [1]. До недоліків всіх наведених методів слід віднести те, що вони травматичні, потребують складного хірургічного втручання, використання наркозних препаратів. Останні пригнічують центральну нервову систему, що утруднює об'єктивну оцінку церебропротекторних властивостей досліджуваних лікарських або інших лікувальнопрофілактичних засобів. Існує також модель повної церебральної ішемії у мишей, яка відтворюється шляхом декапітації тварин без використання знеболювальних засобів з подальшим підрахунком кількості позіхань як маркера стійкості нейронів до гіпоксії (так званий gasping-test) [2]. Але цей метод також має очевидні недоліки. По-перше, він викликає заперечення з точки зору біоетики; крім того, тварина знаходиться у стані спінального шоку, що впливає на результат. Можливості метода дуже обмежені - неможливо дати оцінку інтегрального ефекту, а саме виживаності тварин, і перебіг експериментальної патології після ішемічного періоду, оскільки тварини гинуть під час відтворення церебральної ішемії. Найбільш зручним видом тварин для експериментальних досліджень, особливо скрінінгових, є миші. Вони значно дешевші за щурів, а завдяки меншому розміру кількість речовин, що використовується для дослідження, скорочується в 10-20 разів. Але невеликий розмір мишей створює технічні труднощі, що пов'язані з перев'язуванням сонних артерій - дуже дрібних судин. Завданням винаходу є створення способу моделювання глобальної церебральної ішемії у мишей шляхом створення гравітаційного перевантаження в краніо-каудальному векторі при обертанні, що дозволяє одержати просту та добре відтворювану модель заданої патології з можливістю варіювати тяжкість ішемічних порушень. Поставлене завдання вирішується таким чином, що у способі моделювання глобальної церебральної ішемії у мишей шляхом штучного порушення мозкового кровообігу винаходом передбачено, що мишей піддають впливу гравітаційного перевантаження при обертанні у радіальному положенні головою до центра обертання. Згідно з винаходом мишей піддають впливу гравітаційного перевантаження 6g, причому ступінь ішемічних порушень регулюють тривалістю часу обертання. У відповідності з винаходом, час обертання становить від 10 до 60 секунд. Заявлений спосіб здійснюють наступним чином. Дослідних мишей фіксують на центрифузі у радіальному положенні головою до центра обер 87759 4 тання. При обертанні створюється гравітаційне перевантаження, яке викликає ішемію. Ступінь тяжкості ішемії регулюється часом обертання і залежить від створюваного прискорення. Краніо-каудальний вектор прискорень (позитивне радіальне прискорення) створюється за допомогою центрифуги. За умов частоти обертання 1000 об/хв. (центрифуга лабораторна клінічна ЦЛК-1) при розташуванні тварини в радіальному напрямі з мінімальною відстанню голови від осі обертання (0,5 см) гравітаційне перевантаження становить 6g. Гравітаційне перевантаження сприяє переміщенню крові в каудальному напрямі, що забезпечує ішемію головного мозку в усіх його судинних басейнах, тобто глобальну церебральну ішемію. Винахід ілюструється прикладами. Приклад 1 Були проведені дослідження ефективності модельної патології, одержаної за заявленим способом у порівнянні з існуючими моделями. Дослід виконаний на 74 нелінійних мишах-самцях масою 12-15 г, що були розподілені на 6 груп. Тварин перших трьох груп піддавали впливу гравітаційного перевантаження в краніокаудальному векторі. Для цього їх розміщували в спеціально виготовлених тканинних пеналах, які щільно охоплюють мишу, але не заважають її диханню. Пенали закріплювали на центрифузі перпендикулярно осі обертання таким чином, що голова тварини спрямована до осі (відстань від осі становить 0,5 см). Мишей першої групи (n=16) піддавали впливу гравітаційного перевантаження при 6g (1000 об/хв.) протягом 10-20 секунд, мишей другої групи (n=12) - протягом 30-40 секунд, третьої групи (n=6) - протягом 60 секунд, після чого центрифугу вимикали. Повна зупинка відбувалася через 30 секунд, протягом яких гравітаційне перевантаження плавно зменшувалося з 6g до 0g. У мишей четвертої групи (n=19) під нембуталовим наркозом (40 мг/кг) відтворювали ішемію головного мозку шляхом перев'язування обох загальних сонних артерій, викликаючи незворотну двобічну каротидну оклюзію. У мишей п'ятої групи (n=8) перев'язували загальну сонну артерію з одного боку (по 4 тварини з лівого та з правого), викликаючи незворотну однобічну каротидну оклюзію. Шосту групу (n=13) складали інтактні тварини. Оцінювали виживаність тварин першої, другої, третьої, четвертої та п'ятої груп протягом 2 тижнів, а також набряк головного мозку (його визначали за масовим коефіцієнтом головного мозку порівняно з показником інтактних тварин шостої групи). Визначення вірогідності відмінностей виживаності проводили за кутовим перетворенням Фішера, масового коефіцієнту головного мозку - за критерієм Ст'юдента. Результати наведені в таблицях 1 і 2. 5 87759 6 Таблиця 1 Виживаність мишей з моделями церебральної ішемії, які відтворені шляхом гравітаційного перевантаження та перев'язування загальних сонних артерій № групи 1 2 3 Гравітаційна церебральна ішемія Кількість тварин Вижило / загинуло 16 12/4 12 5/7 6 0/6 Час впливу 6g, с 10-20 30-40 60 Вірогідність відмінностей 4 5 Вірогідність відмінностей Незворотна двобічна каротидна оклюзія 19 0/19 Незворотна однобічна каротидна оклюзія 8 8/0 Як свідчать дані таблиці 1, гравітаційне перевантаження 6g в краніо-каудальному векторі викликає загибель тварин, яка прямо залежить від часу дії перевантаження. Таким чином, тяжкість глобальної церебральної ішемії і летальність мишей можна регулювати шляхом змінення терміну перебування тварин в умовах гравітаційного перевантаження залежно від мети дослідження. У тварин, що вижили після гравітаційного перевантаження, протягом 20-30 хв. спостерігалися значні порушення координації рухів, потім вони візуально не відрізнялися від інтактних тварин. Слід відзначити, що моделювання церебральної ішемії у мишей шляхом перев'язування обох загальних сонних артерій викликає загибель 100% тварин протягом першої доби. Значна частина мишей не виходить з наркозу. Це свідчить про більшу чутливість мишей до незворотної каротид Виживаність, % 75 41,7 0 P1-2