Спосіб визначення класу мутагенності речовин

Спосіб визначення класу мутагенності речовин, що включає врахування структурних аберацій хромосом в анафазах і телофазах клітин цибулі 3 91749 4 За допомогою цього методу отримують інфоПри появі первинних корінців цибулі довжиною рмацію щодо присутності мутагенних факторів у 7-9 мм, їх фіксують в ацетоалкоголі протягом 1 питній воді, а дослідження частоти зустрічальності години, а потім переносять у етанол 70° концентмутацій у популяціях рослин, що ростуть у обласрації для зберігання. Фіксатор готують шляхом тях з різним ступенем забруднення дозволяє назмішування 96° етилового спирту і крижаної оцтодати кількісні оцінки небезпеки і для людини, прової кислоти у співвідношенні 3:1 безпосередньо те дослідити мутагенність промислових відходів за перед фіксацією біооб'єктів. цим способом неможливо, бо використання водФарбування корінців проводять реактивом них витяжок з промислових відходів у якості сереШиффа за Фьольгеном з попереднім гідролізом у довища для росту призведе до загибелі насіння 0,1 н соляній кислоті при температурі 60°С. Після Allium сера та зробить неможливим урахування фарбування біопроби промивають у трьох порціях хромосомних аберацій. сірчаних вод і закріплюють фарбування в проточВ основу винаходу поставлено задачу удосконій воді. Пофарбовані корінці зберігають у 70° налення способу визначення мутагенності речоетиловому спирті. Цитологічні препарати готують з вин, в якому шляхом введення нових технологіч1 мм кінчиків корінців (меристем), поміщених у них операцій та параметрів досягається краплю 45%-ної оцтової кислоти. Препарат накриможливість достовірного визначення класу мутавають покривним склом, роздавлюють меристеми генності надзвичайно токсичних речовин, особлидо отримання моношару клітин. Краї покривного во промислових відходів, і за рахунок цього досяскла заливають розплавленим парафіном. Пригогається можливість уніфікувати процедуру товлений таким чином препарат використовують віднесення відходів до класів екологічної небезпедля мікроскопічного аналізу на мікроскопі. ки, виключити порушення гігієнічних вимог щодо При дослідженні структурних мутацій хромоповодження з небезпечними відходами та підвисом у клітинах використовували тільки препарати, щити рівень екологічної безпеки територій складущо відповідали наступним вимогам: аналізували вання промислових відходів. одношарові цілі клітини з неушкодженими клітинЗадача вирішується тим, що у відомому споними стінками; хромосоми всередині клітини були собі визначення мутагенності, що включає урахудобре пофарбованими та лежали на тлі прозорої вання структурних аберацій хромосом в анафазах цитоплазми. і телофазах клітин цибулі ріпчастої (Allium сера L.), Під час поділу клітина є дуже чутливою до дії пророщеної у середовищі, що досліджується, та різних факторів навколишнього середовища, тому порівнянні отриманого рівня мутагенності з контпротягом мітозу можлива поява численних поруролем, згідно винаходу, у якості середовища для шень: фрагментації, злипання і відставання хропророщування насіння Allium сера L. використовумосом, утворення мостів. Крім того, окремі забрують водну витяжку з промислових відходів, що днювачі можуть блокувати процес клітинного досліджуються, яку розводять чистою водою з поділу та викликати порушення генетичного матекоефіцієнтом розведення від 1:1 до 1:20, визначаріалу на ранніх стадіях мітозу, а саме у профазі та ють кількість хромосомних аберацій у клітинах метафазі. Також незначні порушення можуть вицибулі, враховуючі також профази та метафази, а правлятися системами репарації ДНК, що в свою потім встановлюють залежність частоти зустрічачергу призводить до зменшення кількості хромольності хромосомних патологій в усіх фазах мітозу сомних аберації у ана- та телофазі. Тому для комвід кратності розведення витяжки з відходів, порівплексного врахування мутагенної дії всіх забруднюють з контролем та визначають клас їх небезнювачів, присутніх у досліджуваних середовищах, пеки за показником мутагенності. необхідно додатково враховувати наявність абеСпосіб реалізується наступним чином. Готують рації у метафазі. водний екстракт з промислових відходів за таких На цитологічних препаратах ураховують усі умов: відходи заливають водопровідною водою у фігури мітозу: профазу, метафазу, анафазу, тевідношенні 1:1 [1], ретельно змішують та залишалофазу, що зустрічаються серед 5-6 тис. перегляють на 2 доби. Потім витяжку відфільтровують нутих меристематичних клітин. через фільтрувальний папір. Загальну аберантність хромосом визначають у На першому етапі дослідження проводять повідсотках за формулою: переднє тестування з метою визначення ступеню агресивності витяжки з промислових відходів до G Ax 100,% (1) біооб'єктів. Задля цього в чашку Петрі кладуть m лист фільтрувального паперу, зволожують його 5 мл водного екстракту витяжки та висаджують по де G - кількість аберантних клітин; 50 насінин цибулі. Дослід має бути представлений m - кількість клітин, що діляться. у трьох повторюваностях. Через кожні шість годин Потім встановлюють кратність перевищення проводять провітрювання, відкриваючи на кілька частоти зустрічальності хромосомних аберації у хвилин чашки. Дослід триває 72 години при темдосліді у відношенні до контролю і у відповідності пературі 25°С в умовах термостату. В якості контдо класифікації, що наведена у таблиці 1, встаноролю використовується дистильована вода. влюють клас небезпеки промислових відходів за показником мутагенності [2]. 5 91749 6 Таблиця 1 Критерії віднесення відходів до класу небезпеки Показник небезпеки Мутагенна активність (кратність перевищення дослід/контроль) І Надзвичайно небезпечні >15 У випадку, якщо загибель насінин цибулі у досліді з нерозбавленою витяжкою з відходів становить 10% і більше, необхідно провести додаткові дослідження шляхом розведення витяжки чистою водою. Для цього готують ряд розведень витяжки, використовуючи коефіцієнт розведення від 1:1 до 1:20 у залежності від токсичності промислових відходів. На зразках розведеної витяжки пророщують насіння Allium сера вищевказаним чином та обраховують кількість хромосомних патологій у клітинах біоіндикатора. Після цього будують графік залежності аберантності хромосом від кратності розведення витяжки, який дозволяє шляхом апроксимації результатів експерименту встановити ступень мутагенності нерозведеного екстракту відходів, та визначити клас їх небезпеки за цим показником. Таким чином, даний спосіб дозволяє уніфікувати процедуру визначення мутагенних властивостей промислових відходів та порядок їх віднесення до класів екологічної небезпеки, що у свою чергу, дозволить попередити порушення гігієнічних вимог щодо поводження з небезпечними відходами та підвищить екологічну безпеку у цій сфері. Клас небезпеки II III IV Високо небез- Помірно небез- Мало небезпечпечні печні ні 11-15 4-10 2-3 Приклад. У якості об'єкта дослідження обрали відходи Дніпропетровського сміттєспалювального заводу - золу-унос. Приготувавши водний екстракт з золи, провели попереднє тестування, яке показало 100% загибель насінин біоіндикатора. Тому з водної витяжки були приготовлені варіанти розведення з коефіцієнтом 5; 10; 15 і 20 та проведено дослідження мутагенності золи вищевказаним чином. Результати досліду представлені у таблиці 2 та на Фіг., з яких видно, що залежність ступеню х мутагенності цих відходів А від кратності розбавлення водного екстракту ER має лінійний характер та адекватно описується рівнянням виду Ax(ER)=-0,43·ER+23,19 (R2=0,98). Отримана модель дозволяє встановити ступінь мутагенності нерозбавленої витяжки із золиунос - Ах(0)= 3,19%, що перевищує частоту зустрічальності аберантних фігур мітозу у контролі у 13,5 разів. Таким чином, за даним показником зола-унос відноситься до II класу небезпеки високо небезпечні відходи та має зберігатися та транспортуватися тільки у закритій тарі, що запобігає проникненню цих відходів у довкілля. Таблиця 2 Результати тесту на визначення класу небезпеки золи-унос за показником мутагенності на тест-культурі Allium сера Варіант Варіант 1 Варіант 2 Варіант 3 Варіант 4 Контроль Кратність розведення, разів 5 10 15 20 Частота зустрічальності аберантних фігур мітозу, % 21,39±3,12 18,44±2,31 16,52±2,48 14,83±2,31 1,72±0,46 Джерела інформації: 1. НД №3897-85. Предельное количество токсичных промышленных отходов, допускаемое для складирования в накопителях (на полигонах) твердых бытовых отходов. - Утв. 30.05.85. tst 10,60 10,16 9,06 8,39 2. СП 2.1.7.1386-03. Санитарные правила по определению класса опасности токсичных отходов производства и потребления. Введ. 16.06.03. 7 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 91749 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601