Спосіб кріоконсервування еритроцитів людини

Реферат: Спосіб кріоконсервування еритроцитів людини включає додавання до суспензії еритроцитів кріозахисного середовища, що містить кріопротектор монометиловий ефір поліетиленгліколю, еквілібрацію при кімнатній температурі, і послідуюче заморожування до -196° С шляхом занурення у рідкий азот, причому в кріозахисне середовище додатково вводять кріопротектор диметилацетамід в концентрації 5 %, а кріопротектор монометиловий ефір поліетиленгліколю беруть в концентрації 15 %, при цьому кріозахисне середовище додають до суспензії еритроцитів у співвідношенні 1:1. UA 92248 U (54) СПОСІБ КРІОКОНСЕРВУВАННЯ ЕРИТРОЦИТІВ ЛЮДИНИ UA 92248 U UA 92248 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до кріобіології і кріомедицини і може бути використана для низькотемпературного консервування еритроцитів людини з метою подальшого використання в клінічній практиці для створення запасів рідкісних груп крові, аутокрові, тощо. Відомий спосіб кріоконсервування еритроцитів шляхом заморожування до -196° С у присутності кріопротектора гліцерину [1]. Недоліком цього способу є необхідність видалення кріопротектора з клітинної суспензії, що спричиняє додаткову втрату клітин і ускладнює технологію кріоконсервування. Найбільш близьким до заявленого є спосіб кріоконсервування еритроцитів людини, згідно з яким до клітин перед заморожуванням додають при кімнатній температурі кріозахисне середовище - 30 %-й сольовий розчин кріопротектора монометилового ефіру поліетиленгліколю (МЕПЕГ), і після 30 хв еквілібрації заморожують до -196° С шляхом занурення у рідкий азот [2]. Недоліком цього способу є недостатньо високі показники схоронності еритроцитів після заморожування-відігрівання. Після розморожування у середньому зберігається 70-80 % клітин. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити відомий спосіб заморожування еритроцитів людини шляхом зміни складу кріозахисного середовища, і таким чином забезпечити можливість підвищення схоронності еритроцитів. Ця задача вирішується тим, що в способі кріоконсервування еритроцитів людини, який включає додавання до суспензії еритроцитів кріозахисного середовища, що містить кріопротектор МЕПЕГ, еквілібрацію при кімнатній температурі і послідуюче заморожування до 196 °C шляхом занурення у рідкий азот, згідно з корисною моделлю, в кріозахисне середовище вводять додатково кріопротектор диметилацетамід (ДМАЦ) в концентрації 5 %, а кріопротектор МЕПЕГ беруть в концентрації 15 %, при цьому кріозахисне середовище додають до суспензії еритроцитів у співвідношенні 1:1. Використання додатково кріопротектора ДМАЦ дозволяє знизити концентрацію МЕПЕГ у кріозахисному середовищі з 30 % до 15 %, і, тим самім, зменшити токсичність середовища та підвищити схоронність еритроцитів. Зниження концентрації непроникаючого кріопротектора МЕПЕГсприяє зменшенню негативного впливу процесу дегідратації клітин на етапі еквілібрації, а присутність проникаючого кріопротектора ДМАЦ створює визначальний баланс між зовнішньоі внутріклітинним середовищем, що сприяє підвищенню осмотичної стійкості еритроцитів і зменшенню пошкоджуючої дії внутріклітинної кристалізації. Спосіб дозволяє зменшити показники осмотичної крихкості еритроцитів людини в два рази при поміщенні їх в ізотонічне і гіпотонічне середовища відносно показників, отриманих після заморожування еритроцитів з 30 % МЕПЕГ, і таким чином, підвищити схоронність клітин. Спосіб здійснюють таким чином. До еритроцитів, отриманих з донорської крові людини, додають 1:1 кріозахисне середовище, що містить суміш кріопротекторів - 15 % МЕПЕГ і 5 % ДМАЦ. Після 30-35 хв еквілібрації одержану суспензію переносять у контейнер і заморожують шляхом занурення у рідкий азот. Відігрівають на водяній бані при температурі 42 °C. Приклад 1. Еритроцити отримували з донорської крові людини, яка була заготовлена на гемоконсерванті "Глюгицір" і зберігалася після ексфузії не більш двох діб. Кріозахисне середовище, що містить суміш кріопротекторів МЕПЕГ і ДМАЦ у сумарної концентрації 20 % (15 % МЕПЕГ + 5 % ДМАЦ), додавали до еритроцитів 1:1. Після 30-35 хв еквілібрації заморожували до -196 °C в контейнерах місткістю 2 мл шляхом занурення у рідкий азот. Відігрівали на водяній бані при температурі 42 °C. Після відігріву визначали кількість життєздатних клітин за показниками осмотичної крихкості після перенесення в ізотонічне і гіпотонічне середовища. Осмотичну крихкість у 0,9 % і 0,6 %них розчинах NaCl визначали спектрофотометричним методом [3]. Результати наведені в Таблиці 1 у порівнянні з прототипом. З Таблиці 1 видно, що після кріоконсервування заявленим способом схоронність еритроцитів вища: показники осмотичної крихкості після поміщення еритроцитів в ізотонічне і гіпотонічне середовище нижчі у порівнянні з прототипом у два разі і, відповідно, кількість життєздатних клітин вища ніж в прототипі. Приклад 2 Спосіб здійснювали аналогічно Прикладу 1, за винятком того, що кріопротектори додавали в різних концентраціях. Результати наведені в Таблиці 2. З Таблиці 2 видно, що максимальна схоронність еритроцитів досягається при використанні суміші кріопротекторів МЕПЕГ і ДМАЦ, взятих в концентраціях 15 % і 5 %, відповідно. 1 UA 92248 U Таблиця 1 Схоронність еритроцитів людини після кріоконсервування, n=7 Спосіб кріоконсервування Заявлений Прототип Кількість життєздатних Осмотична крихкість у клітин, % 0,9 % NaCl, % 90-92 8,5±0,27 70-80 18,7±1,2 Осмотична крихкість у 0,6 % NaCl, % 10,2±0,99 29,3±1,8 Таблиця 2 Схоронність еритроцитів людини в залежності від співвідношення концентрацій кріопротекторів, n=7 Кількість Співвідношення концентрацій Осмотична крихкість у Осмотична крихкість у життєздатних клітин, МЕПЕГ і ДМАЦ, % 0,9 % NaCl, % 0,6 % NaCl, % % 5:5 62-70 30±2 38±3 10:5 75-80 16,4±1,35 25,4±1,6 15:5 90-92 8,5±0,27 10,2±0,99 20:5 80-85 15,8±1,53 20,8±1,48 25:5 70-80 19,9±2,51 29,3±1,71 5 10 Джерела інформації: 1. Виноград-Финкель Ф.Р., Федорова Л.И., Семенова Н.В. и др. Усовершенствование криоконсервирования эритроцитов при ультранизких температурах.// Проблемы гематологии и переливания крови.-1980. - № 9. - С. 19-23. 2. Патент № 14078 (Україна), МПК A61N1/02. Публ. 25.04.1997. Кріопротектор еритроцитів людини. 3. Меншиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. - М.: "Медицина".-1987. С. 119-120. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 Спосіб кріоконсервування еритроцитів людини, який включає додавання до суспензії еритроцитів кріозахисного середовища, що містить кріопротектор монометиловий ефір поліетиленгліколю, еквілібрацію при кімнатній температурі і послідуюче заморожування до -196° С шляхом занурення у рідкий азот, який відрізняється тим, що в кріозахисне середовище додатково вводять кріопротектор диметилацетамід в концентрації 5 %, а кріопротектор монометиловий ефір поліетиленгліколю беруть в концентрації 15 %, при цьому кріозахисне середовище додають до суспензії еритроцитів у співвідношенні 1:1. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2