Спосіб культивування рослинних тканин

Изобретение относится к технологии получения и выращивания пересадочных культур растительных тканей, например, культура ткани женьшеня (Panax ginseng), содержащих в качестве продуцентов биологически активные вещества, используемые в медицинской, микробиологической и других о траслях промышленности. Известен способ культивирования ткани лекарственных растений на питательной среде, содержащей неорганические соли, витамины, аденин сульфат, НУК, кинетин, 2,4-Д-мезоинозит, глицин, сахарозу и др. [1]. Эта среда обеспечивает увеличение кратности, прироста биомассы многих лекарственных растений в среднем в 10 раз через 8-10 недель культивирования, что для промышленного выращивания является мало эффективным. Наиболее близким к техническому решению заявляемого изобретения является способ культивирования ткани женьшеня [2] на питательной среде по Мурасиге и Скугу, которая содержит компоненты в следующем соотношении, мг/л: Макроэлементы по Мурасиге-Скугу 4,1.103-4,8 103 Микроэлементы по Мурасиге-Скугу 37,0-39,0 Кинетин 0,5-1,5 Тиаминхлорид 0,3-0,6 a - Нафтилуксусная кислота 1,0-3,0 Мезоинозит 60-90 Хелат железа 4,0-6,0 Гидролизат казеина 0,2.103-0,6 103 Сахароза 25,0.103-35,0 103 Агар-агар 5,0.103-8,0 103 Вода дистиллированная До 1л и родиолы розовой на модифицированной питательной среде [2]. Недостатком данной среды является дефицит гидролизата казеина, сахарозы и низкий выход биомассы, что в значительной степени затрудняет организацию крупнотоннажного промышленного производства. В основу изобретения поставлена задача усовершенствования способа культивирования растительных тканей, путем использования смеси аминокислотной гид-ролизатной (САГ) в качестве источника азотного питания, а в качестве углеродистого питания - сахара-сырца, чем обеспечивается увеличение выхода биомассы и за счет этого удешевляется процесс производства культуры ткани женьшеня. Поставленная задача решается тем, что в способе культивирования растительных тканей, включающем помещение ткани на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по Мурасиге-Скугу, кинетин, тиаминхлорид, a - нафтилуксусную кислоту, мезоинозит, хелат железа, источники азотного и углеродного питания, агар-агар, воду, выращивание и съем биомассы, согласно изобретению, в питательную среду вводят в качестве источника азотного питания смесь аминокислот гидролизатную, а в качестве углеродного питания сахар-сырец, при этом выращивание осуществляют на среде при следующем соотношении компонентов, мг/л: Макроэлементы по Мурасиге-Скугу 4,1.103-4,8 103 Микроэлементы по Мурасиге-Скугу 37,0-39,0 Кинетин 0,5-1,5 Тиаминхлорид 0,3-0,6 a - Нафтилуксусная кислота 1,5-2,3 Мезоинозит 60,0-80,0 Хелат железа 4,0-6,0 Смесь аминокислот гидролизатная 0,2.103-0,35 103 Сахар-сырец 20,0.103-30,0 103 Агар-агар 7,0.103-8,0 103 Вода дистиллированная До 1л Поставленная цель достигается тем, что культивирование ведут в емкости объемом 200мл на 90мл питательной среды. Использование смеси аминокислот гид-ролизатной (САГ), представляющей собой комплекс свободных аминокислот с большим содержанием пролина, необходимого растениям для ускорения роста, вместо гидролизата казеина, у которого компоненты связаны между собой пептидными связями, что затрудняет их утилизацию, повышает питательный и стимулирующий эффект азотистого компонента питательной среды. САГ представляет собой побочный продукт производства индивидуальных L-аминокислот по ТУ 10.16 УССР 40-88. В настоящее время организовано производство САГ промышленным способом. Массовая доля L-аминокислот в САГ составляет, %: Лизин 0-1,7 Гистидин 0 0,5 Аргинин 0-1.2 Аспарагиновая кислота 0,5-2,5 Треонин 46-8,0 Серин 5,6-10,0 Глутаминовая кислота 05-3,0 Пролин 8,5-15,0 Глицин 10,0-20,0 Аланин 13,0-20,0 Цистин 0,5-2,5 Валин 7,0-15,0 Метионин 0,5-2,0 Изолейцин 2,5-8,5 Лейцин 10,0-23,0 Тирозин 0-1,5 Фенилаланин 0-5,0 Оксипролин 0-2,0 Замена сахарозы на сахар-сырец не сказывается на росте и качестве биомассы, а стоимость питательной среды, при этом удешевляется. Выращивание биомассы женьшеня и родиолы розовой проводили на питательных средах с различными концентрациями химических компонентов и на разных объемах питательной среды. Пример 1. Навески компонентов питательной среды растворяют в дистиллированной воде из расчета, мг/л: Макроэлементы по Мурасиге-Скугу 4,57 103 Микроэлементы по Мурасиге-Скугу 38,22 Кинетин 1,0 Тиаминхлорид 0,4 a - Нафтилуксусная кислота 2,0 Мезоинозит 80,0 Хелат железа 5,0 Гидролизат казеина 0,6 103 Сахароза 30,0 103 Агар-агар 7,5 103 Вода дистиллированная До 1л Питательную среду разливают в банке объемом 200мл по 50мл и стерилизуют в автоклаве для уничтожения микроорганизмов при 0,9-1 ати 15мин. На стерильную питательную среду засевают инокулянтный материал в соотношении 1:50. Цикл выращивания - 30сут. Выход биомассы из одного культивационного сосуда 0,5г на АСВ, или 10г/л питательной среды. Πρимеρ 2. Каллусную ткань женьшеня культивируют аналогично примеру 1 на питательной среде следующего состава, мг/л: Макроэлементы по Мурасиге-Скугу 4,57 103 Микроэлементы по Мурасиге-Скугу 38,22 Кинетин 1,0 Тиаминхлорид 0,4 a - Нафтилуксусная кислота 2,0 Мезоинозит 80,0 Хелат железа 5,0 Смесь аминокислот гидролизатная 0,3 103 Сахар-сырец 25,0 103 Агар-агар 7,5 103 Вода дистиллированная До 1л Выход биомассы из одного культивационного сосуда составляет 0,68г на АСВ или 13,6г/л питательной среды. Πρимеρ 3. Каллусную ткань женьшеня культивировали аналогично примеру 2 при соотношении инокулюм: среда 1:70. Макроэлементы по Мурасиге-Скугу 4,57 103 Микроэлементы по Мурасиге-Скугу 38,22 Кинетин 1,0 Тиаминхлорид 0,4 a - Нафтилуксусная кислота 2,0 Мезоинозит 80,0 Хелат железа 5,0 Смесь аминокислот гидролизатная 0,3 103 Сахар-сырец 25,0 103 Агар-агар 7,5 103 Вода дистиллированная До 1л Выход биомассы из одного культивационного сосуда 0,94г на АСВ или 13,6г/л питательной среды. Пример 4. Каллусную ткань женьшеня культивировали аналогично примеру 2 при соотношении инокулюм: среда 1:90. Макроэлементы по Мурасиге-Скугу 4,57 103 Микроэлементы по Мурасиге-Скугу 38,22 Кинетин 1,0 Тиаминхлорид 0,4 a - Нафтилуксусная кислота 2,0 Мезоинозит 80,0 Хелат железа 5,0 Смесь аминокислот гидролизатная 0,3 103 Сахар-сырец 25,0 103 Агар-агар 7,5 103 Вода дистиллированная До 1л Выход сухой биомассы из одного культивационного сосуда 1,2 или 13,6г/л питательной среды. Πρимеρ 5. Каллусную ткань женьшеня культивировали аналогично примеру 2 при соотношении инокулюм: среда 1:100. Макроэлементы по Мурасиге-Скугу 4,57 103 Микроэлементы по Мурасиге-Скугу 38,22 Кинетин 1,0 Тиаминхлорид 0,4 a - Нафтилуксусная кислота 2,0 Мезоинозит 80,0 Хелат железа 5,0 Смесь аминокислот гидролизатная 0,3 103 Сахар-сырец 25,0 103 Агар-агар 7,5 103 Вода дистиллированная До 1л Выход сухой биомассы 0,9г из одного культивационного сосуда или 10г/л питательной среды. Каллусную ткань родиолы розовой (Rhodiola rosea L) культивировали аналогично примеру 2 при соотношении инокулюм:среда 1:70 на среде следующего состава, мг/л; Макроэлементы по Мурасиге-Скугу 4,57 103 Микроэлементы по Мурасиге-Скугу 38,22 Кинетин 1,0 Тиаминхлорид 0,4 a - Нафтилуксусная кислота 2,0 Мезоинозит 80,0 Хелат железа 5,0 Смесь аминокислот гидролизатная 0,3 103 Сахар-сырец 25,0 103 Агар-агар 7,5 103 Вода дистиллированная До 1л Выход биомассы родиолы розовой 0,9г на АСВ из одного культивационного сосуда. Пример 6. Каллусную ткань женьшеня и родиолы розовой культивировали аналогично примеру 1 на питательной среде следующего состава, мг/л: Макроэлементы по Мурасиге-Скугу 3,9 103 Микроэлементы по Мурасиге-Скугу 36,0 Кинетин 0,8 Тиаминхлорид 0,2 a - Нафтилуксусная кислота 1,5 Мезоинозит 50 Хелат железа 3,0 Смесь аминокислот гидролизатная 0,15 103 Сахар-сырец 20,0 103 Агар-агар 7,0 103 Вода дистиллированная До 1л Питательную среду разливают в банки объемом 200мл по 90мл и стерилизуют аналогично примеру 1. Выход сухой биомассы женьшеня с одного культивационного сосуда 1,0г или 11г/л, а родиолы розовой 0,7г или 10г/л питательной среды. Πρимеρ 7. Каллусную ткань женьшеня и родиолы розовой культивировали аналогично примеру 1 на питательной среде следующего состава, мг/л: Макроэлементы по Мурасиге-Скугу 4,1 103 Микроэлементы по Мурасиге-Скугу 37,0 Кинетин 0,5 Тиаминхлорид 0,3 a - Нафтилуксусная кислота 1,5 Мезоинозит 60,0 Хелат железа 4,0 Смесь аминокислот гидролизатная 0,2 103 Сахар-сырец 20,0 103 Агар-агар 7,0 103 Вода дистиллированная До 1л Выход сухой биомассы с одного культивационного сосуда 1,2г или 13,6г/л, а родиолы розовой - 13г/л питательной среды. Пример 8. Каллусную ткань женьшеня и родиолы розовой культивировали аналогично примеру 1 на питательной среде следующего состава, мг/л: Макроэлементы по Мурасиге-Скугу 4,8 103 Микроэлементы по Мурасиге-Скугу 39,0 Кинетин 1,5 Тиаминхлорид 0,6 a - Нафтилуксусная кислота 2,3 Мезоинозит 80,0 Хелат железа 6,0 Смесь аминокислот гидролизатная 0,35 103 Сахар-сырец 30,0 103 Агар-агар 8,0 103 Вода дистиллированная До 1л Выход сухой биомассы женьшеня с одного культивационного сосуда 1,2г или 13,6г/л, а родиолы розовой 13г/л питательной среды. Пример 9. Каллусную ткань женьшеня и родиолы розовой культивировали аналогично примеру 1 при таком соотношении химических компонентов, мг/л: Макроэлементы по Мурасиге-Скугу 5,0·103 Микроэлементы по Мурасиге-Скугу 40,0 Кинетин 1,7 Тиаминхлорид 0,7 a - Нафтилуксусная кислота 2,5 Мезоинозит 100 Хелат железа 7,0 Смесь аминокислот гидролизатная 0,45 Сахар-сырец 40,0 103 Агар-агар 8,5 103 Вода дистиллированная До 1л Выход сухой биомассы женьшеня 11,5г/л, а родиолы розовой - 10г/л питательной среды. Из приведенных примеров видно, что наилучший рост биомассы женьшеня и родиолы розовой наблюдается в примерах 7 и 8. При высоких концентрациях Химических компонентов в питательной среде рост биомассы угнетается и стоимость среды возрастает. Выход сухой биомассы с одного культивационного сосуда увеличено за счет увеличения объема питательной среды в сосудах объемом 200мл до 90мл. Если увеличить объем до 100мл, то при стерилизации подмокают ватно-марлевые пробки, которыми закрыты сосуды. Это приводит к инфициро-паиию каллуса во время 30-ти суточного культивирования. Использование банок большего объема приведет к большим удельным затратам электроэнергии на единицу продукции. При этом в высоких сосудах полностью питательная среда во время роста биомассы не расходуется. Поэтому наилучшими сосудами для выращивания женьшеня и родиолы розовой в заводских условиях являются банки объемом 200мл. Таким образом, предложенная питательная среда позволяет увеличить выход биомассы на 30% с 1л питательной среды; заменить дефицитное пищевое сырье на отходы производства мясо-молочной промышленности; удешевить питательную среду за счет замены источника азотного и углеродного питания; увеличить вы ход биомассы из одного культивационного сосуда в два раза при неизменном инокулюме.