Спосіб одержання біологічно активних речовин з жовчі тварин

Спосіб одержання біологічно активних речовин з тваринної сировини, який відрізняється тим, що біологічно активні речовини одержують за допомогою послідовного розділення фракцій жовчі шляхом висаджування білкової фракції водорозчинним крохмалем у концентрації 3-30 %, спиртом етиловим у співвідношенні розчин - екстрагент від 1:1 до 1:100 та наступним екстрагуванням сумішшю хлороформ - спирт етиловий у співвідношенні від 1:1 до 1:10. (19) (21) a201000821 (22) 27.01.2010 (24) 10.06.2011 (46) 10.06.2011, Бюл.№ 11, 2011 р. (72) МОШКО МИХАЙЛО ОЛЕКСАНДРОВИЧ, СТРЕМОУХОВ ОЛЕКСАНДР ОЛЕКСАНДРОВИЧ (73) МОШКО МИХАЙЛО ОЛЕКСАНДРОВИЧ, СТРЕМОУХОВ ОЛЕКСАНДР ОЛЕКСАНДРОВИЧ (56) RU 2 034 849 C2, 10.05.1995 RU 2 302 249 C2, 10.07.2007 RU 2 108 795 C1, 20.04.1998 CN 101143886 A, 19.03.2008 3 кон», Способ выделения хенодезоксихолевой кислоты, фракции липидов, содержащей холестерин, и фракции жирных кислот. Суть способу полягає в тому, що отриманий препарат використовують для лікування жовчнокам'яної хвороби без хірургічного втручання. Продуктом, який одержують за цим способом, є хенодезоксихолева кислота (ХДХК) + фракція ліпідів, що містить холестерин і фракцію жирних кислот. Вихід складає 71-76%, (холестерин). Реагент 1: жовчні міхури птахів. Реагент 2: луг. Реагент 3: суміш етилового спирту й толуолу у співвідношенні 0,25:1. Після відокремлення фракції ліпідів з екстракту виділяють холестерин. Гідролізат обробляють мінеральною кислотою до рН 1-3 і додають біполярний екстрагент, переважно етиловий спирт, петролейний ефір, гексан для виділення фракції жирних кислот. Переведення низькоплавкої ХДХК з т. пл. 120-128 °С у високоплавку з т. пл. 160-164°С проводять у слабкому розчині лугу, підкисленням мінеральною кислотою до рН 4-4,5, екстрагуванням її органічним розчинником, концентруванням екстракту і додаванням до залишку малополярного розчинника з витримкою розчину при 6-2°С, ХДХК, що випала в осад з т. пл. 140-145°С кип'ятять в органічному розчиннику з т. кип. 60-140°С. Недоліком відомого способу отримання жовчної кислоти є те, що він вимагає великих затрат ручної праці, дорогого устаткування і енергетичних витрат. Іншими недоліками способу-прототипу є необхідність виділення з жовчі тільки жовчних кислот; виділення фракції ліпідів і жирних кислот в суміші, що утилізуються і прямує в каналізацію. Задачею винаходу є створення нового способу для отримання препаратів на основі фракцій жовчі тварин шляхом висаджування білкової фракції та екстракції ліпофільного комплексу при заданих умовах, що дозволяє отримати декілька комплексів речовин із різноманітною активністю. Поставлена задача вирішується таким чином, що одержання фракцій жовчі з різноманітною активністю проводиться шляхом висаджування білкової фракції водорозчинним крохмалем у концентрації 3-30%, спиртом етиловим у співвідношенні розчин - екстрагент від 1:1 до 1:100 та наступним екстрагуванням сумішшю хлороформ - спирт етиловий у співвідношенні від 1:1 до 1:10 в результаті цих операцій утворюється декілька фракцій жовчі з різноманітною активністю. Вибір екстрагенту і параметрів умов способу визначено експериментальним шляхом, враховуючи ступінь біологічної активності отриманого кінцевого продукту, його ефективності, доступності та безпечності при одержанні у промислових умовах. Експериментально встановлено, що використання як екстрагенту водорозчинного крохмалю, етилового спирту та суміші хлороформ - спирт етиловий забезпечує найбільшу повноту витягу біологічно активних речовин. Спосіб, який заявляється, здійснюють наступним чином. До досліджуваної жовчі додавали водорозчинний крохмаль від 3-30%, виливали отриманий розчин у спирт етиловий при співвідношенні розчин спирт від 1:1 до 1:100, в результаті випадає осад. 94830 4 Отриману суміш фільтрували під вакуумом, і фільтрат промивали етиловим спиртом. Осад висушили у сушильній шафі при температурі не більш 80°С, до кремового або ясно-жовтого кольору і вологості до 15%. Вихід сухого залишку у перерахунку на крохмаль складав до 120%. Отриманий фільтрат упарювали під вакуумом до повного видалення спирту. Водний залишок підкисляли кислотою до рН 1-5. Подальшу екстракцію проводили сумішшю хлороформ-етанол у співвідношенні 1:1 1:10, з розрахунку співвідношення органічної фази до водної від 1:1 до 1:50. Органічні витяги об'єднували в один і упарювали до густого залишку більше 10% від об'єму початкової сировини. Водний залишок також упарювали, сухий вихід складав більше 1% від об'єму початкової сировини. Приклад 1 До 1 л досліджуваної жовчі додавали 130 г (13%) водорозчинного крохмалю. Для кращого розчинення крохмалю в жовчі його попередньо розчиняли у мінімальній кількості води і після охолодження крохмального розчину його при перемішуванні вливали у жовч, перемішування триває до повного змішування рідин (до 3 хв.), отриману суміш вливали в п'ятикратну кількість 96% етанолу. Відразу утворюється осад, який фільтрували під вакуумом, і промивали етиловим спиртом. Осад, що утворився на фільтрі, від кремового до ясножовтого кольору висушували у вакуум-сушильній шафі при температурі 30-40°С і подрібнювали. Вихід сухого залишку склав 140 г, із вмістом крохмалю 95%. Отриманий фільтрат упарювали під вакуумом до повного видалення спирту з розчину. Водний залишок жовчі підкислювали НСl до рН 2, з метою руйнування міцелярних комплексів. Подальше виділення компонентів проводили сумішшю хлороформ-етанол у співвідношенні 1:1, з розрахунку співвідношення органічної фази до водної 1:5. Органічні витяги об'єднували в один і упарювали до густого залишку, вихід його склав 190 г (до 10% у перерахунку на сухий залишок жовчі). Отриманий густий екстракт мав забарвлення з зеленуватим або жовтим відтінком. Водний залишок також упарювали під вакуумом до 10 мл, забарвлення розчину було від світло-жовтого до темно-жовтого. Приклад 2 До 1 л досліджуваної жовчі додавали 220 г (22%) водорозчинного крохмалю. Для кращого розчинення крохмалю в жовчі його попередньо розчиняли у мінімальній кількості води і після охолодження крохмального розчину його при перемішуванні вливали у жовч, перемішування триває до повного змішування рідин (до 3 хв.), отриману суміш вливали в п'ятикратну кількість 96% етанолу. Відразу утворюється осад, який фільтрували під вакуумом, і промивали етиловим спиртом. Осад, що утворився на фільтрі, від кремового до ясно жовтого кольору висушували у вакуум-сушильній шафі при температурі 30-40°С і подрібнювали. Вихід сухого залишку склав 235 г, із вмістом крохмалю 95%. Отриманий фільтрат упарювали під вакуумом до повного видалення спирту з розчину. Водний залишок жовчі підкислювали НСl до рН 2, з метою 5 руйнування міцелярних комплексів. Подальше виділення компонентів проводили сумішшю хлороформ-етанол у співвідношенні 1:1, з розрахунку співвідношення органічної фази до водної 1:5. Органічні витяги об'єднували в один і упарювали до густого залишку, вихід його склав 180 г (до 9% у перерахунку на сухий залишок жовчі). Отриманий густий екстракт мав забарвлення з зеленуватим або жовтим відтінком. Водний залишок також упарювали під вакуумом до 15 мл, забарвлення розчину було від світло-жовтого до темно-жовтого. За результатами мікробіологічного дослідження встановлено, що усі отримані сполуки мають виражену фунгіцидну активність та виявляють різноманітну бактеріостатичну дію на штами вищенаведених мікроорганізмів. Фармакологічні дослідження показали, що фосфоліпіди жовчі виявляють антиоксидантну активність. За результатами досліджень визначені основні закономірності зв'язку структури синтезованих похідних жовчних кислот з фармакологічною активністю. Розроблена методика кількісного визначення вільних та кон'югованих жовчних кислот спектрофотометричним методом. Проведені дослідження біологічно активних речовин жовчі та синтезованих сполук на основі жовчних кислот показали перспективність жовчі як 94830 6 джерела одержання біологічно активних речовин стероїдів, фосфоліпідів, ферментів та виявили антимікробну та антиоксидантну дію досліджуваних сполук. Таким чином, фракції, одержані за заявленим способом, проявляють виражену ферментну дію і можуть бути рекомендовані до застосування як перспективні засоби. Приклад 3 Досліди впливу отриманих речовин були поставлені на статевозрілих щурах обох статей масою 150-170 г. Ініціацію вільнорадикальних реакцій в печінці проводили введенням селективного гепатотоксину - тетрахлорметану під шкіру у вигляді 50% олійного розчину. Тетрахлорметан вводили у дозі 0,8 мл на 100 г маси протягом двох днів. Досліджуваний препарат вводили у дозі 25 мг/кг у шлунок за 2 години до і через 2 години після ін'єкції тетрахлорметану (ССl4). Після двох днів дослідження тварин декатінували і у гомогенаті печінки визначали вміст кінцевого продукту пероксидації - малонового діальдегіду (МДА). Результати дослідів (таблиця) показали, що введення ліпідів жовчі істотно знижує рівень МДА як у печінці, так і в сироватці крові дослідних тварин у порівнянні з контрольними. Таблиця Досліджувана речовина ССl4 + ліпофільна фракція жовчі ССl4 + силібор ССl4 + гепатит Інтакт АлАт мкмоль/л 0,92±0,01 2,24±0,06 3,05±0,26 0,88±0,05 % 98,2 37,3 МДА мкмоль/л 111,9±10,3 207,6±7,47 215,8±9,9 102,0±7,89 % 91,3 7,2 Достовірність до контролю при P