Спосіб руйнування клітинної стінки дріжджів phaffia rhodozyma

Реферат: Спосіб руйнування клітинної стінки дріжджів Phaffia rhodozyma включає обробку суспензії клітин ультразвуком. Суспензію готують у дистильованій воді та обробляють ультразвуковими коливаннями з робочою частотою 22 кГц потужністю 40 Вт протягом 30 хвилин за кімнатної температури. UA 95900 U (54) СПОСІБ РУЙНУВАННЯ КЛІТИННОЇ СТІНКИ ДРІЖДЖІВ PHAFFIA RHODOZYMA UA 95900 U UA 95900 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології і мікробіології, а саме до методів руйнування клітин дріжджів, зокрема каротиносинтезувальних Phaffia rhodozyma. Спосіб може використовуватись у науково-дослідних установах, підприємствах мікробіологічної та харчової промисловості, що працюють з культурами дріжджів. Відомий спосіб руйнування клітин каротиносинтезувальних дріжджів Phaffia rhodozyma з використанням ензимів (глюканаз та хітиназ) бактерій Bacillus circulans (Johnson E, Villa T, Lewis M, Phaff H. Simple method for the isolation of astaxanthin from the basidiomycetous yeast Phajfla rhodozyma Appl. Envir. - V. 35. - № 6, 1155-1159 (1978)). Недоліком цього методу є спільне культивування дріжджів та бактерій і неможливість кінцевого розділення клітин. Відомий спосіб хімічного руйнування клітин дріжджів за допомогою диметилсульфоксилу (Sedmak JJ, Weerasinghe DKE, Jolly SO Extraction and quantitation of astaxanthin from Phaffia rhodozyma. Biotechnol. Tech. 4: 107-112 (1990)) та хлоридної кислоти (Ni H, Chen Q, He G, Yang Y Optimization of acidic extraction of astaxanthin from Phaffia rhodozyma. J. Zhejiang Univ.-Sc D 9: 51-59 (2008)). Недоліком цього способу є токсичність препаратів, що використовуються, та деструкція каротиноїдів в процесі обробки клітин. Найближчим по суті до способу, що заявляється, є спосіб руйнування клітин дріжджів Phaffia rhodozyma за допомогою ультразвукових коливань (Wu W., Yu X. Optimization of ultrasoundassisted extraction procedure to determine astaxanthin in Xanthophyllomyces dendrorhous by BoxBehnken design. Adv J Food Sc Tech 5 (11): 1536-1542 (2013)). Особливістю цього способу є використання біомаси ліофілізованих каротиносинтезувальних дріжджів, обробку клітин ультразвуковими коливаннями потужністю 200 Вт за температури 49 °C протягом 26 хвилин у середовищі 5 М розчину молочної кислоти. Заявлений спосіб і прототип мають спільну ознаку у роботі використовують ультразвукові коливання. Недоліком прототипу є попередня обробка біомаси дріжджів (ліофілізація), використання органічної кислоти та підвищеної температури при обробці ультразвуком. Заявлений нами спосіб усуває недоліки прототипу і забезпечує оптимальні умови для руйнування клітин каротиносинтезувальних дріжджів Phaffia rhodozyma. В основу корисної моделі поставлено задачу створити ефективний спосіб руйнування клітинної стінки дріжджів Phaffia rhodozyma для вилучення каротиноїдів та використання зруйнованих клітин як кормової добавки, який би був доступним та придатним для використання у дослідних лабораторіях та на підприємствах мікробіологічної промисловості. Технічний результат досягається обробкою водної суспензії клітин дріжджів Phaffia rhodozyma ультразвуковими коливаннями з робочою частотою 22 кГц, потужністю 40 Вт, протягом 30 хвилин за кімнатної температури. Використання заявлених умов обробки біомаси дріжджів забезпечує високий відсоток руйнування клітин. При проведенні патентно-інформаційного пошуку виявлено технічне рішення, в якому є суттєва ознака спільна із заявленим рішенням: для руйнування клітин дріжджів Phaffia rhodozyma використовують ультразвукові коливання. Однак, наявність зазначеної спільної з прототипом ознаки недостатня для отримання технічного результату, який забезпечує заявлений спосіб, оскільки у заявленому способі застосовують водну суспензію дріжджів Phaffia rhodozyma, обробку клітин проводять ультразвуковими коливаннями з робочою частотою 22 кГц, потужністю 40 Вт, протягом 30 хвилин за кімнатної температури. Технічних рішень, які б за сукупністю ознак співпадали із заявленим способом, у патентній і науково-технічній інформації не виявлено. У джерелах патентної і науково-технічної інформації не знайдено технічних рішень, в яких би були описані відомості про ознаки, що відрізняють заявлений спосіб від прототипу і забезпечують досягнення технічного результату: руйнування клітинної стінки дріжджів Phaffia rhodozyma. Цей спосіб може бути використаний на мікробіологічних підприємствах різної форми власності для руйнування клітин дріжджів, для виробництва кормових добавок, зокрема клітинних стінок каротиносинтезувальних дріжджів. Спосіб відповідає критерію "промислова придатність". 3 Заявлений спосіб здійснюють так: готують 100 см суспензії клітин дріжджів Phaffia rhodozyma у дистильованій воді, обробляють ультразвуковими коливаннями з робочою частотою 22 кГц, потужністю 40 Вт, протягом 30 хвилин за кімнатної температури. Клітини після обробки центрифугують та, за потреби, сушать за температури 37 °C або заливають розчинником для екстракції каротиноїдів. Спосіб руйнування клітинної стінки дріжджів Phaffia rhodozyma та його переваги над прототипом підтверджено науковими дослідженнями, результати яких представлені нижче. 1 UA 95900 U 5 10 15 20 Проведено ультразвукову обробку клітин дріжджів Phaffia rhodozyma у лабораторних умовах з наступним висіванням обробленої та вихідної суспензії на агаризоване середовище для визначення відсотка зруйнованих клітин. Культура: штам дріжджів Phaffia rhodozyma КНГ 1. 3 Поживне середовище: дріжджі вирощують у синтетичному середовищі, яке містить (г/дм ): 3 3 3 3 KН2РО4 - 1 г/дм ; MgSO4×7H2O - 0,5 г/дм ; (NH4)2SO4 - 2 г/дм ; СаСl2×6Н2О - 0,1 г/дм , 3 3 3 дріжджовий екстракт - 2 г/дм , сахароза - 20 г/дм , біотин - 2 мкг/дм , ячмінне сусло (2 %). 3 3 Умови культивування: дріжджі вирощують у колбах Ерленмейєра об'ємом 500 см із 100 см середовища на качалці за температури 20 °C протягом чотирьох діб. Біомаса культури 3 становить 2-3 мг/см . Приготування суспензії клітин: вміст колби після вирощування центрифугують при 4000 3 об./хв. на центрифузі, двічі промивають дистильованою водою по 50 см , центрифугують та 3 3 ресуспендують у 100 см дистильованої стерильної води. Відбирають 0,5 см суспензії та роблять десятикратні розведення із висіванням на чашки Петрі з сусло-агаром (для встановлення титру вихідної необробленої суспензії). 3 Обробка клітин ультразвуком: 100 см суспензії клітин виливають у циліндр та застосовують ультразвукові коливання від генератора УЗДН-2Т з робочою частотою 22 кГц, потужністю 40 Вт протягом 30 хвилин. Відбирають 0,5 мл суспензії та виконують десятикратні розведення із висіванням на чашки Петрі з сусло-агаром (для встановлення титру обробленої суспензії). Клітини дріжджів на чашках Петрі із сусло-агаром вирощують за температури 20 °C у термостаті протягом 6 діб. Проводять підрахунок колоній та обчислення титру обробленої та необробленої суспензії клітин. Результати досліджень представлені у таблиці. Таблиця Показник руйнування клітин дріжджів Phaffia rhodozyma ультразвуком Умови експерименту 22 кГц, 40 Вт, 30 хв., кімнатна температура Титр вихідної суспензії, Титр обробленої клітин суспензії, клітин 9 2,2×10 2,5×10 % зруйнованих клітин 7 98,86 25 30 При проведенні досліджень за умов потужності 200 Вт за температури 49 °C протягом 26 хвилин у середовищі 5 М розчину молочної кислоти (прототип) показник руйнування клітин дріжджів Phaffia rhodozyma становить 97,89 %. Таким чином, аналіз представлених даних вказує, що заявлений спосіб є зручним, ефективним та технологічно виправданим. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 Спосіб руйнування клітинної стінки дріжджів Phaffia rhodozyma, що включає обробку суспензії клітин ультразвуком, який відрізняється тим, що суспензію готують у дистильованій воді та обробляють ультразвуковими коливаннями з робочою частотою 22 кГц потужністю 40 Вт протягом 30 хвилин за кімнатної температури. Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2