Штам дріжджів phaffia rhodozyma імв y-5026 – продуцент каротиноїду астаксантину

Штам дріжджів Phaffia rhodozyma ІMB Y-5026 продуцент каротиноїду астаксантину, який синтезує 14-16 г астаксантину/кг сухої маси клітин. (19) (21) u200703848 (22) 06.04.2007 (24) 12.11.2007 (72) ВЛІЗЛО ВАСИЛЬ ВАСИЛЬОВИЧ, UA, ШАХ ЄВГЕН СТЕПАНОВИЧ, UA, КАПЛІНСЬКИЙ ВАСИЛЬ ВАСИЛЬОВИЧ, UA, КАМІНСЬКА МАРТА ВОЛОДИМИРІВНА, UA, БОРЕЦЬКА НАТАЛІЯ ІВАНІВНА, UA, КОЛІСНИК МАР'ЯНА ІВАНІВНА, 3 містяться поодиноко, парами, інколи короткими ланцюжками чи невеликими гронами, в товщі агару утворюють псевдоміцелій. На агаризованому середовищі колонії віком 7 діб круглі, розміром 3-4мм, профіль припіднятий, поверхня гладка матова, інтенсивного червонооранжевого кольору. На скошеному сусло-агарі 3-х добовий штрих гладкий, матовий, червоно-оранжевого забарвлення. Клітини штаму асимілюють сахарозу, мальтозу, рафінозу, проте не використовують лактозу і гліцерол. При культивуванні в середовищі вищевказаного складу, температурі 20°С і аерації 0,6л повітря/л середовища на ферментері АНКУМ - 2М спостерігається дві фази росту: перша - дихально-ферментативна, під час якої утворюється етанол і друга - дихальна фаза росту, коли використовується етанол, утворений у першій фазі росту. Біомаса клітин на четверту добу вирощування досягає 4г/л. Каротиноїди синтезуються протягом усього періоду культивування, однак найбільша їх кількість синтезується у дихальній та стаціонарній фазах. Як джерело азоту клітини використовують сульфат амонію, диамоній-фосфат, сечовину але не нітрат калію і етиламін. Відношення до кисню. Штам P. rhodozyma ІMB Y-5026 відноситься до факультативних аеробів. Штам росте при температурі 18-26°С, оптимум температури 20°С, оптимум рН становить 4,0-6,0. Штам зберігається на агаризованому суслоагарі в холодильнику. Клонується 2 рази на рік і відсівається 3-4 клони на 7-10 день вирощування. Каротиноїди є важливим компонентом неферментативної системи антиоксидантного захисту в організмі тварин. Особливої уваги заслуговує астаксантин, антиоксидант, який є ефективнішим у 10-12 раз ніж b-каротин і в 500 раз, порівняно з вітаміном Е. Астаксантин захищає клітини організму від пошкоджуючої дії активних форм кисню, вільнорадикального окислення поліненасичених жирних кислот, білків, нуклеїнових кислот, що приводить до передчасного старіння, серцево-судинних захворювань, атеросклерозу та інших захворювань. Астаксантин у невеликих кількостях міститься у деяких видів риб, ракоподібних та водоростей Гематококкус. Дослідження вчених США, Японії та Канади свідчать про пряму залежність між рівнем споживання астаксантину і зниженням рівня онкологічних, серцево-судинних захворювань, а також підвищенням стійкості до вірусних бактерійних і грибкових інфекцій. Захисні властивості астаксантину направлені на посилення імунної системи за рахунок підвищення активності Т-лімфоцитів та синтезу g-інтерферону. Астаксантин, виділений з біомаси дріжджів може використовуватися в медицині і ветеринарії, як сильний антиоксидант, з метою профілактики і лікування онкологічних та нейродегенеративних захворювань, захисту від ультрафіолетових та рентгенівських променів. Одержані з його допомогою каротиноїди і астаксантин можуть бути застосовані як харчові добавки, а також для 27514 4 розробки лікувальних препаратів у ветеринарії і медицині. Селекціонований нами штам P. rhodozyma ІMB Y-5026, клітини, якого містять 14-16мг астаксантину/г сухої маси можна використовувати при промисловому виробництві дріжджів з метою створення кормових препаратів каротиноїдів, також для розробки антиоксидантних рецептур для корекції оксидативного стресу, який виникає при різних патологічних станах. Приклади конкретного використання Одержання штаму. Штам дріжджів P. rhodozyma 1MB Y-5026 був одержаний з штаму P. rhodozyma ІMB Y-5021, який синтезує 0,8-1,0мг каротиноїдів/г сухої маси, шляхом ступінчастого мутагенезу з наступним відбором найпродуктивніших клонів. Для індукції мутацій у дріжджів хімічним мутагеном суспензію двохдобової культури (3x106кл/мл) обробляли 0,02%-ним розчином Nметил-N-нiтро-N-нітрозогуанідину при температурі 23°С та постійному перемішуванні протягом 10 хвилин. Дію мутагена зупиняли центрифугуванням і наступним відмиванням дистильованою водою. Суспензію оброблених клітин висівали на чашки Петрі з сусло-агаром та вирощували у термостаті при 20-22°С протягом 7 діб. Відбирали колонії інтенсивного оранжевого кольору і найпродуктивніші клони піддавали наступному мутагенезу шляхом обробки 0,02% розчину нітрозогуанідину. Одержаний таким способом штам P. rhodozyma ІMB Y-5026 синтезує і нагромаджує в клітинах 25-30мг/г сухої маси каротиноїдів. Екстракцію каротиноїдів із сирої біомаси проводили 96% етанолом. Каротиноїди переводили у гексан та упарювали під струменем інертного газу. Сухий залишок розчиняли в хлороформі. Фракційний склад каротиноїдів визначали методом тонкошарової хроматографії, використовуючи систему розчинників петролейний ефір: діетиловий ефір (2:1). Як свідок використовували астаксантин (Sigma). Електронні спектри поглинання суміші та окремих фракцій пігментів записували на реєструвальному двохвильовому спектрофотометрі „Specord M-40”. При розділенні суміші каротиноїдів встановлено, що екстракт каротиноїдів біомаси, вирощеної на синтетичному середовищі, складається з двох фракцій каротиноїдів, ідентифікованих як астаксантин, один з найсильніших природних антиоксидантів, та фоенікоксантин. На астаксантин припадає 66,7% від загальної кількості каротиноїдів (табл.1). Фракційний склад каротиноїдів біомаси дріжджів P. rh Синтетичне Загальний вміст каротиноїдів, мг/г сухої маси 23,4±2,0 Синтетичне 32,9±2,80 Середовище % фракції від загальної кількості 33,3 66,7 33,3 Макс погли фрак 47 47 46 5 27514 + патока (7%) 22,2 44,5 6 478,7 476,8 фоенікоксантин астаксантин Екстракт каротиноїдів із біомаси клітин, вирощених у середовищі з додаванням зеленої патоки, складається з трьох фракцій. Крім виявлених фракцій астаксантину та фоенікоксантину з'являється фракція з максимумом поглинання 465,9нм, ідентифікована нами як каротини. Поява нової фракції викликана присутністю у зеленій патоці деяких попередників каротинів, що зсувають шляхи каротиногенезу в бік утворення саме цих каротиноїдів. Слід відмітити, що вміст астаксантину у біомасі дріжджів, вирощених на середовищі з добавкою зеленої патоки, складає 44,5%, що становить 14,6мг/г сухої маси, а на синтетичному середовищі відповідно 66,7% і 15,6мг/г сухої маси. Штам дріжджів P. rhodozyma ІMB Y-5026 пройшов лабораторне випробовування. При лабораторній перевірці одержаного штаму визначали показники біомаси в порівнянні до вихідного штаму і кормових дріжджів. Приклад: Дріжджі вирощували в середовищі такого складу (г/л): KН2РО4 - 1; MgSO4 x 7Н2О - 0,2; (NH4)2SO4 - 2; СаСІ2х2Н2О - 0,1; сахароза - 15; пивне сусло - 20; дріжджовий екстракт - 2; біотин 2 х 10-6 при температурі 20°С і аерації 0,6л повітря\л середовища на ферментері АНКУМ - 2М протягом 4-х діб при температурі 20°С Каротиноїди в екстрактах клітин визначали колориметричним методом. Порівняння складу якості біомаси кормових дріжджів і дріжджів P. rhodozyma вихідного і селекціонованого штамів приведено в таблиці 2. Таблиця 2 Порівняльна характеристика біомаси кормових і каротинсинтезуючих дріжджів Phaffia rhodozyma вихідного та селекціонованого штамів Показники Сирий протеїн, % Сирий жир, % Сира клітковина, % Каротиноїди, г/кг Астаксантин, г/кг Коефіцієнт перетравності, % Кормові 44,2 3,3 3,4 сліди не виявлено 90,8 Як видно із даних таблиці, селекціонований штам дріжджів P. rhodozyma 1MB Y-5026 нагромаджує в клітинах 25-30мг/г сухої маси каротиноїдів, що в 30 раз перевищує вміст цих речовин в клітинах вихідного штаму P. rhodozyma ІMB Y-5021. Вміст астаксантину у біомасі селекціонованого штаму становить 16-20г/кг. Штам дріжджів P. rhodozyma ІMB Y-5026 зберігається в депозитарії Інституту мікробіології та вірусології НАН України. Дріжджі P. rhodozyma ІMB Y-5021 24,6±0,15 17,9+0,05 3,3 0,8-1,0 0,5-0,6 89,7 P. rhodozyma ІMB Y-5026 23,8±0,05 17,5±0,20 3,3 23-32 14-16 90,6