Спосіб визначення монофазних автоімунних кислотних теплових та холодових гемолізинів мікрометодом

Реферат: Спосіб визначення монофазних автоімунних кислотних теплових та холодових гемолізинів шляхом поєднання у різних варіаціях досліджуваної сироватки, еритроцитів, донорського комплементу та 1/3 N розчину соляної кислоти. Реакцію проводять в мікропробірках з витягнутим конусним дном, об'єм реагуючих компонентів зменшують у 5 разів, а пробірки після відповідної температурної інкубації центрифугують протягом 10 хв при 1000 об/хв. UA 99298 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ МОНОФАЗНИХ АВТОІМУННИХ КИСЛОТНИХ ТЕПЛОВИХ ТА ХОЛОДОВИХ ГЕМОЛІЗИНІВ МІКРОМЕТОДОМ UA 99298 U UA 99298 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі медицини, зокрема до імуногематологічних досліджень у гематології. Практика визначення автоімунних антиеритроцитарних антитіл вимагає визначення всього спектру їх серологічних варіантів, зокрема автоімунних монофазних кислотних теплових та холодових гемолізинів, частка яких становить близько 17-20 % від усіх автоімунних антиеритроцитарних антитіл [1-3]. Як правило, дослідження обмежуються виявленням неповних теплових антитіл та компонентів комплементу в пробі Кумбса, що не дозволяє в повній мірі оцінити наявність автоімунного гемолізу. Найближчим і єдиним аналогом запропонованого способу є спосіб визначення монофазних холодових та теплових кислотних гемолізинів [2]. Суть його полягає у поєднанні в різних варіаціях досліджуваної сироватки (2,5 мл), 30 % зависі еритроцитів (0,4 мл), донорського комплементу (1,5 мл) і 1/3 N розчину соляної кислоти (0,4 мл) з наступною інкубацією при відповідних температурних режимах (4° та 37 °C) та центрифугуванням протягом 1 хв при швидкості обертання ротора 1500 об/хв. Недоліком вищеописаного способу є потреба в значних об'ємах досліджуваного матеріалу, що при комплексному імунологічному обстеженні хворого складає певні труднощі. В основу корисної моделі поставлено задачу мінімізації об'єму затратного матеріалу при збереженні суті та інформативності реакції. Поставлена задача вирішується шляхом зменшення об'єму компонентів реакції у 5 разів, застосуванням мікропробірок об'ємом 0,5 мл з витягнутим конусним дном для покращення сепарації осаду, м'якого режиму центрифугування для зменшення навантаження на клітинну мембрану. У дослідження включається 8 пробірок: 4 для визначення теплових монофазних кислотних автоімунних гемолізинів (1 ряд) та 4 - для холодових (2 ряд). Вміст та співвідношення реагуючих компонентів у пробірках 1 та 2 ряду ідентичні: - в 1 пробірку вносять 100 мкл досліджуваної сироватки крові хворого та 10 мкл 1/3 N соляної кислоти; - в 2 пробірку - 50 мкл досліджуваної сироватки крові хворого, 50 мкл одногрупової свіжої сироватки донора як комплементу та 10 мкл 1/3 N соляної кислоти; - в 3 пробірку - 100 мкл сироватки крові хворого; - в 4 пробірку вносять 100 мкл одногрупової свіжої сироватки донора як комплементу і 10 мкл 1/3 N соляної кислоти. В кожну із 8 пробірок додають по 10 мкл 30 % зависі тричі відмитих 0,9 % розчином NaCl еритроцитів досліджуваної особи. 1-й ряд мікропробірок інкубувати при температурі 37 °C протягом 60 хв, 2-й ряд - при температурі 4 °C протягом 30 хвилин, потім - при кімнатній температурі (18-25 °C) протягом ще 30 хв. Усі пробірки з сумішшю піддати центрифугуванню протягом 10 хв при обертанні ротора 1000 об/хв. Оцінка реакції проводиться за наявністю чи відсутністю гемолізу в надосадовій рідині в пробірках: 1. Гемоліз відсутній у всіх пробірках - теплові (1 ряд) та холодові (2 ряд) монофазні кислотні гемолізини у сироватці крові хворого відсутні. 2. Гемоліз присутній у 1-ій та 2-ій пробірках, відсутній у 3-ій та 4-ій - наявність монофазних кислотних теплових (1 ряд) та холодових (2 ряд) гемолізинів у сироватці крові хворого. 3. Гемоліз у 1-ій пробірці, відсутній у 2-ій, 3-ій, 4-ій пробірках при наявності монофазних кислотних теплових та холодових гемолізинів у сироватці хворого і при слабкій активності комплементу у сироватці донора. 4. Гемоліз наявний у 2-ій пробірці, відсутній у 1-ій, 3-ій, 4-ій пробірках - при слабкій активності комплемента у сироватці хворого, але наявності теплових (1-ий ряд) та холодових (2ий ряд) гемолізинів. Приклади застосування способу. З дитячої клініки з метою встановлення наявності автоімунних антиеритроцитарних антитіл в групу імуногематології була направлена кров хворої на гемолітичну анемію дитини Г., 9 років. Об'єм доставленого матеріалу: 2 мл. Після здійснення необхідних досліджень кількість матеріалу виявилася недостатньою для визначення монофазних кислотних теплових та холодових гемолізинів класичним способом. Було застосовано запропонованийнами спосіб визначення монофазних кислотних теплових та холодових гемолізинів мікрометодом. Результат дослідження: у надосадовій рідині 1-ої пробірки 1 ряду було виявлено гемоліз. Висновок: у сироватці крові хворого наявні монофазні теплові кислотні гемолізини, що свідчить про автоімунний характер гемолізу. 60 1 UA 99298 U 5 10 Джерела інформації: 1. Wintrobe's clinical hematology / [ed. by J. P. Greer, J. Foerester, J. N. Lukens et al.]. - [11th ed.]. - Philadelfia: LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS, 2004.-1508 p. (P. 1142-1182). 2. Гусева С. А. Аутоиммунная гемолитическая анемія: диагностика и лечение (лекция) / Гусева С. А., Гончаров Я. П. // Український журнал гематології та трансфузіології.-2012. - № 1. С. 34-50. 3. Ланцковский Ф. Детская гематология и онкология / Ф. Ланцковский; пер. с англ. С. Шершакова. - [изд. 3-е]. - М.: Лори, 2005.-763 с. 4. Дыгин В.П. Аутоиммунные заболевания системы крови / В.П.Дыгин. -Ленинград: Медицина, 1964.-222 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 Спосіб визначення монофазних автоімунних кислотних теплових та холодових гемолізинів шляхом поєднання у різних варіаціях досліджуваної сироватки, еритроцитів, донорського комплементу та 1/3 N розчину соляної кислоти, який відрізняється тим, що реакцію проводять в мікропробірках з витягнутим конусним дном, об'єм реагуючих компонентів зменшують у 5 разів, а пробірки після відповідної температурної інкубації центрифугують протягом 10 хв при 1000 об/хв. 20 Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2