Спосіб оцінки якості донорської плазми за вмістом (титром) антиеритроцитарних антитіл

Реферат: Спосіб оцінки якості донорської плазми за вмістом (титром) антиеритроцитарних антитіл шляхом їх визначення імунологічними методами дослідження. Плазма вважається якісною, якщо титр імунних антиеритроцитарних антитіл (AT) за системою АВО не перевищує 1:4 і не містить AT системи Резус. UA 99299 U (12) UA 99299 U UA 99299 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини і може бути використана у виробничій трансфузіології. Проблема заготівлі якісної донорської плазми залишається актуальною, адже її якість безпосередньо впливає на ефективність гемотрансфузійної терапії та безпеку клінічного використання препаратів донорської крові [1, 2]. Наявність антиеритроцитарних антитіл (AT) у донорській плазмі, яка широко використовується в практичній медицині для трансфузій і виробництва препаратів крові, може призвести до гемотрансфузійних ускладнень та реакцій у реципієнта [3]. Титр антиеритроцитарних AT у зразках донорської крові визначають за допомогою імунологічних методів дослідження (пробіркових або у гелі з використанням ID-карток), а саме: реакція конглютинації з використанням 10 % розчину желатину та сольової аглютинації, непряма проба Кумбса, реакція аглютинації у гелі з використанням ID-карток [4, 5]. Найближчим аналогом оцінки якості донорської плазми є лабораторні дослідження по визначенню наступних параметрів: кількість залишкових клітин (еритроцитів, лейкоцитів, тромбоцитів), вміст загального білка, рівень активності фактора VIII [6]. Недоліком даного способу є відсутність параметра - вміст (титр) імунних антиеритроцитарних AT, що не в повній мірі висвітлює імунологічну безпеку донорської плазми. Задачею корисної моделі є контроль якості донорської плазми за вмістом (титром) імунних антиеритроцитарних AT, що надасть можливість попереджати імунологічний конфлікт при проведенні гемотрансфузійної терапії [7]. Поставлена задача вирішується шляхом визначення титру антиеритроцитарних AT за системами АВ0 та Резус у сироватці крові донорів після донації наступними методами: реакцією конглютинації з використанням 10 % розчину желатину та сольової аглютинації, непрямої проби Кумбса, реакцією аглютинації у гелі з використанням ID-карток [8, 9], що дає можливість оцінити якість плазми крові за імунологічним параметром. I. Для оцінки якості донорської плазми за вмістом (титром) антиеритроцитарних AT необхідно: відібрати зразок крові донора об'ємом 4-5 мл у промарковані стерильні, вакуумні пробірки з інактиватором зсідання; розділити донорську кров на фракції (форменні елементи і сироватку) шляхом центрифугування лабораторних зразків при 1500 об/хв впродовж 5 хв. II. Хід виконання дослідження 1. Визначення повних імунних AT за системою АВ0 за допомогою реакції сольової аглютинації. 1.1. Підготовка сироватки до роботи Досліджувану сироватку в кількості 0,5 мл розвести у чотири рази 0,9 % розчином натрію хлориду для запобігання коагуляції білків під час нагрівання. Вміст пробірки розділити на дві рівні частини у дві пробірки. Одну пробірку прогріти протягом (10±1) хв при температурі (70±5)°С, чітко дотримуючись режиму прогрівання. Таким чином, отримуємо дві порції сироватки - нативної та прогрітої, розведення кожної з яких дорівнює 1:4. 1.2. Стандартні тест-еритроцити груп А(ІІ) і В(ІІІ) двічі відмити 0,9 % розчином натрію хлориду шляхом центрифугування, при швидкості ротора 1500 об/хв протягом 5 хв. Приготувати 2 % завис еритроцитів окремо кожної групи. 1.3. Під час дослідження сироватки у штативі розмістити по 12 пробірок (діаметром 1 см) в один ряд для групи А(П) або В(Ш). У разі дослідження сироватки групи 0(1) - два ряди по 12 пробірок. На кожній пробірці підписати ступінь розведення сироватки (1:4, 1:8, 1:16 і т.д.). 1.4. У всі пробірки, починаючи з другої, додати по дві краплі (100 мкл) 0,9 % натрію хлориду. Потім у першу і в другу пробірки внести по дві краплі (100 мкл) приготовленої непрогрітої (нативної) сироватки, розведеної в чотири рази. 1.5. У другій пробірці сироватку змішати з 0,9 % розчином натрію хлориду і дві краплі (100 мкл) цієї суміші перенести в третю пробірку, з третьої (після перемішування) - в четверту і т.д. до останньої, з якої дві краплі (100 мкл) вилити. 1.6. У другому штативі приготувати розведення сироватки, попередньо прогрітої, як указано в п. 1.1. Розведення прогрітої сироватки готуються, згідно з п. 1.5. 1.7. У всі пробірки додати по одній краплі (50 мкл) 2 % зависі стандартних еритроцитів іншої групи: якщо досліджується сироватка групи В(ІІІ) - еритроцити групи А(ІІ), якщо сироватка А(ІІ) еритроцити групи В(ІІІ). У разі дослідженнясироватки групи 0(І) в один ряд пробірок додати еритроцити групи В(ІІІ), в інший - еритроцити групи А(ІІ). 1.8. Досліджувані пробірки старанно перемішати, залишити на 1 год.: з нативною сироваткою - при кімнатній температурі, з прогрітою - при температурі 37 °C. 1 UA 99299 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1.9. Результат оцінювати за формою осаду еритроцитів на дні пробірки, проглядаючи його над джерелом світла через лупу з 6-8 кратним збільшенням. За наявності аглютинації осад розміщується у вигляді грудочок нерівномірним шаром із зігнутими краями. За умови відсутності аглютинації - рівномірним шаром у центрі дна пробірки у вигляді правильно окресленого кола. 1.10. Наявність аглютинації свідчить про присутність повних AT, a останнє розведення, в якому вона спостерігається - про їх титр. Титр AT нативної (непрогрітої) сироватки належить до аглютинінів (а, (3), титр AT у прогрітій сироватці - до імунних анти-А та/або анти-В AT. Негативний результат у всіх пробірках з прогрітою сироваткою свідчить про відсутність повних імунних AT. 2. Визначення неповних імунних AT системи АВ0 непрямою пробою Кумбса. 2.1. Досліджувану сироватку об'ємом 0,5 мл розвести у чотири рази 0,9 % розчином натрію хлориду та прогріти її протягом 10 хв при температурі 70 °C. 2.2. Стандартні тест-еритроцити груп А (II) і В (III) двічі відмити 0,9 % розчином натрію хлориду шляхом центрифугування, при швидкості ротора 1500 об/хв, протягом 5 хв, при кімнатній температурі, після чого на дні пробірок залишаються еритроцити, які використовують для дослідження. 2.3. У штатив встановити 6 пробірок у разі дослідження сироватки А (II) або В (III) групи крові, при дослідженні сироватки 0 (І) - 2 ряди по 6 пробірок. 2.4. Пробірки пронумерувати. 2.5. Додати в усі пробірки, починаючи з другої, по три краплі (150 мкл) 0,9 % розчину натрію хлориду. 2.6. Додати у пробірки № 1 і 2 - по три краплі (150 мкл) досліджуваної (заздалегідь прогрітої сироватки - див. п. 1.1). 2.7. Приготувати розведення сироватки. Для цього із другої пробірки три краплі (150 мкл) переносять в третю пробірку, з третьої в четверту і т.д. до останньої, з якої три краплі (150 мкл) видаляють. 2.8. Додати в усі пробірки пастерівською піпеткою по одній (50 мкл) краплі тест-еритроцитів іншої групи. 2.9. Змішати сироватку з еритроцитами і поставити штатив у термостат для інкубації на 45 хв при температурі 37 °C. 2.10. Після проведеної інкубації відмити еритроцити, для чого в пробірки долити 0,9 % розчин натрію хлориду, перемішати вміст та центрифугувати при 1500 об/хв протягом 5 хв. 2.11. Злити надосадову рідину. Відмивання еритроцитів повторити тричі. 2.12. Після відмивання додати в кожну пробірку 3-5 крапель (150-250 мкл) 0,9 % розчину натрію хлориду (для одержання 5 % зависі еритроцитів). 2.13. Перенести по одній краплі (50 мкл) такої зависі з кожної пробірки на пластинку зі змочуваною поверхнею, пронумерувавши попередньо місця на пластинці, відповідно до номера пробірки. 2.14. Додати до кожної нанесеної краплі по одній краплі (50 мкл) сироватки Кумбса і перемішати їх скляною паличкою. 2.15. За результатом спостерігати 10 хв., періодично похитуючи пластинку. 2.16. Результати оцінювати за наявністю або відсутністю аглютинації, яку видно неозброєним оком. Настання аглютинації позначити на папері на кожній пробірці знаком (+) із зазначенням часу її прояву у хвилинах і секундах. Відсутність аглютинації позначити знаком (-). Наявність аглютинації свідчить про присутність неповних імунних анти-А або анти-В AT, а за останнім розведенням, в якому спостерігалась аглютинація, визначають їхній титр. Негативний результат свідчить про відсутність неповних імунних AT. 3. Визначення імунних AT системи АВ0 у гелі з використанням ID-карток. 3.1. Під час дослідження сироватки в штативі розміщують в один ряд 6 пробірок, які підписані, відповідно до ступеня розведення. У всі пробірки, починаючи з другої, додати по три краплі (150 мкл) 0,9 % розчину натрію хлориду. 3.2. Додати у пробірки № 1 і 2 - по три краплі (150 мкл) досліджуваної (заздалегідь прогрітої сироватки - див. п. 1.1). 3.3. Приготувати розведення сироватки. Для цього із другої пробірки три краплі (150 мкл) переносять в третю пробірку, з третьої в четверту і т. д. до останньої, з якої три краплі (150 мкл) видаляють. 3.4. Взяти дві карти NaCl/Enrym test ("BIO-RAD", Швейцарія), промаркувати їх, позначивши під кожною мікропробіркою розведення сироватки, зняти захисну фольгу. 2 UA 99299 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3.5. Внести в мікропробірки однієї карти по 50 мкл зависі еритроцитів ID-Dia-Cell A| ("BIORAD", Швейцарія), а в мікропробірки другої карти - ID-Dia-Cell В ("BIO-RAD", Швейцарія). 3.6. Додати в кожну мікропробірку двох карт по 25 мкл досліджуваної сироватки (прогрітої та розведеної), відповідно до маркування. 3.7. Інкубувати карти в ID-термостаті ("Dia-Med ID", Швейцарія) протягом 15 хв при температурі 37 °C. 3.8. Центрифугувати карти в ID-центрифузі ("Dia-Med ID", Швейцарія) протягом 10 хв. 3.9. Результати оцінювати за наявністю або відсутністю аглютинації, яку видно неозброєним оком. Внести отримані результати в ID-карту: настання аглютинації позначити знаком (+), відсутність аглютинації позначити знаком Негативний результат у всіх пробірках свідчить про відсутність повних імунних AT. Позитивний результат - про наявність повних імунних анти-А і/або анти-В AT, а за останнім розведенням, в якому спостерігалась аглютинація, визначають їхній титр. Якщо повні імунні аглютиніни не виявлені, то необхідно проводити дослідження неповних імунних антитіл у антиглобуліновому тесті (непряма реакція Кумбса). Антиглобуліновий тест (непряма реакція Кумбса) виконується на ID-картках Liss/Coombs ("BIO-RAD", Швейцарія). Постановка реакції проводиться, як описано в п. 3.1. 4. Визначення повних AT системи Резус методом аглютинації в сольовому середовищі. 4.1. У пробірки зі стандартними еритроцитами долити доверху 0,9 % розчин натрію хлориду, вміст перемішати, центрифугувати протягом 5 хв при 1500 об/хв, видалити відмивну рідину піпеткою. Таке відмивання повторити двічі. Із відмитих еритроцитів приготувати 2 % завис: до 49 крапель (2,5 мл) 0,9 % розчину натрію хлориду добавити одну краплю (50 мкл) еритроцитів, вміст пробірки перемішати. 4.2. У штатив поставити пробірки (діаметром 1 см) за кількістю зразків еритроцитів, відповідно кожну підписати. 4.3. У всі пробірки внести по одній краплі (50 мкл) досліджуваної сироватки і по одній краплі (50 мкл) 0,9 % розчину натрію хлориду. Пробірки старанно перемішати, не допускаючи вспінюванння. 4.4. У пробірки, відповідно до нумерації, внести по одній краплі (50 мкл) еритроцитів, приготовлених як стандарти: + 1-й ряд пробірок - дослід з еритроцитами групи 0(I)Rh ; 2-й ряд пробірок - контроль з еритроцитами групи 0(1) Rh ; 3-й ряд пробірок - обов'язковий контроль власної сироватки з власними еритроцитами. 4.5. Вміст пробірок перемішати і поставити для інкубації в термостат при температурі 37 °C на 1 год. 4.6. Після інкубації оцінити результат за наявністю чи відсутністю аглютинації еритроцитів, яка визначається за формою осаду еритроцитів на дні пробірки за допомогою лупи. Наявність аглютинації в пробірках із резус-позитивними зразками еритроцитів і відсутність її з резус-негативними і власними еритроцитами вказує на наявність у сироватці повних резус-АТ. Відсутність аглютинації зі всіма зразками еритроцитів вказує на те, що повні AT системи резус не виявлені. При виявлені повних резус-АТ провести титрування сироватки аналогічно до реакції + конглютинації з додаванням желатину і з використанням 2 % зависі тест-еритроцитів 0(I)Rh . 5. Визначення неповних AT системи Резус за допомогою реакції конглютинації із застосуванням желатину 5.1. Пронумерувати пробірки, відповідно до числа зразків еритроцитів, з якими досліджують сироватку. 5.2. У пробірки, відповідно до нумерації, внести по одній краплі (50 мкл) еритроцитів, приготовлених як стандарти: + 1-й ряд пробірок - дослід з еритроцитами групи 0(I)Rh ; 2-й ряд пробірок - контроль з еритроцитами групи 0(I) Rh ; 3-й ряд пробірок - обов'язковий контроль власної сироватки з власними еритроцитами. 5.3. У всі пробірки додати по 2 краплі (100 мкл) 10 % розчину желатину, підігрітого до розрідження на водяній бані при температурі від 46 до 48 °C. 5.4. У всі пробірки ввести по 2 краплі (100 мкл) досліджуваної сироватки, струсити для їх перемішування, поставити у водяну баню при температурі від 46 до 48 °C на 10 хв. 5.5. У прогріті пробірки із сумішшю додати 5-8 мл 0,9 % розчину натрію хлориду. Перемішати шляхом одно-дворазового перевертання пробірок. 5.6. Результат реакції спостерігають за наявності чи відсутності аглютинації еритроцитів. Для цього вміст пробірок необхідно переглядати під мікроскопом. 3 UA 99299 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Наявність аглютинації в пробірках із зразками резус-позитивних еритроцитів і відсутність її з резус-негативними і власними еритроцитами вказує на наявність в досліджуваній сироватці неповних резус-АТ. Відсутність аглютинації з усіма зразками еритроцитів вказує на те, що AT системи Резус не виявлено. 5.7. Титрування сироватки, яка містить неповні резус-антитіла. 5.8. Вставити у штатив 10 пробірок з відповідними позначеннями. 5.9. У всі пробірки внести по 2 краплі (100 мкл) 0,9 % натрію хлориду. 5.10. У першу пробірку цією ж піпеткою внести 2 краплі (100 мкл) досліджуваної сироватки. З першої пробірки після перемішування дві краплі перенести в другу, з другої - в третю і так до останньої пробірки, з якої 2 краплі (100 мкл) видалити. При цьому в пробірках утворюється розведення сироватки від 1:2 до 1:1024. + 5.11. У всі пробірки додати по одній краплі (50 мкл) стандартних еритроцитів групи 0(l)Rh . 5.12. У всі пробірки внести по 2 краплі (100 мкл) 10 % розчину желатину, попередньо підігрітого до розрідження при температурі від 46 до 48 °C. 5.13 Пробірки струсити і помістити на водяну баню при температурі 46-48 °C на 10 хв. 5.14. У прогріті пробірки із сумішшю додати по 5-8 мл 0,9 % розчину натрію хлориду. Останнє розведення, в якому спостерігається аглютинація, приймають за титр виявлених резусАТ. 6. Виявлення повних AT до антигенів еритроцитів у гелі з використанням ID-карток. 6.1. Взяти ID-картку "NaCI/Enzyme test" ("BIO-RAD", Швейцарія), промаркувати її і зняти захисну фольгу з 3-х мікропробірок. 6.2. Внести в них по 50 мкл ID-DiaCell І+ІІ+IIІ. 6.3. Додати в кожну з них по 25 мкл досліджуваної сироватки або плазми. 6.4. Інкубувати протягом 15 хв при температурі 37 °C. 6.5. Центрифугувати ID-картку в ID-центрифузі ("Dia-Med ID", Швейцарія) 10 хв. 6.6. Результати оцінювати за наявністю або відсутністю аглютинації, яку видно неозброєним оком. Внести отримані результати в ID-карту: настання аглютинації позначити знаком (+), відсутність аглютинації позначити знаком (-). 7. Виявлення неповних AT до антигенів еритроцитів у гелі з використанням ID-карток. 7.1. Взяти ID-картку "Liss/Coombs" ("BIO-RAD", Швейцарія), промаркувати її і зняти захисну фольгу з 3-х мікропробірок. 7.2. Внести в них по 50 мкл ID-DiaCell І+ІІ+ІII. 7.3. Додати в них по 25 мкл досліджуваної сироватки або плазми. 7.4. Інкубувати протягом 15 хв при температурі 37 °C. 7.5. Центрифугувати в ID-центрифузі ("Dia-Med ID", Швейцарія) 10 хв. 7.6. Результати оцінювати за наявністю або відсутністю аглютинації, яку видно неозброєним оком. Внести отримані результати в ID-карту: настання аглютинації позначити знаком (+), відсутність аглютинації позначити знаком (-). Суть корисної моделі характеризується конкретними прикладами виконання. Приклад №1 Донор П. При проведені дослідження на вміст AT реакцією конглютинації з використанням 10 % розчину желатину, виявлені імунні неповні AT системи Резус у титрі 1:2. При додатковому + досліджені зразка крові донора було встановлено A(II)Rh групу крові, проведено повторне дослідження на вміст AT у гелевому тесті, при цьому було підтверджено наявність AT у титрі 1: 8. Дослідження проводили з панеллю трьох зразків еритроцитів ID-DiaCell І-ІІ-ІII. Імунні антиеритроцитарні AT були виявлені зі стандартними еритроцитами lD-DiaCell-II. Висновок. Отримані результати свідчать, що досліджувана плазма не відповідає імунологічним критеріям якості за вмістом (титром) антиеритроцитарних AT і не може бути використана для проведення трансфузій та виготовлення біопрепаратів. Приклад № 2 Донор Л. При проведені дослідження на вміст AT реакцією сольової аглютинації та непрямої проби Кумбса виявлені імунні AT системи АБО: повні імунні анти-А AT у титрі 1:8, анти-В - 1:16, неповні імунні анти-А AT у титрі 1:32, анти-В - 1:64. При додатковому досліджені зразка крові + було встановлено 0(I)Rh групу крові, проведено повторне дослідження на наявність AT у гелевому тесті, при цьому було підтверджено наявність повних анти-А AT у титрі 1:16, анти-В 1: 128, неповних імунних анти-А AT у титрі 1:32, анти-В -1:256. Дослідження проводили з панеллю еритроцитів ID-DiaCell A1, В. 4 UA 99299 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Висновок. Отримані результати свідчать, що у досліджуваній плазмі наявні антиеритроцитарні AT у високому титрі, така плазма не відповідає імунологічним критеріям якості і не може бути використана для проведення трансфузій і виготовлення біопрепаратів. Приклад № 3 Донор Я. При проведені дослідження на наявність AT реакцією сольової аглютинації та непрямої проби Кумбса виявлені імунні AT системи АВ0: повні імунні анти-В AT без титру, неповні імунні анти-В AT у титрі 1:2. При додатковому досліджені зразка крові було встановлено + A(II)Rh групу крові, проведено повторне дослідження на наявність AT у гелевому тесті, при цьому було підтверджено наявність повних анти-В AT у титрі 1: 2, неповних імунних анти-В AT1:4. Дослідження проводили з панеллю еритроцитів ІD-DiaCell А1, В. Висновок. На підставі отриманих результатів можна констатувати, що в зразку крові донора наявні імунні антиеритроцитарні AT. Відповідно до наявності повних імунних анти-В AT у титрі 1:2 та неповних анти-В AT у титрі 1:4, така плазма відповідає імунологічним критеріям якості і може бути використана для проведення трансфузій і виготовлення препаратів крові. Гелева технологія є більш сучасним і чутливим методом дослідження, але не завжди доступна для закладів служби крові України через високу собівартість, тому для визначення титру антиеритроцитарних AT слід користуватись одним із наведених серологічних методів, які затверджені діючою нормативною документацією. Плазма крові, в якій титр імунних AT за системою АВО не перевищує 1:4 і яка не містить AT системи Резус, вважається якісною і може бути використана для трансфузій та виготовлення біопрепаратів. Таким чином, запропонований спосіб оцінки якості компонента консервованої донорської крові - плазми, - за вмістом (титром) антиеритроцитарних AT, шляхом визначення їх титру за системами АВО та Резус у сироватці крові, дає можливість оцінити якість донорської плазми та є дієвим засобом попередження імунологічних ускладнень при гемотрансфузійній терапії. Джерела інформації: 1. Минеева Н.В. Группы крови человека. Основы иммуногематологии / Н.В. Минеева. - [2-е изд-е]. - СПб.: ООО "А-принт", 2010. - 188 с. 2. Донсков СИ. Группы крови человека: руководство по иммуносерологии / С.И. Донсков, В.А. Мороков. - М.: 2011. - 1014 с. 3. Переливание крови / Перехрестенко П.М., Исакова Л.М., Дизик Г.М. [и др.]. - К.: Здоров'я, 2008. - 223 с. 4. Жибурт Е.Б. Трансфузиология: [учебник] / Жибурт Е.Б. - СПб.: Питер, 2002. - 736 с. 5. Наказ МОЗ України від 05.07.1999 p. № 164 "Про затвердження інструкцій, регламентуючих діяльність закладів служби крові України" [Електронний ресурс] - Режим доступу: http://mozdocs.kiev.ua/view.php7icN565 6. Наказ МОЗ України від 09.03.2010 р. № 211 "Про затвердження Порядку контролю за дотриманням показників безпеки та якості донорської крові та її компонентів" [Електронний ресурс]. Режим доступу: http://document.ua/pro-zatverdzhennia-poriadku-kontrolvu-zadotrimanniam-pokazn-doc25026.html 7. Наказ МОЗ України від 01.08.2005 р. № 385 "Про інфекційну безпеку донорської крові та її компонентів" [Електронний ресурс] - Режим доступу: http://moz.gov.ua/ua/portal/dn_2005080 l_385.html 8. Порядок проведення імуногематологічних досліджень крові донорів і реципієнтів у закладах служби крові та в лікувально-профілактичних закладах: [методичні рекомендації] / Перехрестенко П. М., Чугрієв А. М., Павлюк Р.П. [та ін.]. - К.: Б. в., 2010.-51 с. 9. Виявлення імунних анти-А і анти-В антитіл у сироватці крові людини: [методичні рекомендації] / Перехрестенко П. М., Дизик Г.М., Павлюк Р.П., Лавровська Л.Н. - К.: Б. в., 2005. 16 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 55 Спосіб оцінки якості донорської плазми за вмістом (титром) антиеритроцитарних антитіл шляхом їх визначення імунологічними методами дослідження, який відрізняється тим, що плазма вважається якісною, якщо титр імунних антиеритроцитарних антитіл (AT) за системою АВ0 не перевищує 1:4 і не містить AT системи Резус. 5 UA 99299 U Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6