Конструкція для сайленсингу гена p0 та її застосування

Реферат: Винахід належить до конструкції РНК, що містить послідовність смислового сегмента і послідовність антисмислового сегмента, які мають послідовності, одержані на основі гена Р0 UA 114603 C2 (12) UA 114603 C2 геному BMYV (вірус слабкого пожовтіння буряка) або на основі ортологічного гена, та до використання зазначених конструкції з метою одержання стійких до вірусів рослин. UA 114603 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Область техніки Даний винахід відноситься до способу передачі резистентності до вірусів або толерантності по відношенню до одного або більш ніж одного вірусу(ам), зокрема до вірусу слабкого пожовтіння буряку (BMYV) і до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряків (BNYVV) або виключно до BMYV в рослині, зокрема в рослині цукрового буряка. Крім того, даний винахід відноситься до резистентній або толерантній по відношенню до вірусу рослині, що одержана згідно даному способу, а також до насіння і потомства, одержаному з них. Даний винахід також відноситься до конструкцій для сайленсінгу гена, особливо до шпильковим конструкціям, опосередковуючим BMYV, або сайленсінг РНК BMYV і BNYVV, і їх застосування. Попередній рівень техніки Віруси рослин є серйозною проблемою для багатьох основних сільськогосподарських культур, оскільки вірусні інфекції призводять до великих втрат врожаю. У цукрового буряка основними причинами захворювань є: (i) пожовтіння, що викликається полеровірусом, вірусом слабкого пожовтіння буряку (BMYV), що передається за допомогою свого головного переносника Myzus persicae персистируючим способом; (ii) ризоманія цукрових буряків, що викликається бенівірусом, вірусом некротичного пожовтіння жилок буряків (BNYVV), що передається Polymyxa betae. Широке застосування резистентних стосовно BNYVV сортів дозволило захистити врожаї, однак виникають вірусні ізоляти, що долають резистентність, і існує гостра необхідність у нових резистентних сортах. Віруси, що передаються грибом, такі як BNYVV, можуть зберігатися у спорах, що покояться в ґрунті роками, після того як заражається поле. Оскільки не існує ефективних хімічних або фізичних способів знищення вірусу, ні в рослинах, ні в ґрунті, єдиним можливим варіантом для фермера, який обробляє цукровий буряк, є застосування генетично резистентних культур. Кілька компаній запропонували ряд толерантних, навіть частково резистентних сортів за допомогою селекції. Однак, це дуже виснажливий і трудомісткий процес, зазвичай займає тривалий період часу перед тим, як одержують корисні резистентні рослини. Швидка революція в областях рослинної інженерії привела до розвитку нових стратегій додання генетичної резистентності по відношенню до вірусів. Резистентність по відношенню до вірусних захворювань за допомогою введення частин послідовностей вірусного генома, при якому вірусною послідовністю (конструкцією) трансформують рослинну клітину і рослину, стала новим джерелом резистентності. Відомо, що цукровий буряк є неподатливим видом в генній інженерії, ускладнюючи можливу успішну індукцію резистентності до вірусів. Було опубліковано кілька прикладів конструювання толерантності, наприклад по відношенню до BNYVV за допомогою трансформації та експресії послідовності білка оболонки вірусу BNYVV в геномі цукрового буряку (WO91/13159), хоча існують тільки нечисленні опубліковані дані по цілісним функціональним трансгенним рослинам цукрового буряка, такі як дані, описані в EP 1169463 B1. Зокрема, повідомлення свідчать про обмежену кількість даних за рівнем резистентності, що спостерігається в умовах інфікування у трансгенних рослин цукрового буряку, трансформованих геном, що кодує послідовність білка оболонки вірусу BNYVV. Геном фуровіруса некротичного пожовтіння жилок буряків (BNYVV) складається з п'яти плюс-смислових РНК, дві з яких (РНК 1 і 2) кодують функціональні білки, необхідні для інфікування всіх рослин, в той час як інші три (РНК 3, 4 і 5) залучені в опосередковане переносником інфікування коренів цукрових буряків (Beta vulgaris). Рухом BNYVV від клітини до клітини управляє набір трьох послідовних, вірусних генів на РНК 2, що трохи перекриваються, відомих як потрійний блок генів (TGB), які по порядку кодують вірусні білки P42, P13 і P15 (продукти генів позначають їх розрахованою Mr (молекулярна маса) в кілодальтонах). Геном BMYV складається з лінійної плюс-смислової РНК з шістьма головними відкритими рамками зчитування (ORF 0-5). ORF 1 і 2 кодують білки, залучені в реплікацію вірусу, в той час як кожен з інших трьох ORF (ORF 3, 4 і 5) кодує структурні білки (основні і мінорні білки оболонки) і передбачуваний руховий білок. Було показано, що білок P0 BMYV має слабку експресію внаслідок неоптимального контексту ініціюючого кодону AUG P0 і сильної тенденції до підтримання низького рівня експресії. Крім того, дана частина генома є високоваріабельною, і ця різноманітність послідовності була використана для проведення відмінності різних видів. Як показано, захворювання, що викликаються BNYVV, поширюються географічно з швидкістю, залежною від комбінації численних факторів місцевого навколишнього середовища і сільськогосподарських факторів. Тому існує необхідність у поліпшенні механізмів генетичної 1 UA 114603 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 резистентності, які можуть, окремо або в поєднанні, надавати стабільну і тривалу стійкість рослин цукрових буряків, які вирощують для виробничого застосування. Рівень техніки У патентній заявці WO 2007/128755 описується послідовність TGB-3, що використовується для зниження і/або придушення шкідливих впливів TGB-3 дикого типу в рослинах, для створення трансгенних рослин, резистентних стосовно вірусу, особливо рослин цукрових буряків, резистентних до вірусу некротичного пожовтіння жилок буряків. У Carmen Simon-Mateo et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1809 No. 11-12, pp. 722-731, 2011, описуються різні противірусні стратегії, що застосовуються для одержання рослин, резистентних по відношенню до вірусів, за останні 25 років. У A. Kozlowska-Makulska et al., Journal of General Virology Vol. 91, No. 4, pp. 1082-1091, 2010, описана переважна активність сайленсінга РНК білків P0 з різних ізолятів полеровірусів, що інфікують буряк, вірусу хлорозу буряка і вірусу слабкого пожовтіння буряку. У Pu Yan et al. Journal of Virological Methods Vol. 166, No. 1-2, pp. 101-105, 2010, описані конструкції для сайленсінгу РНК для виведення рослин, резистентних по відношенню до вірусу, за допомогою експресії шпилькових РНК вірусного походження. Короткий опис винаходу Згідно з даним винаходом запропоновані способи і засоби надання толерантності або резистентності по відношенню до вірусів, які не показують недоліки сучасного рівня техніки, переважно способи і засоби, які надають толерантність, резистентність, переважно супер- або загальну резистентність, особливо толерантність по відношенню до вірусу BMYV (вірус слабкого пожовтіння буряка) або резистентність (включаючи супер- або загальну резистентність до BMYV), або, переважно комбіновану толерантність до BMYV (вірус слабкого пожовтіння буряку) і BNYVV (вірус некротичного пожовтіння жилок буряків) або резистентність (включаючи супер- або загальну резистентність до BMYV і BNYVV) в рослинній клітині або в рослині, зокрема в рослинній клітині цукрових буряків або в рослині цукрового буряку (можливо генерованому з даної рослинної клітини). Згідно з даним винаходом додатково запропоновані генетично модифіковані або трансформовані рослинні клітини, одержані як такі або одержані даним способом, і з яких можуть бути одержані рослини, які виявляють цю підвищену толерантність або резистентність по відношенню до згаданих вірусів рослин. Згідно винаходу також запропоновані потомство, тобто потомство, толерантне по відношенню до вірусів або резистентне по відношенню до вірусів, насіння або інші органи або структури, які відтворюються, що походять з денної трансформованої рослини або рослинних клітин. Першим аспектом даного винаходу є РНК конструкція, що містить послідовність смислового сегмента і послідовність антисмислового сегменту, що мають послідовності, одержані на основі гену P0 (або на основі гену, що кодує B0 білок) генома BMYV або на основі ортологічного гену, де послідовності зазначеного смислового сегменту та зазначеного антисмислового сегменту обидві містять нуклеотидний сегмент, що має послідовність, щонайменше на 85 % ідентичну послідовності гена P0 з генома BMYV або з ортологічного гену. Переважно, в даній РНК конструкції послідовність(ті) смислового сегменту і/або антисмислового сегменту додатково містить(ять) нуклеотидний фрагмент, що має послідовність(ті), що володіє(ють) щонайменше 85 % ідентичністю послідовності з 5'-кінцевою нетранслируемой послідовністю (5' UTR), що знаходиться поруч з нуклеотидною послідовністю гена P0. Більш переважно в даній РНК конструкції послідовності смислового сегменту і антисмислового сегменту містять нуклеотидний фрагмент, що має послідовності, що володіють щонайменше 85 % ідентичністю послідовності з нуклеотидною послідовністю гену P0 з генома BMYV. Переважно, в даній РНК конструкції послідовності смислового сегменту і антисмислового сегменту додатково містять нуклеотидний фрагмент, що має послідовності, що володіють щонайменше 85 % ідентичністю послідовності з геном P1 генома BMYV. Можливо, в даних РНК конструкціях смисловий сегмент містить або складається з послідовності SEQ ID NO: 1 і/або антисмисловий сегмент містить або складається з послідовності SEQ ID NO: 3. Переважно, в даних РНК конструкціях послідовності смислового сегменту і антисмислового сегменту додатково обидві містять нуклеотидний фрагмент, що володіє щонайменше 85 % ідентичністю послідовності з геномом BNYVV. 2 UA 114603 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Споріднений аспект даного винаходу являє собою ДНК конструкцію, що транскрибується в дану (дані) РНК конструкцію (ії). Інший споріднений аспект є вектором, що містить нуклеотидну послідовність даних (ДНК) конструкцій нуклеїнової кислоти. Інший споріднений аспект є молекулою дволанцюгової самокомплементарної РНК, що експресується даними ДНК конструкцією або вектором. Даний винахід також стосується способу індукування в рослині або рослинній клітині толерантності або резистентності, переважно повної резистентності щонайменше до вірусу BMYV і можливо іншого вірусу, причому вказаний спосіб включає наступні стадії: одержання конструкції нуклеїнової кислоти за даним винаходом (наприклад, містить послідовність, одержану на основі гена P0 і/або геному BMYV), функціонально пов'язаної з однією або більш ніж однієї регуляторною послідовністю (ми), активною (ми) в рослині або рослинній клітині, і трансформація рослинної клітини конструкцією нуклеїнової кислоти, з індукуванням, таким чином, в рослині або в рослинній клітині резистентності щонайменше до вірусу BMYV. Переважно даний спосіб додатково викликає толерантність по відношенню до іншого вірусу, який вибраний з групи, що складається з вірусу пожовтіння турнепсу, вірусу пожовтіння гарбузових, що переноситься попелицею, вірусу скручування листя картоплі, вірусу пожовтіння листя цукрового очерету, вірусу деформуючої мозаїки гороху, західного вірусу пожовтіння буряку - США (Сполучені Штати Америки), вірусу хлорозу буряка, вірусу жовтої карликовості злаків і вірусу BNYVV, переважно вірусу BNYVV. Споріднений аспект є способом індукування толерантності стосовно щонайменше до вірусу BMYV, який включає стадію одержання конструкції нуклеїнової кислоти, що містить смисловий і антисмисловий сегменти, одержані на основі гену, що кодує білок P15 зазначеного BNYVV. Ще один споріднений аспект є застосуванням нуклеотидної послідовності, що містить послідовність, одержану на основі гену P0, і/або генома BMYV і/або РНК, ДНК або вектора за даним винаходом для індукування в рослині або рослинній клітині толерантності або резистентності, переважно повної резистентності по відношенню до вірусу BMYV і/або до вірусу BNYVV. Інший аспект є трансгенною рослиною або трансгенною рослинною клітиною, які толерантні або резистентні, переважно повністю резистентні по відношенню щонайменше до вірусу BMYV і можливо одного або більш ніж одного іншого(ми) вірусу(ам), і містять конструкцію нуклеїнової кислоти, здатну експресувати нуклеотидну послідовність даного винаходу (що містить послідовність, одержану на основі гену P0 і/або з генома BMYV), функціонально пов'язану з однієї або більш ніж однієї регуляторною послідовністю (ями), активною в рослині або рослинній клітині, містять вектор винаходу або містять молекулу дволанцюгової самокомплементарної РНК за даним винаходом. Переважно дана трансгенна рослину або дана рослинна клітина є резистентними по відношенню до іншого вірусу, який вибраний з групи, що складається з вірусу пожовтіння турнепсу, вірусу пожовтіння гарбузових, що переноситься попелицею, вірусу скручування листя картоплі, вірусу пожовтіння листя цукрового очерету, вірусу деформуючої мозаїки гороху, західного вірусу пожовтіння буряків - США, вірусу хлорозу буряка, вірусу жовтої карликовості злаків і вірусу BNYVV, переважно вірусу BNYVV. Переважно, дана трансгенна рослину, або трансгенна рослинна клітина, вибрана з групи, що складається з салату-латуку, огірка, картоплі, цукрового очерету, гороху, ячменю та цукрових буряків, причому переважними є цукровий буряк або клітка цукрових буряків. Споріднений аспект є тканиною трансгенної рослини і/або відтворює структуру, що походить з даної трансгенної рослинної клітини (відповідно до даного винаходу), де зазначена тканина обрана з групи, що складається з плоду, стебла, кореня, бульби і насіння, або де зазначена структура, що відтворюється обрана з групи, що складається з каллусів, бруньок або зародків. Короткий опис графічних матеріалів На Фіг. 1А і Б показаний фрагмент послідовності P0 вірусу згідно винаходу (Фіг. 1А і Б; SEQ ID NO: 13) зі смисловою нуклеотидною послідовністю P0 (SEQ ID NO: 1, коротше, ніж повна послідовність P0 SEQ ID NO: 17) і відповідною гомологічною антисмисловою нуклеотидною послідовністю P0 (виділено жирним, SEQ ID NO: 3), між якими знаходиться інтронна послідовність петунії, складовою 1352 п.н. (пар нуклеотидів) (виділено жирним і підкреслено, SEQ ID NO: 11). Кілька нуклеотидів на Фіг. 1Б позначені жирним курсивом. Ці нуклеотиди відповідають 5'UTR геному вірусу BMYV. Невелика кількість інших нуклеотидів, виділених курсивом і підкреслених на Фіг. 1Б, не належать P0, ні інтрону, але, тим не менш, представлені, так як вони є залишками стратегії клонування. Конструкція, що утворює повну шпильку (SEQ ID NO: 13), також називається hpP0 конструкцією 1. 3 UA 114603 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 На Фіг. 2 (А і Б) показаний інший фрагмент послідовності P0 вірусу згідно винаходу (Фіг. 2А і Б; SEQ ID NO: 14) зі смисловою нуклеотидною послідовністю P0 і антисмисловою нуклеотидною послідовністю P0 (виділено жирним), між якими знаходиться інтронна послідовність буряка, складова 91 п.н. (виділено жирним і підкреслено, SEQ ID NO: 12). Кілька нуклеотидів на Фіг. 2Б позначені жирним курсивом. Ці нуклеотиди відповідають 5' UTR геному вірусу BMYV. Невелика кількість інших нуклеотидів, виділених курсивом, і підкреслених на Фіг. 2Б, що не належать ні до P0, ні до інтрони, тим не менш, представлені, так як вони є залишками стратегії клонування. Смислова і антисмислова нуклеотидні послідовності P0 тут є такими ж, як смислова і антисмислова нуклеотидні послідовності P0, дані на Фіг. 1Б. Конструкція, що утворює повну шпильку (SEQ ID NO: 14) також називається hpP0 конструкцією 2. На Фіг. 3 виділені відмінності в 5'-кінці SEQ ID NO: 1, в порівнянні з 5'- кінцем P0 BMYV, що кодує послідовність, представлену SEQ ID NO: 17. Підкреслена послідовність Фіг. 3 відповідає нефункціональній 5' лідерній послідовності SEQ ID. Фіг. 4 (А і Б) є схематичним зображенням вектора pFGC5941, в який фрагмент гена P0 був введений в смисловій (SEQ ID NO: 1) і антисмисловій (SEQ ID NO: 3) орієнтації, або упереміж з інтронною послідовністю гену халконсинтази А петунії (CHSA; SEQ ID NO: 11) (Фіг. 4А, pFGC5941, конструкція 1; SEQ ID NO: 13), або упереміж з інтронною послідовністю буряка (SEQ ID NO: 12), що складає 91 нуклеотид (Фіг. 4Б, pFGC5941, конструкція 2; SEQ ID NO: 14). CaMV 35S промотор: промотор 35S CaMV; OCS 3': сигнал поліаденілювання гену октопинсинтази; MAS промотор: промотор гену маннопинсинтази; MAS 3': сигнал поліаденілювання гену маннопинсинтази; BAR: ген стійкості до гербіциду Basta; pVS1: точка початку реплікації pVS1; NPTII: ген стійкості до канаміцину; LB, RB: ліва і права межі T-ДНК. Фіг. 5 є статистичним аналізом тесту на резистентність, одержаний за допомогою конструкції 1 (hpP0u з інтронном петунії). Кожна гістограма зображує середнє значення титру BMYV зі стандартною помилкою на 10 рослинах, інокульованих BMYV (Y). hp: шпилька; Інф: інфікований. На осі Y: оптична щільність (A405), одержана за допомогою ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз), 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1, 1,2. На осі X, зліва направо: трансгенні лінії: hpP0-7, hpP0-8, hpP0-9, hpP0-10, hpP0-11 і hpP0-12; BMYV-інфікований контроль: C0l0 інф; Col0 здоровий. Фіг. 6 є статистичним аналізом тесту на резистентність, одержаний за допомогою конструкції 2 (hpP0u з інтронном буряка). Кожна гістограма зображує середнє значення титру BMYV зі стандартною помилкою на 10 рослинах, інокульованих BMYV (Y). hp: шпилька; hpP0: конструкція 1; hpP0beet: конструкція 2; Інф: інфікований. На осі Y: оптична щільність (A 405), одержана за допомогою ELISA, 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3. На осі X, зліва направо: трансгенні лінії: hpP0-12 (конструкція 1), hpP0beet-1 (конструкція 2), hpP0beet-2, hpP0beet-3, hpP0beet-4, hpP0beet-5, hpP0beet-6, hpP0beet-7 і hpP0beet-8; BMYV-інфікований контроль: Cоl0 інф; Cоl0 здоровий. Фіг. 7 є статистичним аналізом тесту на резистентність, одержаний за допомогою конструкцій 1 і 2 відповідно. Кожна гістограма зображує середнє значення титру вірусу зі стандартною помилкою на 10 інокульованих рослинах (Y) Гістограми з темно-сірим кольором зображують інфікування клоном BMYV-EK, а гістограми зі світло-сірим кольором - інфікування ізолятом BMYV-2itb способом передачі попелицями відповідно. hp: шпилька; hpP0: конструкція 1; hpP0 буряка: конструкція 2; Інф: інфікований. На осі Y: оптична щільність (A 405), одержана за допомогою ELISA, 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5. На осі X, зліва направо: трансгенні лінії: hpP0-9 (конструкція 1), hpP0-10, hpP0-12, hpP0beet-2 (конструкція 2), hpP0beet-7 і hpP0beet-8; інфікований контроль: Cоl0 інф; Cоl0 здоровий. На Фіг. 8 зображена послідовність WT P0 (SEQ ID NO: 17 і 18). На Фіг. 9 (А і Б) зображена послідовність шпилькової конструкції hpP15A4-P0 згідно винаходу (Фіг. 9А і Б, SEQ ID NO: 15) зі смисловою P15A4-P0 нуклеотидною послідовністю (SEQ ID NO: 7, нуклеотиди, виділені курсивом, для послідовності P15A4 з 3 підкресленими мутаціями і невиділені нуклеотиди для P0 послідовності; порівняно c WT P15: A замінений на С, а AG - на GC) і SEQ ID NO: 8, відповідної антисмислової P15A4-P0 нуклеотидної послідовності (виділено жирним курсивом для P15A4 і жирним - для P0), між якими знаходиться інтронна послідовність буряка, складова 91 п.н. (жирно, підкреслено, SEQ ID NO: 12). Кілька нуклеотидів на Фіг. 9Б позначені жирним курсивом і підкреслені. Ці нуклеотиди відповідають 5'UTR геномe вірусу BMYV. Невелика кількість інших нуклеотидів, підкреслених на Фіг. 9Б, що не належать ні до P15A4-P0, ні до інтронну, тим не менш, представлені, так як вони є залишками стратегії клонування. Конструкція, що утворює повну шпильку (SEQ ID NO: 15), також називається hpP15А-P0 конструкцією 1. 4 UA 114603 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 На Фіг. 10 (А і Б) зображена послідовність шпилькових конструкцій hpP0-P15A4-A і hpP0P15A4-Б згідно винаходу (Фіг. 10А і Б, SEQ ID NO: 16) зі смисловою P0-P15A4 нуклеотидною послідовністю (SEQ ID NO: 9, невиділені нуклеотиди для P0 послідовності і нуклеотиди, виділені курсивом, для P15A4 послідовності з 3 підкресленими мутаціями) і SEQ ID NO: 10, відповідної антисмислової P0-P15A4 нуклеотидної послідовності (виділено жирним для P0 і жирним курсовому - для P15A4), між якими знаходиться інтронна послідовність буряка, складова 91 п.н. (жирно, підкреслено, SEQ ID NO: 12). Різниця між двома шпильковими конструкціями полягає в наявності двох додаткових нуклеотидів в послідовності P15A4 (нуклеотиди, укладені в рамку) для конструкції hpP0-P15A4-Б. Кілька нуклеотидів на Фіг. 10Б позначені жирним курсивом і підкреслені. Ці нуклеотиди відповідають 5' UTR геному вірусу BMYV. Невелика кількість інших нуклеотидів, підкреслених на Фіг. 10Б, що не належать ні до P0-P15A4, ні до інтронну, тим не менш, представлені, так як вони є залишками стратегії клонування. Конструкція, що утворює повну шпильку (SEQ ID NO: 16), також називається hpP0-P15А4-А конструкцією 2 і hpP0-P15A4Б конструкцією 3. Фіг. 11 (А і Б) є схематичним зображення вектора pFGC5941, в який послідовність P15A4-P0 або послідовність P0-P15A4 вводили в смисловій і антисмисловій орієнтації, упереміж з інтронною послідовністю буряка, складовою 91 нуклеотид (Фіг. 11А, pFGChpP14A4-P0, конструкція 1 і Фіг. 11Б, pFGChpP0-P15A4-A і pFGChpP0-P15A4-Б, конструкція 2 і 3 відповідно). CaMV 35S промотор: промотор 35S CaMV; OCS 3': сигнал поліаденілювання гена октопинсинтази; MAS промотор: промотор гену маннопинсинтази; MAS 3': сигнал поліаденілювання гену маннопинсинтази; BAR: ген стійкості до гербіциду Basta; pVS1: точка початку реплікації pVS1; NPTII: ген стійкості до канаміцину; LB, RB: ліва і права кордону T- ДНК. Докладний опис винаходу Беручи до уваги поширеність обох вірусів в районах вирощування цукрових буряків, автори винаходу розробили трансгенні рослини, які є резистентними по відношенню до одного або обох вірусів (BMYV і/або BNYVV), або навіть додатковим вірусам, здатним інфікувати ту ж рослина. Насправді, BNYVV є головною проблемою, але автори винаходу припускають, що існує ризик того, що поширеність BMYV також зросте. Перший аспект даного винаходу стосується конструкції РНК (такої як шпилькова РНК, переважно описана нижче як hpP0), що містить смисловий сегмент (РНК) і антисмисловий сегмент (РНК), (обидва) мають послідовності, одержані (тобто володіють щонайменше 85 % ідентичністю послідовності) на основі гену P0 (або нуклеотидної послідовності) або на основі гену (нуклеотидної послідовності, що кодує білок B0) геному BMYV або на основі ортологічних генів, або мають послідовності, одержані (тобто володіють щонайменше 85 % ідентичністю послідовності) на основі генома BMYV. Переважно, дана (шпилькова; hpP0) РНК конструкція містить смисловий (РНК) сегмент і антисмисловий (РНК) сегмент, (обидва) додатково містять (РНК) (смисловий і/або антисмисловий) фрагменти, одержані (тобто володіють щонайменше 85 % ідентичністю) на основі 5'- нетрансльованій (5'-UTR) області BMYV (що знаходиться поруч з цим геном, що кодує P0 BMYV або ортологічними генами), і/або дана (шпилькова) РНК конструкція містить смисловий сегмент РНК і антисмисловий сегмент РНК, що мають послідовності, одержані як на основі нуклеотидного фрагменту 5'-UTR, так і на основі (що знаходиться поруч) нуклеотидного фрагменту нуклеотидної послідовності P0 BMYV або ортологічних генів. Переважно, ці фрагменти 5'-UTR і P0 нуклеотидної послідовності знаходяться поруч у геномі BMYV. Дана РНК шпилька, в тих випадках, коли містить фрагмент 5'-UTR і P0, переважно відноситься, в даному винаході, до hpP0u нуклеотидної послідовності. Можливо (але менш переважно), ця(ці) (hpP0 і/або hpP0u (РНК) шпилька(и)) конструкція(ї) згідно винаходу не містить(ять) фрагмент, що має послідовність, одержану на основі іншого вірусу, такого як геномBNYVV. Переважно ця(і) РНК (шпилька; hpP0 і/або hpP0u) конструкція(ї) згідно винаходу містить(ять) смисловий РНК сегмент і антисмисловий РНК сегмент, що додатково має (фрагмент, що представляє) послідовності, одержані на основі геному BNYVV, переважно в додаток до 5'UTR послідовності з геному BMYV (що знаходиться поруч з P0), і/або дана(і) РНК (шпилька; hpP0 і/або hpP0u) конструкція(ї) містить(ять) смисловий РНК сегмент і антисмисловий РНК сегмент (який містить фрагмент, що має послідовність, одержану на основі гену P0), обидва додатково містять нуклеотидний фрагмент, що володіє щонайменше 85 % ідентичністю послідовності з (частиною) геномом BNYVV. 5 UA 114603 C2 5 10 Більш переважно, даний смисловий і антисмислової РНК сегменти, одержані на основі геному BNYVV, є смисловою і/або антисмисловою послідовностями, відповідними (частини) послідовності P15 генома BNYVV (у тому випадку, коли це шпилька, тут нижче відноситься до hpP0-P15 або hpP0u-P15, причому остання додатково містить нуклеотидний фрагмент, одержаний на основі послідовності 5'-UTR геному BMYV). Переважно, ця hpP0 і/або hpP0u РНК (шпилькова) конструкція(і) також містить смисловий і антисмисловий нуклеотидний (РНК) фрагменти, що мають послідовності, одержані на основі нуклеотидної послідовності P1BMYV. У контексті даного винаходу "ортологи" відносяться до генів в різних видах, які зберігають ту ж функцію (наприклад, в ході еволюції). Приклад ортологічних генів гену P0 (або нуклеотидної послідовності) геному BMYV запропонований в таблиці 1. Таблиця 1: неповний перелік ідентифікованих ортологів послідовності P0 Вірус Розмір P0 Хозяїн Вірус пожовтіння турнепсу (раніше BWYV-FL1) 28,3 кДа цукровий очерет 34 кДа горох 26,3 кДа цукровий буряк Вирус хлороза свеклы 27,4 кДа цукровий буряк Вірус жовтої карликовості злаків 40 картопля Західний вірус пожовтіння буряків - США 35 27,2 кДа Вірус деформуючої мозаїки гороху 30 огірок Вірус пожовтіння листя цукрового очерету 25 26,4 кДа Вірус скручування листя картоплі 20 салат-латук Вірус пожовтіння гарбузових, стерпний попелиць 15 27,5 кДа (кілоДальтон) 28,3 кДа ячмінь У контексті даного винаходу термін "сегмент" відноситься до нуклеотидної (РНК) смислової і/або антисмислової нуклеотидної послідовності(ям), здатної(им) бути використаною(ми) в сайленсінге генів. Таким чином, сегмент може мати довжину 10 (переважно щонайменше 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35 або 40) нуклеотидів, а може також охоплювати кілька генів і/або гени і (5'-) нетрансльовані області (5'UTR), що знаходяться поруч. Переважний сегмент охоплює (5' частину) ген P0 (або нуклеотидну послідовність) і знаходиться поряд 5'UTR. У контексті даного винаходу термін "фрагмент" відноситься до нуклеотидної (РНК) смислової послідовності і/або антисмислової нуклеотидної послідовності, що має послідовність, одержану на основі цільової вірусної нуклеотидної послідовності. Таким чином, фрагмент може мати довжину 10 (переважно щонайменше 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 30, 35 або 40) нуклеотидів, а може також охоплювати більш, ніж один ген. У контексті даного винаходу можливо кілька фрагментів асоційовані з утворенням (РНК) смислового і/або антисмислового сегменту(ів). Можливо (особливо у випадку, коли асоційовані два фрагменти, одержані на основі геному різних вірусів) фрагменти асоційовані за допомогою послідовності лінкеру або спейсеру (одержаного не так на основі цільової вірусної послідовності) з утворенням (РНК) смислового сегменту і/або (РНК) антисмислового сегменту(ів). Переважно в даному винаході 5'UTR фрагмент і P0 фрагмент, що знаходиться поряд асоційовані не за допомогою послідовності лінкеру або спейсеру. Ці конструкції можуть містити змінені послідовності (мутовані послідовності). Внаслідок цього, термін "одержана послідовність" відноситься до нуклеотидних послідовностей, які мають щонайменше 85 % (більш переважно щонайменше 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або навіть 100 %) ідентичність послідовності з вищезазначеним геном. Наприклад, послідовність, одержана на основі гену P0 (або послідовності) геному BMYV відноситься переважно до нуклеотидної послідовності, що має щонайменше 85 % ідентичність послідовності з послідовністю SEQ ID NO: 17. 6 UA 114603 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Переважно, ці конструкції не містять більше 15 % мутованих залишків у порівнянні з послідовністю дикого типу (SEQ ID NO: 17) і/або з послідовністю SEQ ID NO: 1 або послідовністю SEQ ID NO: 3. Переважно, ці (РНК) конструкції (включаючи сегменти і, більш переважно, фрагменти) мають розмір, більше ніж 25 нуклеотидів, переважно більше ніж приблизно 50 нуклеотидів. Можливо, дані (РНК) конструкції (у формі смислового і/або антисмислового сегменту) мають розмір, менше ніж приблизно 10000 нуклеотидів, можливо менше, ніж приблизно 5000, приблизно 3000, приблизно 2000 або приблизно 1000 нуклеотидів. Переважно, смисловий (РНК) сегмент і/або антисмисловий (РНК) сегмент (що має послідовність, одержану на основі 5'UTR P0) містять фрагмент(ти), який охоплює щонайменше 5 нуклеотидів, більш переважно щонайменше 10 нуклеотидів, ще більш переважно щонайменше 20 нуклеотидів 5'UTR (що знаходиться поруч з геном P0), а можливо менше ніж 40 нуклеотидів і переважно менше ніж 30 нуклеотидів даної 5'UTR (що знаходиться поруч з геном P0). Молекулярна характеристика рослинного матеріалу показала наявність малих молекул РНК, комплементарних як смислової, так і антисмислової послідовності BMYV P0, вказуючи на те, що був досягнутий механізм сайленсінгу, і він ініціював розпад геномної РНК. Дані РНК (шпилькові) конструкції ефективно ініціюють PTGS (посттранскрипціоний сайленсінг генів), націлюючись на розпад транскрипційної РНК BMYV (або як BMYV, так і BNYVV). Автори винаходу насправді відкрили більш сильне інгібування BMYV (і BNYVV) за допомогою конструкцій, несучих 5'UTR BMYV, на додаток до P0 (можливо на додаток до (фрагментам) послідовностям, що одержані на основі геному BNYVV). Наприклад, при використанні hpP0-P15 нуклеотидной конструкції автори винаходу звернули увагу на освіту міРНК (малі інтерферуючі РНК), дії яких націлені на послідовність BMYV, а також послідовність РНК2 BNYVV, приводячи в результаті до дуже ефективному і несподіваному інгібіруванню обох вірусних інфекцій. У випадку даної подвійної конструкції автори винаходу звернули увагу на більш виражене зниження обох вірусних інфекцій (BMYV і/або BNYVV), ніж при використанні порівнянної конструкції, націленої виключно на BNYVV або BMYV. Спорідненим аспектом є РНК конструкція (така як шпилькова РНК), що містить смисловий (РНК) сегмент і антисмисловий (РНК) сегмент, (обидва) мають послідовності, одержані на основі (тобто володіють щонайменше 85 % ідентичністю послідовності) геному BMYV (або його нуклеотидної послідовності). Переважно, РНК конструкція (така як шпилькова РНК), одержана на основі геному BMYV, що містить смисловий (РНК) сегмент і антисмисловий (РНК) сегмент, має смислові послідовність, одержану на основі (тобто такі, що володіють щонайменше 85 % ідентичністю послідовності) 5'частини геному BMYV і/або на основі групи, що складається з нуклеотидів геному BMYV, що кодують P0, P1, P2, P3, P4 і P5 білки, більш переважно з нуклеотидів геному BMYV, що кодують білки P1 або P2. Переважно, ці (РНК) конструкції, одержані на основі геному BMYV (які включають сегменти і, більш переважно, фрагменти) мають розмір, більше ніж приблизно 25 нуклеотидів, переважно більше ніж приблизно 50 нуклеотидів. Можливо ці (РНК) конструкції, одержані на основі геному BMYV (у формі смислового сегменту і/або антисмислового сегменту), мають розмір менше ніж приблизно 10 000 нуклеотидів, можливо менше ніж 5000, приблизно 3000, приблизно 2000 або приблизно 1000 нуклеотидів. Навпаки, автори винаходу тестували вплив конструкцій РНК (у формі шпильок), що мають послідовність, одержану виключно на основі геному BNYVV (таку як послідовність, що кодує білок P15) або на основі генома BMYV. Ці шпилькові P15 конструкції, одержані на основі BNYVV, привели в результаті до зниженого рівня BNYVV інфекції у рослин, спільно інфікованих двома вірусами (в порівнянні з контрольними конструкціями), а також викликали деяке зниження вираженості симптомів BMYV (порівняно з контрольними конструкціями). Дані шпилькові hpP0 і головним чином hpP0u конструкції, одержані на основі BMYV, привели до зниженого рівня BMYV інфекції у рослин, спільно інфікованих двома вірусами (в порівнянні з контрольними конструкціями), а також викликали зниження вираженості симптомів, обумовлених BNYVV інфекцією (в порівнянні з контрольними конструкціями). Дві BMYV нуклеотидні послідовності тестували в якості hpP0u нуклеотидної конструкції (послідовність SEQ ID NO: 13 або 14). 7 UA 114603 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Нуклеотидну послідовність SEQ ID NO: 1, 13 або 14 можна порівняти з послідовністю SEQ ID NO: 17, яка представляє собою нуклеотидну послідовність P0 дикого типу (див. Фіг. 8). Довжина послідовності SEQ ID NO: 1 коротша, ніж нуклеотидна послідовність SEQ ID NO: 17 (659 нуклеотидів в порівнянні з 720 нуклеотидами), і вона містить 5'UTR вірусного геному (підкреслені нуклеотиди), за винятком першого нуклеотиду 5'кінця. Переважно смислова і антисмислова P0 нуклеотидная послідовності містяться в одній молекулі, і/або смисловий P0 РНК сегмент і антисмисловий P0 РНК сегмент містяться в одній єдиній молекулі РНК. Переважно, молекула РНК згідно винаходу здатна згортатися, так що вказані РНК сегменти, що містяться там, утворюють молекулу дволанцюгової шпилькової РНК. У даному контексті "шпилькова РНК" відноситься до будь-якої молекули самовідпалювальної дволанцюгової РНК. У своєму найпростішому представлені шпилькова РНК складається з дволанцюгового стебла, складеного відпалювальними нитками РНК, з'єднаного з петлею одноланцюгової РНК. Однак, термін "шпилькова РНК" також спрямований на те, щоб охоплювати більш складні вторинні структури РНК, що містять самовідпалювальні дволанцюгові РНК послідовності, а також внутрішні випетлювання і петлі. Конкретна адаптована вторинна структура буде визначатися за допомогою вільної енергії молекули РНК, і може бути передбачена для різних ситуацій з використанням відповідного програмного забезпечення, такого як FOLDRNA. Як альтернатива, смислова і антисмислова нуклеотидні послідовності P0 можуть перебувати (або кодуватися) в або на двох окремих молекулах або нуклеотидних послідовностях, які можуть бути введені або привнесені в рослинну клітину одночасно і/або послідовно, так що, при транскрибувані, молекула дволанцюгової РНК може утворюватися за допомогою спарювання основ. Даний винахід також відноситься до конструкції ДНК, здатної до транскрипції в конструкцію(ї) РНК за винаходом, і до вектору, який містить дану ДНК конструкцію, зокрема експресійного (і/або самореплиційного вектору (такому як плазміда або вірусний вектор)) вектору або експресійній касеті (або системі), що переважно кодує смисловий і антисмисловий сегменти РНК, що мають послідовності, одержані на основі послідовності(ей) P0, функціонально пов'язані з однією або більш ніж однієї регуляторною послідовністю (послідовність промотору або оператора, включаючи полі(А)-послідовність), активною в рослині або рослинній клітині, переважно в специфічній тканини (переважно корінь) рослини. Інший аспект даного винаходу стосується трансгенних рослин або клітини рослини, такого як Arabidopsis thaliana або рослина цукрового буряка (Beta vulgaris), яке трансформує нуклеотидною (ДНК) конструкцією, вектором і/або молекулою РНК згідно винаходу. Переважно, спостерігається низька, або навіть не спостерігається, ампліфікація вірусу в інокульованій рослині, трансформованому фрагментом(и) нуклеотидної(их) послідовності(ей) P0 згідно винаходу. Переважно, ДНК конструкції згідно винаходу стабільно вбудовуються в геном рослинної клітини, трансформованому генетично модифікованими послідовностями P0 вірусів згідно винаходу і/або вектором, що містить дані послідовності. Як альтернатива, трансген, що містить генетично модифіковану нуклеотидну послідовність P0 відповідно до даного винаходу, може бути локалізований на епісомі або самореплиційному векторі. Прикладами самореплиційних векторів є віруси, зокрема гемінівіруси або плазміди. Численні вектори для трансформації, доступні для трансформації рослин, відомі фахівцям у даній галузі, а ДНК або нуклеотидні конструкції згідно з винаходом (такі, що містять генетично модифіковану послідовність P0 вірусу) можна використовувати в поєднанні з будь-якими такими векторами. Вибір вектору залежить від кращої методики трансформації. Компоненти експресивної системи можна модифікувати, наприклад, із збільшенням експресії смислових і антисмислових РНК сегментів. Промотор, функціонально пов'язаний зі смисловою і/або антисмисловою нуклеотидними послідовностями згідно винаходу може являти собою нативний промотор клітини для трансформації. Промотор як альтернатива може представляти собою гетерологічний промотор, наприклад, тканеспеціфічний промотор, промотор, регульований в процесі розвитку, конститутивний промотор або індуцибельний промотор. Відповідні промотори добре відомі фахівцеві в даній області. У даному винаході переважними є сильні гетерологічні промотори, які є активними в тканинах кореня або є первісно активними в них (коли не бажана експресія в інших тканинах). Різноманітність термінаторів транскрипції доступно для застосування в експресійних касетах. Вони відповідальні за припинення транскрипції поза трансгену і його правильне поліаденилювання. Відповідні термінатори транскрипції є термінаторами транскрипції, які, як 8 UA 114603 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відомо, функціонують в рослинах і включають термінатор CaMV 35S, tm/термінатор, термінатор нопалинсинтази і термінатор rbcS E9 гороху, тощо. Смислові та антисмислові нуклеотидні послідовності (сегменти) в (генетично модифікованій) послідовності P0 вірусу згідновинаходу переважно знаходяться під контролем одного єдиного промотору, головним чином тоді, коли обидва сегменти включені в одну єдину нуклеотидну (шпилькову) послідовність. Проте вони також можуть бути, кожна, під контролем відмінного промотору (наприклад, коли РНК конструкція зроблена із сегментів, які є двома різними молекулами). Тобто, смислова послідовність ДНК може бути функціонально пов'язана з першим промотором, а антисмислова ДНК послідовність - функціонально пов'язана з другим промотором. Перший промотор і другий промотор можуть бути одним і тим же промотором або можуть бути різними промоторами. Промотор може бути дивергентним або двонаправленим промотором, здатним ініціювати транскрипцію ДНК послідовностей (у два сегменти РНК) на кожній стороні промотору. РНК і ДНК конструкція або послідовність згідно винаходу, крім смислової і антисмислової модифікованої (P0) нуклеотидної (фрагмент) послідовності вірусу, переважно додатково містять нуклеотидну послідовність лінкеру або спейсеру між ДНК послідовностями, що кодують смисловий і антисмисловой РНК сегменти. Очікують, що відсутні обмеження довжини або вимоги до послідовності, пов'язані з областю спейсера, за умови, що ці параметри не зачіпають здатність РНК областей зі смисловою і антисмисловою нуклеотидною (сегмент) послідовністю утворювати дволанцюгову РНК. Переважно, область спейсера або послідовність варіює по довжині від приблизно 5 до приблизно 1000 п.н., більш переважно від приблизно 10 до приблизно 500 п.н., ще більш переважно від приблизно 50 до приблизно 200 п.н. Переважною нуклеотидною послідовністю спейсера або лінкера є інтронна послідовність, переважно інтронна послідовність у смисловій орієнтації, що підсилює ефективність зниження рівня експресії цільової нуклеотидної послідовності. Посилення ефективності може бути виражене як підвищення частоти наявності рослин, у яких відбувається сайленсінг, або як підвищення рівня зниження експресії вірусу. Переважні інтроні нуклеотидні послідовності (або інтрони) походять з генів рослин, подібно ймовірним генам рибосомальної РНК або високотранскрибуємим генам рослин. Дані інтрони можуть відбуватися з генів дводольних рослин, наприклад, з генів Petunia, ще більш переважно - походят з генів (цукрового) буряка. Також можливо застосовувати тільки частину цих (рослинних інтронів, наприклад, щонайменше межі, що містять сигнали сплайсингу (див. нижче). Всі дані інтрони та їх частини в контексті винаходу називаються "інтроними фрагментами" або "інтроними послідовностями". Бажана довжина для таких інтронних нуклеотидних послідовностей знаходиться між приблизно 5 і приблизно 1000 п.н., переважно між приблизно 50 і приблизно 600 п.н., більш переважно між приблизно 90 і приблизно 550 п.н. Переважні інтроні послідовності містять послідовність SEQ ID NO: 11 або 12, або навіть більш переважно складаються з послідовності SEQ ID NO: 11 або 12. РНК конструкцію, що містить смислову і антисмислову нуклеотидную (сегмент) послідовності, здатні утворювати, наприклад, структуру шпильки, які утворюються за допомогою транскрипції відповідної рекомбінантної ДНК, можна також вводити безпосередньо в рослинну клітину. Такі молекули РНК могли б бути утворені, наприклад, за допомогою - клонування ДНК області, здатної транскрибуватися в молекулу РНК з нуклеотидною послідовністю, яка містить смислову нуклеотидну послідовність (сегмент) за меншою 10 (переважно щонайменше 20, 21, 22, 23, 24, 25 або більше) послідовних нуклеотидів, що має 75100 % ідентичність послідовності з (щонайменше частиною), цікавою нуклеотидною послідовністю, і антисмислову нуклеотидну послідовність (сегмент), що має щонайменше 10 нуклеотидів (переважно щонайменше приблизно 15 нуклеотидів, 20 нуклеотидів, зокрема щонайменше приблизно 50 нуклеотидів, конкретніше щонайменше приблизно 100 нуклеотидів, головним чином щонайменше приблизно 150 нуклеотидів, особливо щонайменше приблизно 200 нуклеотидів, 250 нуклеотидів, 300 нуклеотидів, зовсім конкретно щонайменше приблизно 350 нуклеотидів або приблизно 400 нуклеотидів) і має від приблизно 75 % до приблизно 100 % ідентичності послідовності з послідовністю, комплементарної нуклеотидам смислової нуклеотидної послідовності (і з цільовою мРНК), в результаті чого дана конструкція РНК (що містить смисловий і антисмисловий сегменти) здатна утворювати дволанцюгову РНК за допомогою спарювання основ між областями зі смисловою і антисмисловою нуклеотидною послідовністю, даючи в результаті, наприклад, шпилькову РНК структуру; 9 UA 114603 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 - проведення in vitro реакції транскрипції за допомогою додавання крім іншого підходящої ДНК-залежної РНК полімерази, а також необхідних реагентів для утворення молекул РНК; і - виділення молекул РНК. Згідно винаходу також додатково запропоновано BMYV і/або BNYVV резистентна або толерантна рослина, яка містить в геномі щонайменше частини своїх клітин, переважно більшості своїх клітин, (генетично модифіковану; смислову і/або антисмислову і/або шпилькову) P0 послідовність (і можливо також смислову і/або антисмислову і/або шпилькову послідовність, одержану на основі геному BNYVV) згідно винаходу і/або вектор, що містить те ж саме, який, при транскрибувані, дає молекулу РНК, яка ініціює PTGS BMYV і, можливо, BNYVV. Також запропоновано BMYV і/або BNYVV резистентна або толерантна рослина, яка містить щонайменше в частині своїх клітин, переважно в більшості своїх клітин, молекулу РНК згідно винаходу з досягненням описаного вище ефекту. "Рослина" відноситься до будь-якої рослини або частини рослини на будь-якій стадії розвитку. Сюди також включені живці, клітинні або тканинні культури та насіння. Використовуваний у зв'язку з даним винаходом термін "рослинна тканина" включає цілі рослини, рослинні клітини, органи рослин, насіння рослин, протопласти, каллус, клітинні культури і будь-які групи рослинних клітин, організованих в структурні і/або функціональні одиниці, але не обмежується ними. Останні також називаються (вегетативно) структурами, відтворюються, що означає те, що з них можна регенерувати цілу рослину. Одержана трансформована рослина, рослинні тканини і рослинний матеріал можна використовувати в традиційній селекції та розмноженні рослин або схемах регенерації з одержанням більшої кількості трансформованих рослин з тими ж характеристиками (резистентність або толерантність по відношенню до вірусів) або з введенням конструкції ДНК відповідно до даного винаходу в інші сорти того ж або спорідненого виду рослини. "Резистентність або толерантність по відношенню до вірусів" в даному документі означає, що резистентна або толерантна клітина або рослина або є нечутливою, або має знижену чутливість до одного або більш ніж одного вірусу в порівнянні з чутливою клітиною або рослиною. У даному випадку розглядають резистентність і переважно суперрезистентність стосовно BMYV і/або BNYVV інфекціям. Толерантність, наприклад, означає, що звичайні симптоми вірусної інфекції відсутні, або їх вираженість знижена, або накопичення або реплікація вірусу в клітині попереджена або знижена, або рух вірусу, наприклад, від клітини до клітини попереджено або зменшено. Далі винахід буде додатково описано за допомогою посилання на наступні докладні приклади (що не обмежують даний винахід). Приклади Для вивчення функціональності послідовності P0, що викликає PTGS, конструювали бінарний вектор Agrobacterium, наприклад, згідно Фіг. 4А і 4Б. Створення ДНК конструкцій згідно винаходу і клонування цих конструкцій в Agrobacterium tumefaciens ((нейтралізований) штам GV3101) проводили згідно способам і методиками, добре відомим в даній області. (P0) смисловий і антисмисловий фрагменти і інтрони генерували за допомогою генетичної ампліфікації (ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція)), включаючи специфічні сайти рестрикції на кінцях. Будучи змішаними з основою вектора, тільки одна рекомбінація/вставка фрагментів була можливою на основі сумісності даних специфічних сайтів на кінці фрагментів. Штам GV3101 Agrobacterium tumefaciens, що несе шпилькову конструкцію, застосовували для сприяння у проведенні трансформації Arabidopsis thaliana способом занурення квіток. Матеріал листя трансгенного Arabidopsis thaliana інфікували изолятом BMYV-2itb, що зустрічається в природі, використовуючи передачу за допомогою попелиць, або штамом BMYVEK, одержаним з інфекційного клону і переносимим за допомогою попелиць. Для експериментів з передачі за допомогою попелиць: для одержання вірусу попелицями давали 48 годинний період доступу для одержання (AAP) на очищеній суспензії BMYV-2itb ізоляту або клону BMYV-EK. Після AAP попелиць переносили тонким пензликом на листя трансгенного Arabidopsis thaliana (10 попелиць на рослину) протягом 96 годинного періоду доступу для інокуляції (IAP). Потім попелиць вбивали обробкою інсектицидами, а детектування вірусів за допомогою ELISA проводили 3 тижні потому на системних листках. Для всіх експериментів, описаних нижче, дані по ELISA оцінювали за допомогою програмного забезпечення SAS 9.1 (метод ANOVA) з подальшим використанням критерію Тьюки. Значення P менше 0,05 вказувало на достовірну відмінність. Приклад 1 10 UA 114603 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Механізм РНК сайленсінгу націлений на консервативні послідовності і викликає їх руйнування. Найбільш консервативні послідовності в межах полеровірусів розташовуються на 3' кінці РНК. Вважається, що експресія шпилькових конструкцій, що мають послідовності, одержані на основі консервативних частин вірусного геному, приводить (в рослині) до утворення дволанцюгової РНК, яка впізнається і розщеплюється на дуплекси, які становлять приблизно 21-24 нуклеотиду (міРНК) за допомогою ферменту Dicer. Специфічні міРНК будуть завантажені в RISC комплекс (комплекс сайленсінгу, індукований РНК), який у свою чергу буде націлений на гомологічну вірусну геномну РНК і буде викликати розпад останньої. У зв'язку з цим, метаболізм вірусу буде серйозно порушений, і вираженість симптомів вірусної інфекції буде знижена. У найбільш сприятливих випадках буде одержана загальна резистентність. Автори винаходу, насамперед, генерували дві шпилькові послідовності, що походять з 3'кінця вірусу вірусного генома (BMYV). Перша конструкція несла послідовність CP (білок оболонки) під назвою hpCP, а друга 3'кінець послідовності RT (білок з "прочитаним" термінатором) з 3' кінцем некодуючої послідовності BMYV геному під назвою hpRT+Nc. Обидві конструкції застосовували для трансформації рослин Arabidopsis thaliana, і для кожної одержували десять незалежних трансгенних ліній і тестували на їх резистентність по відношенню до BMYV. Рослини, які експресують міРНК, специфічні до 3' кінця вірусного геному, інфікували вірусом. Жодна з трансгенних рослин не була резистентною стосовно BMYV, незалежно від того, чи застосовували hpCP або hpRT+Nc шпильку. Приклад 2 Трансгенні рослини Arabidopsis thaliana, що кодують hpP0(u) конструкції згідно винаходу, потім інфікували ізолятом BMYV-2itb. Створювали шість незалежних трансгенних ліній Arabidopsis thaliana, які експресують hpP0 (або hp0u) мРНК (матрична РНК). Результати, одержані за конструкцією 1 (Фіг. 4А), узагальнені на Фіг. 5. Проведений статистичний аналіз ANOVA показав існуючі відмінності в межах значень за ELISA трансгенних рослин та рослин дикого типу (p менш 0,0001). Критерій Тьюки показав відсутність значимої різниці між трансгенними лініями, тоді як всі лінії значимо відрізнялися від Col0 інф (p менше 0,05), виявляючи резистентність трансгенних ліній по відношенню до інокуляції BMYV. P0-специфічні молекули міРНК детектувати в шести лініях, але на більш високих рівнях - у трьох резистентних лініях (hpP0-9, -10 і -12). У чутливих рослин (Col 0) міРНК не детектувати. Дані результати вказують на те, що hpP0(u) конструкції підходять для того, щоб викликати PTGS в рослинах Arabidopsis thaliana, і можуть викликати резистентність по відношенню до BMYV. Приклад 3 Експерименти з прикладу 2 повторювали з конструкцією 2 (Фіг. 4Б) і з великою кількістю (вісім) трансгенних ліній Arabidopsis thaliana, інфікованих ізолятом BMYV-2itb. Результати узагальнені на Фіг. 6. Для даної конструкції, за винятком лінії hpP0 буряк-3, всі лінії були резистентними стосовно BMYV, що підтверджується ANOVA і статистичним аналізом Тьюки (p менше 0,05). Значущої відмінності між hpP0-12 і резистентними лініями hpP0 буряка не спостерігали. Було виявлено, що рівень P0-специфічних молекул міРНК значно вище в резистентних лініях (hpP0beet-1, -2, -5, -7 і 8), ніж в інших лініях. Приклад 4 Результати, описані в прикладі 2 і в прикладі 3, повторювали як з типом трансгенних ліній Arabidopsis thaliana (hpP0-9, -10, 12, hpP0beet-2, -7 і -8), так і двома джерелами інокуляту (BMYV-EK або BMYV-2itb). Результати представлені на Фіг. 7. Всі трансгенні лінії Arabidopsis thaliana виявилися резистентними стосовно інокуляту BMYV-EK (p менше 0,05). Трансгенні лінії відповідають порізному на BMYV-2itb ізолят. У своїй сукупності дані результати показують кращу захищеність стосовно BMYV, коли трансген містить інтрон буряків. Індукція PTGS за допомогою шпилькової конструкції, таким чином, очевидно, є хорошим джерелом резистентності по відношенню до вірусної інфекції, і зокрема по відношенню до BMYV. З вищенаведених прикладів виходить, що резистентність стосовно hpP0(u) патогенного походження згідно винаходу є високоефективною. 11 UA 114603 C2 5 Конструкції hpP0 за винаходом успішно індукували викликану патогеном резистентність рослин. Всі тестовані конструкції hpP0 викликали розпад геномної РНК за допомогою PTGS, що давало в результаті резистентні стосовно BMYV рослини. Приклад 5 Автори винаходу протестували ефективність інших стратегій з використанням конструкції hpCP, що містить ген, що кодує білок оболонки геному MBYV, і 3' дистальну послідовність (hpRT+NC конструкція гену BMYV, що кодує RT білок, за яким слідує некодуючий кінець вірусної BMYV РНК). Автори винаходу несподівано відкрили, що дані дві додаткові конструкції були неефективними для індукування в рослині резистентності по відношенню до вірусів. 10 12 UA 114603 C2 13 UA 114603 C2 14 UA 114603 C2 15 UA 114603 C2 16 UA 114603 C2 17 UA 114603 C2 18 UA 114603 C2 19 UA 114603 C2 20 UA 114603 C2 21 UA 114603 C2 22 UA 114603 C2 23 UA 114603 C2 24 UA 114603 C2 25 UA 114603 C2 26 UA 114603 C2 27 UA 114603 C2 28