Порушення гена ckx3 та принаймні одного іншого гена ckx у рослині або рослинній клітині, що приводить до поліпшених ознак
Номер патенту: 106621
Опубліковано: 25.09.2014
Автори: Шмюллінг Томас, Вернер Томаш, Бартріна і Маннс Ізабель
Формула / Реферат
1. Ізольована рослинна клітина, що включає порушення принаймні у:
і) ендогенному СКХ3 гені, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичності з SEQ ID NО: 1 або її ортологом;
та
іі) одному додатковому ендогенному гені, що кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу та є відмінним від гена, який є визначеним у і);
де вказані порушення інгібують експресію та/або активність продукту принаймні двох порушених генів цитокініноксидази/дегідрогенази у порівнянні із відповідною контрольною рослинною клітиною, що не має таких порушень.
2. Трансгенна рослина, що включає порушення принаймні у:
і) ендогенному СКХ3 гені, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичнності з SEQ ID NО: 1 або її ортологом;
та
іі) одному додатковому ендогенному гені, що кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу та є відмінним від гена, який є визначеним у і);
де вказані порушення інгібують експресію та/або активність продукту принаймні двох порушених генів цитокініноксидази/дегідрогенази у порівнянні із відповідною контрольною рослиною, що не має таких порушень.
3. Ізольована рослинна клітина згідно з пунктом 1 або трансгенна рослина згідно з пунктом 2, що включає порушення принаймні у:
і) ендогенному СКХ3 гені, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичності з SEQ ID NО: 1 або її ортологом;
та
іі) принаймні в одному додатковому ендогенному гені, що являє собою:
a) СКХ1 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичності з SEQ ID NО: 13 або її ортологом;
b) CKX2 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичності з SEQ ID NО: 2 або її ортологом;
c) СКХ4 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичності з SEQ ID NО: 3 або її ортологом;
d) CKX5 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичності з SEQ ID NО: 4 або її ортологом;
e) СКХ6 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичності з SEQ ID NО: 5 або її ортологом;
або
f) CKX7 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичності з SEQ ID NО: 6 або її ортологом.
4. Ізольована рослинна клітина за будь-яким з пунктів 1 та 3 або трансгенна рослина за будь-яким з пунктів 2 та 3, в якій принаймні:
і) ендогенний СКХ3 ген, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичності з SEQ ID NО: 7 або її ортологом;
та
іі) принаймні один додатковий ендогенний ген, що являє собою:
a) СКХ1 ген, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичності з SEQ ID NО: 14 або її ортологом;
b) CKX2 ген, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичності з SEQ ID NО: 8 або її ортологом;
c) СКХ4 ген, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичності з SEQ ID NО: 9 або її ортологом;
d) CKX5 ген, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичності з SEQ ID NО: 10 або її ортологом;
e) СКХ6 ген, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичності з SEQ ID NО: 11 або її ортологом; або
f) CKX7 ген, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичності з SEQ ID NО: 12 або її ортологом;
є порушеними.
5. Ізольована рослинна клітина згідно з пунктом 1 або трансгенна рослина згідно з пунктом 2, де
і) принаймні ендогенний СКХ3 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичності з SEQ ID NО: 1 або її ортологом;
та
іі) ендогенний СКХ5 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичності з SEQ ID NО: 4 або її ортологом,
є порушеними.
6. Ізольована рослинна клітина згідно з пунктом 4 або трансгенна рослина згідно з пунктом 4, де
і) ендогенний СКХ3 ген, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичності з SEQ ID NО: 7 або її ортологом; та
іі) ендогенний СКХ5 ген, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичності з SEQ ID NО: 10 або її ортологом;
є порушеними.
7. Ізольована рослинна клітина за будь-яким з пунктів 1, 3, 4, 5, 6 або трансгенна рослина за будь-яким з пунктів 2, 3, 4, 5, 6, де одне, більше одного або усі порушення є поліпшеними за допомогою структурного порушення, генної супресії при використанні антисмислового полінуклеотиду, генного мовчання, індукованого дволанцюгової ДНК, методик на основі рибозиму, геномних порушень, методики тілінгу та/або гомологічної рекомбінації.
8. Ізольована рослинна клітина за будь-яким з пунктів 1, 3, 4, 5, 6 та 7 або трансгенна рослина за будь-яким з пунктів 2, 3, 4, 5, 6 та 7, де одне, більше одного або усі порушення являють собою гомозиготні порушення.
9. Трансгенна рослина за будь-яким з пунктів 2, 3, 4, 5, 6, 7 та 8, де рослина є вибраною з родини Brassicaceae, переважно з родини Brassica або Arabidopsis.
10. Клітина, орган, тканина або трансгенний матеріал для розмноження, що походить від трансгенної рослини за будь-яким з пунктів 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 та 9.
11. Спосіб підвищення врожайності насіння у рослини та/або збільшення висоти рослини, та/або збільшення товщини стебла у порівнянні із відповідною контрольною рослиною, де спосіб включає введення у рослину порушення принаймні у:
і) ендогенному СКХ3 гені, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичності з SEQ ID NО: 1 або її ортологом;
та
іі) одному додатковому ендогенному гені, що кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу та є відмінним від гена, який є визначеним у і);
де вказані порушення інгібують експресію та/або активність продукту принаймні двох порушених генів цитокініноксидази/дегідрогенази у порівнянні із відповідною контрольною рослиною, що не має таких порушень.
12. Спосіб одержання рослини з підвищеною врожайністю насіння та/або висотою рослини у порівнянні із відповідною контрольною рослиною, що включає порушення у рослини принаймні одного:
і) ендогенного СКХ3 гена, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичності з SEQ ID NО: 1 або її ортологом; та
іі) одного додаткового ендогенного гена, що кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу та є відмінним від гена, який є визначеним у і);
де вказані порушення інгібують експресію та/або активність продукту принаймні двох порушених генів цитокініноксидази/дегідрогенази у порівнянні із відповідною контрольною рослиною, що не має таких порушень.
13. Спосіб згідно з пунктом 11 або спосіб згідно з пунктом 12, в якому принаймні:
і) ендогенний СКХ3 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичності з SEQ ID NО: 1 або її ортологом;
та
іі) ендогенний СКХ5 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95 % ідентичності з SEQ ID NО: 4 або її ортологом,
є порушеними.
14. Спосіб за будь-яким з пунктів 11-13, де одне, більше одного або усі порушення є гомозиготними порушеннями.
15. Трансгенна рослина, яку одержують або яка одержана за допомогою одного зі способів 11-14.
Текст
Реферат: Винахід належить до ізольованої рослинної клітини та рослини, що включають порушення принаймні в одному СКХ3 гені та в одному додатковому гені, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу та є відмінним від СКХ3, а також до способу одержання таких трансгенних рослин та способу підвищення врожайності насіння у рослини та/або висоти рослини. UA 106621 C2 (12) UA 106621 C2 UA 106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Для того, щоб забезпечити популяцію, яка постійно росте, їжею та іншими рослинними продуктами, люди завжди були зацікавлені у підвищенні продуктивності сільського господарства. Продуктивність рослини може піддаватися впливу різними шляхами, наприклад, шляхом поліпшення ростових характеристик рослини або за допомогою затримки в‘янення листя. Існує багато відомих механізмів та шляхів, які є втягненими у ріст та розвиток рослин. Цитокінін являє собою рослинний гормон, що грає позитивну та негативну роль у багатьох аспектах росту та розвитку рослин. Він стимулює утворення та активність паросткових меристем, є здатним до створення провідних тканин, затримує в‘янення листя, інгібує ріст коренів та галуження та відіграє певну роль у розмноженні насіння та у відповідях на стрес (Mok, D. W. S. & Mok, M. C. (2001) Ann. Rev. Plant Physiol. MoI. Bio. 52, 89-1 18). Аналіз дефектних за цитокініном рослин показав, що цитокінін грає протилежні ролі у меристемах пагонів та коренів, що дає можливість запропонувати, що цей гормон відіграє суттєву функцію у кількісному контролі росту органів (Werner T, Motyka V, Laucou V, Smets R, Van Onckelen H, Schmülling T, Plant Cell 2003,15(11):2532-50; Werner T, Motyka V, Strnad M, Schmülling T, Proc Natl Acad Sci U S A 2001, 98(18):10487-92). Оксидази/дегідрогенази цитокініну (CKX) являють собою важливий фактор для регуляції гоместостазу рослинного гормону цитокініну. Геном Arabidopsis кодує сім генів CKX, які мають відмінні експресійні домени (Werner та ін., 2001; Werner та ін., 2003). CKX білки відрізняються за своєю субклітинною локалізацією та біохімічними ознаками (Werner та ін., 2003). Понадекспресія індивідуальних генів CKX створила дефіцитні за цитокініном рослини та виявила, що цитокінін являє собою позитивний регулятор активності паросткових меристем та негативний регулятор активності кореневих меристем. Нещодавно було показано, що у рослині рису інгібування функції конкретного гена CKX, ортолога гена CKX3 Arabidopsis thaliana, приводило до підвищення кількості зернин у волоті вказаної рослини рису (див. US 2006/0123507 A1). Незважаючи на те, що ці результати є перспективними, все ще залишається потреба у додатковому підвищенні продуктивності рослин. Задачею даного винаходу є забезпечення засобів та способів, прийнятних для продукції трансгенних рослин з поліпшеною продуктивністю та/або ростовими характеристиками. Ця задача вирішується за допомогою даного винаходу, як представлено більш детально нижче. Даний винахід забезпечує ізольовані клітини рослин та трансгенні рослини, в яких експресія та/або активність принаймні двох різних генів цитокініноксидази/дегідрогенази інгібується шляхом порушення у порівнянні із контрольною рослинною клітиною або контрольною рослиною, яка не має таких порушень, де перший ген цитокініноксидази/дегідрогенази являє собою ендогенний ген, що кодує CKX3 або його ортолог, а другий ген цитокініноксидази/дегідрогенази являє собою ендогенний ген, що кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу та відрізняється від CKX3 або його ортолога. Несподівано було виявлено, що у рослині одночасне порушення CKX3 гена та другого гена цитокініноксидази/дегідрогенази, що кодує один з CKX2, CKX4, CKX5 або CKX6, приводить до одержання трансгенних рослин з врожаєм насіння, що є вищим, ніж такий у рослини, яка немає такого порушення, або трансгенних рослин, в яких тільки один ген цитокініноксидази/дегідрогенази був порушений. У той час, як одиничне порушення гена CKX3 приводить до слабкого (але не значущого) підвищення врожайності насіння, як повідомлялося в US 2006/0123507 A1, одиничне порушення CKX5 не дає здатного до вимірювання впливу на врожайність насіння. Несподівано було виявлено, що одночасне порушення CKX3 та одного з CKX2, CKX4, CKX5 або CKX6, але не одночасне порушення CKX2 та CKX4 або CKX2 та CKX4 та CKX5, або CKX4 та CKX6, або CKX5 та CKX6, приводить до значного підвищення врожайності насіння у порівнянні із диком типом та одиничними порушеннями CKX3 та CKX5. Найбільш значне підвищення врожайності насіння спостерігали для одночасного порушення CKX3 та CKX5. Навіть більш несподівано було виявлено, що одночасне порушення CKX3 та одного з CKX2, CKX4, CKX5 або CKX6, зокрема, CKX3 та CKX5, приводить до одержання трансгенних рослин зі значно збільшеною висотою рослини у порівнянні із рослинами дикого типу та трансгенними рослинами, що включають одиничні порушення CKX3 або CKX5. Таким чином, одночасне порушення принаймні CKX3 та одного додаткового ендогенного гена, що кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, переважно CKX1, CKX2, CKX4, CKX5, CKX6 або CKX7, приводить до одержання трансгенних рослин з поліпшеною продуктивністю та/або ростовими характеристиками. 1 UA 106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У першому аспекті даний винахід відноситься до ізольованої рослинної клітини, що включає порушення принаймні у: i) ендогенному CKX3 гені, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 1 або її ортологом; та ii) одному додатковому ендогенному гені, що кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу та є відмінним від гена, який є визначеним у i); де вказані порушення інгібують експресію та/або активність продукту принаймні двох порушених генів цитокініноксидази/дегідрогенази у порівнянні із відповідною контрольною рослинною клітиною, що не має таких порушень. У другому аспекті даний винахід є направленим на трансгенну рослину, яка включає порушення у принаймні: i) ендогенному CKX3 гені, що кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 1 або її ортологом; та ii) одному додатковому ендогенному гені, що кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу та є відмінним від гена, який є визначеним у i); де вказані порушення інгібують експресію та/або активність продукту принаймні двох порушених генів цитокініноксидази/дегідрогенази у порівнянні із відповідною контрольною рослиною, що не має таких порушень. При цьому є зрозумілим, що для цілей даного винаходу термін “трансгенна рослина” охоплює не тільки рослину, що включає порушення згідно з винаходом як таку, але також відноситься до будь-якого її потомства, незалежно від номера покоління, тобто термін “трансгенна рослина” охоплює потомство першого покоління, а також потомство X покоління, за умови, що вказане потомство все ще включає порушення згідно з винаходом, що охоплюються батьківською трансгенною рослиною. У третьому аспекті винахід відноситься до способу підвищення врожайності насіння у рослини та/або підвищення висоти рослини та/або збільшення товщини стебла у порівнянні із відповідною контрольною рослиною, при цьому спосіб включає введення у рослину порушення принаймні у: i) ендогенному CKX3 гені, який кодує цитокініноксидаз/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 1 або її ортологом; та ii) одному додатковому ендогенному гені, що кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу та є відмінним від гена, який є визначеним у i); де вказані порушення інгібують експресію та/або активність продукту принаймні двох порушених генів цитокініноксидази/дегідрогенази у порівнянні із відповідною контрольною рослиною, що не має таких порушень. У четвертому аспекті даний винахід є направленим на спосіб одержання рослини з підвищеною врожайністю насіння та/або висотою рослини у порівнянні із відповідною контрольною рослиною, що включає порушення у рослині принаймні у: i) ендогенному CKX3 гені, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 1 або її ортологом; та ii) одному додатковому ендогенному гені, що кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу та є відмінним від гена, який є визначеним у i); де вказані порушення інгібують експресію та/або активність продукту принаймні двох порушених генів цитокініноксидази/дегідрогенази у порівнянні із відповідною контрольною рослиною, що не має таких порушень. Даний винахід також відноситься до ізольованої рослинної клітини, що включає порушення принаймні у: i) ендогенному CKX3 гені, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 1 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 1 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 2 UA 106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 1, більш переважно уздовж повної довжини послідовності SEQ ID No. 1; та ii) принаймні в одному додатковому ендогенному гені, що являє собою: a) CKX1 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 13 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з однією з SEQ ID No. 13 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 13, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 13, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 13; b) CKX2 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 2 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 2 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 2, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 2, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 2; c) CKX4 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 3 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 3 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 3, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 3, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 3; d) CKX5 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 4 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 4 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 4, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 4, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 4; e) CKX6 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 5 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 5 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 5, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 5, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 5; або f) CKX7 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 6 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 6 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 6, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 6, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 6; де вказані порушення інгібують експресію та/або активність продукту принаймні двох порушених генів цитокініноксидази/дегідрогенази у порівнянні із відповідною контрольною рослинною клітиною, що не має таких порушень. Даний винахід також відноситься до трансгенної рослини, що включає порушення принаймні у: i) ендогенному CKX3 гені, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 3 UA 106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 1 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 1, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 1, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 1; та ii) принаймні в одному додатковому ендогенному гені, що являє собою: a) CKX1 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 13 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 13 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 13, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 13, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 13; b) CKX2 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 2 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 2 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 2, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 2, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 2; c) CKX4 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 3 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 3 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 3, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 3, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 3; d) CKX5 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 4 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 4 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 4, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 4, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 4; e) CKX6 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 5 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 5 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 5, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 5, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 5; або f) CKX7 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 6 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 6 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 6, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 6, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 6; де вказані порушення інгібують експресію та/або активність продукту принаймні двох порушених генів цитокініноксидази/дегідрогенази у порівнянні із відповідною контрольною рослиною, що не має таких порушень. 4 UA 106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Ізольована рослинна клітина згідно з винаходом та/або трансгенна рослина згідно з винаходом можуть включати порушення принаймні у: i) ендогенному CKX3 гені, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 7 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ген, що включає послідовність нуклеїнової кислоти принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності до SEQ ID No. 7 протягом безперервної послідовності нуклеїнової кислоти з 300 нуклеотидів SEQ ID No. 7, переважно 500 нуклеотидів SEQ ID No. 7, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 7; та ii) принаймні в одному додатковому ендогенному гені, який являє собою: a) CKX1 ген, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 14 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, що включає послідовність нуклеїнової кислоти принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 14 уздовж безперервної послідовності нуклеїнової кислоти з 300 нуклеотидів SEQ ID No. 14, переважно 500 нуклеотидів послідовності SEQ ID No. 14, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 14; b) CKX2 ген, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 8 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген що включає послідовність нуклеїнової кислоти принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 8 уздовж безперервної послідовності нуклеїнової кислоти з 300 нуклеотидів послідовності SEQ ID No. 8, переважно 500 нуклеотидів SEQ ID No. 8, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 8; c) CKX4 ген, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 9 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, що включає послідовність нуклеїнової кислоти принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 9 уздовж безперервної послідовності нуклеїнової кислоти з 300 нуклеотидів SEQ ID No. 9, переважно 500 нуклеотидів SEQ ID No. 9, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 9; d) CKX5 ген що включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 10 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген що включає послідовність нуклеїнової кислоти принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності до SEQ ID No. 10 уздовж безперервної послідовності нуклеїнової кислоти з 300 нуклеотидів SEQ ID No. 10, переважно 500 нуклеотидів SEQ ID No. 10, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 10; e) CKX6 ген, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 11 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, що включає послідовність нуклеїнової кислоти принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 11 уздовж безперервної послідовності нуклеїнової кислоти з 300 нуклеотидів послідовності SEQ ID No. 11, переважно 500 нуклеотидів SEQ ID No. 11, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 11; або f) CKX7 ген, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 12 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, що включає послідовність нуклеїнової кислоти принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80% або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 12 уздовж безперервної послідовності нуклеїнової кислоти з 300 нуклеотидів послідовності SEQ ID No. 12, переважно 500 нуклеотидів SEQ ID No. 12, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 12; де вказані порушення інгібують експресію та/або активність продукту принаймні двох порушених генів цитокініноксидази/дегідрогенази у порівнянні із відповідною контрольною рослиною або клітиною контрольної рослини, що не має таких порушень. Переважно ізольована рослинна клітина згідно з винаходом та/або трансгенна рослина згідно з винаходом включає порушення у 5 UA 106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 i) принаймні ендогенному CKX3 гені, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 1 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 1 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 1, переважно 100 амінокислот послідовності SEQ ID No. 1, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 1; та ii) ендогенному CKX5 гені, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 4 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80% або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 4 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот послідовності SEQ ID No. 4, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 4, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 4. Переважно ізольована рослинна клітина згідно з винаходом та/або трансгенна рослина згідно з винаходом включає порушення у i) ендогенному CKX3 гені, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 7 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ген, що включає послідовність нуклеїнової кислоти принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80% або принаймні 90% ідентичністю послідовності до SEQ ID No. 7 уздовж безперервної послідовності нуклеїнової кислоти з 300 нуклеотидів послідовності SEQ ID No. 7, переважно 500 нуклеотидів SEQ ID No. 7, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 7; та ii) ендогенному CKX5 гені, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 10 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, що включає послідовність нуклеїнової кислоти принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80% або принаймні 90% ідентичністю послідовності до SEQ ID No. 10 уздовж безперервної послідовності нуклеїнової кислоти з 300 нуклеотидів послідовності SEQ ID No. 10, переважно 500 нуклеотидів SEQ ID No. 10, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 10. В ізольованій рослинній клітині згідно з винаходом та/або у трансгенній рослині згідно з винаходом oдне, більше одного або усі порушення згідно з винаходом можуть бути поліпшені за допомогою структурного порушення, антисмислової супресії полінуклеотидного гена, мовчання гена, індукованого дволанцюговою РНК, методик на основі рибозиму, геномних порушень, тілінгу та/або гомологічної рекомбінації. В ізольованій клітини рослини згідно з винаходом та/або у трансгенній рослині згідно з винаходом oдне, більше одного або усі порушення згідно з винаходом можуть бути гомозиготними порушеннями. Tрансгенна рослина згідно з винаходом є переважно вибраною з родини Brassicaceae, більш переважно з роду Brassica або Arabidopsis. Даний винахід є також направленим на клітину, орган, тканину або трансгенний матеріал для розмноження, що походить від трансгенної рослини згідно з винаходом. Трансгенний матеріал для розмноження охоплює частини трансгенної рослини згідно з винаходом, такі, як насіння, бульби, коренеплоди, розширені стрижневі корені або плоди, що походять від трансгенної рослини згідно з винаходом. Даний винахід також є направленим на спосіб підвищення врожайності насіння рослини та/або збільшення висоти рослини у порівнянні із відповідною контрольною рослиною, при цьому спосіб включає введення у рослину порушення принаймні в: i) ендогенному CKX3 гені, що кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 1 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності до SEQ ID No. 1 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 1, переважно 100 амінокислот послідовності SEQ ID No. 1, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 1; 6 UA 106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 та ii) принаймні одному додатковому ендогенному гені, що являє собою: a) CKX1 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 13 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 13 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 13, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 13, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 13; b) CKX2 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 2 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 2 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 2, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 2, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 2; c) CKX4 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 3 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 3 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 3, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 3, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 3; d) CKX5 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 4 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 4 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 4, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 4, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 4; e) CKX6 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 5 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 5 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 5, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 5, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 5; або f) CKX7 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 6 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 6 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 6, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 6, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 6; де вказані порушення інгібують експресію та/або активність продукту принаймні двох порушених генів цитокініноксидази/дегідрогенази у порівнянні із відповідною контрольною рослиною, що не має таких порушень. У додатковому аспекті даний винахід є направленим на спосіб одержання рослини, переважно трансгенної рослини, з підвищеною врожайністю насіння та/або висотою рослини у порівнянні із відповідною контрольною рослиною, що включає порушення у рослині принаймні у: i) ендогенному CKX3 гені, що кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 1 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує 7 UA 106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності до SEQ ID No. 1 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 1, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 1, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 1; та ii) принаймні в одному додатковому ендогенному, що являє собою: a) CKX1 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 13 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 13 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 13, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 13, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 13; b) CKX2 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 2 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 2 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 2, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 2, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 2; c) CKX4 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 3 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 3 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 3, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 3, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 3; d) CKX5 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 4 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 4 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 4, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 4, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 4; e) CKX6 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 5 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 5 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 5, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 5, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 5; або f) CKX7 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 6 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 6 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 6, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 6, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 6; де вказані порушення інгібують експресію та/або активність продукту принаймні двох порушених генів цитокініноксидази/дегідрогенази у порівнянні із відповідною контрольною рослиною, що не має таких порушень. У способах згідно з винаходом переважно 8 UA 106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 i) принаймні ендогенний CKX3 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 1 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності до SEQ ID No. 1 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 1, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 1, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 1; ii) ендогенний CKX5 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 4 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності до SEQ ID No. 4 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 4, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 4, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 4, може переважно бути порушений. У способі згідно з винаходом переважно: i) ендогенний CKX3 ген, що включає послідовність нуклеїнової кислоти, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 7 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ген, що включає послідовність нуклеїнової кислоти принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності до SEQ ID No. 7 уздовж безперервної послідовності нуклеїнової кислоти з 300 нуклеотидів SEQ ID No. 7, переважно 500 нуклеотидів з SEQ ID No. 7, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 7; та ii) принаймні один додатковий ендогенний ген являє собою: a) CKX1 ген, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 14 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, що включає послідовність нуклеїнової кислоти принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 14 уздовж безперервної послідовності нуклеїнової кислоти з 300 нуклеотидів SEQ ID No. 14, переважно 500 нуклеотидів SEQ ID No. 14, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 14; b) CKX2 ген, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 8 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, що включає послідовність нуклеїнової кислоти принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності до SEQ ID No. 8 уздовж безперервної послідовності нуклеїнової кислоти з 300 нуклеотидів SEQ ID No. 8, переважно 500 нуклеотидів SEQ ID No. 8, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 8; c) CKX4 ген, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 9 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, що включає послідовність нуклеїнової кислоти принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності до SEQ ID No. 9 уздовж безперервної послідовності нуклеїнової кислоти з 300 нуклеотидів SEQ ID No. 9, переважно 500 нуклеотидів SEQ ID No. 9, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 9; d) CKX5 ген, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 10 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, що включає послідовність нуклеїнової кислоти принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності до SEQ ID No. 10 уздовж безперервної послідовності нуклеїнової кислоти з 300 нуклеотидів SEQ ID No. 10, переважно з 500 нуклеотидів SEQ ID No. 10, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 10; e) CKX6 ген, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 11 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, що включає послідовність нуклеїнової кислоти принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності до SEQ ID No. 11 протягом безперервної послідовності нуклеїнової кислоти з 300 нуклеотидів 9 UA 106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID No. 11, переважно 500 нуклеотидів SEQ ID No. 11, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 11; або f) CKX7 ген, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 12 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, що включає послідовність нуклеїнової кислоти принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності до SEQ ID No. 12 уздовж безперервної послідовності нуклеїнової кислоти з 300 нуклеотидів SEQ ID No. 12, переважно з 500 нуклеотидів SEQ ID No. 12, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 12; є порушеними. В іншому бажаному способі згідно з винаходом: i) ендогенний CKX3 ген, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 7 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ген, що включає послідовність нуклеїнової кислоти принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності до SEQ ID No. 7 протягом безперервної послідовності нуклеїнової кислоти з 300 нуклеотидів SEQ ID No. 7, переважно 500 нуклеотидів SEQ ID No. 7, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 7; та ii) ендогенний CKX5 ген, який включає послідовність нуклеїнової кислоти, що є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 10 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, що включає послідовність нуклеїнової кислоти принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності до SEQ ID No. 10 уздовж безперервної послідовності нуклеїнової кислоти з 300 нуклеотидів SEQ ID No. 10, переважно 500 нуклеотидів SEQ ID No. 10, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 10, є порушеними. У способах згідно з винаходом переважно одне, більше одного або усі порушення являють собою гомозиготні порушення. Даний винахід є також направленим на ізольовані рослинні клітини або трансгенні рослини, які одержані або можуть бути одержані за допомогою одного зі способів згідно з винаходом. В одному втіленні принаймні одне з порушень в ізольованих клітинах рослини згідно з винаходом або у трансгенній рослині згідно з винаходом одержують шляхом введення принаймні однієї полінуклеотидної послідовності, що включає послідовність нуклеїнової кислоти, яка має принаймні приблизно 70%, принаймні приблизно 75%, принаймні приблизно 80%, принаймні приблизно 85%, принаймні приблизно 90%, принаймні приблизно 95%, принаймні приблизно 99%, приблизно 99,5% або більшу ідентичність послідовності до SEQ ID No. 14 (CKX1), SEQ ID No. 7 (CKX3), SEQ ID No. 8 (CKX2), SEQ ID No. 9 (CKX4), SEQ ID No. 10 (CKX5), SEQ ID No. 11 (CKX6), SEQ ID No. 12 (CKX7) або до її субпослідовності, або її комплементу, у рослинній клітині, так, що принаймні одна полінуклеотидна послідовність є зв‘язаною з промотором у смисловій або антисмисловій орієнтації. В іншому втіленні порушення вводять у рослинну клітину або трансгенну рослину згідно з винаходом шляхом введення принаймні однієї полінуклеотидної послідовності, конфігурованої для мовчання або пригнічення РНК. В іншому втіленні одне, більше одного або усі порушення принаймні в одному із згаданих вище ендогенних генів включає інсерцію одного або більше транспозонів, одне, більше одного або усі порушення можуть включати одну або більше точкових мутацій принаймні в одному із згаданих вище ендогенних генів. Одне, більше одного або усі порушення принаймні в одному із згаданих вище ендогенних генів можуть являти собою гомозиготні порушення. Альтернативно, одне, більше одного або усі порушення принаймні в одному із згаданих вище ендогенних генів можуть являти собою гетерозиготні порушення. У деяких втіленнях порушення принаймні в одному із згаданих вище ендогенних генів можуть включати гомозиготні порушення, гетерозиготні порушення або комбінацію гомозиготних та гетерозиготних порушень. Якщо не визначене інше, то усі технічні та наукові терміни, що використовуються у даній заявці, мають таке саме значення, як в загальному випадку розуміється середнім спеціалістом у даній галузі техніки, до якої відноситься винахід. В описі та пунктах формули даного винаходу буде використовуватися наступна термінологія у відповідності із визначеннями, приведеними нижче. 10 UA 106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як використовується у даному описі та прикладених пунктах формули, сингулярні форми "будь-який", "один" та "цей" включають форми однини та множини, якщо у контексті ясно не вказано інше. Таким чином, наприклад, посилання на "будь-яку клітину" включає одну клітину та будь-яку комбінацію двох або більше клітин, та таке інше. Термін "рослина" в загальному випадку відноситься до будь-якого із зазначених нижче: цільні рослини, частини або органи рослини (наприклад, листя, стебла, корені, тощо), вегетативні органи/структури проростків (наприклад, листя, стебла та бульби), корені, квітки та квіткові органи/структури (наприклад, прицвітник, чашолистки, пелюстки, тичинки, плодолистки, пиляки та насінний зачаток), насіння (включаючи зав‘язь, eндосперм та покриви насіння), плід (зріла зав‘язь), рослинну тканину (наприклад, провідну тканину, основну паренхіму та подібні до них), калуси тканинної культури та клітини рослин (наприклад, клітини продихів, яйцеклітини, трихоми та подібні до них), та їх потомство. Термін “рослина” в загальному випадку означає усі ці організми, які є здатними до фотосинтезу. У термін "рослина" згідно з об‘ємом даного винаходу включаються усі роди та види вищих та нижчих рослин царства рослин. Зрілі рослини означають рослини на будь-якій стадії розвитку вище стадії проростка. Проросток означає молоду незрілу рослину на ранній стадії розвитку. Однорічні, багаторічні, однодольні та/або дводольні рослини є бажаними. Перевага надається рослинам наступної родини рослин: Brassicaceae, зокрема, рослинам роду Brassica та Arabidopsis. Термін "рослинна клітина", як використовується у даній заявці, додатково включає, але без обмеженні, клітини, одержані з або виявлені у рослині або її частині: насіння, культури, суспензійні культури, зав‘язі, меристематичні ділянки, тканину калусів, листя, корені, пагони, гаметофіти, спорофіти, пилок та мікроспори. Клітини рослин можуть також передбачати включення модифікованих клітин, таких, як протопласти, одержані із згаданих вище тканин. Термін “порушення” або “порушений”, як використовується у даній заявці, означає, що ген може бути структурно порушеним для включення принаймні однієї мутації або структурної зміни так, що порушений ген є нездатним до направлення ефективної експресії продукту функціонального гена повного розміру. Термін "порушення” або “порушений” також охоплює ситуацію, коли порушений ген або один з його продуктів може функціонально інгібуватися або інактивуватися так, що ген або не експресується або є нездатним до ефективної експресії повнорозмірного та/або повністю функціонального генного продукту. Функціональне інгібування або інактивація може бути спричинена структурним порушенням та/або перериванням експресії на рівні транскрипції або трансляції. Функціональне інгібування або iнактивація може бути також досягнута, наприклад, за допомогою способів таких, як антисмислова супресія полінуклеотидного гена, індуковане РНК мовчання гена, методики на основі рибозиму та подібні до них. Інгібування експресії та/або активності може бути результатом, наприклад, антисмислових конструкцій, смислових конструкцій, конструкцій мовчання РНК, РНК інтерференції, геномних порушень (наприклад, транспозонів, тіллінгу гомологічної рекомбінації, тощо) та/або подібних до них. Порушення за допомогою функціонального інгібування також охоплює інгібування гена або одного з його продуктів шляхом взаємодії із хімічною сполукою, переважно хімічною сполукою, яка специфічно взаємодіє із вказаним геном або генним продуктом. Інгібування еспресії та/або активності може вимірюватися шляхом визначення присутності та/або кількості транскрипту (наприклад, за допомогою Нозерн-блотінгу або методик ПЛР зі зворотною транскриптазою) та/або шляхом визначення присутності та/або кількості поліпептиду повної довжини або його вкороченої форми, що кодується вказаним геном, наприклад, за допомогою ELISA або Вестерн-блотінгу), та/або за допомогою визначення присутності та/або кількості цитокініноксидазної/дегідрогеназної активності продукту порушеного гена цитокініноксидази/дегідрогенази. Термін "порушення” або "порушений”, як використовується в даній заявці, є призначеним для розуміння того, що порушення також охоплює порушення, яке є ефективним тільки у частині рослини, у конкретному типі клітин або тканині, подібній, наприклад, до репродуктивної меристеми верхівок пагонів. Порушення можна досягнути шляхом взаємодії з кодуючою ділянкою або впливу на кодуючу ділянку, некодуючу ділянку, та/або на регуляторну ділянку, подібну до промоторної ділянки конкретного гена. Термін "трансгенний" відноситься до рослини, що має вбудовані послідовності нуклеїнової кислоти, включаючи, але без обмеження, гени, полінуклеотиди, ДНК, РНК, тощо та/або зміни у них (наприклад, мутації, точкові мутації або подібні до них), що були введені у рослину, у порівнянні із рослиною, в яку не були внесені такі зміни, за допомогою процесів, які не є суттєво біологічними процесами для одержання рослин. Таким чином, термін “трансгенна рослина” охоплює не тільки рослини, що включають неендогенні нуклеїнові кислоти, але також очевидним чином відноситься до рослин, що несуть мутації в ендогенному гені, наприклад, точкові мутації, які були введені у вказану трансгенну рослину у порівнянні із рослиною, в яку 11 UA 106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 такі зміни не були внесені, за допомогою процесів, які не є суттєво біологічними процесами для одержання рослин. Термін "ендогенний" відноситься до будь-якого гена або послідовності нуклеїнової кислоти, що вже є присутньою у даній клітині або організмі, подібному, наприклад, рослині. Термін ”eкзогенний” відноситься до будь-якого гена або послідовностей нуклеїнової кислоти, що не є ендогенними. Термін "мобільний елемент" (TE) або "мобільний генетичний елемент" являє собою послідовність ДНК, що може рухатися з одного місця розміщення до іншого у клітині. Рух мобільного елемента може відбуватися від епісоми до епісоми. Мобільні елементи характеризуються присутністю інвертованих послідовностей повтору при вживанні у множині. Мобілізація опосередковується ферментативно за допомогою "транспозази”. Структурно мобільний елемент класифікується як "транспозон" (TN) або "елемент інсерції послідовності" (IS eлемент) на основі присутності або відсутності, відповідно, генетичних послідовностей на доповнення до тих, які є необхідними для пересування елементу. Міні-транспозон або міні-IS елемент типово не містить послідовностей, які кодують транспозазу. Термін "нуклеїнова кислота" або "полінуклеотид" типово використовується у значенні, яке є визнаним у галузі техніки для посилання на полімер рибонуклеїнової кислоти (РНК) або дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) або його аналог, наприклад, нуклеотидний полімер, що включає модифікації нуклеотидів, пептидно-нуклеїнову сполуку або подібні до них. У деяких втіленнях нуклеїнова кислота може являти собою полімер, що включає багато типів мономерів, наприклад, субодиниці якРНК, так і ДНК. Нуклеїнова кислота може являти собою, наприклад, хромосому або хромосомний сегмент, вектор (наприклад, експресійний вектор), експресійну касету, оголений полімер ДНК або РНК, продукт полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), олігонуклеотид, зонд, тощо. Нуклеїнова кислота може бути, наприклад, одноланцюговою та/або дволанцюговою. Якщо не вказано інше, то деякі послідовності нуклеїнової кислоти згідно з винаходом необов‘язково включають або кодують комплементарні послідовності, на доповнення до будь-якої послідовності, яка чітко вказана. Термін "полінуклеотидна послідовність", “послідовність нуклеїнової кислоти” або "нуклеотидна послідовність" відноситься до суміжної послідовності нуклеотидів в одній нуклеїновій кислоті або до представлення її, наприклад, у вигляді рядка символів. Тобто "полінуклеотидна послідовність" являє собою полімер нуклеотидів (олігонуклеотид, ДНК, нуклеїнову кислоту, тощо.) або рядок символів, що представляє нуклеотидний полімер, у залежності від контексту. З будь-якої вказаної полінуклеотидної послідовності може бути визначена або дана нуклеїнова кислоти або комплементарна полінуклеотидна послідовність (наприклад, комплементарна нуклеїнова кислота). Термін "субпослідовність" або "фрагмент" являє собою будь-яку частину повної послідовності. "Експресійна касета" являє собою конструкцію нуклеїнової кислоти, наприклад, вектор, такий, як плазміда, вірусний вектор, тощо, здатні до продукції транскриптів та, потенційно, поліпептидів, що кодуються полінуклеотидною послідовністю. Експресійний вектор є здатним до продукції транскриптів в екзогенній клітині, наприклад, бактеріальній клітині, або у рослинній клітині, in vivo або in vitro, наприклад, у культивованих рослинних протопластах. Експресія продукту може бути або конститутивною, або індицибельною у залежності, наприклад, від вибраного промотора. Антисмислові, смислові конфігурації або конфігурації інтерференції або мовчання РНК, які не транслюються або не можуть транслюватися, чітко включаються цим визначенням. У контексті експресійного вектора, як кажуть, промотор є "оперативно зв‘язаним" або “функціонально зв‘язаним” з полінуклеотидною послідовністю, якщо він є здатним до регуляції експресії асоційованої полінуклеотидної послідовності. Цей термін також застосовують до альтернативних конструкцій екзогенного гена, таких, як експресовані або інтегровані трансгени. Подібно до цього, термін оперативно або функціонально зв‘язаний застосовують у відповідній мірі до альтернативних або додаткових послідовностей регуляції транскрипції, таких, як енхансери, асоційовані із полінуклеотидною послідовністю. Полінуклеотидна послідовність, послідовність нуклеїнової кислоти або ген, як кажуть, "кодує" смислову або антисмислову молекулу РНК, або мовчазну або інтерферуючу молекулу РНК, або поліпептид, якщо полінуклеотидна послідовність може бути транскрибована (у сплайсованій або у несплайсованій формі) та/або трансльована у РНК або поліпептид, або їх субпослідовність. Кваліфікований спеціаліст у даній галузі техніки є добре знайомим з виродженістю генетичного коду, що дозволяє одержувати ряд інших послідовностей нуклеїнової кислоти, які кодують ту саму амінокислотну послідовність або поліпептид, та не складно 12 UA 106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 визначити, чи кодує дана послідовність нуклеїнової кислоти дану амінокислотну послідовність або поліпептид. "Експресія гена" або "експресія нуклеїнової кислоти" означає транскрипцію ДНК у РНК (необов‘язково включаючи модифікацію РНК, наприклад, сплайсинг), трансляцію РНК у поліпептид (що можливо включає подальшу модифікацію поліпептиду, наприклад, посттрансляційну модифікацію), або як транскрипцію, так і трансляцію, як вказано у контексті. Термін "ген" або “генна послідовність” широко використовується стосовно будь-якої нуклеїнової кислоти, асоційованою з біологічною функцією. Гени типово включають кодуючі послідовності та/або регуляторні послідовності, які є необхідними для експресії таких кодуючих послідовностей. Термін "ген" відноситься до специфічної геномної послідовності, а також до кДНК або мРНК, що кодуються такою геномною послідовністю. Гени також включають неекспресовані сегменти нуклеїнової кислоти, що, наприклад, утворюють послідовності для інших білків. Неекспресовані регуляторні послідовності включають промотори та енхансери, з якими регуляторні білки, такі, як білки, які зв‘язують фактори транскрипції, що приводить до транскрипціїсусідних або більш віддалених послідовностей. "Поліпептид" являє собою полімер, що включає два або більше амінокислотних залишків (наприклад, пептид або білок). Полімер може додатково включати елементи, відмінні від амінокислот, такі, як мітки, групи для гасіння, блокування, або подібні до них, а також може необов‘язково включати модифікації такі, як глікозилювання або подібні до нього. Амінокислотні залишки поліпептиду можуть бути природними або неприродними та можуть бути незаміщеними, немодифікованими, заміщеними або модифікованими. Як використовується в даній заявці, термін “ген цитокініноксидази/дегідрогенази” відноситься до гена, який кодує поліпептид з цитокініноксидазною/дегідрогеназною активністю. Цитокініноксидаза/дегідрогеназа являє собою фермент, який каталізує хімічну реакцію: N6-диметилалілaденін + aкцептор + H2O aденін + 3-метилбут-2-eналь + відновлен. акцептор Три субстрати для цього ферменту являють собою N6-диметилаліладенін, акцептор та H2O, у той час як три його продукти являють собою аденін, 3-метилбут-2-eналь та відновлений акцептор. Переважно термін “цитокініноксидазна/дегідрогеназна активність” охоплює активність даного поліпептиду для каталізу окисно-відновної реакції принаймні з одним з цитокінінів як субстрата. Кваліфікований спеціаліст у даній галузі техніки є добре обізнаним із засобами та способами для визначення, чи має даний поліпептид цитокініноксидазну/дегідрогеназну активність або ні та для визначення рівня цитокініноксидазної/дегідрогеназної активності конкретного поліпептида або зонда в абсолютних значеннях та/або відносного іншого поліпептида або зонда. У літературі існує багато методик, як може бути досліджений даний поліпептид на таку активність, див., наприклад, EC 1.5.99.12. Більш переважно термін “цитокініноксидазна/дегідрогеназна активність” охоплює активність даного поліпептида стосовно каталізу окисно-відновної реакції принаймні з одним із цитокінінів як субстрата, переважно з активністю не менше ніж 30% активності AtCKX3 (CKX3 з послідовністю SEQ ID No. 1), переважно не менше ніж 50% активності AtCKX3. Термін “oртолог”, як використовується в даній заявці, відноситься до гена із видів, переважно відмінних від Arabidopsis thaliana, що демонструють найвищу подібність, переважно найвищу ідентичність послідовності, до вказаного гена Arabidopsis thaliana, оскільки обидва гени мають походження від спільного анцесторного ендогенного гена, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу та включає послідовність (поліпептиду або нуклеїнової кислоти) принаймні з 80%, принаймні 85%, принаймні 90%, принаймні 95%, або принаймні 99% ідентичністю послідовності із даною послідовністю відповідного ортолога, з яким його порівнюють, переважно уздовж певної довжини послідовності. Більш бажано, коли термін “oртолог” позначає ендогенний ген, який має походження від видів, відмінних від Arabidopsis thaliana, що кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу та включає послідовність принаймні з 80%, принаймні 85%, принаймні 90%, принаймні 95%, або принаймні 99% ідентичності послідовності з даної послідовністю Arabidopsis thaliana, з якою його порівнюють, переважно уздовж певної довжини послідовності. Термін "рекомбінантний" вказує на те, що матеріал (наприклад, клітина, нуклеїнова кислота або білок) був штучно або синтетично (неприродно) змінений втручанням людини. Зміна може здійснюватися на матеріалі в його природному середовищі або стані, або на матеріалі, який є виділеним із природного середовища. Наприклад, "рекомбінантна нуклеїнова кислота" являє собою таку, що утворена шляхом рекомбінації нуклеїнової кислоти, наприклад, під час клонування, ДНК перестановки або інших процедур; "рекомбінантний поліпептид" або "рекомбінантний білок" являє собою поліпептид або білок, який є одержаним шляхом експресії 13 UA 106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рекомбінантної нуклеїнової кислоти. Приклади рекомбінантних клітин включають клітини, які містять рекомбінантні нуклеїнові кислоти та/або рекомбінантні поліпептиди. Термін "вектор" відноситься до засобів, за допомогою яких нуклеїнова кислота може розмножуватися та/або переноситися між організмами, клітинами або клітинними компонентами. Вектори включають плазміди, віруси, бактеріофаги, провіруси, фагеміди, транспозони, штучні хромосоми та подібні до них, що реплікуються автономно або можуть інтегруватися у хромосому хазяйської клітини. Вектор може також являти собою оголений РНК полінуклеотид, оголений ДНК полінуклеотид, полінуклеотид, що складається як з ДНК, так і РНК у межах того самого ланцюга, кон‘юговану з полілізином ДНК або РНК, кон‘юговану з пептидом ДНК або РНК, кон‘юговану з ліпосомою ДНК або подібні до них, що не є такими, які автоматично реплікуються. В контексті даного винаходу термін "iзольований" відноситься до біологічного матеріалу, такого, як нуклеїнова кислота або поліпептид, який є суттєво вільним від компонентів, які у нормі його супроводжують або взаємодіють з ним в його природному оточуючому середовищі. Ізольований матеріал необов‘язково включає матеріал, який не виявляють з матеріалом в його природному оточуючому середовищі, наприклад, у клітині. Наприклад, якщо матеріал знаходиться в природному оточуючому середовищі, такому, як клітина, то цей матеріал поміщають у такому положенні у клітині (наприклад, геномі або генетичному елементі), що є ненативним стосовно матеріалу, який виявляється у цьому природному оточуючому середовищі. Наприклад, існуючі у природі нуклеїнові кислоти (наприклад, кодуюча послідовність, промотор, енхансер, тощо) стають ізольованими тоді, коли вони вводяться за допомогою засобів, які не існують у природі, у локус генома (наприклад, вектор, такий, як плазміда, або вірусний вектор або aмплікон), що не є нативним для цієї нуклеїнової кислоти. Ізольована рослинна клітина, наприклад, може знаходитися в оточенні (наприклад, системі культури клітин або бути очищеною з культури клітин), відмінному від природного оточення рослинної клітини дикого типу (наприклад, цільної рослини). "Промотор", як використовується в даній заявці, включає посилання на ділянку ДНК, що розміщується вище від початку транскрипції та є втягненою у впізнання та зв‘язування РНК полімерази та інших білків для ініціації транскрипції. "Рослинний промотор" являє собою промотор, здатний до ініціації транскрипції у рослинних клітинах. Типові рослинні промотори включають, але без обмеження такими, ті, що одержані з рослин, рослинних вірусів та бактерій, які включають гени, що експресуються у рослинних клітинах, таких, як Agrobacterium або Rhizobium. Приклади промоторів, зв‘язаних з контролем розвитку, включають промотори, які переважно ініціюють транскрипцію у деяких тканинах, таких, як листя, корені або насіння, або просторово у ділянках, таких, як ендосперм, зав‘язь або ділянки меристеми. Такі промотори називаються "переважними для тканини" або "специфічними для тканини". Тимчасово регульований промотор направляє експресію у певний час, такий, як від 0 до 25 днів після запліднення. Промотор "переважний для типу клітин" в основному направляє експресію у певних типах клітин в одному або більше органів, наприклад, клітинах судин у коренях або листі. "Індуцибельний" промотор являє собою промотор, який знаходиться під контролем навколишнього середовища та може бути індуцибельним або здатним до дерепресії. Приклади умов навколишнього середовища, які можуть впливати на транскрипцію за допомогою індуцибельних промоторів, включають анаеробні умови або присутність світла. Специфічні для тканин, специфічні для типів клітин та індуцибельні промотори складають клас "некоститутивних" промоторів. "Конститутивний" промотор являє собою промотором, який є активним за більшості умов навколишнього середовища та в усіх або майже усіх тканинах, на усіх або майже на усіх стадіях розвитку. "Tрансформація", як використовується в даній заявці, являє собою процес, за допомогою якого клітина "піддається трансформації" за допомогою екзогенної ДНК, коли така екзогенна ДНК є введеною у клітинну мембрану. Eкзогенна ДНК може бути або може не бути інтегрована (ковалентно зв‘язана) у хромосомну ДНК, складаючи геном клітини. У прокаріотів та дріжджів, наприклад, екзогенна ДНК може підтримуватися як епісомальний елемент, такий, як плазміда. Що стосується вищих еукаріотичних клітин, то стабільно трансформована або трансфікована клітина являє собою таку, в якій екзогенна ДНК була інтегрована у хромосому так, що вона успадковується дочірніми клітинами при реплікації хромосоми. Ця стабільність демонструється здатністю еукаріотичної клітини давати початок лініям клітин або клонам, що включають популяцію дочірніх клітин, які містять цю екзогенну ДНК. Для цілей даного винаходу "ідентичність" послідовності об‘єктивно визначається за допомогою будь-якого з ряду способів. Кваліфікований спеціаліст у даній галузі техніки є добре обізнаним із цими способами та може вибрати прийнятний спосіб без надмірних зусиль. 14 UA 106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Різноманітні способи для визначення взаємозв‘язку між двома або більше послідовностями (наприклад, ідентичності, подібності та/або гомології) є доступними та добре відомими у галузі техніки. Способи включають, наприклад, ручне порівняння, комп‘ютерне порівняння послідовностей та їх комбінації. Ряд алгоритмів (які звичайно передбачають застосування комп‘ютера) для здійснення вирівнювання послідовності є широко доступними або можуть бути одержані спеціалістом. Ці способи включають, наприклад, алгоритм локальної гомології Smith та Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482; алгоритм гомологічного вирівнювання Needleman та Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443; метод пошуку на подібність Pearson та Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444; та/або комп‘ютеризовані реалізації цих алгоритмів (наприклад, GAP, BESTFIT, FASTA та TFASTA у Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, WI). Наприклад, програмне забезпечення для проведення аналізу ідентичості послідовності (та подібності послідовності) при використанні BLAST aлгоритму є описаним у Altschul та ін. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Це програмне забезпечення є загально доступним, наприклад, через Національний центр для біотехнологічної інформації у мережі Інтернет на ncbi. nlm. nih. gov. Цей алгоритм передбачає першу ідентифікацію пар послідовностей з високим балом (HSPs) шляхом ідентифікації коротких кодових груп з довжиною W у заданій послідовності, які або співпадають, або задовольняють деяке позитивне порогове значення T, коли вирівнюються із кодовою групою тієї самої довжини у базі даних послідовності. T відноситься до порогового значення близької кодової групи. Ці початкові близькі хіти кодової групи виконують роль затравки для початку проведення пошуків для виявлення більш довгих хітів HSPs, що містять їх. Хіти кодової групи потім подовжують в обох напрямках уздовж кожної послідовності настільки, наскільки може бути підвищений кумулятивний бал вирівнювання. Кумулятивні бали підраховують при використанні для нуклеотидних послідовостей параметрів M (винагороджувальний бал для пар співпадаючих залишків; завжди > 0) та N (штрафний бал за неспівпадання залишків; завжди < 0). Для амінокислотних послідовностей матриця замін використовується для підрахунку кумулятивного балу. Подовження хітів кодової групи у кожному напрямку переривають тоді, коли: кумулятивний бал вирівнювання величини X знижується з її максимально досягнутого значення; кумулятивний бал знижується до нуля або нижче завдяки накопиченню одного або більше вирівнювань залишків з негативним балом; або досягається кінець послідовності. Параметри BLAST алгоритму W, T та X визначають чутливість та швидкість вирівнювання. Програма BLASTN (для нуклеотидних послідовностей) використовує як параметри по умовчанню довжину кодової групи (W) 11, очікування (E) 10, порогове значення 100, M=5, N=-4, та порівняння обох ланцюгів. Для амінокислотних послідовностей програма BLASTP (BLAST Protein) як параметри по умовчанню використовує довжину кодової групи (W) 3, очікування (E) 10, та BLOSUM62 матрикс замін (див., Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915). Додатково BLAST алгоритм здійснює статистичний аналіз подібності між двома послідовностями (див., наприклад, Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 58735787). Одна з оцінок подібності, що забезпечується BLAST алгоритмом, являє собою найменшу суму ймовірностей (p (N) ), що забезпечує показник ймовірності, при якому порівняння між двома нуклеотидними або амінокислотними послідовностями буде виникати випадково. Наприклад, нуклеїнова кислота вважається подібною до референтної послідовності (та, таким чином, у даному контексті гомологічною), якщо найменша сума ймовірностей у порівнянні досліджуваної нуклеїнової кислоти з референтною нуклеїновою кислотою є меншою, ніж приблизно 0,1, або меншою, ніж приблизно 0,01, та або навіть меншою, ніж приблизно 0,001. Інший приклад корисного алгоритму вирівнювання послідовності являє собою PILEUP. PILEUP здійснює множинне вирівнювання послідовностей з групи споріднених послідовностей при використанні прогресивного попарного вирівнювання. Можна побудувати дерево, що показує взаємозв‘язки угруповань, що використовуються для проведення вирівнювання. PILEUP використовує симпліфікацію методу прогресивного вирівнювання Feng та Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35: 351-360. Використовуваний спосіб є подібним до способу, що описується Higgins та Sharp (1989) CABIOS5: 151-153. Програма може вирівнювати, наприклад, аж до 300 послідовностей з максимальною довжиною 5000 символів. Процедура множинного вирівнювання починається з попарного порівняння двох найбільш подібних послідовностей, що забезпечує одержання кластера двох вирівняних послідовностей. Цей кластер може потім вирівнюватися з наступною найбільш спорідненою послідовністю або кластером вирівняних послідовностей. Два кластери послідовностей можуть бути вирівняні за допомогою простого подовження попарного вирівнювання двох індивідуальних послідовностей. Заключне вирівнювання досягається за допомогою серій прогресивних попарних вирівнювань. Ця 15 UA 106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 програма може також використовуватися для побудови дендограми або представлення у вигляді дерева взаємовідносин угруповань. Ця програма здійснюється при використанні попередньо визначених специфічних послідовностей та їх координат амінокислот або для ділянок порівняння послідовностей. Додатковий приклад алгоритму, що є прийнятним для множинних вирівнювань послідовностей ДНК або амінокислот, являє собою програму CLUSTALW (Thompson, J. D. та ін. (1994) Nucl. Acids. Res. 22: 4673-4680). CLUSTALW здійснює множинне попарне порівняння між групами послідовностей та поєднує їх у множинне вирівнювання на основі їх гомології. Штрафні бали за відкриття пробілу (Gap) та подовження пробілу (Gap) можуть складати, наприклад, 10 та 0,05 відповідно. Для амінокислотних вирівнювань може використовуватися алгоритм BLOSUM як матриця ваги білків. Див., наприклад, Henikoff та Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919. Ізольована рослинна клітина або трансгенна рослина згідно з винаходом може бути одержана за допомогою традиційних способів, подібних, наприклад, до трансформації. Tрансформація рослинних клітин та протопластів може здійснюватися суттєво шляхом будьякого із різноманітних шляхів, що є відомими кваліфікованому спеціалістові у галузі молекулярної біології рослин, включаючи, але без обмеження, способи, описані в даній заявці. Див., в загальному випадку Methods in Enzymology, том 153 (Recombinant DNA частина D) Wu та Grossman (ред.) 1987, Academic Press. Як використовується в даній заявці, термін "трансформація" означає зміну генотипу хазяйської рослини або рослинної клітини шляхом введення послідовності нуклеїнової кислоти, наприклад, "гетерологічної", "eкзогенної" або "чужорідної" послідовності нуклеїнової кислоти. Гетерологічні послідовності нуклеїнової кислоти не повинні обов‘язково походити від різних джерел, проте вони можуть, деякою мірою, бути зовнішніми стосовно клітини, в яку вони вводяться. На доповнення до Berger, Ausubel та Sambrook, корисні загальні посилання для клонування рослинних клітин, культивування та регенерації включають Jones (ред.) (1995) Plant Gene Transfer and Expression Protocols--Methods in Molecular Biology, том 49 Humana Press Towata NJ; Payne та ін. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY (Payne); та Gamborg та Phillips (ред.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) (Gamborg). Різноманітні середовища для культури клітин є описаними у Atlas та Parks (ред.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL (Atlas). Додаткова інформація стосовно культури рослинних клітин може бути знайдена у комерційній літературі, такій, як Life Science Research Cell Culture Catalogue (1998) від Sigma-Aldrich, Inc (St Louis, MO) (Sigma-LSRCCC) та, наприклад, Plant Culture Catalogue та доповнення (1997) також від Sigma-Aldrich, Inc. (St Louis, MO) (Sigma- PCCS). Додаткові подробиці стосовно культури рослинних клітин можуть бути знайдені у Croy, (ред. ) (1993) Plant Molecular Biology Bios Scientific Publishers, Oxford, U. K. Одне, більше одного або усі порушення принаймні в одному із згаданих вище ендогенних генів можуть бути поліпшені шляхом введення та експресії в рослинній клітині або рослині трансгенної полінуклеотидної послідовності, наприклад, у антисмисловій та смисловій конфігурації, або у конфігурації мовчання або інтерференції РНК, тощо, де трансгенна полінуклеотидна послідовність включає послідовність нуклеїнової кислоти, яка являє собою або є комплементарною до: a) послідовності або субпослідовності ендогенного CKX3 гена, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 1 або її ортологом; b) послідовності або субпослідовності ендогенного CKX1 гена, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність SEQ ID No. 13 або її ортолог; c) послідовності або субпослідовності ендогенного CKX2 гена, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 2 або її ортологом; d) послідовності або субпослідовності ендогенного CKX4 гена, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 3 або її ортологом; e) послідовності або субпослідовності ендогенного CKX5 гена, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 4 або її ортологом; 16 UA 106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 f) послідовності або субпослідовності ендогенного CKX6 гена, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 5 або її ортологом; g) послідовності або субпослідовності ендогенного CKX7 гена, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 6 або її ортологом; або h) послідовності або субпослідовності ендогенного гена, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з такою SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5, 6 або 13 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот, переважно 100 амінокислот, більш переважно уздовж повної довжини; та включає промотор, інгібуючи таким чином експресію та/або активність принаймні порушеного гена цитокініноксидази/дегідрогенази у порівнянні із відповідною контрольною рослинною клітиною або рослиною, що не має таких порушень (наприклад, її нетрансгенною батьківською формою або нетрансгенною рослиною тих самих видів). Трансгенна полінуклеотидна послідовність може бути введена за допомогою методик, включаючи, але без обмеження такими, наприклад, eлектропорацію, бомбардування мікрочастинками, опосередкований Agrobacterium перенос, або за допомогою інших доступних способів. У деяких аспектах даного винаходу полінуклеотид є зв‘язаним з промотором у смисловій орієнтації або у антисмисловій орієнтації або є конфігурованим для мовчання або інтерференції РНК. Релевантна Джерела інформації:, що описує застосування гомологічно залежного гена мовчання, включає: Jorgensen, Trends Biotechnol. 8 (12): 340-344 (1990); Flavell, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 91: 3490-3496 (1994); Finnegan та ін., Bio/Technology 12: 883-888 (1994); Neuhuber та ін., Mol. Gen. Genet. 244: 230-241 (1994); Flavell та ін. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3490-3496; Jorgensen та ін. (1996) Plant Mol. Biol. 31: 957-973; Johansen та Carrington (2001) Plant Physiol. 126: 930-938; Broin та ін. (2002) Plant Cell 14: 1417-1432; Stoutjesdijk та ін. (2002) Plant Physiol. 129: 1723- 1731; Yu та ін. (2003) Phytochemistry 63: 753-763; та патенти США № 5,034,323, 5,283,184 та 5,942,657. Альтернативно, інший підхід до генного мовчання може бути таким при застосуванні антисмислової технології (Rothstein та ін. у Plant Mol. Cell. Biol. 6: 221-246 (1989); Liu та ін. (2002) Plant Physiol. 129: 1732-1743 та патенти США № 5,759,829 та 5,942,657. Застосування антисмислової нуклеїнової кислоти є добре відомим у галузі техніки. Антисмислова нуклеїнова кислота має ділянку комплементарності із цільовою нуклеїновою кислотою, наприклад, деякою геномною генною послідовністю, мРНК або кДНК. Антисмислова нуклеїнова кислота може являти собою РНК, ДНК, ПНК або будь-яку іншу прийнятну молекулу. Може утворюватися дуплекс між антисмисловою послідовністю та її комплементарною смисловою послідовністю, що приводить до інактивації гена. Антисмислові нуклеїнові кислоти можуть інгібувати генну експресію шляхом утворення дуплекса з РНК, яка транскрибується з гена, шляхом утворення триплекса з дуплексом ДНК, тощо. Антисмислова нуклеїнова кислота може бути одержана за допомогою ряду добре відомих методик (наприклад, за допомогою хімічного синтезу антисмислової РНК або олігонуклеотиду (з необов‘язковим включенням нуклеотидів та/або зв‘язків, що підвищують резистентність до розкладання або поліпшують поглинання клітиною) або шляхом in vitro транскрипції). Антисмислові нуклеїнові кислоти та їх застосування описуються, наприклад, у USP 6,242,258, що відноситься до Haselton та Alexander (5 червня 2001 року) під назвою "Способи для селективної регуляції транскрипції ДНК та РНК та трансляції за допомогою фотоактивації"; USP 6,500,615; USP 6,498,035; USP 6,395,544; USP 5,563,050; E. Schuch та ін. (1991) Symp Soc. Exp Biol 45: 117-127; de Lange та ін., (1995) Curr Top Microbiol Immunol 197: 57-75; Hamilton та ін. (1995) Curr Top Microbiol Immunol 197: 77-89; Finnegan та ін., (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 8449-8454; Uhlmann та A. Pepan (1990), Chem. Rev. 90: 543; P. D. Cook (1991), Anti-Cancer Drug Design 6: 585; J. Goodchild, Bioconjugate Chem. 1 (1990) 165; та, S. L. Beaucage та R. P. Iyer (1993), Tetrahedron 49: 6123; та F. Eckstein, ред. (1991), Oligonucliotides and Analogues--A Practical Approach, IRL Press. Каталітичні молекули РНК або рибозими можуть також використовуватися для інгібування експресії певних вибраних генів. Є можливим сконструювати рибозими, які специфічно попарно з‘єднуються віртуально з будь-якою бажаною цільовою РНК та розщеплюють фосфодіефірний скелет у специфічному розміщенні, інактивуючи таким чином функціонально цільову РНК. При здійсненні такого розщеплення сам рибозим не змінюється та є, таким чином, здатним до 17 UA 106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 рециркуляції та розщеплення інших молекул. Включення послідовностей рибозиму у антисмислові РНК забезпечує активність розщеплення РНК, підвищуючи, таким чином, активність конструкцій. Було ідентифіковано ряд класів рибозимів.. Наприклад, один клас рибозимів має походження від ряду маленьких кільцевих РНК, що є здатними до саморозщеплення та реплікації у рослинах. Ці РНК можуть піддаватися реплікації або самостійно (віроїдні РНК) або за допомогою хелперного віруса (сателітні РНК). Приклади РНК включають РНК з віроїда сонячної плямистості авокадо та сателітні РНК з вірусу кільцьової плямистості тютюну, вірусу нестійкої смугастості люцерни, вірусу крапчастості бархатистого тютюну, вірус крапчастості Solanum nodiflorum та вірус крапчастості підземної конюшини. Конструювання та застосування націлених специфічних для РНК рибозимів було описане. Див., наприклад, Haseloff та ін. (1988) Nature, 334: 585-591. Інший спосіб для інактивації певного вибраного гена шляхом інгібування експресії являє собою смислову експресію. Введення експресійних касет, в яких нуклеїнова кислота конфігурується у смисловій орієнтації по відношенню до промотора, було продемонстровано як ефективний засіб, за допомогою якого блокується транскрипція бажаного цільового гена. Див., наприклад, Napoli та ін. (1990), The Plant Cell 2: 279-289, та патенти США №№ 5,034,323, 5,231,020 та 5,283,184. Порушення згідно з винаходом можуть також бути одержані при використанні РНК мовчання або iнтерференції (РНКi), які можуть також називатися посттранскрипційним генним мовчанням (PTGS) або косупресією. В контексті даного винаходу "мовчання РНК" (також називається як РНКi або опосередкована РНК інтерференція) відносяться до будь-якого механізму, за допомогою якого присутність одноланцюгової або, типово, дволанцюгової РНК у клітині приводить до інгібування експресії цільового гена, що включає послідовність, ідентичну або майже ідентичну з такою для РНК, включаючи, але без обмеження, РНК інтерференцію, репресію трансляції цільової мРНК, що транскрибується з цільового гена без зміни стабільності мРНК та транскрипційне мовчання (наприклад, гістонне ацетилювання та утворення гетерохроматину, що приводить до інгібування транскрипції цільової мРНК). При "інтерференції РНК" присутність одноланцюгової або дволанцюгової РНК у клітині приводить до ендонуклеолітичного розщеплення, а потім до деградації цільової мРНК. В одному втіленні трансген (наприклад, послідовність та/або субпослідовності гена або кодуючої послідовності, що представляє інтерес) вводяться у рослинну клітину для порушення одного або більше генів за допомогою мовчання або інтерференції РНК (РНКi). Наприклад, послідовність або субпослідовність (трансген) включають невеликі субпослідовності, наприклад, приблизно такі, що складають 21-25 основ у довжину, більші субпослідовності, наприклад, приблизно 25-100 або приблизно 100-2000 (або приблизно 200-1500, приблизно 250-1000, тощо) основ у довжину, та/або цільну кодуючу послідовність або ген, вибраний з, або такий, який є комплементарним до: a) послідовності або субпослідовності ендогенного CKX3 гена, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 1 або її ортологом; b) послідовності або субпослідовності ендогенного CKX1 гена, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність SEQ ID No. 13 або її ортолог; c) послідовності або субпослідовності ендогенного CKX2 гена, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 2 або її ортологом; d) послідовності або субпослідовності ендогенного CKX4 гена, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 3 або її ортологом; e) послідовності або субпослідовності ендогенного CKX5 гена, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 4 або її ортологом; f) послідовності або субпослідовності ендогенного CKX6 гена, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 5 або її ортологом; g) послідовності або субпослідовності ендогенного CKX7 гена, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 6 або її ортологом; або 18 UA 106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 h) послідовності або субпослідовності ендогенного гена, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з такою SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5, 6 або 13 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот, переважно 100 амінокислот, більш переважно уздовж повної довжини; Переважно, трансген включає ділянку у послідовності або субпослідовності, що складає приблизно 21-25 основ у довжину принаймні з 80%, принаймні 90% або принаймні 99% ідентичністю із субпослідовністю однієї з послідовностей SEQ ID No. 7, 8, 9, 10, 11, 12 або 14. Застосування РНКi для інгібування генної експресії у ряді типів клітин (включаючи, наприклад, рослинні клітини) та організмів, наприклад, шляхом експресії РНК шпильки (стовбурпетля) або двох ланцюгів інтерферуючої РНК, наприклад, є добре описаним у літературі, як і способи для визначення прийнятної(их) інтерферуючої(их) РНК для націлювання на бажаний ген, та для одержання таких інтерферуючих РНК. Наприклад, інтерференція РНК є описаною наприклад, у піблікаціях патентних заявок США 20020173478, 20020162126 та 20020182223 у Cogoni та Macino (2000), "Post-transcriptional gene silencing across kingdoms" Genes Dev., 10: 638643; Guru T. (2000), "A silence that speaks volumes" Nature 404: 804-808; Hammond та ін., (2001), "Post-transcriptional Gene Silencing by Double-stranded RNA" Nature Rev. Gen. 2: 110-119; Napoli та ін., (1990) "Introduction of a chalcone synthase gene into Petunia results in reversible cosuppression of homologous genes in trayas." Plant Cell 2: 279-289; тощо. Полінуклеотидна(і) послідовність (послідовності) або субпослідовність (субпослідовності), що експресуються для індукції РНКi, можуть експресуватися, наприклад, під контролем конститутивного промотора, індуцибельного промотора або специфічного для тканини промотора. Експресія при використання специфічного для тканини промотора може бути бажаною у деяких втіленнях. Одне, більше одного або усі порушення принаймні в одному із згаданих вище ендогенних генів можуть вводитися, наприклад, шляхом інактивації генів за допомогою транспозона. Наприклад, етап інактивації включає одержання однієї або більше мутацій у гені, що являє собою: i) ендогенний CKX3 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 1 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 1 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 1, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 1, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 1; та/або ii) принаймні в одному додатковому ендогенному гені, що являє собою: a) CKX1 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 13 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 13 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 13, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 13, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 13; b) CKX2 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 2 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 2 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 2, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 2, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 2; c) CKX4 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 3 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 3 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 19 UA 106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 3, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 3; d) CKX5 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 4 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 4 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 4, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 4, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 4; e) CKX6 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 5 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 5 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 5, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 5, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 5; або f) CKX7 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичості з SEQ ID No. 6 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 6 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 6, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 6, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 6; де одна або більше мутацій у послідовності гена включають одну або більше інсерцій транспозону та де порушення інгібують експресію та/або активність принаймні порушеного гена цитокініноксидази/дегідрогенази у порівнянні із відповідною контрольною рослинною клітиною або рослиною, що не має таких порушень. Наприклад, одна або більше мутацій включають гомозиготне порушення в одному або більше генів, згаданих вище, одна або більше мутацій включають гетерозиготне порушення в одному або більше генів, згаданих вище, або комбінацію як гомозиготних, так і гетерозиготних порушень. Транспозони спочатку були ідентифіковані у кукурудзі Barbara McClintock наприкінці 1940-их. Родина мутаторних генів мобільних генетичних елементів, наприклад, мобільні генетичні елементи мутаторних генів (Mu) Робертсона, типово використовуються у мутагенезі рослинних генів, оскільки вони є присутніми у великій кількості копій (10-100) та переважно вбудовуються усередину або поблизу генів. Мобільні генетичні елементи можуть бути класифіковані у два широкі класи на основі способу їх перестановки. Вони позначаються як клас I та клас II; обидва мають застосування у мутагенах та як вектори для доставки. Клас I мобільних генетичних елементів перегруповується за допомогою проміжної сполуки РНК та використовує зворотні транскриптази, тобто вони являють собою ретроелементи. Існує принаймні три типи класу I мобільних генетичних елементів, наприклад, ретротранспозони, ретропозони, SINE-подібні елементи. Ретротранспозони типово містять LTR та гени, що кодують вірусні білки оболонки (gag) та зворотну транскриптазу, гени РНКази H, iнтегрази та полімерази (pol). Численні транспозони були описані у видів рослин. Такі ретротранспозони мобілізуються та переміщаються за допомогою проміжної сполуки РНК у реакції, що каталізується за допомогою зворотної транскриптази та РНКази H, що кодуються транспозоном. Приклади потрапляють у Tyl-копії та Ty3-gypsy групи, а також у SINE-подібні та LINE-подібні класифікації. Більш детальне обговорення може бути знайдене у Kumar та Bennetzen (1999) Plant Retrotransposons in Annual Review of Genetics 33: 479. Крім того, мобільні генетичні елементи на основі ДНК, такі, як Ac, Taml та En/Spm, також можуть бути знайдені у різноманітних видах рослин та можуть використовуватися у винаході. Транспозони (та IS eлементи) являють собою загальні засоби для введення мутацій у рослинні клітини. Ці мобільні генетичні елементи доставляються до клітин, наприклад, за допомогою статевого схрещування, після цього перестановки піддають селекції, а одержані в результаті інсерції мутанти піддаються скринінгу, наприклад, на фенотип, який представляє інтерес. Порушені гени можуть потім вводитися в інші рослини шляхом схрещування 20 UA 106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ізольованих або трансгенних рослин з рослиною, яка не має порушень, наприклад, шляхом статевого схрещування. Будь-яка із ряду стандартних методик розведення може використовуватися в залежності від видів, які піддаються схрещуванню. Розміщення TN у геномі ізольованої або трансгенної рослини може визначатися за допомогою відомих способів, наприклад, секвенування фланкуючих ділянок, як обговорюється в даній заявці. Наприклад, реакція ПЛР може використовуватися для ампліфікації послідовності, яка потім може бути діагностично секвенована для підтвердження її походження. Необов‘язково, мутанти, одержані в результаті інсерції, піддають скринінгу на бажаний фенотип, такий, як інгібування експресії або активності гена, що представляє інтерес, у порівнянні із контрольною рослиною. Тілінг (tilling) може також використовуватися для ідентифікації порушення згідно з даним винаходом. Тілінг (tilling) являє собою індуковані націлюванням локальні пошкодження у геномах (Targeting Induced Local Lesions In Genomes). Див., наприклад, McCallum та ін., (2000), "Targeting Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) for Рlant Functional Genomics" Plant Physiology 123: 439-442; McCallum та ін., (2000), "Targeted screening for induced mutations" Nature Biotechnologу, 18: 455-457; та Colbert та ін., (2001), "High-throughput Screening for Induced Point Mutations" Plant Physiology 126: 480-484. Tілінг поєднує високу щільність мутацій зі швидким чутливим визначенням мутацій. Tипово, етилметансульфонат (EMS) використовується для мутагенезу насіння рослин. EMS алкілує гуанін, що типово приводить до неправильного парування. Наприклад, насіння замочують у приблизно 10-20 мM розчині EMS протягом приблизно 10 - 20 годин; насіння промивають та потім висівають. Рослини цього покоління є відомими як M1. M1 рослини потім піддають самозапиленню. Мутації, присутні у клітинах, що утворюють репродуктивні тканини, успадковуються наступним поколінням (M2). Типово, M2 рослини піддають скринінгу на мутацію у бажаному гені та/або на специфічні фенотипи. Наприклад, ДНК з M2 рослин поєднують та мутації у гені, що представляє інтерес, визначають шляхом виявлення утворення гетеродуплексів. Tипово, ДНК одержують із кожної рослини M2 та поєднують. Бажаний ген піддають ампліфікації за допомогою ПЛР. Поєднаний зразок потім денатурують та піддають відпалюванню для того, щоб дозволити здійснити формування гетеродуплексів. Якщо мутація є присутньою в однієї з рослин, то продукти ПЛР будуть відноситися до двох типів: дикого типу та мутантного. Пули, які включають гетеродуплекси, ідентифікують шляхом розділення продуктів ПЛР реакції, наприклад, за допомогою денатуруючої високоефективної рідинної хроматографії (DPHPLC). DPHPLC визначає невідповідності у гетеродуплексах, створені шляхом розплавлення та відпалювання гетероалельної ДНК. Хроматографію проводять при нагрівання ДНК. Гетеродуплекси мають більш низьку температурну стабільність та утворюють розплавлювальні пухирці, що приводить до більш швидкого руху у хроматографічній колонці. Коли гетеродуплекси є присутніми додатково до очікуваних гомодуплексів, то буде спостерігатися подвійний пік. В результаті цього ідентифікують пули, які несуть мутацію у гені, що представляє інтерес. Індивідуальні ДНК із рослин, що складають поєднану популяцію, можуть бути потім ідентифіковані та секвеновані. Необов‘язково, рослина, що містить бажану мутацію у гені, який представляє інтерес, може схрещуватися з іншими рослинами для видалення фонових мутацій. Інші способи мутагенезу також можуть використовуватися для введення порушення згідно з винаходом. Способи для введення генетичних мутацій у рослинні гени та селекції рослин з бажаними ознаками є добре відомими. Наприклад, насіння або інший насінний матеріал може оброблятися за допомогою мутагенної хімічної речовини у відповідності із стандартними методиками. Такі хімічні речовини включають, але без обмеження такими, наступні: діетил сульфат, етиленімін, та N-нітрозо-N-етилсечовину. Альтернативно, може використовуватися іонізуюче випромінювання від джерел таке, як рентгенівські промені або гамма-промені. Можуть використовуватися інші способи визначення для виявлення мутацій у гені, що представляє інтерес, наприклад, капілярний електрофорез (наприклад, константний капілярний електрофорез з денатуруючим агентом та одноланцюговий конформаційний поліморфізм). В іншому прикладі гетеродуплекси можуть визначатися при використанні ферментативного способу відновлення невідповідностей (наприклад, CEL I ендонуклеаза із селери). CEL I впізнає невідповідності та розщеплює точно з 3'-сторони невідповідності. Точне положення основи невідповідності може бути визначене за допомогою розрізання при використанні ферменту для відновлення невідповідності, після чого здійснюють, наприклад, денатуруючий гельелектрофорез. Див., наприклад, Oleykowski та ін., (1998), "Mutation detection using a novel plant endonuclease" Nucleic Acid Res. 26: 4597-4602; та Colbert та ін., (2001), "High-Throughput Screening for Induced Point Mutations" Plant Physiology 126: 480-484. 21 UA 106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Рослина, яка містить бажане(і) порушення згідно з винаходом може схрещуватися з іншими рослинами для введення порушень в іншу рослину. Це здійснюють при використанні стандартних методик розведення. Гомологічна рекомбінація може також використовуватися для введення порушення згідно з винаходом. Гомологічна рекомбінація була продемонстрована у рослин. Див., наприклад, Puchta та ін. (1994), Experientia 50: 277-284; Swoboda та ін. (1994), EMBOJ. 13: 484- 489; Offringa та ін. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7346-7350; Kempin та ін. (1997) Nature 389: 802-803; та Terada та ін., (2002), "Efficient gene targeting by homologous recombination in rice" Nature Biotechnology, 20 (10): 1030-1034. Гомологічна рекомбінація може використовуватися для індукції націлених генних модифікацій за допомогою специфічного націлювання на ген, що представляє інтерес, in vivo. Мутації у вибраних частинах послідовності вибраного гена (включаючи розміщені вище 5', розміщені нижче 3' та внутрішньогенні ділянки) такого, як, наприклад: i) ендогенний CKX3 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 1 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності до SEQ ID No. 1 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 1, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 1, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 1; та/або ii) принаймні один додатковий ендогенний ген, що являє собою: a) CKX1 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 13 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 13 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 13, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 13, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 13; b) CKX2 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 2 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 2 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 2, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 2, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 2; c) CKX4 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичості з SEQ ID No. 3 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 3 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 3, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 3, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 3; d) CKX5 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичніості з SEQ ID No. 4 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 4 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 4, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 4, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 4; e) CKX6 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 5 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності 22 UA 106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 з SEQ ID No. 5 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 5, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 5, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 5; або f) CKX7 ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу що включає поліпептидну послідовність, яка є ідентичною або має принаймні 95% ідентичності з SEQ ID No. 6 або її ортологом, де ортолог переважно являє собою ендогенний ген, який кодує цитокініноксидазу/дегідрогеназу, що включає поліпептидну послідовність принаймні з 45%, принаймні 50%, принаймні 60%, принаймні 80%, або принаймні 90% ідентичністю послідовності з SEQ ID No. 6 уздовж безперервної амінокислотної послідовності з 50 амінокислот SEQ ID No. 6, переважно 100 амінокислот SEQ ID No. 6, більш переважно уздовж повної довжини SEQ ID No. 6; здійснюють in vitro та вводять у бажану рослину при використанні стандартних методик. Мутований ген буде взаємодіяти з цільовим геном дикого типу таким чином, що у трансгенних рослинах буде виникати гомологічна рекомбінація та націлена заміна гена дикого типу. Ізольовані клітини рослин та/або трансгенні рослини згідно з винаходом, які споживаються людиною та тваринами, можуть також використовуватися, наприклад, безпосередньо або після одержання, що є відомими як таке, харчових або кормових продуктів. Винахід додатково відноситься до застосування описаних вище ізольованих клітин рослин та/або трансгенних рослин згідно з винаходом та клітин, культур клітин, частин, таких, як, наприклад, корені, листя, тощо, у випадку організмів трансгенної рослини, та трансгенного матеріалу для розмноження, такого, як насіння, бульби, буряки/розрослі стрижневих корені або плоди, що походять від них, для одержання харчових або кормових продуктів, фармацевтичних засобів або чистих хімічних агентів. Далі даний винахід буде додатково описаний за допомогою прикладів. ФІГУРИ: ФІГ. 1: показує положення інсерцій T-ДНК та транспозонів у ckx мутантах. Інсерційні мутанти були ідентифіковані за допомогою ПЛР скринінгу, та сайт інсерції визначали за допомогою секвенування ДНК граничних фрагментів. Чорні квадрати представляють екзони, білі квадрати представляють інтрони та трикутники показують інсерції T-ДНК. G, GABI-KAT T-ДНК-колекція; S, Salk T-ДНК-колекція; T, Torrey Mesa T-ДНК-колекція; Z, ZIGIA колекція транспозонів. ФІГ. 2 демонструє характеристику алелі інсерції ckx T-ДНК та транспозону. Відсутність експресії CKX гена в інсерційних мутантах. РНК з 10-денних проростків використовували як матрицю для ПЛР аналізу зі зворотною транскриптазою. Актин 2 піддавали ампліфікації як контроль. ФІГ. 3 показує вміст цитокініну у суцвіттях ckx3 ckx5 мутанта та рослини дикого типу. Збирали 0,5 г суцвіть Arabidopsis на зразок та поєднували 30 DAG. Збирали п‘ять незалежних біологічних зразків для кожного генотипу. Представлені дані являють собою середні значення вмісту цитокініну [пмоль/г сирої маси] ± стандартне відхилення.; n = 5. tZ, транс-зеатин; tZR; транс-зеатин рибозид; tZRMP, транс-зеатин рибозид 5’-монофосфат; tZ9G, транс-зеатин 96 2 6 глюкозид; tZROG, транс-зеатин рибозид O-глюкозид; iP, N -(Δ ізопентил)аденін; iPR, N 2 6 2 6 (Δ ізопентил)аденозин; iPRMP, N -(Δ ізопентил)аденозин 5’-монофосфат; iP9G, N2 (Δ ізопентил)аденін 9-глюкозид. ФІГ. 4 показує порівняння морфології паростків з рослин дикого типу та ckx мутантів. Кількість стручків, утворених рослиною дикого типу та ckx мутантами на основному стеблі протягом одного життєвого циклу. Рослини дикого типу формували 54,7 стручків (100%). Висота рослини Arabidopsis дикого типу та ckx мутантів наприкінці періоду цвітіння. Висота рослин дикого типу складала 39,5 cм (100%). Дані представляють собою середні значення ± стандартне відхилення (n = 13-17). *, P < 0,01 у порівнянні із диким типом; • = P < 0,01 у порівнянні із ckx3. ФІГ. 5 показує фенотип квітів та врожайність насіння ckx мутантів. a, b, стадія 13 квітів (a) та відповідний гінецей (b) Зліва направо є представленим дикий тип, ckx3, ckx5 та ckx3 ckx5. c, Поверхня пелюсток ckx мутантів, стадія 14 квітів, 39 DAG (n = 30). d, кількість насінних зачатків на гінецей (n = 12). e, врожайність насіння дикого типу та ckx3 ckx5 за умов ростової камери (n = 30). Дані представляють собою середні значення ± стандартне відхилення *, P < 0,01 у порівнянні із диким типом. ФІГ. 6 показує кількість стручків, утворених рослиною дикого типу та ckx мутантами на основному стеблі протягом одного життєвого циклу (n = 15). Рослини дикого типу формували 54,7 стручків (100%). Дані представляють собою середні значення ± стандартне відхилення *, P < 0,01 у порівнянні із диким типом. •, P < 0,01 у порівнянні із ckx3. 23 UA106621 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ФІГ. 7 показує молоді насінні зачатки рослини дикого типу та ckx3 ckx5 мутанта. Визначення стадій насінних зачатків згідно з Schneitz та ін. Прямокутник шкали: 10 мкм. Кількість насінних зачатків збільшується у ckx3 ckx5 мутантах у порівнянні із рослинами дикого типу. ПРИКЛАДИ: СПОСОБИ Рослинний матеріал та умови вирощування Колумбійський (Col-0) екотип Arabidopsis thaliana використовували як дикий тип. Інсерційні мутанти T-ДНК ckx2-S1 (SALK_068485), ckx3-S1 (SALK_050938), ckx4-S1 (SALK_055204), ckx5S1 (SALK_064309), та ckx6-S1 (SALK_070071) були одержані з лабораторії геномного аналізу Інституту Солка (Alonso та ін., (2003) Science 301, 653-657), інсерційний транспозоновий мутант ckx4-Z був одержаний від ZIGIA коллекції транспозонів (Baumann E, Lewald J, Saedler H, Schulz B, Wisman E (1998) Successful PCR-based reverse genetic screens using an En-1-mutagenised Arabidopsis thaliana population generated via single-seed descent. Theoretical and Applied Genetics 97: 729-734), ckx5-G2 (лінія ід. номер 332B10) та ckx7-G1 (лінія ід. номер 363C02) булиодержані із GABI-KAT коллекції (Rosso, M.G., Li, Y., Strizhov, N., Reiss, B., Dekker, K., та Weisshaar, B. (2003) Plant Mol. Biol. 53, 247-259) та ckx7-T1 (SAIL_515_A07) був від Torrey Mesa Research Institute (зараз Синджента). Для перевірки інсерції T-ДНК використовували геномний праймер 1 та праймер лівої границі, а також використовували геномний праймер 1 та 2 гомозиготних ліній (Таблиця 1). Подвійні мутанти одержували шляхом схрещування, а інсерції підтверджували за допомогою геномної ПЛР при використанні специфічних для гена та T-ДНК граничних праймерів (Taблиця 1). Мутантну лінію ckx4-Z не використовували як партнер для схрещування. Рослини вирощували у вегетаційних будиночках на грунті при 22 °C за умов довгого дня (16 годин світла/8 години темряви). Для вимірювання врожайності насіння рослини вирощували у ростових камерах (Percival AR-66L) на грунті при 24 °C при ~100 мкE та 65% вологості за умов довгого світлового дня. Aналіз експресії CKX Загальну РНК екстрагували з проростків згідно з Verwoerd та ін. (Verwoerd та ін., 1989). РНК обробляли ДНКазою І, вільною від РНК (Fermentas, St. Leon-Rot, Germany) при 37 °C протягом 30 хвилин. Один мікролітр 25 мM EДТА додавали при 65 °C протягом 10 хвилин. РНК (0,5 мкг) використовували для реакції ЗТ-ПЛР. Усі використовувані пари праймерів охоплювали відповідний сайт інсерції T-ДНК (Taблиця 2). В усіх реакціях ЗТ-ПЛР праймери для Aктину 2 використовували як контролі. ЗТ-ПЛР здійснювали при використанні набору для одноетапної ЗТ-ПЛР (Qiagen, Hilden, Germany) згідно з інструкціями виробника. ПЛР включала 35 циклів по 30 сек. при 94 °C, 30 сек. при 57 °C та 2 хвилини при 72 °C. Сканувальна електронна мікроскопія Сканувальну електронну мікроскопію проводили так, як описано Krupková та ін. (Krupková, E., Immerzeel, P., Pauly, M., та Schmülling, T. (2007) Plant J. 50, 735-750) при використанні LEO 430 мікроскопа (Zeiss, Oberkochen, Germany). Вимірювання цитокініну Рослини вирощували у ґрунті до тих пір, поки основні суцвіття не досягали приблизно 10 cм у висоту (приблизно 30 DAG). Для кожного зразка збирали ~0,5 г суцвіть від стадії 1 до стадії 15 квітів (Smyth, D.R., Bowman, J.L., та Meyerowitz, E.M. (1990) Plant Cell 2, 755-767), та відбирали п‘ять незалежних зразків для кожного генотипу. Вміст цитокініну визначали за допомогою високоефективної рідинної хроматографії-eлектророзпилювальної тандемної мас-спектрометрії (Novák, O., Hauserová, E., Amakorová, P., Doležal, K., та Strnad, M. (2008) Phytochemistry 69, 2214-2224). Площа пелюстків Площу пелюстків вимірювали, виходячи із цифрових зображень відпрепарованих органів при використанні програми Scion Image (Scion Corporation, Frederick, Maryland, USA). Визначення заключної висоти рослини та параметрів врожайності Заключну висоту рослини та кількість стручків на основному стеблі визначали після закінчення цвітіння. Для аналізу врожайності насіння рослини поміщали у паперові пакети після закінчення цвітіння. Після висушування рослин протягом додаткових трьох тижнів визначали загальну вагу насіння. Світлова мікроскопія Для підрахунку насінних зачатків та вивчення гінецеї очищали та готували для мікроскопічного дослідження так, як описано (Malamy та Benfey, 1997). Усі зразки оцінювали за допомогою Axioskop 2 plus мікроскопа (Zeiss, Jena, Germany). Підрахунок та розділення насінних зачатків 24 UA 106621 C2 5 Одержували насінні зачатки рослин дикого типу та ckx3 ckx5 мутантів, аналізували та розділяли так, як описано у Schneitz та ін. (1995). Розвиток насінних зачатків рослин дикого типу у Arabidopsis thaliana: дослідження при використанні світлового мікроскопа очищених тотальних препаратів тканини. Plant J. 7, 731-749. Виявлялося, що здатність плацентарної тканини ініціювати зав‘язі збільшується у ckx3 ckx5 мутантів у порівнянні із рослинами дикого типу, що приводить до більш високої загальної кількості та щільності насінних зачатків та насіння у плодолистках. 10 25 UA 106621 C2 26 UA 106621 C2 27 UA 106621 C2 28
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюDisruption of ckx3 and an least one other ckx gene in a plant or plant cell leads to improved traits
Автори англійськоюSchmulling, Thomas, Bartrina y Manns, Isabel, Werner, Tomas
Автори російськоюШмюллинг Томас, Бартрина и Маннс Изабель, Вернер Томаш
МПК / Мітки
МПК: C12N 15/82
Мітки: поліпшених, клітині, приводить, гена, одного, рослинній, порушення, принаймні, рослини, ознак, іншого
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/73-106621-porushennya-gena-ckx3-ta-prinajjmni-odnogo-inshogo-gena-ckx-u-roslini-abo-roslinnijj-klitini-shho-privodit-do-polipshenikh-oznak.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Порушення гена ckx3 та принаймні одного іншого гена ckx у рослині або рослинній клітині, що приводить до поліпшених ознак</a>
Попередній патент: Панелі з цеглою та спосіб їх збирання
Наступний патент: Агрономічні композиції
Випадковий патент: Спосіб лікування глибоких опіків