Застосування гена аполіпопротеїду е (апое) як засобу для профілактики кардіосклерозу

Застосування гену аполіпопротеїду Е (апоЕ) як засобу для профілактики кардіосклерозу. (19) (21) u201104115 (22) 05.04.2011 (24) 10.11.2011 (46) 10.11.2011, Бюл.№ 21, 2011 р. (72) ГРИНЧАК НАТАЛЯ МИКОЛАЇВНА, ПІСКУН РАЇСА ПЕТРІВНА, ІСТОШИН ВАЛЕРІЙ МИХАЙЛОВИЧ 3 хворювання, які б сприяли регресу склеротичних змін в органах, а особливо в серці. АпоЕ - одноланцюговий білок, що складається з 299 амінокислотних залишків, молекулярна маса - 34 кДа. АпоЕ входить до складу різноманітних класів ліпопротеїнів плазми. Білок апоЕ складається з двох доменів: один зв'язується з ліпідом, а другий визначає пов'язання з апоЕ-рецепторами і клітинним глікокаліксом. Синтезується в основному в печінці і мозку, причому вони абсолютно не залежні один від одного, оскільки апоЕ не здатний здолати бар'єр між кров'ю і церебро-спинальною рідиною. У крові апоЕ визначає поглинання ремнантів хіломікронів і ремнантів ліпопротеїнів дуже низької щільності (ЛПДНЩ). Зараз у ссавців ідентифіковано сім рецепторів, лігандом яких є апоЕ. Всі ці рецептори належать до еволюційноконсервативного сімейства рецепторів ліпопротєїнів низької щільності. Ген апоЕ людини локалізується в хромосомі 19 і знаходиться в кластері з іншими аполіпопротеїнами апоС1 і апоС2. Ген складається з 4 екзонів, 3 інтронів, 3597 пар нуклеотидів. Ген характеризується поліморфізмом. АпоЕ відіграє найважливішу роль в метаболізмі, транспорті та регуляції рівня холестеролу та тригліцеридів [Machley R.W., 1988; Килимчук В. Контроль липидного спектра крови - неотъемлемое условие лечения и профилактики сердечнососудистых заболеваний //Здоровья України, №1112, 2007, с. 7-8; Талалаєв Т.В. з співав. Системний характер порушень обміну ліпопротеїнів крові як основа патогенезу атеросклерозу //Журнал АМН України/, 2007, т. 13, №1. - с. 45-64]. Встановлено, що апоЕ і ангіотензин-перетворюючий фермент (АСОВІ) відіграють важливу роль в ліпідному метаболізмі, а оскільки серцево-судинні захворювання є головною причиною смерті людини, то вони безпосередньо впливають на тривалість життя. Білок апоЕ бере участь в створенні, секреції, транспорті і зв'язуванні макромолекулярних ліпопротеїдних комплексів. АпоЕ захищає коронарні артерії від атеросклеротичних уражень шляхом видалення атерогенних залишкових ліпопротеїнів. Перенесення гена апоЕ дозволяє покращити ліпідний профіль і чинить сприятливу дію на стан пошкоджених ділянок, а саме запобігає розвиткові атеросклерозу або призводить до його зворотного розвитку. В дослідженні були використані кДНК гена Апо-Е людини, субклонована в вектор pUC18, представлена професором G.Dickson і дослідником T.Athanasopoulos (факультет біохімії Королівського Лондонського університету, Великобританія) і вектор pCMV.SPORT6 ("Invitrogen", США), який має цитомегаловірусний промотор і сигнал поліаденілування SV40, що дозволяє експресувати клоновану в ньому послідовність ДНК в еукаріотичних клітинах. КДНК гена Апо-Е переклонували у вектор pCMV.SPORT6, по сайтах рестриктаз Smal і Sall, вектор обробляли рестриктазами HindІІІ і Sall, при цьому кінці ДНК після обробки рестриктазою HindIII затуплювали за допомогою фрагмента Кленова. Отриману конструкцію pCMV.SPORT6 - АпоЕ виділяли в препаративних кількостях методом лужного лізису, використовуючи реактиви і колон 64452 4 ки tip500 фірми "Qiagen" (США). (Білошицька А.В, Піскун Р.П., Горбатюк С.М. та ін. Морфофункціональні дослідження ефективності генної терапії при експериментальному атеросклерозі // Фактори експериментальне еволюції організмів//, том 7, 2009, - с. 298-303). Експерименти проведено на білих лабораторних щурах-самцях масою тіла 150-170 грамів, які утримувались на стандартному раціоні в умовах науково-експериментальної клініки Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова. Створювали модель експериментального атеросклерозу шляхом згодовування щурам-самцям холестерину в дозі 0,5 г/кг та введенням 4(6) - Метил-2-тіоурацил в дозі 12 мг/кг маси тіла для пригнічення функції щитоподібної залози, протягом 30 днів. При формуванні моделі профілактичної групи вводили ген апоЕ по 50 мкг на тварину внутрішньом'язово в перший день досліду. Ефективність дії апоЕ оцінювали за динамікою ЕКГ, макро- та мікроморфометричних, морфологічних, ультраструктурних та біохімічних досліджень. В дослідах була застосована модель склеротичного ураження серця, що відображає найбільш типові зміни, які можна спостерігати у клініці при ураженні цього органа. Щури були поділені на такі групи: 1 група - інтактні тварини, 2 група - щури, яким протягом 30 днів моделювався атеросклероз, щоденно згодовуючи холестерол в дозі 0,5 г/кг маси тіла і 4(6) - Метил-2-тіоурацил в дозі 12 мг/кг, 3 група – «профілактична», щури, яким в перший день моделювання атеросклерозу вводили ген апоЕ по 50 мкг на тварину внутрішньом'язово. Для комплексної оцінки стану серця за умов експериментальної патології без корекції та на фоні застосування гена апоЕ, були проведені дослідження динаміки ЕКГ, макроморфометричних показників, біохімічні дослідження ліпідного спектра сироватки крові, також були проведені гістологічні дослідження тканин серця, вивчені ультраструктурні зміни міокарду щурів. Статистичну обробку цифрових даних проводили за допомогою загальноприйнятих методів статаналізу на комп'ютері з використанням стандартних пакетів програми MS Excel 97. Аналізуючи результати електрокардіограм тварин першої (інтактної) групи ми отримали дані, які свідчать, що порушень ритму, провідності та порушень коронарного кровообігу тварини не мали. У більшості тварин 2 групи (з експериментальним атеросклерозом) переважає реакція тахікардитичного типу: частота серцевих скорочень, в порівнянні з інтактними тваринами, зростає на 5,01 %, а амплітуда зубця S зменшується на 22,9 %. У тварин профілактичної групи вказані показники становлять відповідно 1,6 % та 10 %. Результати макрометричного дослідження показали, що застосування атерогенної дієти призвело до вираженої структурної перебудови серця. Відмічаються зміни як планіметричних, так і вагових показників лівого шлуночка (ЛШ). Так, площа стінки правого шлуночка (ЛШ) у тварин з атеросклерозом перевищує даний показник у інтактних тварин на 5,23 %, а площа стінки ПШ збільшується 5 на 14,9 % порівняно з аналогічним показником інтактної групи. Зростання даних показників свідчить про наявність об'ємного навантаження на серце і, як наслідок, виникнення дилатації його порожнини. Також зазнають змін і гравіметричні показники морфометрії. Так, абсолютна маса серця у тварин з експериментальним атеросклерозом на 3,75 % більше, ніж у тварин інтактної групи. Абсолютна маса ЛШ зростає на 7,12 %, а абсолютна маса ПШ - на 4,70 %. Відповідно питома маса ЛШ у тварин з експериментальним атеросклерозом зростає на 2,33 %, а питома маса ПШ зменшується на 3,51 %. Індекс Фултона збільшується на 2,49 %, площа лівої поверхні МШП збільшується на 2,17 %. Такі зміни вказаних показників свідчать про гіпертрофію окремих частин міокарда, в більшій ступені лівого шлуночка, а також розширення камер серця та зменшення кількості функціонально здатної тканини міокарда на одиницю площі. У тварин профілактичної групи, в порівнянні з тваринами з експериментальним атеросклерозом без корекції, зменшилась абсолютна маса серця на 3,68 %, абсолютні маси ЛШ та ПШ відповідно на 5,01 % і на 5,05 %. В даній групі відмічаються позитивні зміни планіметричних показників. Так, зменшились площі стінок ЛШ та ПШ, збільшився планіметричний індекс на 1,38 %. Отримані дані свідчать про нормалізацію більшості вивчених показників макроморфометрії. В результаті холестеринового навантаження у тварин, яким моделювали експериментальний атеросклероз, зростають майже всі мікрометричні показники кардіоміоцитів, порівняно з тваринами інтактної групи, а саме: площа кардіоміоцитів - на 25,44 %, площа їх ядер - на 21,92 %, максимальний діаметр кардіоміоцитів - на 6,98 %, мінімальний діаметр кардіоміоцитів - на 13,72 %, максимальний діаметр ядер - 11,2 %, мінімальний діаметр Комп’ютерна верстка М. Ломалова 64452 6 ядра – 13 %, ядерно-цитоплазматичне співвідношення зменшується на 3,5 %. Таким чином, навантаження холестерином призводить до виникнення виражених гіпертрофічних змін в міокарді експериментальних тварин. Використання гена апоЕ з метою профілактики призводить до наступних позитивних змін порівняно з тваринами з експериментальним атеросклерозом: площа кардіоміоцитів зменшується на 2,11 % менше; площа ядра - на 7,07 %, а ядерно-цитоплазматичне співвідношення на 3,6 % менше ніж у тварин з атеросклерозом. Отже, в результаті проведених досліджень було встановлено, що дія гена апоЕ сприяє зменшенню пошкодження міокарду щурів з експериментальним кардіосклерозом. На це вказувала статистично вірогідна нормалізація показників електрокардіографії. Крім того введення гена апоЕ з профілактичною метою показує тенденцію до нормалізації концентрації в сироватці крові загального холестерину, ліпопротеїнів низької щільності і тригліцеридів. Також відмічений позитивний вплив дії апоЕ на показники планіметрично-вагової кардіометрії. Всі ці явища корелювали з позитивною динамікою мікроморфометричної та ультраструктурної картини серця. Так, при використанні гена в мікропрепаратах серця практично не виявлялись вогнища жирової дистрофії та некрозу кардіоміоцитів, спостерігались ознаки покращення мікроциркуляції та репарації в серцевому м'язі. Таким чином, проведене дослідження показало, що введення гена апоЕ дає достатньо виразну гіполіпідемічну, протисклеротичну та кардіопротекторну дію в умовах експериментального кардіосклерозу. Запропонований засіб сприятиме обмеженню можливої поліпрагмазії, і, тим самим, підвищенню ефективності та безпечності лікування кардіосклерозу. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601