Спосіб вибірного одержання рослин з чоловічою або жіночою стерильністю
Номер патенту: 82665
Опубліковано: 12.05.2008
Автори: Хедфілд Стефен Томас, Томпсон Пол Ентоні, Хоукс Тімоті Роберт, Занг Ян, Мітчелл Глунн, Вінер Русселль
Формула / Реферат
1. Спосіб одержання рослин з чоловічою або жіночою стерильністю, який включає наступні етапи: трансформацію рослинного матеріалу полінуклеотидом, який кодує принаймні один фермент, який взаємодіє з нефітотоксичною субстанцією з утворенням фітотоксичної субстанції, і регенерацію з трансформованого в такий спосіб матеріалу рослини, де нефітотоксичну субстанцію наносять на рослину до утворення і/або дозрівання чоловічої або жіночої гамет, при цьому відбувається утворення з нефітотоксичної субстанції фітотоксичної субстанції, яка вибірно запобігає формуванню або в іншому варіанті порушує функцію гамет, при цьому фермент експресується переважно в структурах або чоловічої, або жіночої репродуктивної системи, який відрізняється тим, що (I) нефітотоксичну субстанцію вибирають із групи, яка включає складноефірні похідні гербіцидів, які не належать до фосфонатів, які мають безпосередню фітотоксичність у відношенні незеленої тканини, D-альфа-амінокислоти, пептидні похідні D-альфа-амінокислот, які не входять до складу протеїнів, і (II) фермент вибирають із групи, яка включає оксидази D-aмінокислот.
2. Спосіб за п. 1, у якому вказану нефітотоксичну субстанцію наносять у суміші з принаймні ще однією субстанцією, вибраною з групи, яка включає антидоти, гаметоциди, індуктори глутатіон-S-трансферази, індуктори цитохрому P450, гербіциди, добрива, нематоциди, синергісти, інсектициди, фунгіциди, гормони, регулятори росту рослин і інгібітори цитохрому P450.
3. Спосіб за п. 1 або 2, у якому нефітотоксичну субстанцію наносять на листя, і вона являє собою метаболічно стабільний окислюваний субстрат ферменту, який має здатність просуватися по флоемі, і при цьому фермент безпосередньо або опосередковано забезпечує утворення фітотоксичного продукту з нефітотоксичної субстанції.
4. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, у якому фітотоксичний продукт утворюється опосередковано у формі аніона пероксиду і/або супероксиду.
5. Спосіб за п. 3 або 4, у якому нефітотоксична субстанція являє собою D-альфа-амінокислоту, вибрану з групи, яка включає D-аланін, D-валін, D-метіонін, D-серин, D-лейцин і D-ізолейцин, і фермент являє собою оксидазу D-амінокислот або оксидоредуктазу, яка окисляє амінокислоту до 2-кетокислоти, що супроводжується відновленням кисню до аніона пероксиду.
6. Спосіб за п. 3 або 4, у якому нефітотоксична субстанція являє собою D-аспартат або D-глутамат, і фермент являє собою оксидазу D-амінокислот або оксидоредуктазу, яка окисляє амінокислоту до 2-кетокислоти, що супроводжується відновленням кисню до аніона пероксиду.
7. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, у якому фермент являє собою мутантну оксидазу D-амінокислот, одержувану з Rhodotorula gracilis, що несе заміни в положеннях 213 і/або 238 у порівнянні з послідовністю дикого типу, або D-аспартатоксидазу.
8. Спосіб за п. 7, у якому оксидаза, яку одержують з Rhodotorula, несе в положенні 213 амінокислоту, вибрану з групи, яка включає Arg, Lys, Ser, Cys, Asn і Ala, і/або в положенні 238 амінокислоту, вибрану з групи, яка включає His, Ser, Cys, Asn і Ala.
9. Спосіб за будь-яким з пп. 3-8, у якому направлене перенесення ферменту здійснюють до органели, відмінної від пероксисоми.
10. Спосіб за п. 1 або 2, у якому фермент являє собою оксидазу D-амінокислот, дегідрогеназу D-амінокислот або рацемазу D-амінокислот, і нефітотоксична субстанція являє собою або D-енантіомер фосфінотрицину, або D енантіомер біалафосу.
11. Спосіб за п. 1 або 2, у якому нефітотоксична субстанція входить до складу суміші, яка містить фітотоксичну субстанцію, і фермент являє собою оксидазу D-амінокислот або оксидоредуктазу, яка має здатність окислювати амінокислоту до 2-кетокислоти, що супроводжується відновленням кисню до аніона пероксиду.
12. Спосіб за п. 7, 8 або 11, у якому суміш містить і D-, і L-фосфінотрицин, і рослинний матеріал експресує ген PAT практично тільки в зелених тканинах і в квітковій тканині, яка продукує гамети, відмінні від тих, які стають нефункціональними.
Текст
1. Спосіб одержання рослин з чоловічою або жіночою стерильністю, який включає наступні етапи: трансформацію рослинного матеріалу полінуклеотидом, який кодує принаймні один фермент, який взаємодіє з нефітотоксичною субстанцією з утворенням фітотоксичної субстанції, і регенерацію з трансформованого в такий спосіб матеріалу рослини, де нефітотоксичну субстанцію наносять на рослину до утворення і/або дозрівання чоловічої або жіночої гамет, при цьому відбувається утворення з нефітотоксичної субстанції фітотоксичної субстанції, яка вибірно запобігає формуванню або в іншому варіанті порушує функцію гамет, при цьому фермент експресується переважно в структурах або чоловічої, або жіночої репродуктивної системи, який відрізняється тим, що (I) нефітотоксичну субстанцію вибирають із групи, яка включає складноефірні похідні гербіцидів, які не належать до фосфонатів, які мають безпосередню фітотоксичність у відношенні незеленої тканини, D-альфаамінокислоти, пептидні похідні D-альфаамінокислот, які не входять до складу протеїнів, і (II) фермент вибирають із групи, яка включає оксидази D-aмінокислот. 2 (19) 1 3 82665 4 9. Спосіб за будь-яким з пп. 3-8, у якому направлене перенесення ферменту здійснюють до органели, відмінної від пероксисоми. 10. Спосіб за п. 1 або 2, у якому фермент являє собою оксидазу D-амінокислот, дегідрогеназу Dамінокислот або рацемазу D-амінокислот, і нефітотоксична субстанція являє собою або Dенантіомер фосфінотрицину, або D енантіомер біалафосу. 11. Спосіб за п. 1 або 2, у якому нефітотоксична субстанція входить до складу суміші, яка містить фітотоксичну субстанцію, і фермент являє собою оксидазу D-амінокислот або оксидоредуктазу, яка має здатність окислювати амінокислоту до 2кетокислоти, що супроводжується відновленням кисню до аніона пероксиду. 12. Спосіб за п. 7, 8 або 11, у якому суміш містить і D-, і L-фосфінотрицин, і рослинний матеріал експресує ген PAT практично тільки в зелених тканинах і в квітковій тканині, яка продукує гамети, відмінні від тих, які стають нефункціональними. Гетерозис культурних рослин може впливати на підвищення врожаю. У цілому, гібриди мають підвищену врожайність у порівнянні з негібридними сортами. Як правило, гібриди в порівнянні з негібридними сортами дають більшу віддачу на застосування факторів росту, таких як вода і добрива. Для гібридів часто характерна підвищена стійкість до стресу, однорідність продукту і його ступеня зрілості, у гібридах за допомогою схрещування легко можна об'єднувати характеристики або ознаки, які може виявитися важко об'єднувати іншими шляхами. Гібридна сила рослин, як правило, є досить високою для того, щоб мати практичне застосування. Широко використовуються гібриди багатьох культурних рослин, які мають комерційну значимість, включаючи кукурудзу, сорго, цукровий буряк, соняшник і ріпак. Однак, насамперед, через відсутність економічних методів одержання гібридного насіння, пшеницю, ячмінь і рис усе ще вирощують головним чином у вигляді інбредних ліній. Традиційне одержання гібридного насіння передбачає окрему посадку блоків материнських і батьківських ліній, і збір насінного матеріалу тільки материнських рослин. Для гарантії того, що цей насінний матеріал є гібридним, самозапилення жіночої лінії повинне бути мінімізоване шляхом надання цій лінії чоловічої стерильності. Для одержання материнської лінії з чоловічою стерильністю застосовують механічні, хімічні і генетичні методи. Для однодомних рослин, таких як кукурудза, чоловічу стерильність легко можна одержувати механічно шляхом видалення чоловічої квітки. Однак більшість культурних рослин є дводомними і несуть чоловічі і жіночі органи в одній і тій квітці, що не дозволяє застосовувати в практичних умовах фізичну емаскуляцію. Таким чином, у багатьох випадках слід застосовувати генетичні підходи. Ознаки, зв'язані з наявністю генетичної чоловічої стерильності, як правило, контролюються ядерними генами, у яких алелі, зв'язані зі стерильним фенотипом, звичайно експресуються рецесивно відносно відповідних алелів, зв'язаних з фертильністю. Коли має місце генетична чоловіча стерильність, то вона звичайно зв'язана з одним рецесивним геном, який для того, щоб експресувалась чоловіча стерильність, повинен бути гомозиготним. Для практичного застосування ознак такої генетичної чоловічої стерильності селекціонери, як правило, створюють фенотипічно однорідну жіночу лінію, яка поділяється на рослини з чоловічою стерильністю і рослини з чоловічою фертильністю. Рослини з чоловічою фертильністю після їх виявлення повинні бути відділені від сортових домішок, що вимагає великих зусиль. Завжди існує проблема з підтриманням батьківської лінії, оскільки рослини з чоловічою фертильністю не можна елімінувати з популяції через їх важливу роль у підтриманні популяції. Замість того щоб передбачати застосування тільки алелів чоловічої стерильності, що зустрічаються в природних умовах, можна використовувати також методи молекулярної біології. Можна конструювати рослини, які експресуюють, наприклад, антисмислові або рибозимні гени, які знижують або елімінують експресію генів, які відіграють основну роль в утворенні життєздатного пилку. Такі трансгенні лінії рослин мають чоловічу стерильність і їх можна застосовувати для одержання гібридного насінного матеріалу шляхом схрещування з використанням пилку рослин, що мають чоловічу фертильність. Основна проблема, зв'язана з застосуванням таких ліній, полягає в тому, що їх можна підтримувати в наступних поколіннях тільки в гетерозиготному стані, здійснюючи схрещування з ізогенними фертильними лініями. Це може бути зв'язане з труднощами в одержанні гібридного насінного матеріалу, коли врожайність має вирішальне значення. Хоча, наприклад, шляхом зв'язування генів, які обумовлюють стійкість до гербіцидів, з генами чоловічої стерильності, можна вибірно відбраковувати рослини з чоловічою фертильністю, що є необхідним, насамперед у випадку, коли рослини спочатку висаджують з дуже високою щільністю. Для застосування цитоплазматичної чоловічої стерильності для комерційного одержання гібридів потрібна стабільна цитоплазма з чоловічою стерильністю і джерело пилку. Для одержання гібриду за допомогою цитоплазматичної генетичної системи чоловічої стерильності необхідна наявність трьох типів ліній: лінії А (з цитоплазматичною чоловічою стерильністю), лінії Б (лінія для підтримки чоловічої фертильності) і лінії R (чоловіча фертильна лінія з генами-відновниками). Потрійні схрещування, які здійснюються з використанням цієї системи, включають підтримання і виробництво чотирьох ліній, по одній інбредній лінії А і Б і двох інших інбредних ліній з чоловічою фертильністю. Застосування одного джерела цитоплазми з чоловічою стерильністю може знижувати до мінімуму пластичність селекції й одержувати потомство, 5 більша частина якого має чутливість до конкретних хвороб. Можна одержувати також гібридний насінний матеріал за допомогою хімічних речовин, які інгібують утворення життєздатного пилку. Ці хімічні речовини, які називають гаметоцидами, застосовують для надання тимчасової чоловічої стерильності. Однак застосування гематоцитів обмежують високу вартість і проблеми, зв'язані з їх реєстрацією і доступністю. Недоліком традиційних систем одержання гібридного насінного матеріалу є необхідність вирощувати батьківські і материнські рослини у відділених один від одного рядах або блоках. При цьому низька ефективність запилення є особливо актуальною для таких культурних рослин, як пшениця, які утворюють невелику кількість пилку, який не переноситься на значні відстані вітром. Для таких культур до двох третин посівної площі повинне бути віддане під чоловічі рослини-донори пилку і внаслідок цього одержання гібридного насінного матеріалу стає неекономічним. Для більш економічного одержання насінного матеріалу пшениці й інших культурних рослин необхідно наближати одна до одної батьківські і материнські рослини для більш ефективного перенесення пилку; найбільш ефективною є ущільнена посадка батьківських і материнських рослин, при якій рослини знаходяться на відстані декількох сантиметрів один від одного в тих самих рядах. При застосуванні такої системи може виявитися неможливим збирати насінний матеріал тільки з материнських рослин (з чоловічою стерильністю). Забруднення негібридного насінного матеріалу батьківськими рослинами можна мінімізувати шляхом максимально можливого зниження відсотка таких батьківських рослин у суміші батьківських і материнських рослин, що висаджуються, і/або шляхом використання чоловічих рослин з жіночою стерильністю. Метод створення лінії з домінантною жіночою стерильністю відомий [EP 412006 A1 (1990); Goldman і ін. EMBO. J., 13, 1994, стор.29762984], але, також як і у випадку ліній з чоловічою стерильністю, таку лінію необхідно підтримувати у вигляді гетерозиготної лінії. Таким чином, зберігається необхідність у створенні простих економічних методів одержання гібридного насінного матеріалу. Зокрема, для ефективного одержання гібридного насінного матеріалу зберігається необхідність в одержанні як материнських ліній з чоловічою стерильністю, так і батьківських рослин з жіночою стерильністю, які можна легко підтримувати у вигляді чистих гомозиготних ліній і які можна застосовувати для ефективного одержання гібридного насінного матеріалу. Відомі в даній галузі методи, призначені для вирішення цієї задачі, включають методи, які полягають у тому, що гібридний насінний матеріал одержують від батьківських і материнських ліній, принаймні одна з яких містить гетерологічний химерний ген, експресія якого переважно відбувається в квітковій тканині, що обумовлює умовну стерильність лінії, яка залежить від екзогенної обробки нефітотоксичною субстанцією, яку можна специфічно і локально перетворювати у фітоксин 82665 6 за допомогою ферменту, який кодується гетерологічним химерним геном і який переважно експресується в структурах або чоловічої, або жіночої репродуктивної системи. Нефітотоксична субстанція може являти собою прогербицід. Перевагою вказаних батьківських ліній з умовною стерильністю (умовно стерильні лінії) є те, що їх можна підтримувати у вигляді гомозигот за ознакою стерильності. Фертильність порушується тільки після екзогенної обробки нефітотоксичною субстанцією. Одним із прикладів системи умовної чоловічої стерильності є система, яка включає ген, що кодує фермент деацетилазу, який переважно експресується в клітинах вистильного шару (тапетуму) у тканині чоловічої квітки, де він перетворює внесений екзогенно прогербицід N-ацетил-Lфосфінотрицин у фітотоксин L-фосфінотрицин і тим самим перешкоджає утворенню життєздатного пилку. Аналогічні додаткові приклади включають: (І) переважну для тапетуму експресію бактеріального цитохрому Р450, який каталізує перетворення прогербиціду R7402 у фітотоксичну сульфонілсечовину, яка перешкоджає утворенню життєздатного пилку; і (II) переважну для тапетуму експресію гідролази моноефірів фосфорних кислот, яка перетворює прогербицід гліцерилгліфосат у фітотоксичний гліфосат, який також перешкоджає утворенню життєздатного пилку. У [WO 98/03838] описані приклади систем на основі умовної жіночої стерильності, у яких ферменти, які мають здатність перетворювати прогербиціди у фітотоксини, переважно експресуються в структурах жіночої репродуктивної системи. Незважаючи на наявність методів одержання батьківської і материнської ліній з умовною стерильністю, одержання гібридного насінного матеріалу таких культур, як пшениця, ще далеко від того, щоб стати загальноприйнятим. Даний винахід стосується, зокрема, удосконалених способів одержання материнських ліній з умовною чоловічою стерильністю і батьківських ліній з умовною жіночою стерильністю. Даний винахід стосується шляхів, які удосконалять методи одержання гібридного насінного матеріалу культурних рослин. Зокрема, винахід стосується способу одержання гібридного насінного матеріалу батьківської і материнської ліній, принаймні одна з яких має умовну жіночу або чоловічу стерильність, яка залежить від екзогенної обробки субстанцією, яка є нефітотоксичною для культурної рослини і яка включає прогербиціди. Винахід стосується також способу, у якому вказану нефітотоксичну субстанцію наносять у такий момент часу й у достатній кількості для того, щоб мінімізувати або запобігати самозаплідненню умовно стерильної(их) батьківської(их) лінії(ій). Даний винахід стосується також способу одержання рослин з умовною чоловічою або жіночою стерильністю, який полягає в тому, що (І) трансформують рослинний матеріал одним або декількома химерними генами, які індивідуально або в сполученні кодують один або декілька ферментів, здатних взаємодіяти з нефітотоксичною субстанцією, переважно у формі прогербиціду, з утворенням фітотоксичної субстанції. Ферменти експресуються під функціональ 7 ним контролем одного або декількох промоторів, які у випадку рослин з умовною чоловічою стерильністю забезпечують експресію ферменту(ів) переважно в структурах чоловічої репродуктивної системи або у випадку рослин з умовною жіночою стерильністю забезпечують експресію вказаного(их) ферменту(ів) переважно в структурах жіночої репродуктивної системи. З рослинного матеріалу регенерують морфологічно нормальні фертильні рослини з умовною чоловічою або жіночою стерильністю. Винахід стосується також застосування рослин з умовною чоловічою стерильністю в сполученні з рослинами з умовною жіночою стерильністю для більш ефективного одержання гібридного насінного матеріалу, застосування як нефітотоксичних субстанцій певних прогербицідів і застосування химерних генів для більш ефективного одержання гібридного насіння, химерних генів і ферментів, запропонованих у винаході. Винахід стосується також рослин з умовною чоловічою стерильністю, умовною жіночою стерильністю, насіння таких рослин і гібридного насіння, отриманого за допомогою вказаного способу. Відповідно до переважних варіантів здійснення винаходу культурні рослини, до яких застосовний спосіб одержання гібридного насінного матеріалу, включають кукурудзу, рис, сорго, пшеницю, просо, овес, ріпак і ячмінь. Даний винахід стосується способу одержання рослин з чоловічою або жіночою стерильністю, який полягає в тому, що трансформують рослинний матеріал полінуклеотидом, що кодує принаймні один фермент, який взаємодіє з нефітотоксичною субстанцією з утворенням фітотоксичної субстанції, і регенерують із трансформованого в такий спосіб матеріалу рослину, причому нефітотоксичну субстанцію наносять на рослину до утворення і/або дозрівання чоловічої або жіночої гамет, при цьому відбувається утворення з нефітотоксичної субстанції фітотоксичної субстанції, яка вибірно запобігає формуванню або в іншому варіанті порушує функцію гамет, при цьому фермент експресується переважно в структурах або чоловічої, або жіночої репродуктивної системи, який відрізняється тим, що (І) нефітотоксичну субстанцію вибирають із групи, яка включає похідні складних ефірів, які не належать до фосфонатів гербіцидів, де гербіциди мають безпосередню фітотоксичність для незеленої тканини, D-альфаамінокислоти, пептидні похідні D-альфаамінокислот, які не входять до складу протеїнів, Sенантіомери арилоксифеноксипропіонатів і Sенантіомери складноефірних похідних арилоксифеноксипропіонатів, і (II) фермент вибирають із групи, яка включає карбоксилестерази, оксидази D-амінокислот, дегідрогенази D-амінокислот, рацемази D-амінокислот, 2-арилпропіоніл-СоАепімерази, альфа-метилацил-СоА-рацемази, тіоестерази й ацил-СоА-синтетази. Оскільки існує реальна необхідність у збільшенні до максимуму врожаю гібридного насінного матеріалу і для цього необхідно мінімізувати будьяке ушкодження культури, то відповідно до переважних варіантів здійснення винаходу нефітотоксична субстанція являє собою прогербицід, виб 82665 8 раний із сполук, які є відносно нефітотоксичними для культури. Для того щоб за допомогою прогербицідів можна було б впливати на квіткові тканини, також є бажаним, щоб прогербиціди були попередниками фітотоксинів, які мають ефективність у «незелених» тканинах. Таким чином, відповідно до переважних варіантів здійснення винаходу прогербиціди вибирають із сполук, які є попередниками фітотоксинів, які мають безпосередню фітотоксичність для «незелених» тканин, а не із сполук, основний механізм дії яких зв'язаний із впливом на фотосинтез або на утворення зв'язаних з фотосинтезом пігментів. Також важливу роль відіграє зниження до мінімуму вартості одержання гібридного насінного матеріалу. Таким чином, відповідно до переважних варіантів здійснення винаходу прогербиціди вибирають з таких хімічних субстанцій, застосування яких на культурних рослинах або вже дозволено відповідними контролюючими органами, або перебуває на стадії розгляду. Поняття «ген» у контексті даного опису стосується будь-якої послідовності ДНК, яка містить декілька функціонально зв'язаних фрагментів ДНК, таких як промотор і 5'-регуляторна ділянка, кодувальна послідовність і нетрансльованая 3'-ділянка, яка включає сайт поліаденілування. Поняття «химерний» у відношенні гена або послідовності ДНК використовують для позначення того факту, що в природних умовах кодувальна послідовність не зв'язана з промотором або принаймні з однією іншою регуляторною ділянкою ДНК у гені. Поняття «химерний ген» у контексті даного опису стосується гена, у якому в природних умовах кодувальна послідовність не зв'язана з промотором або принаймні з однією іншою регуляторною ділянкою ДНК у гені. Поняття «касета експресії» у контексті даного опису стосується ділянки ДНК, яку можна переносити, що містить химерний ген, який фланкований одним або декількома сайтами рестрикції або іншими сайтами, які полегшують точну ексцизію локусу з однієї ДНК і вбудовування його в іншій. Поняття «нефітотоксичні субстанції» у контексті даного опису стосується субстанцій, які є відносно нефітотоксичними для рослин, клітин або тканин будь-якої конкретної культурної рослини, до якої застосовують спосіб, запропонований у винаході. Нефітотоксичні субстанції не повинні бути нефітотоксичними для всіх рослинних тканин усіх рослин. Нефітотоксичні субстанції включають прогербиціди, які являють собою сполуки, що не мають вираженої безпосередньої токсичної дії на рослинні тканини, але які є попередниками активних фітотоксинів. На чутливі види рослин такі прогербиціди здійснюють непрямий гербицідний вплив завдяки активності ендогенних ферментів, які перетворюють їх у рослині у фітотоксин. Поняття «фітотоксини» у контексті даного опису стосується субстанцій, які є токсичними для рослин, рослинних тканин і рослинних клітин конкретної культурної рослини, до якої застосовний спосіб, запропонований у винаході. Такі фітотоксини не повинні мати фітотоксичність для всіх рослинних тканин усіх видів рослин. 9 Поняття «структура жіночої репродуктивної системи» стосується жіночих гамет і частин рослини, спеціалізованих у відношенні виробництва, дозрівання і забезпечення життєздатності жіночих гамет. Як правило, воно стосується тих частинам рослини, які містять плодолистик або гінецей («маточку»). Плодолистик рослини включає (але не обмежений ними) приймочку, стовпчик, зав'язь і клітини або тканини, які входять до складу приймочки, стовпчика і зав'язі. Поняття «структура чоловічої репродуктивної системи» стосується чоловічих гамет і частин рослини, спеціалізованих у відношенні виробництва, дозрівання і забезпечення життєздатності чоловічих гамет. Воно стосується тих частин рослини, які містять, наприклад, мікроспори, тичинки, тапетум, пиляк і пилок. Поняття «рослина з жіночою стерильністю» у контексті даного опису стосується рослини, у якій не відбувається підтримання утворення життєздатного насінного матеріалу при запиленні функціонально активним або життєздатним пилком. Така жіноча стерильність може бути результатом селекції або присутності трансгена. Поняття «рослина з умовною жіночою стерильністю» стосується рослини, яка при звичайних умовах вирощування має жіночу фертильність і стає рослиною з жіночою стерильністю у певних умовах. У контексті даного опису ці умови включають екзогенну обробку прогербицідом або іншою нефітотоксичною субстанцією. У контексті даного опису мається на увазі, що «рослина з жіночою стерильністю» або «рослина з умовною жіночою стерильністю» зберігає чоловічу фертильність і має здатність продукувати життєздатний пилок. Поняття «рослина з чоловічою стерильністю» у контексті даного опису стосується рослини, у якій не відбувається підтримання утворення життєздатного пилку. Така чоловіча стерильність може бути результатом селекції або присутності трансгена. Поняття «рослина з умовною чоловічою стерильністю» стосується рослини, яка при звичайних умовах вирощування має чоловічу фертильність і стає рослиною з чоловічою стерильністю у певних умовах. Наприклад, такі умови можуть являти собою фізичну емаскуляцію або обробку специфічним хімічної гематоцидом. У контексті даного опису ці умови включають екзогенну обробку прогербицідом або іншою нефітотоксичною субстанцією. У контексті даного опису «рослина з чоловічою стерильністю» або «рослина з умовною чоловічою стерильністю» зберігає жіночу фертильність і має здатність утворювати життєздатне насіння при запиленні функціонально активним або життєздатним пилком. Поняття «промоторна ділянка» у контексті даного опису стосується ділянки ДНК, яка містить принаймні один функціональний промотор і необов'язково декілька або всі зв'язані з ним розташовані проти ходу транскрипції регуляторні послідовності, включаючи енхансерні послідовності і/або зв'язані з ним і розташовані по ходу транскрипції послідовності, включаючи фрагмент або усю 5'-нетрансльовану ділянку гена, ендогенного для промотору. 82665 10 Поняття «ущільнена посадка» у контексті даного опису стосується методу посадки насіння або рослин у польових умовах, яке гарантує адекватне перехресне запилення рослин з чоловічою стерильністю або рослин з умовною чоловічою стерильністю за допомогою рослин з чоловічою фертильністю. Для цього можна або випадковим способом змішувати материнський і батьківський насінний матеріал у різних співвідношеннях (80/20; 90/10 і т.д.) перед посадкою, або посадку батьківських ліній, яка здійснюється на індивідуальному полі, одержуючи тим різні насінини. Коли потрібен окремий збір врожаю різних рослин, переважною є посадка в блоки, що чергуються, або ряди. Поняття «карбоксилестераза» у контексті даного опису стосується тільки ферментів, які строго за класифікацією ферментів належать до КФ 3.1.n. У способі, запропонованому у винаході, нефітотоксичну субстанцію можна застосовувати в суміші принаймні із ще однією субстанцією, яку вибирають із групи, яка включає амінокислоти, антидоти, гаметоциди, індуктори глутатіон-Sтрансферази, індуктори цитохрому Р450, добрива, гербіциди, нематоциди, синергісти, інсектициди, фунгіциди, гормони, регулятори росту рослин і інгібітори цитохрому Р450. Відповідно до переважних варіантів здійснення винаходу нефітотоксичну субстанцію можна застосовувати в суміші з пшеронілбутоксидом або малатіоном. Відповідно до конкретних варіантів здійснення винаходу нефітотоксичну субстанцію можна застосовувати в суміші з тією фітотоксичною субстанцією, попередником якої є нефітотоксична субстанція. Фермент, який застосовують у способі, запропонованому у винаході, може являти собою карбоксилестеразу, а нефітотоксична субстанція може являти собою складний ефір імазаметабензу або флампропу. Відповідно до найбільш переважного варіанта здійснення винаходу, який стосується конкретно пшениці, нефітотоксична субстанція являє собою прогербицід, вибраний із групи, яка включає імазаметабенз-метил, флампроп-метил або флампроп-ізопропіл. Вказаний фермент може являти собою оксидазу D-амінокислот, дегідрогеназу D-амінокислот або рацемазу D-амінокислот, а нефітотоксична субстанція може в цьому випадку являти собою Dамінокислоту і, зокрема, може являти собою Dенантіомер фосфінотрицину (ФФТ), D-енантіомер біалафосу або амінокислоту, вибрану з групи, яка включає D-аланін, D-серин, D-ізолейцин, Dметіонін, D-лейцин або D-валін. У контексті даного опису поняття «оксидаза D-амінокислот» означає будь-який фермент, який має здатність окислювати D-амінокислоту з утворенням 2-кетокислоти, і включає ферменти, які мають специфічність у відношенні аспартату, відомі як «Dаспартатоксидази». В іншому варіанті фермент, що застосовують у способі, запропонованому у винаході, можна вибирати з ряду, який включає 2-арилпропіоніл-СоАепімерази, альфа-метилацил-СоА-рацемази, тіоестерази й ацил-СоА-синтетази, а нефітотоксична субстанція в цьому випадку може являти собою Sенантіомер арилоксифеноксипропіонату або S 11 енантіомер арилоксифеноксипропіонатного складного ефіру. Химерні гени, які кодують ферменти, які мають здатність індивідуально або в сполученні один з одним взаємодіяти з нефітотоксичною субстанцією з утворенням фітотоксичної субстанції, можна вибирати з генів, що містять кодувальні послідовності ДНК, які кодують один або декілька наступних ферментів. (1) Карбоксилестерази, які мають здатність каталізувати реакцію гідролізу: імазаметабенз-метил → імазаметабенз + метанол (2) Карбоксилестерази, які мають здатність каталізувати наступну реакцію гідролізу: флампроп-метил → флампроп + метанол і/або: флампроп-ізопропіл → флампроп + изопропанол (3) Оксидази D-амінокислот, які мають здатність каталізувати окислення: D-амінокислота + O2 + H2O → NH3 + H2O2 + 2оксокислота і відповідно до конкретних варіантів здійснення винаходу, зокрема реакцію D-фосфінотрицин + O2 + H2O → NH3 + H2O2 + 2-оксо-4-метилфосфінобутират (4) Дегідрогенази D-амінокислот, які мають здатність каталізувати окислення: D-фосфінотрицин + акцептор електронів + H2O → NH3 + 2е-відновлений акцептор електронів + 2оксо-4-метилфосфінобутират. Дегідрогенази Dамінокислот можуть являти собою асоційовані з мембраною ферменти, які зв'язують електрони через акцептор електронів із зв'язаним з мембраною транспортним ланцюгом електронів, у якому кінцевим реципієнтом електронів може бути, наприклад, НАД+ або O2. (5) Рацемази амінокислот, які мають здатність каталізувати взаємне перетворення: D-фосфінотрицин L-фосфінотрицин (6) 2-арилпропіоніл-СоА-епімерази або альфаметилацил-СоА-рацемази, які мають здатність каталізувати одну або декілька наступних реакцій: S-флуазифоп-СоА → R-флуазифоп-СоА і/або S-хізалофоп-СоА → R-хізалофоп-СоА і/або S-пропахізафоп-СоА → R-пропахізафоп-СоА і/або S-галоксифоп-СоА → R-галоксифоп-СоА і/або S-феноксапроп-СоА → R-феноксапроп-СоА і/або S-дихлофоп-СоА → R-дихлофоп-СоА і/або S-цигалофоп-СоА → R-цигалофоп-СоА і/або S-клодинафоп-СоА → R-клодинафоп-СоА (7) Тіоестерази, які мають здатність каталізувати реакцію гідролізу: R-флуазифоп-СоА → R-флуазифоп + CoA і/або R-хізалофоп-СоА → R-хізалофоп + CoA і/або R-пропахізафоп-СоА → R-пропахізафоп + CoA і/або R-галоксифоп-СоА → R-галоксифоп + CoA і/або R-феноксапроп-СоА → R-феноксапроп + CoA і/або 82665 12 R-дихлофоп-СоА → R-дихлофоп + CoA і/або R-цигалофоп-СоА → R-цигалофоп + CoA і/або R-клодинафоп-СоА → R-клодинафоп + CoA (8) Ацил-СоА-синтетази, які мають здатність каталізувати реакцію: S-флуазифоп + CoA + АТФ → S-флуазифопСоА + PPi + АМФ і/або S-хізалофоп + CoA + АТФ → S-хізалофоп-СоА + PPi + АМФ і/або S-пропахізафоп + CoA + АТФ → Sпропахізафоп-СоА + PPi + АМФ і/або S-галоксифоп + CoA + АТФ → S-галоксифопСоА + PPi + АМФ і/або S-феноксапроп + CoA +АТФ → S-феноксапроп -CoA + PPi + АМФі/або S-дихлофоп + CoA + АТФ → S-дихлофоп-СоА + PPi + АМФ і/або S-цигалофоп + CoA + АТФ → S-цигалофопСоА + PPi + АМФ і/або S-клодинафоп + CoA + АТФ → S-клодинафопСоА + PPi + АМФ Фермент карбоксилестеразу можна вибирати з ферментів, які належать до типу карбоксилестераз В (КФ 3.1.1.1), насамперед, з ферментів, які одержують з Arthrobacter sp., Bacillus sp., печінки свиней, Saccharomyces sp. або Synechocystis sp. Переважно такі ферменти можна вибирати з ряду протеїнів, які мають реєстраційні номери Swissprot Q01470, Р37967, Q29550 (зріла пептидна послідовність, від 60 до 1703), Р40363 або SEQ ID: 2 (у даному описі), а послідовність ДНК, яка кодує карбоксилестеразу, можна вибирати з послідовностей ДНК, які мають реєстраційні номери EMBL М94965, BS06089, SSCE , Z34288 і SEQ ID: 1 (у даному описі). Додаткові карбоксилестерази і кодувальні послідовності ДНК, придатні для здійснення винаходу, можна вибирати з карбоксилестераз рослин і мікроорганізмів, для яких встановлено, що в мінімальному середовищі вони мають однакову чутливість до інгібування росту як імазаметабенз-метилом, так і імазаметабензом. Гени перспективних естераз з бібліотек ДНК таких організмів ідентифікують за допомогою придатних ДНК-зондів і виділяють субклонуванням. В іншому варіанті гени, які кодують відповідні ферменти, ідентифікують і відбирають шляхом експресії бібліотек у придатних організмах-хазяях, нечутливих до імазаметабенз-метилу, шляхом скринінгу, що дозволяєть виявляти перетворення в чутливий до імазаметабенз-метилу фенотип. Аналогічним способом, придатні й удосконалені гени і ферменти відбирають на основі експресії в Е.соlі і визначають або in vivo, або in vitro необхідну естеразну активність у відношенні складного ефіру флампропу або складного ефіру імазаметабензу за допомогою придатних методів, які дозволяють здійснювати виявлення імазапіру або флампропу шляхом інгібування ферментів-мішеней, таких як синтаза ацетоксигідроксикислоти, за допомогою РХВР/УФ і/або шляхом дериватизації і ГХ-МС. Оксидазу D-амінокислот (DAMOX) можна вибирати з ферментів, які продукуються такими видами, як Rhodosporidium sp. (Rhodotorula sp.), Trigonopsis sp., свині, Fusarium sp., Candida sp., Schizosasaccharomyces sp. і Verticillium sp., і можна 13 вибирати з протеїнів, які мають послідовності, що відповідають послідовностям з реєстраційними номерами Swissprot P80324, Q99042, P00371, P24552 або номерами SPTREMBL Q9HGY3 і Q9Y7N4. Послідовності ДНК, які кодують оксидази D-амінокислот, можна вибирати з послідовностей, які мають реєстраційні номери в EMBL А56901, RGU60066, Z50019, SSDA04, D00809, АВ042032, RCDAAOX, А81420 і SPCC1450. Оксидази Dамінокислот являють собою широко розповсюджені флавоферменти. Коли нефітотоксична субстанція являє собою D-фосфінотрицин або D-біалафос, або D-аспартат або D-гхітамат, те найбільш переважні оксидази Dамінокислот одержують з мутантних штамів Rhodotorula gracilis, або вона являє собою Dаспартатоксидазу. Такі мутанти незалежно від нефітотоксичної субстанції можуть нести одну або дві амінокислотні заміни в положеннях 213 і 238 у порівнянні з послідовністю дикого типу. Переважно в положенні 213 метіонін послідовності дикого типу замінений Arg, Lys, Ser, Cys, Asn або AIa, а в положенні 238 Туr у послідовності дикого типу замінений His, Ser, Gys, Asn або AIa. Однак фермент може нести заміни в додаткових положеннях або у положеннях, відмінних від вказаних у попередньому параграфі. Зокрема, Phe у положенні 58 послідовності дикого типу можна замінювати залишком, вибраним із групи, яка включає His, Ser, Lys, Ala, Arg і Asp, і переважно або His, або Se, або AIa. У додатковому або альтернативному варіанті Met у положенні 213 послідовності дикого типу можна замінювати залишком, вибраним із групи, яка включає His, Ser, Lys, Ala, Arg і Asp і переважно або Ser, або AIa. Ще в одному додатковому або альтернативному варіанті Туr у положенні 223 послідовності дикого типу можна замінювати залишком, вибраним з групи, яка включає His, Ser, Ala, Arg і Asp. Ще в одному додатковому або альтернативному варіанті Туг у положенні 238 послідовності дикого типу можна замінювати залишком, вибраним з групи, яка включає His, Ser, Lys, Ala, Arg і Asp. Найбільш переважною мутантною формою ферменту є форма, яка несе принаймні дві вказані вище мутації. Перший варіант такого мутанта з двома замінами несе His у положенні 58 (замість Phe послідовності дикого типу) і Ser у положенні 213 (замість Met). Другий варіант такого мутанта з двома замінами несе Ser у положенні 58 (замість Phe у послідовності дикого типу) і Arg у положенні 213 (замість Met у послідовності дикого типу). Коли нефітотоксична субстанція являє собою D-амінокислоту, відмінну від D-фосфінотрицину або D-біалафосу, то фермент являє собою оксидазу D-амінокислот. D-амінокислота переважно являє собою неендогенний рослинний метаболіт, і вона повинна мати такі характеристики, як рухливість у флоемі, метаболічна стабільність у рослині (переважне значення t ½ у рослині становить більше ~ 1 тижня) і бути ефективним субстратом для оксидази. Окислення D-амінокислоти ферментом супроводжується відновленням кисню до фітотоксичних аніонів пероксиду і/або супероксиду. 82665 14 У переважному варіанті здійснення винаходу оксидазу спрямовано переносять до субклітинної органели, відмінної від пероксисоми. Це здійснюють, наприклад, шляхом модифікації гена, яка полягає в делеції, модифікації трьох С-кінцевих амінокислот (наприклад, SKL у випадку оксидази Dамінокислоти Rhodotorula gracilis) і/або в додаванні послідовності хлоропластного або мітохондріального транзитного пептиду до N-кінця. Інші прийнятні оксидази D-амінокислот можна одержувати, використовуючи переважно як джерело гриби, шляхом мутації і за допомогою методів відбору, відомих фахівцю в даній галузі і представлених у даному описі. Для одержання інших оксидаз D-амінокислот (або, що рівнозначно, фосфінотрицинрацемази) і кодувальних послідовностей ДНК, які можна застосовувати відповідно до винаходу, використовують організми, необов'язково піддаючи їх мутагенезу, для яких встановлено, що їх ріст на середовищах з недостатністю N в умовах, коли відбувається індукція оксидази D-амінокислот (або фосфінотрицинрацемази) (наприклад, ріст на середовищі, що містить D-аланін) вибірно інгібується в присутності D-фосфінотрицину. Потім гени оксидази D-амінокислот, які можна застосовувати відповідно до винаходу, одержують, наприклад, за допомогою зондування бібліотек генів таких організмів з використанням придатних вироджених ДНК-зондів (наприклад, на основі відомих даних про консенсусні послідовності оксидаз Dамінокислот, таких як PROSITE, PS00677) і субклонуванням. В альтернативному варіанті гени, які кодують придатні ферменти, одержують шляхом скринінгу бібліотек експресії генів у прийнятній клітині-хазяїні, такій як Е.соlі або дріжджі (придатні штами хазяїнів не мають ендогенної оксидазної або дегідрогеназної активності у відношенні Dфосфінотрицину), для трансформації з одержанням фенотипу, який має підвищену чутливість до інгібування росту D-фосфінотрицином на мінімальному середовищі. Основою для застосування такого методу є здатність трансформованих клонів Е.соlі продукувати L-ФФТ із D-ФФТ за допомогою спільної дії ендогенних L-трансамінази і гетерологічної оксидази. В альтернативному варіанті прийнятні й удосконалені гени вибирають на основі аналізу in vitro здатності експресованого ферменту здійснювати необхідне окислення Dфосфінотрицину. Відомо багато методів безпосереднього визначення активності оксидаз Dамінокислот на основі виявлення пероксиду [Enzyme Microb. Technol., 27(8), 2000, стор.605611], виснаження кисню з використанням кисневого електрода або на основі безпосереднього виявлення аміаку. Відповідно до варіанта здійснення винаходу переважно отриманий із грибів ген DAMOX клонують у біфункціональному векторі під функціональним контролем промотору (наприклад, промотору GAL), здатного забезпечувати експресію в організмі-хазяїні, у якому потрібно здійснювати відбір (переважно в клітинах дріжджів). Потім цей ген піддають мутагенезу, наприклад, за допомогою ПЛР із додаванням Мn2+; здійснюють реплікацію 15 плазмідної ДНК у штамі з виродженими процесами репарації/зборки ДНК, такому як штам Е.соlі XL1 red; або здійснюють реплікацію плазмідної ДНК у штамі-хазяїні, підданому мутагенезу з використанням крім хімічного мутагену, наприклад, рентгенівських променів, УФ-опромінення і трансформують організм-хазяїн (переважно дріжджі). Потрібну ДНК, яка кодує фермент DAMOX, який має потрібну властивість підвищеної здатності окислювати D-ФФТ, вибирають (після необов'язкової початкової стадії відбору трансформантів за допомогою селектованих маркерів, що присутні у біфункціональному векторі, які дозволяють, наприклад, здійснювати відбір на основі відновлення профототрофії або росту в присутності гігроміцину і т.д.), наприклад, за допомогою: а) відбору трансформованих клітин, які мають здатність утилізувати амінокислоти, хімічно подібні до D-фосфінотрицину, що використовують як єдине джерело азоту. Наприклад, відбирають трансформовані колонії дріжджів, які можуть рости в присутності аналогів D-ФФТ (і його ефірів), у яких залишок фосфінової кислоти замінений карбоксилатом (тобто D-глутаматом), сульфонатом, фосфонатом, сульфоном або сульфоксидом (або їх ефірами), як єдині джерела N, наприклад, таких аналогів б) відбору трансформованих клітин, які мають здатність утилізувати сам D-ФФТ як єдине джерело N. Для здійснення такого відбору клітини-хазяїн необхідно трансформувати геном, який має здатність усувати інгібуючу дію L-фосфінотрицину на глутаматсинтетазу. Наприклад, біфункціональний вектор може містити також ген, який кодує фермент, такий як фосфінотрицинуцетилтрансфераза (PAT), що інактивує L-ФФТ. Цикли мутагенезу і відбору можна повторювати. Оксидази D-амінокислот можна додатково клонувати, експресувати, частково очищати й одержувати кінетичні характеристики з метою ідентифікації генів і DAMOX з найбільш переважними властивостями (наприклад, такими як стабільність ферменту, високе значення kcat/ Km при окисленні D-ФФТ, мінімальне окислення ендогенних субстратів рослин, оптимальні значення рН і т.д.). Коли нефітотоксична субстанція являє собою D-фосфінотрицин (ФФТ), то її можна одержувати із суміші D- і L-ФФТ. Наприклад, DL-ФФТ можна до 82665 16 давати в культуральне середовище (переважно мінімальне) для клітин Е.соlі (необов'язково мутанта arg E з метою зниження до мінімуму фонового рівня активності N-ацетил-ФФТ-деацетилази), трансформувати і індукувати високий рівень експресії гена PAT (який кодує фермент, який забезпечує перенесення ацетильної групи з ацетил-СоА на L-ФФТ). Після витримування протягом часу, необхідного для практично повного Nацетилування L-енантіомеру (що підтверджують, наприклад, здійснюючи моніторинг перетворення за допомогою 31Р-ЯМР), D-ФФТ виділяють і очищають з безклітинного середовища за допомогою послідовних стадій, таких, наприклад, як екстракція розчинником при високих і низьких значеннях рН, аніоно- і катіонообмінна хроматографія, вибірна кристалізація з використанням хіральних катіонів, таких як хінхоцин, або інші процедури, відомі в даній галузі, такі як екстракція в системі рідина/рідина з використанням двох водних фаз, які незмішуються, як системи фаз (порівн. методи, описані в USP 5153355). Як правило, кінцевою стадією є катіонообмінна хроматографія, за допомогою якої D-ФФТ виділяють у вигляді амонієвої солі. В альтернативному варіанті D-ФФТ можна одержувати ферментативним методом, який полягає в тому, що DL-ФФТ + 2 кетоглутарат перетворюють спочатку в суміш D-ФФТ, 2-оксо-ФФТ (і його декарбоксильовані продукти) і ГАМК (гаммааміномасляна кислота) шляхом спільної дії (І) Lамінотрансферази (наприклад, з E. соlї) і (II) глутаматдекарбоксилази. Потрібний чистий D-ФФТ виділяють з реакційної суміші за допомогою методів, відомих у даній галузі й описаних вище. D-ФФТ можна одержувати також за допомогою ферментативного методу, який полягає в тому, що DL-ФФТ + 2 кетоглутарат + НАД перетворюють спочатку в суміш D-ФФТ, 2-оксо-ФФТ (і його декарбоксильовані продукти), НАД•Н і аміак шляхом спільної дії (І) L-амінотрансферази і (II) глутаматдегідрогенази. Потрібний D-ФФТ очищають з реакційної суміші. Наступний метод одержання D-ФФТ, полягає в тому, що DL-ФФТ обробляють оксидазою Lамінокислот, у результаті чого амінокислота, яка залишилася, являє собою тільки потрібну Dформу. Потім D-ФФТ очищають з реакційної суміші. Ще один метод полягає в тому, що (І) перетворюють D-ФФТ у N-ацетил-DL-ФФТ (використовуючи оцтовий ангідрид або інші ацетилювальні реагенти і методи, добре відомі в даній галузі) і (II) обробляють N-ацетил-DL-ФФТ D-аміноацилазою, у результаті чого відбувається деацетилювання тільки N-ацетил-D-ФФТ. Утворений D-ФФТ очищають з реакційної суміші. Наприклад, D-ФФТ виділяють з N-ацетил-L-ФФТ, зв'язуючи з аніонообмінною смолою типу Dowex і здійснюючи елюювання 40мМ мурашиною кислотою. При відповідних умовах завантаження ця кислота елюює D-ФФТ, залишаючи N-ацетил-L-ФФТ зв'язаним із колонкою. Наступний метод полягає в тому, що обробляють DL-ФФТ L-аміноацилазою і ацилювальним 17 агентом у неводному розчиннику, при цьому в неацетильованій формі залишається лише потрібний D-ФФТ. І ще один метод одержання чистого D-ФФТ полягає в тому, що здійснюють енантіоселективну кристалізацію з DL-ФФТ за допомогою хіральної основи, такої як хінхоцин, і додають затравочний кристал хіральної основи з чистим D-ФФТ. Наступний метод одержання чистого D-ФФТ із DL-ФФТ являє собою безпосередню хіральну хроматографію з використанням колонки з хіральною основою. Докладний метод одержання чистого D-ФФТ поданий в одному з наведених нижче прикладів. 2-Арилпропіоніл-СоА-епімеразу або альфаметилацил-СоА-рацемазу (КФ 5.1.99.4) можна вибирати з ферментів, які продукуються щурячою печінкою, Acremomium sp. або Neurospora crassa. 2-Арилпропіоніл-СоА-епімеразу або альфаметилацил-СоА-рацемазу (КФ 5.1.99.4) можна вибирати з протеїнів, які мають послідовності, що відповідають AAR49827 у базі даних GENESEQP Derwent, P70473 у Swissprot або SEQ ID: 4 (у даному описі) і фермент 2-арилпропіоніл-СоАепімераза або альфа-метилацил-СоА-рацемаза (КФ 5.1.99.4) може кодуватися кодувальною послідовністю ДНК, вибраною з послідовностей, які мають реєстраційний номер AAQ44447 у базі даних GENESEQN Derwent, реєстраційні номери RN2ARYLCO і RNU89905 у EMBL і SEQ ID: 3 (у даному описі). Ацил-СоА-синтетази ((жирна кислота)-СоАлігази), які можна застосовувати відповідно до винаходу, можуть являти собою (жирна кислота з довгим ланцюгом)-СоА-лігази (КФ 6.2.1.3), вибрані з ферментів, які продукуються Brassica napus, щурячою печінкою, Saccharomyces sp. або Arabidopsis. Ці синтетази можна вибирати з протеїнів, які мають послідовності, що відповідають послідовностям Q96338 у базі даних SPTREMBL, Swissprot P18163, Swissprot P39518, SPTREMBL Q9C5U7 або SPTREMBL Q9TOAO, а послідовності ДНК, які кодують ацил-СоА-синтетази можна вибирати з послідовностей, що мають реєстраційні номери EMBL BNAMPBP2, J05439, Х77783 і АВ030317. Ферменти ацил-СоА-синтетази, 2арилпропіоніл-СоА-епімерази і тіоестерази і/або послідовності ДНК, які кодують їх, які можна застосовувати відповідно до способу, запропонованому у винаході, можна вибирати на основі здатності організму-джерела перетворювати Sарилоксифеноксипропіонати в Rарилоксифеноксипропіонати і/або перетворювати S-ібупрофен у R-ібупрофен. Такі організми можна одержувати, наприклад, зі зразків ґрунту, і за допомогою таких добре відомих методів аналізу і виявлення, як хіральні інверсії в культурах клітин і мікробіологічних бульйонів [порівн. MenzelSoglowek і ін. J. Chromatogr., 532, стор.295-303, 1990; Bewick, Pestic. Sci., 17, стор.349-356, 1986]. Таким чином, ферменти ацил-СоА-синтетази, 2арилпропіоніл-СоА-епімерази і/або тіоестерази і необов'язково послідовності ДНК, які кодують їх, можна одержувати з таких джерел, як Arthrobacter 82665 18 simplex NCIB 8929; Arthrobacter roseoparaffineus ATCC 15584; Bacillus subtilis ATCC 15841; Botrytis cinerea CM1 124882; Brevibacterium butanicum ATCC 15841; Brevibacterium healii ATCC 15527; Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 21004; Brevibacterium paraffinolyticun ATCC 21195; Corynebacterium fascians; Corynebacterium fijikoense ATCC 21496; Methanomonas methanolica NRRL B-5758; Micrococcus roseus; Mycobacterium aurum NCTC 1043; Mycobacterium petroteophilum ATCC 21497; Mycobacterium phlei NCTC 10266; Mycobacterium smegmatis ATCC 19420; Nocardia opaca NCIB 9409; Nocardiopsis asteroids ATCC 21943; Psuedomonas dimimuta NCIB 9393; Psuedomonas lemoignei NCIB 9947; Rhodococcus rhodocrous ATCC 13808; Rhodococcus rhodocrous ATCC 21197; Rhodococcus sp. ATCC 21499; і Rhodococcus sp. ATCC 31337]. За допомогою методів, добре відомих у даній галузі, гени-кандидати й удосконалені гени, які містять кодувальні послідовності ДНК, можна легко клонувати і відбирати з придатних бібліотек генів цих організмів за допомогою відповідних вироджених зондів на основі відомих послідовностей інших ацил- СоА-синтетаз, 2-арилпропіоніл-СоА-епімераз і тіоестераз. Інші і додаткові прийнятні гени вибирають шляхом одержання експресійної бібліотеки в придатному хазяїні і скринінгу бібліотеки або за допомогою аналізів in vitro, або аналізів культури цілого організму на здатність клонів здійснювати повну хіральну конверсію або в іншому варіанті на здатність індивідуально каталізувати кожну часткову реакцію, для здійснення якої необхідна присутність ацил-СоАсинтетази (із застосуванням мікросомальної фракції), 2-арилпропіоніл-СоА-епімерази або тіоестерази. Придатні методи аналізів цих видів активності in vitro аналогічні до методів, описаних у літературі для ібупрофену [див., наприклад, Shieh і Chen, JBC, 268, 1993, стор.3487-3493.] Фермент, який можна застосовувати відповідно до способу, запропонованому в даному винаході, може являти собою фосфінотрицинрацемазу, кодувальну послідовність ДНК якої одержують шляхом мутагенезу і/або рекомбінаторної перестановки генів глутаматрацемази з наступними повторюваними циклами відбору і додаткової оцінки зростаючих рівнів активності фосфінотрицинрацемази. Глутаматрацемази широко поширені в бактеріях, і їх поділяють на два типи, таких як ферменти, які залежать від піридокалфосфату як кофактора, і не залежні від кофактора, які містять також два активних цистеїнові сайти. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу послідовності, які кодують глутаматрацемази Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis, Lactobacillus brevis, Staphylococcus hemolyticus і Bacillus sphaericus, вибирають на основі мутації і/або рекомбінаторної перестановки представників сімейства. У конкретному варіанті здійснення винаходу гени вибирають на основі перестановки кодованих протеїнів, які мають послідовності, що відповідають послідовностям О82826, P94556 і 031332 (Swissprot). Гени, які можна застосовувати для здійснення даного винаходу, вибирають шляхом скринінгу експресійних бібліотек у придатній 19 клітині-хазяїні, такій як Е.соlі або дріжджі, у колоніях яких виявлена підвищена чутливість до інгібування росту D-фосфінотрицином у мінімальному середовищі. L-ФФТ інгібує глутамінсинтетазу, у той час як D-ФФТ не виявляє такого впливу. Мутантний клон, який несе глутаматрацемазу, яка перетворює D-ФФТ у L-ФФТ, не може рости на мінімальному середовищі без додавання глутаміну. У прийнятних штамах-хазяях активності ендогенних оксидаз D-амінокислот або дегідрогеназ Dамінокислот або не виявляються, або ці ферменти не використовують D-фосфінотрицин як субстрат. В іншому варіанті придатні гени можна вибирати на основі аналізів in vitro або in vivo здатності кодованого ферменту здійснювати взаємне перетворення D- і L-фосфінотрицину. Основою таких прийнятних аналізів може бути обмін альфапротона, застосування біологічних аналізів для виявлення утворення L-фосфінотрицину з Dфосфінотрицину або, наприклад, виявлення конверсії L-фосфінотрицину в D-фосфінотрицин, у присутності прийнятної оксидази D-амінокислот. Послідовності ДНК, які кодують ферменти, що застосовуються згідно із даним винаходом, необов'язково можна додатково піддавати мутації і відбирати для одержання додаткових придатних ферментів, які мають поліпшені властивості. Таким чином, поліпшують цілий ряд характеристик ферментів, включаючи каталітичну активність (kcat/Km) у відношенні необхідного ' субстрату, теплостійкість і оптимальне значення рН. Методи одержання, скринінгу і відбору таких варіантів з поліпшеними характеристиками добре відомі. Наприклад, придатні варіанти послідовностей ДНК одержують за допомогою мутагенезу (наприклад, трансформуючи ДНК бактеріальні або дріжджові штами, у яких реплікація ДНК має тенденцію до порушення, такі як штам Е.соlі XL1 red, за допомогою УФ, хімічного або сайнаправленого ПЛРмутагенезу з використанням олігонуклеотидів). Зокрема, такі гени одержують за допомогою будьякого іншого процесу перестановки ДНК або «зв'язаної зі статтю ПЛР», наприклад, відповідно до методів, які узагальнені, [див. WO 0061740, стор.28-41], зміст якого повністю включений в даний опис як посилання. Для відбору таких поліпшених генів можна застосовувати різноманітні методи. Гени можна експресувати у прийнятній клітині-хазяїні, такій як Е.соlі або дріжджі, і відбирати з метою одержання поліпшених характеристик за допомогою відповідних методів, наприклад, викладених у даному описі. Химерні гени, які кодують ферменти, призначені для застосування у винаході, які мають здатність індивідуально або в сполученні один з одним перетворювати нефітотоксичну субстанцію у фітотоксичну, усі можуть містити послідовність ДНК, яка кодує один із вказаних ферментів, функціонально зв'язану з 5'- промоторною ділянкою, яка переважно забезпечує експресію або в чоловічій, або в жіночій репродуктивних системах. Вказана специфічність експресії гарантує, що вплив експресованого(их) фермент(ів) буде виявлятися тільки в тій ділянці тканини і клітин, яка необхідна для утворення життєздатного насінного матеріалу 82665 20 або життєздатного пилку, і не буде виявляти ніякого іншого шкідливого впливу на рослину крім впливу на фертильність, у присутності прийнятної нефітотоксичної субстанції, зокрема прогербиціду. Крім промоторних ділянок химерні гени, запропоновані в даному винаході, містять також 3'термінуючу послідовність, яка бере участь у процесі транскрипції. Ця послідовність забезпечує термінацію транскрипції і правильне поліаденілування мРНК. Багато таких 3'-термінуючих послідовностей, які приймають участь в процесі транскрипції, відомі в даній галузі, і їх можна застосовувати в химерних генах, запропонованих у даному винаході. У конкретних варіантах здійснення винаходу 3'-термінуючу послідовність, яка бере участь в процесі транскрипції, вибирають з термінатора CMV 35S, термінатора tml, термінатора нопілінсинтази (nos) і термінатора rbcS E0 гороху. 5' Промоторні ділянки, які можна застосовувати в конкретних варіантах химерних генів, включають 5'-ділянки генів, які переважно експресуються в жіночих квіткових тканинах. У конкретних варіантах здійснення винаходу 5'-промоторну ділянку вибирають із групи, яка включає промотор stig 1 тютюну [Goldman і ін. EMBO J., 13, стор. 2976-2984, 1994], модифікований промотор S13 [Dzelkalns і ін. Plant Cell, 5, с. 8555, 1993], промотор AGL5 [Savidge і ін., Plant Cell, 7, стор. 721-733, 1995] і промоторну 5'-ділянку специфічного для плодолистика кукурудзи гена ZAG2 [Thiessen і ін., Gene, 156, стор. 155-166, 1995]. Необов'язково додаткові прийнятні промоторні ділянки одержують з ділянок, розташованих проти ходу транскрипції кодувальних послідовностей геномної ДНК, які відповідають послідовностям кДНК, для яких у даній галузі відомо, що вони переважно експресуються в структурах жіночої репродуктивної системи. У конкретних варіантах здійснення винаходу такі кДНК-зонди вибирають із групи, яка включає гени Fbp7 і Fbp11 Arabidopsis [Angenent і ін., Plant Cell, 7, стор. 1569-1582, 1995] і специфічних для представників орхідних кДНК О40, О108, O39, O126 і O141 [Nadeau і ін., Plant Cell, 8, стор. 213239, 1996]. У конкретних варіантах здійснення винаходу 5'-промоторні ділянки, які містять геномну ДНК, зв'язану з переважною експресією в структурах жіночої репродуктивної системи, вибирають з ділянок ДНК, які включають клон геномної ДНК pSH64, що має реєстраційний NRRL В-21920, геномний клон рСІВ10302, який гібридизується з кДНК Р26-А4, що має реєстраційний номер NRRL В-21655, і клон геномної ДНК Х2-1, який гібридизується з клоном кДНК P 19-QA, що має реєстраційний номер NRRL В-21919. Відповідно до інших конкретних варіантів здійснення винаходу вказані промоторні ділянки містять нуклеотид 1-1390 SEQ ID No. 11, SEQ ID No.2 і нуклеотиди 1-1093 SEQ ID No. 4, описані в WO 98/39462. Відповідно до альтернативних варіантів здійснення винаходу інші 5'промоторні ділянки, які можна застосовувати в химерних генах, запропонованих у винаході, виділяють і клонують за допомогою методів, добре відомих фахівцю в даній галузі. Наприклад, нові транскрипти, які екс пресуються в структурах жіночої репродуктивної системи, ідентифікують, виді 21 ляючи PHK із тканин, таких як шовк кукурудзи або маточки пшениці, і потім здійснюють диференціальний скринінг за допомогою таких методик, як диференціальний прояв, відбір за допомогою ПЛР вилучених фрагментів кДНК і конструювання бібліотеки вилучених кДНК. Такі клони кДНК переважно експресуються в тканинах жіночої репродуктивної системи і не експресуються в інших частинах рослини, таких як лист, корінь або волоть. Тканинноспецифічність експресії необов'язково додатково підтверджують методом Нозернблотингу. Клони кДНК застосовують як зонди для скринінгу геномної бібліотеки. 5'-Промоторні ділянки і необов'язково З'-нетрансльовані ділянки ДНК, зв'язані з тканинноспецифічною експресією, одержують із клонів геномної ДНК і застосовують для конструювання химерних генів, призначених для експресії переважно в структурах жіночої репродуктивної системи. 5'- Промоторні ділянки, які можна застосовувати відповідно до конкретних варіантів здійснення винаходу в химерних генах, включають 5'-ділянки генів, які переважно експресуються в чоловічих квіткових тканинах. Вони включають промоторні ділянки, які забезпечують експресію в пилку, тапетумі або інших структурах пиляка. Відповідно до конкретних варіантів здійснення винаходу ці 5'промоторні ділянки вибирають із групи, яка включає промотор LAT52 [Twell і ін., Dev., 109, стор. 705-713, 1989], промотор томатів А127 [Dotson і ін., Plant J., / 10, стор. 383- 392, 1996], промотор Zmg кукурудзи [Hamilton і ін., Sex. Plant Reprod. 2, стор. 208-212, 1989], промотор CDPK кукурудзи [Guerro і ін., Моl. Gen. Genet., 224, стор. 161-168, 1990] і специфічні для пиляка промотори ant32 і ant43D, описані в USP 5477002, зміст якого повністю включений як посилання. Відповідно до інших конкретних варіантів здійснення винаходу 5'промоторну ділянку вибирають із групи, яка включає специфічний для тапетуму промотор СА55 з кукурудзи [позначений як «Рса55» у WO 92/13956], специфічний для тапетуму промотор E1 з рису (описаний у USP 5639948), специфічний для тапетуму промотор Т72 з рису (описаний у USP 5639948), специфічний для пиляка промотор RA8 з рису [EMBL/реєстраційний номер у Genbank AF042275; Jean Js і ін., PMB, 39, стор. 35-44, 1999], специфічний для пиляка промотор Тар1 [Spena і ін., Theor Appl Genet 84, стор. 520-527, 1992] і специфічний для пилку промотор ZmC5 з кукурудзи (EMBL/реєстраційний номер у Genbank Y13285; Wakeley і ін., PMB, 37, стор. 187-192, 1998). Необов'язково інші прийнятні промоторні ділянки одержують з ділянок, розташованих проти ходу транскрипції кодувальних послідовностей геномної ДНК, які відповідають послідовностям кДНК, для яких у даній галузі відомо, що вони переважно експресуються в структурах чоловічої репродуктивної системи. Відповідно до конкретних варіантів здійснення винаходу такі кДНК-зонди вибирають із групи, яка включає ген специфічного для пилкової трубки орхідних цитохрому Р450 [Nadeau і ін., Plant Рослина Cell, 8, 1996, стор. 213-239], ген Bcp1 Arabidopsis [Xu і ін., P.N.A.S., 92, 1995, стор. 2106-2110] і специфічний для чоловічих квіток ген 82665 22 MFS14 кукурудзи [Wright S. Y. і ін., Plant J 3, 1993, стор. 41-49]. Відповідно до наступних варіантів здійснення винаходу додаткові 5'-промоторні ділянки, які можна застосовувати в химерних генах, запропонованих у винаході, виділяють і клонують за допомогою методів, відомих фахівцю в даній галузі. Наприклад, нові транскрипти, які експресуються в структурах чоловічої репродуктивної системи, ідентифікують, виділяючи PHK із тканин, таких як волоті, пилкові трубки, пиляк або тапетум, і потім здійснюють диференціальний скринінг за допомогою таких методик як диференціальний прояв, відбір за допомогою ПЛР вилучених фрагментів кДНК і конструювання бібліотеки вилучених кДНК. Виділяють клони кДНК, що переважно експресуються в тканинах чоловічої репродуктивної системи і не експресуються в інших частинах рослини, таких як листи, корені і приймочка. Тканинноспецифічність експресії необов'язково додатково підтверджують методом Нозерн-блотингу. Клони кДНК застосовують як зонди для скринінгу геномної бібліотеки. 5'-Промоторні ділянки і 3'нетрансльовані ділянки ДНК, зв'язані з тканинноспецифічною експресією, одержують із клонів геномної ДНК і застосовують для конструювання химерних генів, призначених для експресії переважно в структурах чоловічої репродуктивної системи. Додаткові промоторні ділянки, які можна застосовувати в химерних генах, запропонованих у винаході, включають ділянки, розташовані проти ходу транскрипції гена Osmads 13 рису, гена OSG пиляка рису і гена YY2 рису. Як правило, як найбільш переважні вибирають промоторні ділянки, які забезпечують високий рівень ранньої, постійної і переважної експресії в структурах чоловічої або жіночої репродуктивної системи. Промоторні ділянки можуть також містити їх химерні комбінації один з одним і з іншими енхансерними ділянками. Химерні гени необов'язково можуть містити ділянку, яка безпосередньо передує послідовності ДНК, яка кодує фермент, який бере участь у перетворенні нефітотоксичної субстанції у фітотоксин, яка кодує пептидну послідовність, що забезпечує направлене перенесення ферменту до субклітинних органел, таких як хлоропласт, пероксисома (у тому випадку, коли фітотоксин не являє собою аніон пероксиду або супероксиду) або мітохондрії, і цей протеїн, який забезпечує направлене перенесення, може мати послідовність (І) транзитного пептиду або хлоропласта (II) комплексу транзитний пептид хлоропласт-N-кінцева ділянка протеїну хлоропласта - транзитний пептид хлоропласта. Це може виявитися особливо сприятливим у випадку, коли, наприклад, послідовність ДНК кодує дегідрогеназу D-амінокислот, для якої можна очікувати, що вона найбільш ефективно функціонує в такому компартменті, як мітохондрія або хлоропласт, які несуть мембранний ланцюг транспорту електронів, або у випадку, коли, наприклад, послідовність ДНК кодує фермент, який каталізує тільки частину стадії загальної необхідної трансформації і для здійснення повної реакції необхідна комбінація з метаболітами, які знаходять у компартментах, й ендогенними активними факторами. Зокрема, для здійснення направленого перенесення в мітохонд 23 рію вказана ділянка ДНК, яка безпосередньо передує послідовності ДНК, яка кодує фермент, кодує послідовність мітохондріального транзитного пептиду. Відповідно до конкретних варіантів здійснення винаходу послідовність транзитного пептиду можна вибирати з групи, яка включає ендогенні послідовності транзитного пептиду бетасубодиниці мітохондріальної АТФ-синтази Nicotinia plumbaginifolia, специфічної для мітохондрії НАДФзалежної ізоцитратдегідрогенази, що зв'язується з НАДФ•Н-субодиниці комплексу I дихального ланцюга і мітохондріальної триптофаніл-тРНКсинтетази дріжджів. (WO 6121513). Полінуклеотиди, призначені для застосування в способі, запропонованому у винаході, можуть містити один або декілька химерних генів, які кодують ферменти, які каталізують реакції, які беруть участь в утворенні фітотоксинів з нефітотоксичних субстанцій. Необов'язково такі полінуклеотиди містять додаткові гени і химерні гени, такі як химерний маркерний ген. Згідно із даним винаходом химерний маркерний ген містить маркерну ДНК, експресія якої контролюється промотором, який має активністю в рослинних клітинах. Маркерна ДНК кодує PHK, протеїн або поліпептид, які при експресії в рослині, тканині рослини або клітині рослини дозволяють відрізнити вказаний матеріал рослини від матеріалу рослини, у якому не відбувається експресія маркерної ДНК. Прикладами маркерних генів є гени, які забезпечують специфічний колір клітин, такі як ген A1 [Meyer і ін., Nature 330, с.667, 1987], або гени, які надають клітинам рослин стійкість до летальної для чутливих клітин селекції антибіотиками (наприклад, ген аас(б'), який кодує стійкість до гентамицину, описаний у WO 94/01560, або гени гігроміцин-фосфотрансферази, які надають стійкість до гігроміцину), або гени, які надають стійкість до гербіцидів, таких як гліфосат (наприклад, гени EPSPS, описані в USP 5510471 або WO 00/66748), фенмедіфам (наприклад, ген pmph, описаний у USP 5347047; USP 5543306), бромоксиніл (наприклад, гени, описані в USP 4810648), сульфонілсечовини (наприклад, гени, описані в EP 0360750), далапон (гени, описані в WO 99/ 48023), ціанамід (гени, описані в WO 98/48023; WO 98/56238), і гени, які кодують стійкість до інгібіторів глутамінсинтетази, такі як L-фосфінотрицин (наприклад, гени N-ацетилтрансферази, описані в EP 0242246, EP 0242246 і EP 0257542). Переважний полінуклеотид, запропонований у даному винаході, містить як маркерний ген ген, який зумовлює стійкість до гербіциду, при цьому гербіцид являє собою гербіцид, який можна застосовувати для боротьби з бур'янами в посівах культурної рослини, і, крім того, експресія гена, який зумовлює стійкість до гербіциду, є достатньою для забезпечення вираженої толерантності до застосовуваних в польових умовах норм витрати цього гербіциду. Згідно із ще одним переважним варіантом здійснення винаходу гербіцид являє собою гліфосат, а ген, який зумовлює стійкість до гербіциду, являє собою ген EPSPсинтази. Однак маркерний ген може являти собою ген, призначений для позитивного відбору, коли маркерний ген кодує фермент, який у конкретному 82665 24 середовищі надає трансформованим рослинним клітинам позитивну метаболічну перевагу. У USP 5767378 описаний цілий ряд придатних систем і генів для позитивного відбору. Коли полінуклеотид, запропонований у даному винаході, містить ген, який зумовлює стійкість до гербіциду, то гербіцид наносять екзогенно на ущільнено посаджені культурні рослини, щільність посадки яких є достатньою для того, щоб елімінувати одержання негібридного насінного матеріалу нетрансгенних самозапильних батьківських рослин. Відповідно до переважного варіанта здійснення винаходу гербіцид являє собою гліфосат або його агрономіно прийнятну сіль, і маркерний ген, який зумовлює стійкість до гербіциду, вибирають з генів, які надають стійкість до гліфосату, що описані в WO 00/66748. При наявності маркерного гена також може виявитися необхідним використовувати певні методи для його видалення. Це є необхідним, наприклад, у випадку, коли існує необхідність у створенні комбінованих ознак. Також може виявитися бажаним видаляти маркерні гени, які зумовлюють стійкість до , гербіцидів, які можуть впливати на залежний від прогербиціду механізм умовної фертильності, запропонований у даному винаході. Наприклад, може виявитися бажаним видаляти маркерний ген, який зумовлює стійкість до гербіциду, такий як ген фосфінотрицин-Nацетилтрансферази (PAT), з полінуклеотиду, який містить також химерний ген, що застосовують для надання умовної чоловічої або жіночої стерильності, що залежить від екзогенного внесення прогербиціду D-фосфінотрицину. Присутність гена PAT потенційно може впливати на успішне одержання умовної стерильності шляхом інактивації фітотоксину L-фосфінотрицину. Таким чином, полінуклеотиди, які містять маркерні гени, необов'язково можуть нести специфічні сайти, які розпізнаються специфічними рекомбіназами, розташовані у фланкуючих маркерний ген положеннях, що дозволяють «вилучати» їх з послідовності. Схрещування рослини, яка несе фланкований у такий спосіб маркерний ген, з рослиною, яка несе ген, який кодує специфічну рекомбіназу, дозволяє одержувати потомство рослин, з якого маркер специфічно вилучений. Приклади прийнятних таких сайтспецифічних гомологів рекомбінантних систем є система F1p/frt [Lyznik і ін., Nucleic Acids Res. 24, стор. 3784-3789,1996] і система Cre/Lox [Bayley C.C. і ін., PMB, 18, стор.353-361, 1992]. Полінуклеотиди, які застосовують у способі, запропонованому в даному винаході, необов'язково можуть містити один або декілька приймаючих участь у трансляції енхансерів, які локалізовані в 5'-нетрансльованих ділянках послідовностей, які кодують протеїн. Фахівець у даній галузі може ідентифікувати такі прийнятні енхансери, які беруть участь у трансляції, - такі як послідовності Omega і Omega-prim, які одержують з TMV (вірус мозаїки тютюну), послідовності, які одержують з вірусу тютюнового гравірування, і йому відомі шляхи інтродукції таких енхансерів, які беруть участь у трансляції, у полінуклеотид для того, щоб одержувати необхідний результат, тобто підвищений рі 25 вень експресії протеїну. Додаткові приклади включають енхансери, що беруть участь в трансляції, які одержують з вірусу хлорозної плямистості кукурудзи і вірусу мозаїки люцерни [GaIlie і ін., Nucl. Acids Res., 15, стор.8693-8711, 1987; Skuzeski і ін., PMB., 15, стор.65-79, 1990]. Для додаткової оптимізації експресії протеїнів, кодованих химерними генами і химерними маркерними генами, ці полінуклеотиди можуть додатково містити такі елементи, як енхансери, які сприяють приєднанню певних ділянок (SARS або MARS) і інтрони. Установлено, що різні інтронні послідовності, такі як інтрон 1 гена adh1 кукурудзи, підсилюють експресію при включенні в 5'-нетрансльовану ділянку генів, і їх необов'язково застосовують у химерних генах, запропонованих у даному винаході. Рослини, яка підлягають трансформації відповідно до винаходу, для того, щоб вони набували потрібних характеристик чоловічої/жіночої стерильності, можна трансформувати також полінуклеотидом, який несе ділянки, які кодують протеїни, які можуть надавати рослинному матеріалу принаймні одну з важливих з агрономічної точки зору ознак: стійкість до комах, грибів, вірусів, бактерій, нематодів, стресу, зневоднювання і гербіцидів. Гени, які надають стійкість до гербіцидів, можна вибирати, наприклад, із групи, яка кодує наступні протеїни: гліфосатоксидазу (GOX), EPSPсинтазу, фосфінотрицинуцетилтрансферазу (PAT), гідроксифенілпіруватдіоксигеназу (HPPD), глутатін-S-трансферазу (GST), цитохром Р450, ацетилСоА-карбоксилазу (ACCase), ацетолактатсинтазу (ALS), протопорфіриногеноксидазу (PPO), дигідроптероатсинтазу, протеїни транспорту поліімінів, супероксиддисмутазу (SOD), бромоксинілнитрилазу, фітоендесатуразу (PDS), продукт гена tfdA, який одержують з Alcaligenes eutrophus, і відомі мутантні або іншим способом модифіковані варіанти вказаних протеїнів. Фахівець у даній галузі повинен розуміти необхідність у ретельному виборі таких генів і промоторів, які забезпечують їх експресію, з урахуванням природи ферменту, який застосовують для перетворення нефітотоксичної субстанції. У випадку, коли полінуклеотид забезпечує множинну стійкість до гербіцидів, такі гербіциди можна вибирати з ряду, який включає динітроанілінові гербіциди, триазолопіримідини, гербіциди з групи урацилу, фенілсечовини, трикетону, ізоксазолу, ацетаніліду, оксадіазолу, триазинону, сульфонаніліду, аміду, аніліду, ізоксафлутолу, фторхлоридону, норфлуразону і триазолінону, а гербіциди для обробки після проростанням вибирають з ряду, який включає гліфосат і його солі, глуфосинат, азулам, бентазон, біалафос, бромацил, сетоксидим або інші похідні циклогександіону, дикамба, фосамін, флупоксам, феноксипропіонат, хізалофоп або інші похідні арилооксифеноксипропаонату, піклорам, флуометурон, бутафенацил, атразин або інші похідні триазину, метрибузин, хлоримурон, хлорсульфурон, флуметсулам, галосульфурон, сульфометрон, імазахін, імазетапір, ізоксабен, імазамокс, метосулам, піритробак, римсульфурон, бенсульфурон, нікосульфурон, фомесафен, флуроглікофен, КІН9201, ЕТ751, карфент 82665 26 разон, мезотріон, сулькотріон, паракват, дикват, бромоксиніл і феноксапроп. У випадку, коли полінуклеотид містить послідовності, які кодують протеїни, які мають інсектицидні властивості, то ці протеши можна вибирати з ряду, який включає кристалічні токсини, які одержують з Bt, включаючи секретовані Bt токсини, відомі як «VIP» (вегетативні інсектицидні протеши); інгібітори протеаз, лектини і токсини Xenhorabdus/Photorhabdus. Гени, які зумовлюють стійкість до грибів, можна вибирати з ряду, який включає гени, які кодують відомі АФП (альфафетопротеїн), дефенсини, хітинази, глюканази і Avr-Cf9. Найбільш переважними ісектицидими протеїнами є сrуІАс, сrуІАb, сrу3А, Vip 1A, Vip 1B, Vip3A, Vip3B, інгібітори цистеїнових протеаз і лектин проліску. У випадку, коли полінуклеотид несе гени, які зумовлюють стійкість до бактерій, то їх можна вибирати з ряду, який включає гени, які кодують цекропіни і техіплесин і їх аналоги. Гени, які зумовлюють стійкість до вірусів, можна вибирати з ряду, який включає гени, які кодують протеїни вірусної оболонки, протеїни, зв'язані з рухом, вірусні реплікази й антисмислові і рибозимні послідовності, які, як відомо, надають стійкість до вірусів; гени, які зумовлюють стійкість до стресу, засоленості і посушливим умовам, можна вибирати з генів, які кодують глутатіон -S-трансферазу і пероксидазу, з послідовностей, які несуть відому регуляторну послідовність CBF1, і генів, які, як відомо, забезпечують нагромадження трегалози. Полінуклеотиди, які застосовують згідно із даним винаходом, можна «модифікувати» для підвищення рівня експресії послідовностей, які входять до їх складу, які кодують протеїн, для цього можна видаляти нестабільні мотиви мРНК і/або випадкові сплайсингові ділянки, або використовувати переважні для даної культурної рослини кодони для того, щоб при експресії модифікованого в такий спосіб полінуклеотиду в рослині одержувати практично такий же протеїн, який має практично таку ж активність/функцію, що і протеїн, одержуваний при експресії кодуюяих протеїн ділянок немодифікованого полінуклеотиду в організмі, для якого такі ділянки немодифікованого полінуклеотиду є ендогенними. Ступінь ідентичності модифікованого полінуклеотиду й ендогенного для рослини полінуклеотиду, який кодує практично такий же протеїн, може бути такий, щоб перешкоджати косупресії між модифікованою й ендогенною послідовностями. У цьому випадку ступінь ідентичності між послідовностями переважно повинна становити менше приблизно 70%. Крім того, можна модифікувати послідовність, яка прилягає до сайту ініціації трансляції, таким чином, щоб вона підпадала під поняття «переважний», запропоноване Козаком (Kozack). Це поняття добре відомо фахівцю в даній галузі. Винахід стосується також морфологічно нормальних умовно фертильних цілих рослин, які одержують у результаті схрещування рослин, регенерованих з матеріалу, який був трансформований нуклеїновою кислотою, запропонованою в даному винаході, і які внаслідок цього несуть таку 27 ознаку. Винахід стосується також потомства отриманих рослин, їх насіння і частин. Рослини, які можна використовувати відповідно до винаходу, якщо не вказане інше, вибирають з ряду, який включає польові, плодові й овочеві культури, такі як ріпак, соняшник, тютюн, цукровий буряк, бавовник, кукурудза, пшениця, ячмінь, рис, сорго, кормовий буряк, томати, манго, персик, яблуня, груша, полуниця, банан, диня, картопля, морква, салат, капуста, цибуля, різні сорти сої, цукровий очерет, горох, кінські боби, тополя, виноград, цитрусові, люцерна, жито, овес, дерноутворюючі і кормові трави, льон і насінний ріпак і горіхоплідні рослини, їх потомство, насіння і частини. Найбільш переважними рослинами є пшениця, ячмінь, овес, рис, кукурудза, просо і сорго. Винахід стосується також переважного способу одержання гібридного насінного матеріалу пшениці, який полягає в тому, що (I) трансформують рослинний матеріал полінуклеотидом або вектором, що несе ген, який надає умовну чоловічу стерильність при екзогенній обробці прогербицідом або іншою нефітотоксичною субстанцією; (II) відбирають такий трансформований матеріал; і (III) регенерують з такого відібраного матеріалу морфологічно нормальні цілі рослини з умовною чоловічою стерильністю; (IV) розмножують гомозиготну материнську лінію з умовною чоловічою стерильністю; (V) трансформують рослинний матеріал полінуклеотидом або вектором, що несе ген, який надає умовну жіночу стерильність при екзогенній обробці таким же прогербицідом або нефітотоксичною субстанцією, яка і вказана в розділі (І); (VI) відбирають такий трансформований матеріал; і (VII) регенерують з такого відібраного матеріалу морфологічно нормальні цілі рослини з умовною жіночою стерильністю; (VIII) розмножують гомозиготну батьківську лінію з умовною жіночою стерильністю; (IX) здійснюють ущільнену посадку батьківських ліній з умовною чоловічою і жіночою стерильністю в такому співвідношенні, щоб гарантувати ефективне запилення; (X) обробляють прогербицідом або іншою нефітотоксичною субстанцією ущільнено посаджені батьківські лінії, використовуючи таку дозу і на такій стадії розвитку, щоб мінімізувати самозапилення; (XI) збирають гібридний насінний матеріал пшениці з ущільнено посаджених батьківських рослин. Даний винахід стосується також у варіантах вказаного вище способу, згідно із яким батьківській рослині надають жіночу стерильність за допомогою будь-яких методів, материнській рослині надають чоловічу стерильність за допомогою будьяких методів, батьківській і материнській лініям надають умовну стерильність, які забезпечуються обробкою різними прогербицідами, і культурна рослина не являє собою пшеницю. 82665 28 Даний винахід стосується також діагностичного набору, який включає засоби для виявлення протеїнів або їх кодувальних послідовностей ДНК, які присутні в рослинах, одержуваних відповідно до способу, запропонованому в даному винаході, і який внаслідок цього можна застосовувати для ідентифікації тканин або зразків, які містять їх. Послідовності ДНК можна виявляти за допомогою відомого фахівцям у даній галузі методу ПЛРампліфикації на основі праймерів, які легко одержувати з послідовностей, які кодують фермент, , описаних або згаданих у даному описі. Самі ферменти можна виявляти, наприклад, за допомогою антитіл до цих ферментів, одержуваних для діагностичного визначення антигенних ділянок, які вони містять. Даний винахід стосується також способу одержання енантіомерно чистого D-фосфінотрицину (D-ФФТ), який полягає в тому, що: (а) одержують клітини, які містять фермент, який має здатність вибірно N-ацилювати ФФТ; (б) вирощують клітини в середовищі, яке містить D-L ФФТ, для одержання кондиціонованого середовища; (в) відокремлюють клітини від кондиціонованого середовища, вказаного в (б); (г) необов'язково екстрагують кондиціоноване середовище неводним розчинником, який незмішується з водою, при різних значеннях рН для того, щоб відокремлювати фракцію, яка містить ФФТ від фракції, яка містить більш водорозчинні молекули, ніж ФФТ; (д) необов'язково змішують з кондиціонованим середовищем або екстрагованими середовищами, які містять ФФТ, вказаними на стадії (г), катіонообмінну смолу в протонованій формі в кількості і при значеннях рН, достатніх для абсорбції значних кількостей відмінних від ФФТ продуктів із середовища; (є) змішують з кондиціонованим середовищем, екстрагованим середовищем або середовищем, отриманим на стадії (д), катіонообмінну смолу в протонованій формі в кількості і при значеннях рН, достатніх для того, щоб зв'язувати основну частину ФФТ у середовищі; (ж) збирають катіонообмінну смолу, вказану на стадії (е), з якою зв'язаний ФФТ, і вибірно елюють з неї ФФТ, використовуючи середовище для елюювання, яке має достатнє значення рН і іонну силу, за умови, що значення рН вказаного середовища для елюювання не є настільки низьким, щоб викликати рацемізацію елюйованого ФФТ. Щодо трансформації рослинного матеріалу фахівцям у даній галузі повинно бути очевидно, що хоча нижче в прикладах описані конкретні типи матеріалу-мішені (наприклад, суспензійна культура ембріогенних клітин або дедиференційовані незрілі зародки) і конкретні методи трансформації (наприклад, за допомогою Agrobacterium або бомбардування частинками), даний винахід не обмежений цими конкретними варіантами його здійснення і матеріали-мішені, і методи можна змінювати. Крім того, поняття «рослинна клітка» у контексті даного опису може стосуватися виділених клітин, включаючи суспензійні культури, а та 29 кож клітин у інтактній або частково інтактній тканини, такий як зародок, щиток, мікроспора, зародок, який одержують з мікроспори, або соматичні клітини органів рослин. Аналогічно до вищесказаного, хоча конкретні приклади обмежені кукурудзою і пшеницею, винахід стосується також широкого спектра сільськогосподарських культур, які можна трансформувати за допомогою методів, які застосовують для трансформації рослинних клітин. Нижче даний винахід проілюстрований на прикладах, які не обмежують його обсяг, які слід розглядати з посиланням на доданий перелік послідовностей та креслення. SEQ ID NO: 1 являє собою послідовність ДНК, виділену з Synechocystis sp., яка кодує фермент (позначений як SEQ ID NO: 2), який має активність естерази В. SEQ ID NO: 3 являє собою послідовність ДНК, виділену з Neurospora crassa, яка кодує фермент (позначений як SEQ ID NO: 4), який має активність ацилметилацил-СоА-рацемази. SEQ ID NO: 5 і 6 являють собою послідовності ПЛР-праймерів, які застосовують для одержання промоторної ділянки ТА29. SEQ ID NO: 7 являє собою послідовність ДНК, виділену з Rhodotorula gracilis, яка кодує фермент, який має активність оксидази D-амінокислот. SEQ ID NO: 8 і 9 являють собою послідовності вироджених олігонуклеотидів, які застосовують для одержання варіанта оксидази D-амінокислот. SEQ ID NO: 10 і 11 являють собою мотиви, у яких альтернативні амінокислоти можна замінювати для одержання варіантів оксидаз Dамінокислот. На кресленнях показано: на Фіг.1 - схематичне зображення конструкції, призначеної для трансформації тютюну, яка несе послідовність оксидази D-амінокислот з Rhodotorula, функціонально зв'язану з промоторною ділянкою stig 1. Компоненти позначені наступними скороченнями LB (ліва погранична послідовність), AOPR1 (промотор AoPR1), PSTIG1 (EMBL, реєстраційний номер. Х77823), RGDAO (OPT) (SEQ ID NO: 7), промотор PC (EMBL, реєстраційний номер X16082), PAT (EMBL, реєстраційний номер А02774), NOS (термінатор nos, який одержується із зареєстрованої в EMBL послідовності, реєстраційний номер ATU237588) і RB (права погранична послідовність); на Фіг.2 - схематичне зображення конструкції, призначеної для трансформації тютюну, яка несекодувальну послідовність оксидази D-амінокислот з Rhodotorula, укорочену на 3 кодони на 3'-кінці, і злиту на 5'-кінці (RGDAO (OPT)-SKL) з ділянкою, яка кодує опимізований транзитний пептид (FR2673643); на Фіг.3а - карта плазмідної Ubi-CoAсинтетази, де PUB11-01-01 має реєстраційний номер EMBL SM29159, а СоА-синтетаза має реєстраційний номер J05439; на Фіг.3б - карта плазмідної Ubi-епімерази, де епімераза має реєстраційний номер EMBL Y0817Z. Застосовувані загальні методи молекулярної біології відповідають загальноприйнятим. 82665 30 Більша частина наведених нижче прикладів включає опис ряду варіантів здійснення даного винаходу. При цьому поняття «промоторна ділянка гена» у контексті даного опису позначає послідовності ДНК, які містять промотор, послідовності, розташовані проти ходу транскрипції відносно промотору, а також необов'язково всю або частину послідовності ДНК, яка кодує 5'-нетрансльовану лідерну ділянку мРНК. Приклад 1. Рослини тютюну, які мають умовну жіночу стерильність, яка залежить від екзогенної обробки D-фосфінотрицином або D-аланіном, або D-лейцином, або D-метіоніном, або D-аспарагіном, або D-аспартатом., або D-глугаматом Послідовність ДНК, яка кодує послідовність протеїну оксидази D-амінокислот Q99042 (Swissprot), що знаходиться в EMBL- послідовності Z50019, одержують або за допомогою ЗТ-ПЛР із мРНК Trigonopsis variablis, або за допомогою синтезу. В іншому варіанті послідовність ДНК, яка кодує послідовність протеїну оксидази Dамінокислот Р80324 (Swissprot), що знаходиться в EMBL- послідовності А56901, одержують або за допомогою ЗТ-ПЛР із мРНК Rhodosporidium tolruloides (Rhodotorula gracilis), або за допомогою синтезу (при цьому легше здійснювати контроль над присутніми внутрішніми сайтами, що розпізнаються рестриктазами, і створювати фланкуючі сайти, які полегшують клонування), наприклад, SEQ ID NO: 7, яку створюють з врахуванням кодонів, які найбільш часто зустрічаються у рослині (у даному випадку пшениці) і для зниження до мінімуму структур ДНК, які можуть перешкоджати експресії. В іншому варіанті послідовність ДНК (наприклад, отриману з EMBL-послідовності з реєстраційним номером Х95310), яка кодує «Dаспартатоксидазу», таку як Р31228 (Swiss Prot), синтезують також з урахуванням кодонів, які найбільш часто зустрічаються у даній рослині, і для зниження до мінімуму структур, які можуть перешкоджати експресії. Згідно із одним варіантом послідовності, які кодують оксидази D-амінокислот, одержують відповідно до методу, описаному в прикладі 2. Створюють послідовності, які фланкують ПЛР-праймер, і синтетичні послідовності ДНК для вбудовування унікальних сайтів рестрикції, призначених для клонування. Переважно, а також у випадку, коли послідовність, яка кодує оксидазу, не містить неприйнятних внутрішніх сайтів, сайт Nco1 або Nde1 поміщають на 5'-кінець для полегшення клонування в рамці зчитування злиттів з послідовностями, що додаються в 3'-орієнтації до ВРЗ, таких як кодувальні послідовності транзитного пептиду хлоропласта. Для деяких варіантів оксидаз D-амінокислот (у тому числі деяких варіантів, позначених як «D-аспартатоксидаза») ген клонують таким чином, що 3'- кінцеві амінокислотні послідовності є укороченими, і внаслідок цього для кодованого ферменту стає неможливим направлене перенесення до пероксисоми. Відповідно до інших варіантів способу ген конструюють за допомогою ПЛР таким чином, щоб він кодував оксидазу D-амінокислот Rhodotorula gracilis з альтернативними амінокислотами в положеннях 213 і 238 і, зокрема, фермент, у якому метіонін у положенні 31 213 замінений аргініном, серином, цистеїном, лізином, аспарагіном або аланіном, і/або тирозин у положенні 238 замінений гістидином, серином, аспарагіном або аланіном. Метіонін у положенні 212 позначений як «М» у нативній амінокислотній послідовності мотиву RCTMDSS. Тирозин у положенні 238 позначений як «Y» у нативній амінокислотній послідовності мотиву GGTYGVG. Вказані варіанти оксидази D-амінокислот Rhodotorula або «D-аспартатоксидази», використовують, коли жіноча стерильність повинна бути умовною і залежною від обробки D-аспартатом, D-глутаматом або D-фосфінотрицином. Сайти рестрикції можна поміщати проти ходу транскрипції відносно сайту ініціації трансляції ATG вбудовуваних послідовностей для того, щоб вони згідно із Козаком відповідали трансляційним консенсусним послідовностям рослини. «Промотор дельта S13» являє собою промоторну ділянку, яку можна застосовувати для забезпечення переважної для частин жіночої квітки експресії. Вона включає ділянка від положення 339 до положення -79 промоторної ділянки SLG13, злиту з ділянкою, яка розташована від положення 46 до положення +8 корового промотору CMV 35S [Dzelkalns і ін. Plant Cell, 5, стор. 833-863, 1993]. Цю промоторну ділянку S13 клонують у Bluescript sk, цю плазміду потім додатково розщеплюють і лігують з рестрикційними фрагментами, яку містять 3'-ділянку термінатора транскрипції nos і ту чи іншу з кодувальних послідовностей оксидаз, одержуючи тим самим касету експресії: «дельта S13оксидаза D-амінокислот - термінатор Nos»' у плазміді Bluescript sk. Плазміду потім відповідним чином розщеплюють, одержуючи, наприклад, EcoR1фрагмент, який потім зворотно вбудовують шляхом лігування в придатний сайт вектора, такого як pBIN19 [Bevan, Nucleic Acids Res., 1984] або pCIB200, або рСІВ2001 (WO 98/39462) для наступного застосування для трансформації з використанням Agrobacterium. Як описано в WO 98/39462, рСІВ200 містить у полілінкері наступні унікальні сайти рестрикції: EcoR1, Sst1, Kpn1, Bg1II, Xba1 і Sa1l. PCIB2001 містить вставку в полілінкері, яка додає додаткові унікальні сайти рестрикції, такі як MIuI, BcII, Avrll, АраІІ, НраІ і Stul. РСІВ200 і рСІВ2001 несуть також селектовані маркерні гени для рослин і бактерій, призначені для відбору за ознакою стійкості до канаміцину, ліву і праву пограничні послідовності T-DNA, одержувану з RK2 функцію trfA для здійснення мобілізації між Е.соlі і іншими хазяїнами і функції оrіТ і oriV з RK2. В іншому варіанті застосовують бінарний вектор рСІВ10, який включає послідовності плазміди із широким спектром хазяїнів pRK252 [Rothstein і ін., Gene 53, стор. 153-161, 1987], або застосовують одну з її похідних, яка включає як гени, які зумовлюють стійкість до канаміцину, так і ген гігроміцинфосфотрансферази, наприклад, рСІВ715 [Gritz і ін., Gene 25, стор. 179-188, 1983]. В альтернативному варіанті застосовують промоторну ділянку Stig1 розміром ~1,6 т.п.н. (яку одержують з EMBL-послідовності з реєстраційним номером Х77823). Наприклад, кодувальна ділянка гена GUS конструкції stig1 -GUS , яка описана в 82665 32 [Goldman і ін. , EMBO J., 13, 1994, стор. 29762984], замінюють послідовністю ДНК, яка кодує кодувальні послідовності або Р80324, або Q99042, використовуючи відповідні рестриктази, утворену касету експресії: stig1-оксидаза D-амінокислот клонують у прийнятному векторі, такому як рСІВ200, у положенні, розташованому проти ходу транскрипції відносно 3і-термінучої послідовності, прилеглої до придатного маркерного гена, і між пограничними послідовностями T-ДНК. Відповідно до іншого конкретного приклада ТДНК-вставку конструюють, як описано на Фіг.1. Конструкцію, яка містить синтетичну послідовність ДНК (SEQ ID No: 7), яка кодує оксидазу Dамінокислот Rhodotorula gracilis під функціональним контролем промоторної ділянки stigl, а також послідовність ДНК (А02774), яка кодує Lфосфінотрицин-N-ацетилтрансферазу (PAT) під функціональним контролем промотору пластоціаніну гороху, клонують у сайті між LB/ ген npt II і RB T-ДНК бінарного вектора. У цілому, метод полягає в наступному: послідовність ID No: 7 клонують у плазміді pFse4-Stig1nos (описана в WO 99/42598) за промотором Stig1 і перед термінуючою ділянкою nos (входить до складу EMBL-послідовності з реєстраційним номером ATU237588) у вигляді NcoI/PstI-фрагмента. Промоторну ділянку пластоціаніну гороху (отриману з EMBL- послідовності з реєстраційним номером X160 82) одержують з геномної ДНК гороху за допомогою ПЛР і клонують попереду від конструкції ген РАТ/термінатор nos. Утворену касету: PC-PAT-nos клонують за конструкцією Stig1-RGDAMOX-nos у вигляді Notlфрагмента і цю повну конструкцію, яка несе два гени, переносять у бінарний вектор (pVB6, похідне Віn19) у вигляді Fsel-фрагмента. Згідно із одним варіантом способу застосовують конструкцію, схематично зображену на Фіг.2. Кодувальну послідовність оксидази D-амінокислот Rhodotorula, SEQ ID No. 7, необов'язково піддану сайтнаправленому мутагенезу для кодування М213К-форми, укорочують на 3 кодони на 3'-кінці і на 5'-кінці, клонують, вбудовуючи безпосередньо по ходу транскрипції відносно ділянки, яка кодує транзитний пептид хлоропласта, при цьому кодується злитий протеїн транзитний пептид хлоропласта /оксидаза D-амінокислот. Кодувальну послідовність транзитного пептиду хлоропласта одержують з гена Arabidopsis, що кодує малу субодиницю EPSP-синтази [Кlее і ін., Mol.Gen.Genet, 210, 1987, стор. 437]. Необов'язково її модифікують, вбудовуючи сайт Sphl у сайт процесування CTP, замінюючи тим самим Glu-Lys у цьому положенні на Cys-Met (SEQ на Фіг.9. WO 92/044490). Аналогічно до цього можна створювати сайт SPh 1 на N-кінці кодувальної послідовності оксидази Dамінокислот (замінюючи амінокислоту, яка знаходиться за метіоніном, на leu). B іншому варіанті кодувальну послідовність транзитного пептиду хлоропласта одержують з гена Petunia, який кодує EPSP-синтазу (Фіг.11 WO 92/044490). В іншому варіанті кодувальна послідовність із хлоропласта являє собою будь-яку із широкої розмаїтості можливих послідовностей, включаючи отримані з малої субодиниці Rubisco і включаючи так звану «оп 33 тимізовану» химерну послідовність транзитного пептиду (FR 2673643). В усіх випадках повну необхідну послідовність ДНК, яка кодує злитий поліпептид: транзитний пептид хлоропласта/оксидаза Dамінокислот Rhodotorula простіше одержувати синтетичним шляхом, ніж допомогою субклонування. Цю послідовність клонують у сайті, розташованому по ходу транскрипції промоторної ділянки stig1 і проти ходу транскрипції термінуючої послідовності (наприклад, nos) у прийнятному векторі (наприклад, заміняючи кодувальна послідовність GUS у векторі, що містить конструкцію stig1 → GUS, описану в Goldman і ін., EMBO J., 13, стор. 2976-2984, 1994). Потім конструкцію для експресії всього гена клонують у придатному сайті між правою і лівою пограничними послідовностями T-ДНК вектора PVB6. Диски з листків тютюну трансформують рекомбінантними бінарними векторами, використовуючи методи, аналогічні до [описаних в Horsch і ін., Science, 227, стор. 1229-1231, 1985]. Можна застосовувати різноманітні варіанти цього методу. Бінарним вектором можна трансформувати, наприклад, штам Agrobacterium tumefaciens LBA 4404, використовуючи метод трансформації, заснований на заморожуванні/відтаванні. Трансформацію тютюну і регенерацію цілої рослини здійснюють, використовуючи Nicotiana tabacum var. Samsun, відповідно до протоколу, описаному в Draper і ін. [Plant Genetic Трансформація, Blackwell Sci. Pub. 1989]. Випадки трансформації відбирають на MSсередовищі, яке містить канаміцин або інший прийнятний антибіотик. Присутність інтегрованих трансгенів підтверджують за допомогою ПЛР. Рослини регенерують і дозволяють досягати зрілості і самозапилюватися для одержання насінного матеріалу. Для підтвердження тканинноспецифічної експресії генів оксидаз D-амінокислот використовують Нозерн- і/або Вестерн-блотинг. Рослини самі є фертильними, але мають умовну жіночу стерильність. Саджають насіння покоління T1. Паростки після їх появи вирощують до розміру, достатнього для їх тестування за допомогою ПЛР на присутність трансгена. Позитивні за даними ПЛР рослини переносять у теплицю. Ці рослини є повністю фертильними за відсутності внесеного екзогенно прогербиціду. Підгрупу цих рослин (передбачувано) з умовною стерильністю обробляють D-фосфінотрицином, або D-аланіном, або Dлейцином, або D-аспарагіном, або D-метіоніном, або D-аспартатом, або D-глутаматом у різних кількостях і на різних стадіях росту. Такій обробці піддають рослини покоління T1, для яких за допомогою ПЛР підтверджено, що вони є позитивними за геном оксидази D-амінокислот, або аналогічній обробці піддають безпосередньо рослини покоління Т0 (які піддають вегетативному клонуванню для того, щоб необроблені клони в кожному випадку можна було виключати з клонів-виробників насінного матеріалу). Отриману фертильність потім використовують як основу для відбору прийнятних ліній рослин, що несуть найбільш виражений фенотип умовної стерильності. Наприклад, ці амінокислоти являють собою чисті D-енантіомери або в іншому варіанті DL-рацемати. Наприклад, їх нано 82665 34 сять шляхом обприскування листя до або протягом ранніх стадій утворення квітки в нормі витрати 0,25-20кг/га. Амінокислоти, які можуть викристалізовуватися з розчину на листках після листової обробки, можна повторно розчиняти і ремобілізувати з метою проникнення в листок шляхом додаткових обробок водою у вигляді аерозолю. Амінокислоти, наприклад, можна також вносити шляхом просочування зони розташування коренів і необов'язково додатково вносити у вигляді ~ 50мкл 10200мМ розчину, яким безпосередньо зрошують бруньки квіток, які з'явилися. Пилок оброблених рослин збирають і оцінюють його життєздатність. Одержують рослини, які дають відносно невелику кількість насінного матеріалу або не дають його взагалі після обробки D-фосфінотрицином, або Dаланіном, або D-лейцином, або D-аспарагіном, або D-метіоніном, або D-аспартатом, або Dглутаматом, але які, незважаючи на це, при таких же умовах обробки можуть утворювати практично нормальні рівні життєздатного пилку. Як контрольні використовують як трансгенні, так і нетрансгенні рослини і їх вирощують в ідентичних умовах і в ідентичному режимі фізичних обробок, за винятком того, що розчини для обробки являють собою або воду, або розчин з еквівалентною концентрацією чистої L-амінокислоти. Відповідно до одного з варіантів способу застосовувана для обробки амінокислота являє собою рацемічний DL-фосфінотрицин. У цьому випадку застосовувана для трансформації конструкція ДНК крім послідовностей ДНК, які кодують оксидазу D-амінокислот, експресіяякої знаходиться під функціональним контролем специфічної для жіночої квітки промоторної ділянки, такої як «stig1» , містить також послідовність ДНК (EMBL: А02774) гена «PAT» під функціональним контролем промоторної ділянки, такої як ділянка 5'- сайта ініціації трансляції гена пластоціаніну Pisum sativum (EMBL, реєстраційний номер X16082). Наприклад, конструкція відповідає описаній на Фіг.1, за винятком того, що послідовність ДНК, яка кодує оксидазу D-амінокислот, піддають сайтнаправленому мутагенезу для того, щоб вона кодувала М213R-форму ферменту. Промоторну ділянку пластоціаніну застосовують для переважної експресії в зелених тканинах рослини. При створенні винаходу несподівано було встановлено, що такий промотор, на відмінну, наприклад, від 358-промоторної ділянки, забезпечує експресію тільки у певних тканинах рослини і головним чином у зелених тканинах, однак при його застосуванні в сполученні з геном PAT він забезпечує практично повне зниження толерантності до гербіциду DL-ФФТ при його застосуванні в нормах витрати, які перевищують 2кг/га. Крім того, за відсутності спільної експресії в квіткових тканинах якоїнебудь прийнятної гетерологічної оксидази або Dамінокислот аналогічного ферменту, який має здатність перетворювати D-енантіомер у Lенантіомер, комбінація пластоціанін /ген PAT забезпечує практично повну репродуктивну толерантність без істотної втрати врожаю, незважаючи на те, що рівень експресії PAT є низьким або експресія відсутня у багатьох квіткових тканинах, що ма 35 ють вирішальне значення при експресії під контролем вказаної промоторної ділянки. Таким чином, у цьому прикладі нефітотоксичну субстанцію Dфосфінотрицин наносять у вигляді найдешевшої і найбільш широко доступної форми рацемату гербіциду DL- фосфінотрицину, що надходить у продаж. При обприскуванні у відповідні моменти часу й у нормах витрати від 250г/га до 5кг/га оброблені DL-фосфінотрицином рослини не мають видимих ушкоджень, але мають умовну жіночу стерильність, зберігаючи при цьому нормальну або практично нормальну чоловічу фертильністю. Приклад 2. Рослини тютюну, які мають умовну чоловічу стерильність, що залежить від екзогенної обробки D-фосфінотрипином або D-аланіном, або D-лейцином, або D-метіоніном, або D-аспарагіном, або D-аспартатом, або D-глутаматом Послідовність ДНК, яка кодує послідовність протеїну оксидази D-амінокислот Q9HGY3 (Sptrembl), що знаходиться в EMBL- послідовності AB042032, одержують або за допомогою ЗТ-ПЛР із мРНК Candida boidini, або за допомогою синтезу. В іншому варіанті послідовність ДНК, яка кодує послідовність протеїну оксидази D-амінокислот Р24552 (Swissprot), що знаходиться в EMBL- послідовності D00809, одержують або за допомогою ЗТ-ПЛР із мРНК Fusarium solani, або за допомогою синтезу. Створюють послідовності, які фланкують ПЛР-праймер, або синтетичні послідовності ДНК для вбудовування унікальних сайтів рестрикції, призначених для клонування. Переважно, а також у випадку, коли послідовність, яка кодує оксидазу, не містить неприйнятних внутрішніх сайтів, сайт Nco1 або Nde1 поміщають на 5’-кінець для полегшення клонування в рамці зчитування злиттів з послідовностями, які додаються в 5'-орієнтації до ВРЗ. В іншому варіанті, коли сайти рестрикції поміщають проти ходу транскрипції відносно сайта ініціації трансляції ATG, створюють вбудовувані послідовності для того, щоб вони згідно із Козаком відповідали трансляційним консенсусним послідовностям рослини. В іншому варіанті послідовності, які кодують оксидази D-амінокислот, одержують відповідно до методу, описаному в прикладі 1. Також як і в попередньому прикладі, коли потрібно одержувати стерильність, яка залежить від обробки D-аспартатом, D-глутаматом або Dфосфінотрицином, то переважно, оксидази Dамінокислот являють собою варіанти амінокислот, які мають заміни в положеннях 213 і/або 238. Промоторну ділянку ТА29 [Kriete і ін., Plant J., 9, стор. 808-818, 1996] клонують з геномної ДНК тютюну за допомогою ПЛР, використовуючи праймери 5’-AACTGCAGCTTTTTGGTTAGCGAATGC-3’ (SEQ ID No.5) і 5'CAGACTAGTTTTAGCTAATTTCTTTAAGTAAAAACS' (SEQ ID No. 6). ПЛР-фрагмент, отриманий за допомогою серій стадій обробки рестриктазами і субклонування, поміщають проти ходу транскрипції кодувальної послідовності оксидази Dамінокислот і додають до 3'-кінця кодувальної ділянки термінатор транскрипції nos. Утворену касету експресії: ТА29-оксидаза D-амінокислот - термінатор nos потім клонують, одержуючи прийнятний рестрикційний фрагмент, і клонують у бінарному 82665 36 векторі, відповідно до методу, описаному в прикладі 1. Також як описано в прикладі 1, якщо потрібно одержати стерильність, яка є умовною, що залежить від обробки D-аспартатом, D-глутаматом або D-фосфінотрицином, то переважно використовувати варіанти оксидази D-амінокислот Rhodotorula gracilis, які несуть мутації в положеннях 213 і/або 238. В іншому варіанті будь-які вказані вище ділянки кодувальних послідовностей оксидаз Dамінокислот клонують у вигляді прийнятного рестрикційного фрагмента (наприклад, BamH1, Bg1/II, якщо синтетичні варіанти кодувальних послідовностей створюють так, щоб вони видаляли внутрішні сайти рестрикції), і зливають із промотором CaMV 35S i термінуючою ділянкою нопалінсинтази шляхом вбудовування в (наприклад) сайт BamH1 бінарного вектора Prok1 [Baulcombe і ін., Nature, 321, стор. 446-449, 1986] у смисловій конфігурації. EcoR1-BamH1-фрагмент, який несе промоторну ділянку 35S, потім вирізують і заміняють EcoR1BamH1-фрагментом з АР30 [Kriete і ін., Plant Journal 9, стор. 809-818, 1996], який несе фрагмент промоторної ділянки ТА29 (від положення 810 до положення + 54). Утворені вектори можна позначити як pGKTA29_ Q99042, pGKTA29_ P80324, pGKTA29_ Q9HGY3 і pGKTA29_ Р24552 і т.д. залежно від кодованої послідовності протеїну. Рослинним матеріалом рослин тютюну трансформують за допомогою Agrobacterium вектором і трансгенні рослини регенерують аналогічно до описаного в попередньому прикладі. Отримані рослини самі є фертильними, але мають умовну чоловічу стерильність. Насіння покоління T1 саджають у ґрунт. Паростки після їх появи вирощують до розміру, достатнього для їх тестування за допомогою ПЛР на присутність трансгена. Позитивні за даними ПЛР рослини переносять у теплицю. Ці рослини є повністю фертильними за відсутності внесеного екзогенно прогербиціду. Підгрупу цих рослин покоління T1, які ймовірно мають умовну стерильність, або в іншому варіанті паростки покоління Т0 (які одержують після регенерації «випадків» трансформації) обробляють Dфосфінотрицином, або D-аланіном, або Dлейцином, або D-метіоніном, або D-аспарагіном, або D-аспартатом, або D-глутаматом у різних кількостях і на різних стадіях росту. Якщо обробці піддають рослини покоління Т0, то їх піддають вегетативному клонуванню для того, щоб необроблені клони в кожному випадку можна було виключати з клонів-виробників насінного матеріалу. Отриману фертильність потім використовують як основу для відбору прийнятних ліній рослин, які несуть найбільш виражений фенотип умовної стерильності. Наприклад, ці амінокислоти являють собою чисті D- енантіомери або в іншому варіанті DLрацемати. Наприклад, їх наносять шляхом обприскування листків до або протягом ранніх стадій утворення квітки в нормі витрати 0,25-20кг/га. Амінокислоти, які можуть викристалізовуватися з розчину на листках після листової обробки, можна повторно розчиняти і ремобілізувати з метою проникнення в листок шляхом додаткових обробок водою у вигляді аерозолю. Амінокислоти, напри 37 клад, можна також вносити шляхом просочування зони розташування коренів і необов'язково додатково вносити у вигляді 10-200мМ розчину, яким безпосередньо зрошують бруньки квіток, які з'явилися. Пилок оброблених рослин збирають і оцінюють його життєздатність. Одержують рослини, які дають відносно невелику кількість пилку або не дають його і/або пилок яких є нежиттєздатної. Пилок, зібраний з деяких оброблених рослин, тестували, і було встановлено, що він є недорозвиненим і нежиттєздатним. Однак такі рослини з чоловічою нефертильністю зберігають жіночу фертильність і дають (гібридний) насінний матеріал при запиленні пилком, зібраним з інших необроблених нетрансгенних рослин тютюну або рослин з умовною жіночою стерильністю. Як контрольні використовують як трансгенні, так і нетрансгенні рослини і їх вирощують в ідентичних умовах і в ідентичному режимі фізичних обробок, за винятком того, що розчини для обробки являють собою або воду, або розчин з еквівалентною концентрацією чистої L-амінокислоти. За аналогією з прикладом 1, в одному з варіантів здійснення винаходу застосовувана для обробки амінокислота являє собою рацемічний DLфосфінотрицин. У цьому випадку застосовувана для трансформації конструкція ДНК крім послідовності ДНК, яка кодує оксидазу D-амінокислот, експресія якої знаходиться під функціональним контролем специфічної для чоловічої квітки промоторної ділянки, такої як «ТА 291», містить також послідовність ДНК, яка кодує ген фосфінотрицин-N-ацетилтрансферази, такий як ген «PAT», під функціональним контролем промоторної ділянки, такої як промоторна ділянка пластоціаніну (у цьому випадку ділянка з гена пластоціаніну Pisum sativum). При обприскуванні у відповідні моменти часу й у нормах витрати від 250г/га до 5кг/га оброблені DL-фосфінотрицином рослини не мають видимих ушкоджень, але мають умовну чоловічу стерильність, зберігаючи при цьому нормальну або практично нормальну жіночу фертильність. Приклад 3. Химерні гени, експресія яких переважно відбувається в структурах чоловічої репродуктивної системи, і які кодують ферменти, які мають здатність здійснювати гідроліз імазаметабенз-метилу або флампроп-М-метилу або флампроп-М-ізопропілу до відповідних карбонових кислот Послідовність ДНК, яка кодує послідовність протеїну карбоксилестерази Q01470 (Swissprot), що знаходиться в EMBL- послідовності М94965, одержують або за допомогою ПЛР із геномної ДНК Arthrobacter oxydans, або за допомогою синтезу. В іншому варіанті послідовність ДНК, яка кодує послідовність протеїну карбоксилестерази Р37967 (Swissprot), що знаходиться в EMBL-послідовності BS06089, одержують або за допомогою ПЛР із геномної ДНК Bacillus subtilis, або за допомогою синтезу. Ще в одному варіанті послідовність ДНК, яка кодує послідовність протеїну карбоксилестерази Р40363 (Swissprot), що знаходиться в EMBLпослідовності Z34288, одержують або за допомогою ЗТ-ПЛР із мРНК Saccharomyces cervisiae, або 82665 38 за допомогою синтезу. Створюють послідовності, які фланкують ПЛР-праймер, або синтетичні послідовності ДНК для вбудовування унікальних сайтів рестрикції, призначених для клонування. Переважно, а також у випадку, коли послідовність, яка кодує карбоксилестеразу, не містить неприйнятних внутрішніх сайтів, сайт Nco1 або Nde1 поміщають на 5'-кінець для полегшення клонування в рамці зчитування злиттів з послідовностями, які додаються в 5'-орієнтації до ВРЗ. В іншому варіанті, коли сайти рестрикції поміщають проти ходу транскрипції проти ходу транскрипції відносно сайта ініціації трансляції ATG, створюють вбудовувані послідовності, для того, щоб вони згідно із Козаком відповідали трансляційним консенсусним послідовностям рослини. Плазміда pGK73 несе EcoR1-BamH1 фрагмент, який розташована від положення -810 до положення +54 промоторної ділянки ТА29 [Kriete і ін. 9, стор. 809-818, 1996]. Цей рестрикційний фрагмент або інший придатний аналогічний фрагмент, отриманий за допомогою ПЛР, клонують, переважно у вигляді злиття в рамці зчитування, у положенні, що знаходиться проти ходу транскрипції послідовності ДНК, яка кодує карбоксилестеразу або Q01470, або Р37967 у Bluescript sk. За допомогою відповідних серій стадій рестрикції, лігування і субклонування додають термінатор транскрипції nos до 3'-кінця кодувальної ділянки для одержання, залежно від кодувальної послідовності інших касет експресії типу: ТА29карбоксилестераза-nоs у плазмідах Bluescript sk, pBLTA_Q01470, pBLTA_P37967 і pBLTA_P40363. У ще одному прикладі варіанта здійснення застосовують специфічну для пиляка промоторну ділянку SGB6, представлену в SEQ ID No. 1 USP 5470359. Наприклад, субклонований з pSGB6g1 (USP 5470359) геномний EcoR1-Nhe1-фрагмент розміром 3 т.п.н., який містить pSGBNE1, додатково субклонують для вбудовування клонованого з затупленими кінцями АраІІ/Xba1-фрагмента розміром 1500 пар основ у сайт Smal Bluescript ks. Аналогічно до описаного вище методу за допомогою додаткових стадій рестрикції і клонування цей фрагмент зливають у рамці зчитування проти ходу транскрипції з кодувальним послідовностями ДНК або Р37967, або Q01470, або Р40363. І в цьому варіанті термінатор nos додають до 3'-кінця кодувальної ділянки для створення інших плазмід Bluescript sk, тобто pBLB6_Q01470, pBLB6_P37967 і pBLB6_P40363, що містять інші касети експресії SGB6-карбоксилестераза-nos. В іншій серії аналогічних прикладів варіантів здійснення специфічну для пиляка промоторну ділянку RA8 з рису [EMBL/ реєстраційний номер банку генів AF042275; Jean Js і ін. PMB, 39, стор. 35-44, 1999] аналогічним чином зливають у сайті в рамці зчитування і проти ходу транскрипції відносно однієї з послідовностей ДНК, які кодують карбоксилестеразу і 3'-термінатор nos, для створення альтернативних касет експресії RA8карбоксилестераза-nos у серіях векторів Bluescript sk, тобто pBLRA8_Q01470, pBLRA8_P37967 і pBLRA8_P40363. 39 Приклад 4. Химерні гени, експресія яких переважно відбувається в структурах жіночої репродуктивної системи, і які кодують ферменти, які мають здатність окислювати D-фосфінотрицин і/або Dаланін, і/або D-лейцин, і/або D-метіонін, і/або Dаспарагін, і/або D-аспартат, і/або D-глутамат Послідовності ДНК, які кодують послідовності протеїнів оксидаз D-амінокислот, одержують за допомогою методів, описаних у прикладах 1 і 2. Геномний клон pSH64 відповідно до Будапештського договору депонований 27/02/1998 у колекції культур для цілей патентування Служби сільськогосподарських досліджень (NRRL), і йому присвоєний реєстраційний номер NRRL В-21920. Було встановлено, що геномний клон гібридизується із специфічним для шовку клоном кДНК В200i4-2 (WO 98/39462). Химерні гени, експресія яких переважно відбувається в структурах жіночої репродуктивної системи, конструюють у такий спосіб. Плазміду, яка є похідною Bluescript ks і аналогічна до pSH70, яка несе «порожню» касету експресії, що містить (у напрямі від 5' до 3') промоторну ділянку В200i 5', яка складається з нуклеотидів 1-3790 SEQ ID No. 11 WO 98/39462, сайт BamH1 і 3'-нетрансльовану термінуючу ділянку В200i, яка складається з нуклеотидів 4427-6397 послідовності ID No. 11 WO 98/39462, конструюють відповідно до методу, описаному в WO 98/39462. За допомогою часткового розщеплення BamH1 або в альтернативному варіанті шляхом додаткових стадій субклонування, ПЛР і лігування інші кодувальні послідовності оксидази D-амінокислот вбудовують шляхом лігування в сайт BamH1 або по сусідству із сайтом BamH1 так, щоб вони безпосередньо прилягали до 3'-кінця промоторної ділянки В200i і 5'-кінця термінатора В200i. Таким чином, створюють серії векторів Bluescript, такі як pBLB200_ Q99042, pBLB200_ P80324, pBLB200_ Q9HGY3 і pBLB200_ P24552, які кодують інші касети експресії В200і-оксидаза D-амінокислот B200i. В іншому варіанті за допомогою методу, описаного в WO 98/39462, Pstl/ Ncol-фрагмент 5'промоторної ділянки гена P19 вирізують з геномного клону Х2-1, депонованого відповідно до Будапештського договору 27/02/1998 у NRRL під реєстраційним номером В-21919. Сайт Ncol, розташований на нуклеотиді 1088 SEQ ID No. 14 WO 98/39462 , відповідає сайта ініціації трансляції ATG гена P19. За допомогою відповідних стадій субклонування, рестрикції, лігування і ПЛР цей фрагмент вбудовують шляхом лігування для одержання в рамці зчитування злиття з однієї з послідовностей ДНК, які кодують оксидазу Dамінокислот, і додають послідовність термінатора nos до 3'-кінця кодувальної послідовності. Таким чином, створюють серії векторів Bluescript, такі як pBLP19_ Q99042, pBLP19_ P80324, pBLP19_ Q9HGY3 і pBLP19_ P24552 і т.д., які кодують інші касети експресії Р19-оксидаза D-амінокислот-nos. В іншому варіанті за допомогою аналогічних стандартних методів одержують аналогічні плазміди, які несуть 5'-промоторну ділянку (яка містить частину або всі нуклеотиди 1-3987 SEQ ID No. 2, описаної в WO 98/39462) гена Р26, замість промотор 82665 40 ної ділянки гена P19. Геномний клон Р26-А4 рСІВ 10302, який депонований відповідно до Будапештського договору 21 січня 1997р. у колекції культур для цілей патентування Служби сільськогосподарських досліджень (NRRL) під реєстраційним номером NRRL В-21655, субклонують відповідно до методу, описаному в WO 98/39462. Таким чином, створюють серії векторів Bluescript, такі як pBLP26_ Q99042, pBLP26_ Р80324, pBLP26_ Q9HGY3 і pBLP26_ P24552, які кодують інші касети експресії P19-оксидаза D-амінокислот-nos. Приклад 5. Химерні гени, експресія яких переважно відбувається в структурах чоловічої репродуктивної системи, і які кодують ферменти, які мають здатність окислювати D-фосфінотрицин і/або D-аланін, і/або D-лейцин, і/або D-метіонін, і/або D-аспарагін, і/або D-аспартат, і/або Dглутамат Послідовності ДНК, які кодують послідовності протеїнів оксидаз D-амінокислот, одержують за допомогою методів, описаних у прикладах 1 і 2. Плазміда pGK73 несе EcoR1-BamH1фрагмент, який розташований від положення -810 до положення +54 промоторної ділянки ТА29 [Kriete і ін. 9, стор. 809-818, 1996]. Цей рестрикційний фрагмент або інший придатний аналогічний фрагмент, отриманий за допомогою ПЛР, клонують, переважно у вигляді злиття в рамці зчитування, у положенні, яке знаходиться проти ходу транскрипції послідовності ДНК, яка кодує оксидазу D-амінокислот у Bluescript sk. За допомогою відповідних серій стадій рестрикції, лігування і субклонування додають термінатор транскрипції nos до 3'-кінця кодувальної ділянки для одержання, залежно від кодувальної послідовності інших касет експресії типу: ТА29-оксидаза D-амінокислот-nоs у плазмідах Bluescript sk. У ще одному прикладі варіанта здійснення застосовують специфічну для пиляка промоторну ділянку SGB6, представлену в SEQ ID No. 1 USP 5470359. Наприклад, субклонований з pSGB6g1 (USP 5470359) геномний EcoR1-Nhe1-фрагмент розміром 3 т.п.н., що містить pSGBNE1, додатково субклонують для вбудовування клонованого з затупленими кінцями АраІІ/Xba1-фрагмента розміром 1500 пар основ у сайт Smal Bluescript ks. Аналогічно до описаного вище методу за допомогою додаткових стадій рестрикції і клонування цей фрагмент зливають у рамці зчитування проти ходу транскрипції з кодувальною послідовністю ДНК оксидази D-амінокислот. І в цьому випадку термінатор nos додають до 3'-кінця кодувальної ділянки одержуючи плазміди Bluescript sk, які містять інші касети експресії SGВ6-оксидаза D-амінокислотnos. В іншій серії аналогічних прикладів варіантів здійснення специфічну для пиляка промоторну ділянку RA8 з рису [EMBL/ реєстраційний номер у банку генів AF042275; Jean Js і ін. PMB, 39, стор.35-44, 1999] аналогічним способом зливають у сайті в рамці зчитування і проти ходу транскрипції відносно однієї з послідовностей ДНК, які кодують оксидазу D-амінокислот і 3'-термінатор nos, створюючи альтернативні касети експресії RА8 41 оксидаза D-амінокислот-поз у серіях векторів Bluescript sk. Приклад 6. Пари комплементарних конструкцій, які можна застосовувати для створення (а) материнської інбредної лінії, яка має умовну чоловічу стерильність, що залежить від обробки DLфосфінотрицином, і (б) комплементарної батьківської інбредної лінії, яка має умовну жіночу стерильність, що залежить від обробки DLфосфінотрицином. Перша конструкція ДНК, яку можна застосовувати для одержання материнської інбредної лінії рослин хлібних злаків або рису, яка має умовну чоловічу стерильність, що залежить від обробки DL- фосфінотрицином, містить три гени А), Б) і В). Ген А) являє собою послідовність ДНК, яка кодує фермент PAT, який має здатність N-ацетилювати L-фосфінотрицин, під функціональним контролем промоторної ділянки розміром ~ 1 т.п.н. з гена пластоціаніну ячменю (EMBL: Z28347) і придатної термінуючої ділянки, наприклад, гена nos або 35S, ген Б) являє собою кодувальну послідовність гена PAT, яка аналогічна до першої послідовності, і при цьому знаходиться під функціональним контролем тканинноспецифічної для жіночої квітки промоторної ділянки (такої як Р19 або Р26, описаної в прикладі 4) і придатного термінатора, і ген В) являє собою придатну кодувальну послідовність DAMOX, описану в прикладах 1, 2, 12 і 13, яка кодує, наприклад, мутантну форму оксидази Dамінокислот Rhodotorula gracilis, у якій метіонін у положенні 213 замінений на аргінін, серин, цистеїн, лізин, аспарагін або аланін, і/або тирозин у положенні 238 замінений на гістидин, серин, цистеїн, аспарагін або аланін, яка знаходиться під функціональним контролем тканинноспецифічної для чоловічої квітки промоторної ділянки (такої як SGB6 або RA8, описані в прикладі 5) і придатної термінуючої ділянки. Цю конструкцію збирають за допомогою стандартних методів і на основі інформації, наведеної в попередніх прикладах. Друга конструкція ДНК, яку можна застосовувати для одержання батьківської інбредної лінії рослин хлібних злаків або рису, яка має умовну жіночу стерильність, що залежить від обробки DLфосфінотрицином, містить три гени А), Г) і Д). Ген А) являє собою послідовність ДНК, яка кодує фермент PAT, який має здатність N-ацетилювати Lфосфінотрицин, під функціональним контролем промоторної ділянки з гена пластоціаніну ячменю і придатної термінуючої ділянки, наприклад, гена nos або 35S, ген Г) являє собою кодувальну послідовність гена PAT, яка аналогічна до першої послідовності і при цьому знаходиться під функціональним контролем тієї ж тканинноспецифічної для чоловічої квітки промоторної ділянки, яку застосовують у конструкції 1 (таку як SGB6 або RA8, описані в прикладі 5), і придатного термінатора, і ген Д) являє собою придатну кодувальну послідовність DAMOX, описану в прикладах 1,2, 12 і 13, яка кодує, наприклад, мутантну форму оксидази Dамінокислот Rhodotorula gracilis, у якій метіонін у положенні 213 замінений на аргінін, серин, цистеїн, лізин, аспарагін або аланін, і/або тирозин у положенні 238 замінений на гістидин, серин, цистеїн, 82665 42 аспарагін або аланін, що знаходиться під функціональним контролем тієї ж тканинноспецифічної для жіночої квітки промоторної ділянки (такої як P19 або Р26, описані в прикладі 4) , яку застосовують у конструкції 1, і придатної термінуючої ділянки. Цю конструкцію збирають за допомогою стандартних методів і на основі інформації, наведеної в попередніх прикладах. Пари описаних у цьому прикладі конструкцій ДНК містить, наприклад, такі елементи: Конструкція 1 А = промоторна ділянка гена пластоціаніну ячменю → кодувальна послідовність PAT, термінатор Nos; Б = промоторна ділянка гена P19 → кодувальна послідовність PAT, термінатор 35S; В = промоторна ділянка гена RA8 → кодувальна послідовність оксидази D-амінокислот Rhodotorula (мутант M213R), термінатор Nos. Конструкція 2 А = промоторна ділянка гена пластоціаніну ячменю → кодувальна послідовність PAT, термінатор Nos; Г = промоторна ділянка гена RA8 → кодувальна послідовність PAT, термінатор 35S; Д = промоторна ділянка гена P19 → кодувальна послідовність оксидази D-амінокислот Rhodotorula (мутант M213R), термінатор Nos. Приклад 7. Полінуклеотидні вектори для трансформації пшениці У прикладах 3, 4, 5 і 6 описане конструювання різних химерних генів, які входять в касети експресії, що звичайно клонують у Bluescript sk (наприклад, pBLRA8_Q01470, pBLRA8_P37967, pBLRA8_P40363, pBLB200_ Q99042, pBLB200_ P80324, pBLB200_ Q9HGY3 і pBLB200_ P24552 і т.д.). Необов'язково ці вектори одержують у кількості, необхідній для безпосередньої трансформації ДНК, при використанні в сполученні з застосовуваним для спільного бомбардування селектованим маркером, таким як pSOG35 (DHFR/метотрексат) або pUbi-Hyg (гігроміцинфосфотрансфераза/гігроміцин), як це описано в WO 98/39462. Переважно після одержання певної кількості вектори лінеаризують за допомогою відповідної рестриктази для видалення гена Bluescript, який обумовлює стійкість до ампіциліну. Необов'язково замість застосування спільного бомбардування за допомогою стандартних методів створюють додаткові вектори Bluescript, які додатково містять рослинний селектований маркерний ген, наприклад, який зумовлює стійкість до канаміцину, стійкість до гігроміцину, стійкість до метотрексату або стійкість до гліфосату, і застосовують їх для безпосередньої трансформації. У деяких наведених нижче прикладах ген PAT є основою для створення вектора й у цьому випадку DL-фосфінотрицин необов'язково можна застосовувати для відбору на певній стадії після трансформації. В іншому варіанті касети експресії вирізують із прийнятного рестрикційного фрагмента і клонують у векторах, отриманих з pIGPD9 (представлено на Фіг.12 WO 00/66748). Застосування цього вектора для трансформації дозволяє уникати переносу маркерних генів антибіотиків у рослину, тому що їх 43 підтримання в бактеріях впливає на комплементацію ауксотрофного мутанта hisB E.coli. Вектор містить ген, який експресує IGPD (hisB-продукт), і його додатково конструюють для вбудовування рослинного селектованого маркерного гена, такого як ген EPSPS, клонованого в сайті Xmal, наприклад, у pZEN16i і pZEN18i, як описано в WO 00/66748. В іншому варіанті застосовують маркерний ген, який дозволяє здійснювати позитивний відбір на манозі або ксилозі (USP 5767378). У конкретних прикладах застосування векторів pIGPD9 конструюють плазміди для трансформації пшениці. Наведеними як ілюстрація прикладами є pZEN18_ BLB200_ Q99042 і pZEN18_ BLRA8_Q01470. Ці вектори є похідними pIGPD9, містять ген EPSPS pZEN18 (WO 00/66748), і в цьому випадку несуть касети експресії або оксидази D-амінокислот-В200і B200i-(Q99042), або карбоксилестерази-nos RA8-(Q01470) відповідно. Великомасштабне одержання ДНК для застосування з метою трансформації рослин здійснюють за допомогою процедури Махі-prep (фірма Qiagen), використовуючи протоколи виробника. Приклад 8. Трансформація/регенерація пшениці полінуклеотидами, які містять химерні гени, експресія яких переважно відбувається в структурах або чоловічої, або жіночої репродуктивної системи і які кодують ферменти, які мають здатність окислювати D-фосфінотрицин і/або D-аланін, і/або D-лейцин, і/або D-метіонін і/або D- аспарагін, і/або D-аспартат, і/або D-глутамат В одному з прикладів незрілі зародки (довжиною 0,75-1,0мм) пшениці генотипу UC703 поміщають на середовище Мурасига і Скуга (MSсередовище), яке містить 3мг/л 2,4-Д і 3% сахарози. Приблизно через 4 год зародки поміщають на MS-середовище, яке містить 15% мальтози, 3% сахарози і 3мг/л 2,4-Д, покриті шаром агарози, який містить такі ж компоненти, що підтримується фільтрувальним папером. Зародкам дають пройти плазмоліз за 2-3 год до бомбардування. ДНК, отримані відповідно до методу, описаному в прикладі 7 і в наведених нижче прикладах, осаджують на золоті частинки розміром порядку мікрометра за допомогою стандартних методик. Чотири пластини-мішені, які несуть по 16 зародків на мішень, обстрілюють двічі за допомогою пристрою на основі гелію Biolistics фірми DuPont при тиску залпу 1100фунтів/кв. дюйм. Пластини обстрілюють з використанням екрана з розміром пор 80 меш, який поміщають між підтримуючою полицею і мішенню. Пластини-мішені після бомбардування витримують у темряві при 25°C протягом 24 год, а потім шматочки агарози з зародками поміщають на пластинки з MS-середовищем, яке містить 3% сахарози і 3мг/л 2,4-Д. Ще через 48 год окремі зародки видаляють зі шматочків агарози і поміщають безпосередньо на свіже середовище такого ж складу. Приблизно через 6 тижнів після введення генів тканину, що підлягає аналізу, поміщають на 3 тижні на MS-середовище, яке містить 3мг/л 2,4-Д , 3% сахарози і 0,2мг/л метотрексату. Потім тканину переносять на середовище для регенерації, яке складається з MSсередовища, доповненого 1мг/л зеатинрибозиду і 82665 44 1мг/л метотрексату. Через 2 тижні паростки, які регенерують, поміщають у стерильні контейнери із середовищем, яке включає MS-середовище половинної міцності, 2% сахарози, 1мг/л нафтилоцтової кислоти і 4мг/л метотрексату. У конкретних варіантах здійснення вектори, які містять химерні гени, експресія яких переважно відбувається в структурах чоловічої репродуктивної системи, використовують для спільного бомбардування з іншими селектованими маркерними генами. Так, наприклад, за допомогою методу, аналогічного до описаного у прикладі 3, одержують ДНК плазмід, таких як pBLRA8_P24552 (але які експресують послідовність оксидази Dамінокислот замість карбоксилестерази), під функціональним контролем промоторної ділянки RA8 і наносять на золоті частинки разом з pUbiHyg (плазміда, яка кодує ген гігроміцинфосфотрансферази під функціональним контролем промотору поліубікітину кукурудзи). У цьому випадку трансформацію і регенерацію здійснюють відповідно до описаного вище методу, за винятком того, що після бомбардування середовища для регенерації містять зростаючі концентрації від 2 до 20мг/л гігроміциду. Ще в одному варіанті здійснення пшеницю трансформують pZEN18_ BLB200_ Q99042, відбирають за допомогою гліфосату і регенерують відповідно до методу, описаному в прикладі 15 WO 00/66748. ДНК екстрагують з листової тканини рослин, отриманих у результаті трансформації, і здійснюють ПЛР у присутності селектованого маркерного гена і гена, який кодує оксидазу D-амінокислот. Позитивні за даними ПЛР рослини розмножують. У процесі цвітіння збирають маточки і пиляки й одержують з них PHK. Експресію ДНК підтверджують за допомогою Нозерн-блотингу. Крім того, гени оксидаз D-амінокислот експресують за допомогою векторів рЕТ у Е.соlі і частково очищають. Відповідні смуги експресованого протеїну вирізують із ДСН-гелю і застосовують для одержання поліклональних антитіл. Ці антитіла використовують для виявлення експресії в квіткових і інших тканинах за допомогою Вестерн-блотингу. Приклад 9. Спосіб ефективного одержання гібридних культур хлібних злаків, який передбачає обробку DL-фосфінотрицином як для боротьби з бур'янами, так і як хімічний гибридизуючий агент, і при якому покоління F1 гібридних рослин, отримане зі створеного в такий спосіб гібридного насінного матеріалу, має помітну як вегетативну, так і репродуктивну толерантність до обробки DLфосфінотрицином Хімічні гібридизуючі агенти є дорогими. Бажано використовувати як хімічний гібридизуючий агент відносно дешеву субстанцію, таку як гербіцид, що надходить у продаж. Такий шлях може забезпечувати також додаткову ефективність, оскільки при цьому боротьбу з бур'янами можна об'єднувати з хімічною гібридизацією. Однак існує цілий ряд проблем, які необхідно вирішити для реалізації такого проекту. Спочатку необхідно створити батьківську і материнську лінії, які мають толерантність до розглянутого гербіциду. Крім того, для одержання необхідної «умовної» фертиль 45 ності у відповідь на обробку гербіцидом необхідно створювати дві такі лінії, у яких ознака толерантності до гербіциду не експресувалася б у всіх тканин, але специфічно експресувалася в тканині так, щоб будь-яка одна з необхідних квіткових тканин зберігала вибірну чутливість. Таким чином, в одній лінії (материнська лінія) рослинна маса плюс жіноча тканина повинні зберігати толерантність, у той час як певна частина чоловічої квіткової тканини, що має вирішальне значення, повинна залишатися чутливою до обробки, а в іншій (батьківської лінії) конверсія повинна відбуватися тільки у певній ділянці жіночої гамето утворюючої тканини, яка має вирішальне значення і яка зберігає чутливість. Навіть при вирішенні вказаної задачі зберігається додаткова проблема, зв'язана з гібридним насінним матеріалом і поколінням F1. З урахуванням того, що це покоління культурної рослини повинно обов'язково нести принаймні два гени, які мають здатність надавати стійкість до гербіциду, бажано, щоб цей же гербіцид можна було застосовувати також для боротьби з бур'янами в культурах. Однак дуже важко створити комбінацію гербіцидів, тканинноспецифічних промоторних ділянок і зумовлюючих толерантність генів, яка дозволяла б застосовувати цей же гербіцид для обробки покоління F1. Імовірно, така гібридна культура може мати вегетативну толерантність, але давати невеликий врожай зерна або не давати його взагалі після обробки гербіцидом покоління F1. Наприклад, для гербіциду гліфосату звичайним механізмом стійкості є експресія стійкої форми EPSPсинтази. Важко знайти промоторну ділянку або комбінацію промоторних ділянок, які могли б забезпечувати досить високий рівень експресії REPSPS у всіх тканинах і в усі моменти часу, відмінні, наприклад, від стадії, що має вирішальне значення для розвитку тичинок або приймочок. Найбільш перспективним шляхом у цьому плані є застосування антисмислових генів або аналогічного підходу, при якому експресія R-EPSPS знаходиться під контролем не специфічного для тканини/конститутивного промотору і його тільки локального і тимчасового пригнічення, наприклад, у тичинках внаслідок експресії антисмислового гена EPSPS (див., наприклад, WO 99/46396). Однак у цьому випадку пригнічення експресії в тичинці (або приймочці) повинне контролюватися домінантним геном. Зрозуміло, що для будь-якого такого механізму обробка гербіцидом покоління F1 повинна приводити до одержання стерильної культури, яка не дає врожаю, через адитивні впливи домінантних генів чоловічої і жіночої умовної стерильності. Даний винахід стосується способу, який дозволяє вирішити вказану задачу шляхом застосування дешевого гербіциду DL-фосфінотрицину, який надходить у продаж, як для боротьби з бур'янами, так і як гібридизуючий агент для одержання гібридних хлібних злаків, і цей спосіб також дозволяє одержувати гібридні хлібні злаки або рис, для яких DL- фосфінотрицин (або L-фосфінотрицин), який застосовується для боротьби з бур'янами, може виявитися безпечним, і не приводити до зниження врожаю. Ще однією перевагою винаходу 82665 46 є те, що за рослинами, отриманими із самозапиленого насінного матеріалу покоління F1, які потім можуть виростати у вигляді рослин-самосівів, легше доглядати, оскільки, вони самі, як правило, повинні ставати стерильними при обприскуванні застосовуваними для боротьби кількостями DLфосфінотрицину. Це стосується також потомства, отриманого в результаті перехресного запилення рослин покоління F1 бур'янами (наприклад, червоним рисом) або іншими хлібними злаками. Даний винахід стосується генів і ферментів, які перетворюють нефітотоксичний компонент, Dфосфінотрицин, який входить до складу композиції гербіциду DL- фосфінотрицину, що надходить у продаж, в активну L-форму. Ген PAT, який зумовлює перетворення L-фосфінотрицину в N-ацетилL-фосфінотрицин, уже добре відомий і його застосовують на практиці для надання толерантності до DL- фосфінотрицину культурних рослин. При створенні винаходу несподівано був виявлений факт, який має вирішальне значення, що пшениця, яка містить ген PAT, функціонально зв'язаний з контролюючою експресію промоторною ділянкою пластоціаніну ячменю, має виражену репродуктивну толерантність до внесення DLфосфінотрицину в нормах витрати, які досягають принаймні 2кг/га. Це є особливістю конструкцій, яка має вирішальне значення, описаних у прикладі 6, які використовують для надання рослинам, вказаних у даному прикладі, зв'язаної з геном PAT ознаки стійкості при його експресії під функціональним контролем промоторної ділянки, яка забезпечує експресію практично тільки в зелених тканинах. Характерною рисою такої застосовуваної промоторної ділянки є те, що вона забезпечує такий шлях експресії PAT, при якому всі незелені квіткові тканини виявляються захищені відповідним чином при листовій обробці DLфосфінотрицином, при цьому в квіткових тканинах рівень експресії PAT є лише мінімальним у самих квіткових тканинах і особливо низьким у тих частинах, з якими зв'язана умовна стерильність. При експресії PAT під функціональним контролем промоторної ділянки пластоціаніну ячменю, очевидно, виникає така ситуація, оскільки практично весь застосовуваний для обприскування Lфосфінотрицин, який проникає через листя, захоплюється і перетворюється в нефітотоксичний Nацетил-L-фосфінотрицин до його транслокації в квіткові тканини, які розвиваються. Таким чином, згідно із даним винаходом L-фосфінотрицин, який здійснює на тканину вибірну стерилізуючу дію у батьківських лініях, утворюється лише протягом невеликого проміжку часу і локально з переміщається з флоеми нефітотоксичного Dфосфінотрицину за допомогою оксидази D- амінокислот. Шляхом точного підбору квіткових контролюючих елементів, які забезпечують експресію PAT, і елементів, які забезпечують експресію оксидази D-амінокислоти в комплементарній парі конструкцій (приклад 6), можна гарантувати, що в поколінні F1 гібриду короткочасна поява Lфосфінотрицину в квітковій тканині-мішені швидко нейтралізується відповідною появою експресії PAT у цей же момент часу в тому ж локусі тканини. Та 47 ка обробка гербіцидом не виявляє стерилізуючої дії на гібрид. Однак у наступних поколіннях відповідність між PAT і оксидазою D-амінокислот у тканинах квітки гібриду повинно порушуватися і тому утворені рослини знову будуть набувати чоловічу або жіночу стерильність при обробці застосовуваними для боротьби кількостями DLфосфінотрицину. За допомогою методів, описаних у прикладах 7 і 8, конструкціями, описаними в прикладі 6, трансформують пшеницю або (використовуючи стандартні методи, засновані на застосуванні супербіфункціональних векторів) рис, здійснюють відбір і регенерують паростки. Відбирають випадки трансформації в поколінні Т0 (за допомогою клонального розмноження паростків для підтримки необроблених ліній) і за допомогою методів, описаних у цілому в прикладах 1 і 2, відбирають придатні для розмноження випадки трансформації, такі як або батьківські інбредні лінії з умовною жіночою стерильністю, яка залежить від обробки DLфосфінотрицином, або материнські інбредні лінії з умовною чоловічою стерильністю, яка залежить від обробки DL-фосфінотрицином. Найбільш переважні лінії мають найбільш високу толерантність до гербіциду, для них характерна мінімальна втрата врожаю, найбільш виражений фенотип умовної стерильності і т.д. Відбирають альтернативні батьківські і материнські лінії і необов'язково піддають зворотному схрещуванню з прийнятними елітними лініями протягом декількох поколінь. Генетичні вставки в ці остаточно відібрані варіанти повністю охарактеризовані, встановлено, що вони зв'язані з генетичною основою ознак спадкування умовної фертильності і стійкості до гербіцидів і характеристиками експресованих генних продуктів. Потім проводять ущільнену посадку в поле відібраних у такий спосіб рослин материнської і батьківської лінії, узятих у прийнятних співвідношеннях, і обприскують DL-фосфінотрицином, виходячи з придатної норми витрати 0,05- 5кг/га, і в момент часу, який передує періоду раннього цвітіння, вибраного з метою оптимізації одержання гібридного насінного матеріалу. Отриманий у такий спосіб насінний матеріал має перевагу, яка полягає в тому, що з нього одержують рослини, не тільки цінні з погляду гібридної сили, але які також мають толерантність до композицій, що містять DLфосфінотрицин, які внаслідок цього можна застосовувати для боротьби з бур'янами. Гібридні насіння також мають перевагу, яку полягає в тому, що ознака толерантності до гербіциду, яку вони несуть, не повністю успадковується наступними самозапилюваними поколіннями або ауткросами, отриманими в результаті схрещування з спорідненими бур'янами. Так, наприклад, гібридні рослини рису, отримані за допомогою способу, запропонованого у винаході, можна вирощувати, використовуючи DL-фосфінотрицин як агент для боротьби з бур'янами, без помітної втрати врожаю. Однак наступні покоління рослин червоного рису, які є нащадками гібридних рослин рису, запилених пилком гібридного рису в результаті випадкового схрещування (ауткросингу) з материнською лінією червоного рису, повинні мати вегетативну толера 82665 48 нтність до DL-фосфінотрицину, але мати знижену здатність до самозапилення (через експресію оксидази D-амінокислот у квітковій тканині) і внаслідок цього давати меншу кількість зерен. Тому при використанні гібридних рослин рису, запропонованих у даному винаході, можна застосовувати DLфосфінотрицин для боротьби з бур'янами з істотно меншим ризиком наступного забруднення зерен червоним рисом через те, що ознака стійкості до гербіциду стійкість виявилася випадково схрещеною із близькоспорідненим червоним рисом. Аналогічно до цього друге покоління рослинсамосівів, таких як рис або пшениця, отримане з гібридної культури повинне у своїй більшості не утворювати зерна після обприскування DLфосфінотрицином. Приклад 10. Трансформація/регенерація пшениці полінуклеотидом, який містить химерний ген, експресія якого переважно відбувається в структурах чоловічої репродуктивної системи і який кодує фермент, який має здатність гідроліизувати імазаметабенз-метил або флампроп - метил, або флампроп-ізопропіл до відповідних кислот Касети експресії RА8-карбоксилестераза-по8 клонують у серіях векторів Bluescript sk, таких як pBLRA8_Q01470, pBLRA8_P37967 і pBLRA8_P40363, відповідно до описаного вище методу. Необов'язково їх застосовують для спільного бомбардування з ДНК, що містить маркери селекції, такими як pUbiHyg або pSOG35, відбирають і регенерують, використовуючи гігроміцин або метотрексат, відповідно до методу, описаному, наприклад, у прикладі 11 WO 98/ 39462. В іншому варіанті вектором pZEN18_ BLRA8_Q01470 безпосередньо обстрілюють або переносять його за допомогою вусів з карбіду кремнію в клітини кукурудзи і рослини кукурудзи відбирають і регенерують на гліфосаті, наприклад, відповідно до методів, описаних у прикладах 12 і 13 WO 00/ 66748. Згідно із одним варіантом трансформацію кукурудзи здійснюють за допомогою Agrobacterium tumefaciens, що містять супербіфункціональний вектор. Наприклад, касету експресії pZEN18 і химерний ген BLRA8Q01470 вирізують з конструкції pZEN18_ BLRA8_Q01470 і клонують у положеннях між правою і лівою пограничними послідовностями Т-ДНК отриманого з pSB1d супербіфункціонального вектора за допомогою серій субклонування і гомологічної рекомбінації за допомогою декількох стадій, аналогічних до описаних у WO 00/ 66748. Рослинний матеріал, отриманий з незрілих зародків, заражають Agrobacterium, який містить супербіфункціональний вектор, що несе маркерний ген гліфосату і химерний ген, запропонований у винаході. Рослини відбирають і регенерують за допомогою гліфосату відповідно до методу, описаному в WO 00/ 66748. ДНК екстрагують з листкових тканин рослин, отриманих після трансформації, і здійснюють ПЛР із метою виявлення присутності селектованого маркерного гена і гена, який кодує карбоксилестеразу. Позитивні за даними ПЛР рослини розмножують. У процесі цвітіння збирають маточки і пиляки й одержують з них PHK. Експресію ДНК 49 підтверджують за допомогою Нозерн-блотингу. Крім того, гени карбоксилестерази експресують за допомогою векторів рЕТ у Е.соlі і частково очищають. Відповідні смуги експресованого протеїну вирізують із ДСН-гелю і застосовують для одержання поліклональних антитіл. Ці антитіла використовують для виявлення експресії в квіткових і інших тканинах за допомогою Вестерн-блотингу. Приклад 11. Трансформація клітин кукурудзи з одержанням фенотипу, який характеризується підвищеною чутливістю до інгібування росту Sфлуазифопом у вигляді кислоти. Послідовності ДНК, які кодують послідовність протеїну 2-арилпропіоніл-СоА-епімерази AAR49827, база даних GENESEQP Derwent або Р70473 (Swissprot), що знаходяться в послідовностях, які входять у бази даних GENESEQN Derwent під реєстраційним номером AAQ44447 або в EMBL під реєстраційним номером RN2ARYLCO відповідно, одержують або за допомогою ЗТ-ПЛР або за допомогою синтезу для оптимізації експресії в рослинних тканинах. Створюють послідовності, що фланкують ПЛР-праймер, або синтетичні послідовності ДНК для вбудовування унікальних сайтів рестрикції, призначених для клонування. Переважно, а також у випадку, коли послідовність, яка кодує епімеразу, не містить неприйнятних внутрішніх сайтів, сайт Ncol або Ndel поміщають на 5'кінець для полегшення клонування в рамці зчитування злиттів з послідовностями, які додаються в 5'-орієнтації до ВРЗ. У іншому варіанті сайти рестрикції можна поміщати проти ходу транскрипції відносно сайта ініціації трансляції ATG вбудовуваних послідовностей для того, щоб вони згідно із Козаком відповідали трансляційним консенсусним послідовностям рослини. Послідовності ДНК, які кодують послідовність протеїну (жирна кислота з довгим ланцюгом)-СоАлігази P18163 або Р39518 (Swissprot), що знаходяться в послідовностях, які входять у EMBL під реєстраційними номерами J05439 або Х77783 відповідно, одержують або за допомогою ЗТ-ПЛР, або за допомогою синтезу. Створюють послідовності, які фланкують ПЛР-праймер, і синтетичні послідовності ДНК для вбудовування унікальних сайтів рестрикції, призначених для клонування. Переважно, а також у випадку, коли послідовність, яка кодує епімеразу, не містить неприйнятних внутрішніх сайтів, сайт Ncol або Ndel поміщають на 5'кінець для полегшення клонування в рамці зчитування злиттів у 5'-орієнтації з послідовностями, які додаються до ВРЗ. У іншому варіанті сайти рестрикції можна поміщати проти ходу транскрипції відносно сайта ініціації трансляції ATG вбудовуваних послідовностей для того, щоб вони згідно із Козаком відповідали трансляційним консенсусним послідовностям рослини. За допомогою методів, аналогічних до описаних вище в прикладах 1 і 2, вищевказані кодувальні послідовності спочатку клонують у pUC19 або Bluescript sk. Потім кодувальні послідовності вирізують за допомогою прийнятних рестриктаз, переважно, використовуючи сайт Ncol на 5'-кінці кодувальної послідовності клонують у pMJB1 для створення інших злитих у рамці зчитування касет 82665 50 експресії, які містять у напрямку від 5’ до 3' промотор CaMV 35S, енхансер трансляції TMV, кодувальну послідовність ацил-СоА-синтетази або епімерази -термінатор nos. Вектор pMJB1 є похідним плазміди pUC19, яка містить функціонуючий у рослині подвійний посилений промотор CaMV 35S; омега-енхансер TMV і послідовність термінатора nos. Схематичне зображення pMJBl представлене на Фіг.2 WO 98/ 20144. У такий спосіб створюють серії похідних pMJB1, такі як pMJ35S_ AAR49827 і т.д. і pMJ35S_ P18163 і т.д., які несуть інші касети експресії епімерази й ацил-соА-синтетази відповідно. За допомогою стандартних методів їх необов'язково додатково клонують у векторах, таких як pUbiHyg, які несуть селектовані маркерні гени рослин. В іншому варіанті створюють дві конструкції, одну для експресії (жирна кислота з довгим ланцюгом)-СоА-лігаз, а іншу для експресії 2арилпропіоніл-СоА-епімерази, схематичні зображення яких представлені на Фіг.3А і Фіг.3Б. Представлена на Фіг.3А конструкція ДНК містить у напрямку від 5' до 3' промотору ділянку поліубікітину кукурудзи (EMBL: ZM29159), послідовність ДНК, яка кодує ацил-СоА-синтетазу (EMBL: J05439), термінатор nos, промоторну ділянку CMV 35S, ділянку, яка кодує 5'-нетрансльовану лідерну послідовність, що містить інтрон ADH кукурудзи, послідовність ДНК, яка кодує фосфінотрицинуцетилтрансферазу, і термінатор nos. Як правило, цю повну конструкцію ДНК клонують у прийнятному сайті у векторі (наприклад, похідному pUC), що містить сайт ініціації реплікації Е.соlі і ген, який зумовлює стійкість до ампіциліну. Конструкція, представлена на Фіг.3б, є аналогічною до описаної вище, за винятком того, що послідовність ДНК, яка кодує ацил-соА-синтетазу, замінена послідовністю ДНК, яка кодує 2-арилпропіоніл-СоА-епімеразу (EMBL: Y08172). Цими векторами індивідуально й у сполученні один з одним трансформують культуру клітин рослин кукурудзи, за допомогою (кремнієвих) вусів. Наприклад, клітинні суспензії BMS-клітин трансформують шляхом контакту клітин з вусами з карбіду кремнію, на які нанесені ДНК, за допомогою методів, що у цілому описані в [Frame і ін., Plant J., 6, 1994, стор. 941-948]. Отриманий при цьому трансформований калюс відбирають за ознакою різного росту в середовищі, яке містить різні концентрації селектуючого агента, який, залежно від застосовуваної для трансформації ДНК, може являти собою, наприклад, гліфосат, гігроміцин, Lфосфінотрицин або канаміцин. При використанні конструкцій, представлених на Фіг.3а і 3б, відбір здійснюють за допомогою DL-фосфінотрицину або його похідного. Стабільно трансформовані лінії відбирають у вигляді калюсу, який утворився і продовжує рости в присутності селектуючого агента. Наприклад, після трансформації з використанням вусів з карбіду кремнію BMS-клітини вирощують на MS-середовищах, доповнених 1мг/л біалафосу. Через 2 тижні клітини переносять в основні MS-середовища, доповнені 5 мг/л біалафосу, де їх витримують протягом 6-8 тижнів. Отримані стійкі 51 калюси переносять у MS-середовища, доповнені 2мг/л біалафосу. Стабільно трансформовані калюси переносять у рідкі основні MS-середовища, у яких їм дають рости до 2 тижнів. Після цього періоду росту клітини пелетрують і ресуспендують у середовищі, розведеному 1:10. Зрештою їх вносять у 6-лунковий планшет для аналізу й обробляють 2,5 і 10част./млн R- або S-флуазифопу. Після витримування протягом 4 днів у присутності або R-, або S-флуазифопу, по 0,1мл від постійного об'єму клітин вилучають з лунок, промивають свіжими рідкими MS-середовищами і висівають на тверді основні MS-середовища. Здатність клітин до активного росту і поділу оцінюють через 7 днів. Трансформовані лінії порівнюють з нетрансформованими лініями у відношенні чутливості до S-флуазифопу, S-флуазифоп-бутилу або аналогічних до S-арилоксифеноксипропіонатів і їх похідних. Як кодувальні послідовності ДНК, які кодують ферменти, переважні для застосування в способі, запропонованому у винаході, відбирають ті послідовності, які при експресії в BMS-клітинах кодують фермент або комбінацію ферментів, які змінюють фенотип трансформованих клітин кукурудзи, від послідовностей, чутливих до інгібування росту лише високими концентраціями S флуазифопу або S-флуазифоп-бутилу до чутливих до істотно більш низьких (принаймні в 2-3 рази) концентрацій. Потім відібрані в такий спосіб кодувальні послідовності ДНК застосовують аналогічно до методів, описаних в інших прикладах, для створення ліній рослин кукурудзи, які мають або чоловічу, або жіночу стерильність, яка залежить від екзогенної обробки S-флуазифопом або складними ефірами S-флуазифопу. Приклад 12. Сайтнаправлений мутагенез, призначений для створення генів, які кодують оксидази D-амінокислот, які окисляють D-фосфінотрицин У цьому прикладі описаний шлях одержання генів, які кодують варіанти оксидаз D-амінокислот R.gracilis, що мають підвищену здатність окислювати D-фосфінотрицин. Ці гени застосовують відповідно до одного з переважних варіантів здійснення винаходу, які описані в інших прикладах, де створюють умовну стерильність, що залежить від обробки D-фосфінотрицином. У даному прикладі описані гени, які кодують ферменти, що мають одну амінокислотну заміну в положенні «213» і/або в положенні «238». Метіонін у положенні «213» позначений як «М» у нативній амінокислотній послідовності мотиву RCTMDSS. Тирозин у положенні «238» позначений як «Y» у нативній амінокислотній послідовності мотиву GGTYGVG. У даній галузі відомо багато шляхів одержання серій генів, які кодують варіанти оксидаз D-амінокислот з амінокислотними замінами в одному або обох із вказаних положень. Вибір ДНК-матриці для мутагенезу також залежить від призначення. Так, наприклад, коли планується застосовувати мутантий ген для експресії в рослинах, то як вихідну можна застосовувати синтетичну ДНК, яка кодує оксидазу D-амінокислот R. gracilis, таку як представлену в SEQ ID No.7. З іншого боку, коли планується безпосереднє застосування мутантного гена як вихідного для додаткових циклів мутагене 82665 52 зу і поліпшення заснованої на використанні дріжджів системи відбору (як у прикладі 13), то більш переважною є нативна послідовність ДНК (необов'язково удосконалена для експресії в S. cerevisiae). Переважний спосіб одержання придатних варіантів оксидаз D-амінокислот R. gracilis полягає в тому, що застосовують вироджені олігонуклеотиди і набір для мутагенезу типу Strategenes Quickchange mutagenesis. Методи здійснюють відповідно до інструкцій виробника. Наприклад (у випадку коли ДНК-матрицею для мутагенезу є нативна послідовність ДНК R. gracilis, що кодує оксидазу D-амінокислот) можна створювати пари «верхнього» (RGMUTTOP) і «нижнього» (RGMUTBOT) вироджених олігонуклеотидів, які складаються з 50-250 нуклеотидів і містять всередині представлені нижче фрагменти послідовностей. RGMUTTOP містить усередині послідовність (SEQ ID No. 8) tccccatgcaagcgatgcacgNNNgactcgtccgaccccgcttctccc gcctacatcattccccgaccaggtggcgaag tcatctgcggcgggacgNNNggcgtgggagactgggacttg. RGMUTBOT містить усередині послідовність (SEQ ID No. 9) caagtcccagtctcccacgccNNNcgtcccgccgcagatgacttcgc cacctggtcggggaatgatgtaggcgggaga agcggggtcggacgagtcNNNcgtgcatcgcttgcatgggga Крім того, ці два олігонуклеотиду, тобто RGMUTTOP і RGMUTBOT, несуть на кожному кінці послідовності, що після ренатурації один з одним, повинні утворювати 5'- і 3'-кінці, які точно відповідають кінцям, створеним, коли ДНК-матрицю розщеплюють у необхідній парі унікальних сайтів рестрикції (тобто конструюють таким чином, щоб ренатуровані олігонуклеотиди могли замінювати унікальний рестрикційний фрагмент, вирізаний із ДНК-матриці, яка кодує оксидазу D-амінокислот). По 0,5-1,0мкг кожного олігонуклеотиду переносять у центрифужну пробірку Еппендорфа об'ємом 0,5мл і витримують при необхідній температурі (наприклад, 94°C , залежно від розрахованих температур плавлення) протягом 5хв і повільно відпалюють, охолоджуючи до кімнатної температури. Потім ДНК-матрицю (наприклад, дріжджовий біфункціональний вектор pYES6/CT) вирізують за допомогою двох рестриктаз (що відповідають двом унікальним сайтам рестрикції в ДНК-матриці, які перекривають ділянку, що включає два кодони, які повинні бути замінені і які є характерними для кінців ренатурованої ДНК), очищають на гелі, лігують з ренатурованим олігонуклеотидом і трансформують клітини дріжджів, наприклад, відповідно до методу, описаному в прикладі 13, здійснюючи тим самим експресію в дріжджах інших оксидаз Dамінокислот, створених за допомогою мутагенезу. Потім за допомогою описаного раніше методу відбирають клони дріжджів, які характеризуються найбільш швидким ростом у присутності аналогів D-фосфінотрицину (таких як D-гомоцистеїнова кислота) або D-фосфінотрицину (коли спільно експресують ген PAT) як єдине джерело азоту, як колонії, які містять варіант кодувальних послідовностей оксидази D-амінокислот з необхідними 53 властивостями. В іншому варіанті експресію оксидази D-амінокислот здійснюють у мікроорганізмі, відмінному від дріжджів, і, наприклад, використовуючи для контролю експресії промотор t7 вектора рЕТ у лізогені Е.соlі. У цьому випадку після трансформації індивідуальні колонії можна відбирати, висівати репліки, вирощувати, індукувати, лізувати і здійснювати скринінг на необхідну субстратну активність у відношенні D- фосфінотрицину, використовуючи відомі в даній галузі методи (наприклад, флуориметриний скринінг утворення пероксидази або колориметричний аналіз утворення аміаку). Відібрані в такий спосіб клони дріжджів або інших мікроорганізмів вирощують, одержують ДНК і повнорозмірну послідовність ДНК оксидази D-амінокислот клонують за допомогою ПЛР із правильним зчитуванням і клонують у pCRBlunt II, використовуючи набір Invitrogens Zero Blunt TOPO. Визначають кодувальні послідовності оксидази Dамінокислот, характерні для відібраних клонів. Ці кодувальні послідовності оксидази D-амінокислот додатково субклонують для експресії у векторі рЕТ (наприклад, Novagen рЕТ 24а) і трансформують штам Е.соlі BL21 DE3. Клітини вирощують у ферментері в LСМ50-середовищі, яке містить 100мкг/мл канаміцину, індукують ІПТГ (ізопропілтіогалактозид), збирають, розщеплюють і екстракт частково очищають і аналізують у відношенні активності оксидази D-амінокислот (метод докладно описаний нижче). Відбирають гени оксидази Dамінокислот, які кодують оксидази D-амінокислот, які мають відповідну стабільність і найбільш високу активність (kcat/ Km) на мг чистого протеїну у відношенні D-фосфінотрицину при рН 7,0. Створюють додаткові серії конкретних послідовностей ДНК, які кодують оксидази Dамінокислот, що мають певну субстратну специфічність. Зокрема, створюють гени, які кодують оксидазу D-амінокислот Rhodotorula gracilis, у якій метіонін у положенні 213 замінений аргініном, серином, цистеїном, лізином, аспарагіном або аланіном і/або тирозин у положенні 238 замінений гістидином, серином, цистеїном, аспарагіном або аланіном. Застосовувані для цієї мети методи описані вище, за винятком того, що створюють і застосовують для здійснення кожної індивідуальної або подвійної заміни не суміш олігонуклеотидів, а пари індивідуальних олігонуклеотидів. Кожну отриману в такий спосіб кодувальну послідовність оксидази D-амінокислот клонують для (ненаправленої) експресії за промотором Т7 у Novagen pET 24A і трансформують штам E.coli BL21 DE3. Клітини вирощують у ферментері об'ємом 1,0л у LСМ50-середовищі, доповненому 100 мкг/мл канаміцину, індукують експресію 1мM ІПТГ і збирають за допомогою низькошвидкісного центрифугування. Середовище LCM50 містить (у 1 літрі) KH2PO4 (3г), Na2HPO4 (6г), NaCl (0,5г), казеїновий гідролизат (фірма Oxoid) (2г), (NH4)2SO4 (10г), дріжджовий екстракт (фірма Difco) (1г), гліцерин (35г) (ці інгредієнти об'єднують у розчині й автоклавують). Наступні додаткові інгредієнти стерилізують фільтрацією у вигляді розчинів і додають до середовищ: MgSO4 (2,5мл розчину з концентраці 82665 54 єю 246,5мг/мл), тіамін•НСІ (1мл розчину з концентрацією 8мг/мл), CaCl2•2H2O (0,2мл розчину з концентрацією 147г/л), * маточний розчин Fe SO4•7H2O/ лимонна кислота (2мл), **розчин мікроелементів (5мл) і доводять до 1 літра. * маточний розчин Fe SO4•7Н2О/лимонна кислота на 100мл містить FeSO4 •7Н2О (0,415мг), лимонну кислоту (0,202мг). ** Розчин мікроелементів має наступний склад на 1мл: AlCl3•6H2O (20мг), CoCl2 •6Н2О (8мг), KCo(SO4)2•12 H2O (2мг), CuCl2•H2O (2мг), H3BO3 (1мг), KI (20мг), MnSO4•H2O (0,8мг), Na2MO4•2H2O (4мг), ZnSO4•7H2O (4мг) Приблизно 7г клітин у вологому стані промивають водою. Клітини ресуспендують у рівному об'ємі 50мМ буфера /Mops/KOH, pH 7,0, який містить 2мМ ЕДТК, 2мМ ДТТ і 0,01мM ФАД. Клітини остаточно суспендують за допомогою скляного гомогенізатора і потім руйнують за допомогою довбальної головки пристрою для руйнування клітин типу Basic Z, який входить у набір Constant Systems (фірма BudBrooke Rd, Варвік, Великобританія), при 13500фунтів/кв.дюйм. Неочищений екстракт витримують у холодних умовах (~ 4°C), центрифугують при 30000хg протягом 1год і дебрис відкидають. Частину білкового екстракту розганяють за допомогою ДСН-ПААГ, фарбуючи кумасі діамантовим голубим, і шляхом поступового порівняння з отриманими аналогічним способом екстрактами клітин, які містять тільки «порожній» вектор рЕТ, встановлюють, що 2-50% усього розчинного білка в екстракті являє собою оксидазу Dамінокислот. Частину білкового екстракту заміняють буфером 50мМ Mops/KOH, pH 7,0, що містить 0,01мM ФАД. Його розбавляють таким же буфером у стандартній кисневій електродній комірці (відкаліброваної при 25°C у діапазоні від нуля до концентрації насичення кисню). Необов'язково оксидазу D-амінокислот очищають додатково за допомогою іонообмінної хроматографії, на фенілсахарозі, фракційного осадження в сульфаті амонію і гель-фільтрації. Аналізи, які проводять при 25°C, починають, додаючи 200мМ розчин амонієвої солі DL-фосфінотрицину до розведеного ферменту. Кінцевий об'єм у кисневій електродній комірці становить 2мл. Вимірюють швидкості поглинання кисню (після віднімання будь-яких зсувів основою лінії). Мутантна форма оксидази Dамінокислот R. gracilis M213R (у якій метіонін замінений аргініном) окисляє DL-фосфінотрицин із швидкістю ~14 нмолів/хв/мг білка неочищеного екстракту (встановлено, що чистота оксидази Dамінокислот в екстракті становить 35±15% від загального протеїну). Мутантна форма оксидази Dамінокислот R. gracilis M213S (метіонін замінений серином) окисляє DL-фосфінотрицин із швидкістю ~4 нмоля/хв/мг білка неочищеного екстракту (встановлено, що чистота оксидази D-амінокислот у кожному екстракті становить 35±15% від загального білка). У контрольних експериментах чиста Lформа не окисляється зовсім, чиста D-форма залежно від концентрації окисляється з більшою швидкістю (аж до дворазової) у порівнянні з DLформою. В аналогічних умовах нативна (немутантна) оксидаза D-амінокислот R.gracilis має невисо 55 ку здатність ( 200 трансформованих колоній шляхом зскрібання колоній із планшета в L-бульйон і потім вирощують, використовуючи розведення 1:100 і 1:1000, і послідовно пересівають у L-бульйон/ампіцилін і витримують при 37°C протягом 1-2 тижнів, для того, щоб гарантувати велику кількість клітинних поділів. Аналогічну процедуру здійснюють с багатьма планшетами. Мініпрепи (miniprep) ДНК біфункціонального вектора одержують з вирощених протягом ночі клітин і знову трансформують ними дріжджі. Трансформовані дріжджі вирощують і колонії, які містять оксидази D-амінокислот з поліпшеними характеристиками, відбирають за допомогою описаного вище методу. В іншому варіанті експресію і відбір оксидаз Dамінокислот здійснюють у деяких інших видах мікроорганізмів, відмінних від дріжджів, і, наприклад, використовуючи для контролю експресії промотор t7 вектора в лізогені E. соlі. У цьому випадку кодувальну послідовність оксидази D-амінокислот (необов'язково піддану мутагенезу за допомогою Мn2+-ПЛР) клонують у векторі рЕТ, трансформують штам E.coli XL1 red і після пересівання декількох поколінь знову трансформують лізоген E.coli, такий як E.coli BL212 DE3. Потім індивідуальні колонії збирають, висівають репліки, вирощують, індукують ІПТГ, лізують і здійснюють скринінг на потрібну активність при використанні як субстрату D-фосфінотрицину, використовуючи відомі в даній галузі методи (наприклад, застосовуючи флуориметричний скринінг утворення пероксидази або колориметричний аналіз утворення аміаку). Згідно із одним варіантом мутагенез і відбір кодувальних послідовностей оксидази Dамінокислот з поліпшеними характеристиками здійснюють безпосередньо в Rhodotorula gracilis. R.gracilis вирощують у мінімальному середовищі в присутності D-аланіну або D-глутамату як єдиного джерела азоту, піддають послідовним циклам мутагенезу з використанням EMS і відбирають шляхом пересівання в середовища із зростаючою строгістю, у яких проводять заміну єдиного джерела азоту з D-глутамату на D-гомоцистеїнову кислоту. В одному з варіантів здійснення Rhodotorula gracilis трансформують одним з описаних вище дріжджових векторів для того, щоб відбувалася експресія PAT (або при вирощуванні в присутності галактози, або конститутивно), і кінцеву стадію строгого відбору здійснюють у присутності DLфосфінотрицину або D-фосфінотрицину як єдиного джерела азоту. Необов'язково середовища, які застосовують для відбору дріжджів, містять невисоку концентрацію розчинника (наприклад, 0,1% ДМСО). Приклад 14. Одержання D-фосфінотрицину в енантіомерно чистій формі Штам E.coli BL21, який містить DE3 плюс RIL, трансформують вектором Novagen рЕТ 24А, який несе кодувальну послідовність PAT (A02774), клонують для (ненаправленої) експресії за промото 57 ром Т7. Ці клітини вирощують до оптичної густини OГ600HM ~ 40 у 10-літровому ферментері з LCM50середовищем, яке містить канаміцин, індукують 0,2мМ ІПТГ, збирають за допомогою низкькошвидкісного центрифугування і швидко переносять у мінімальні середовища, які містять 9,91г амонієвої солі D/L- фосфінотрицину (ФФТ). Мінімальні середовища містять (у 1 літрі): Na2HPO4 (6г), KH2PO4 (3г), NaCl (1г), NH4Cl (1г), розчинені у воді й автоклавовані, і після стерилізації фільтрацією до них додають наступні розчини: CaCl2 (1мл розчину з концентрацією 14,7г/л ), MgSO4 (1мл розчину з концентрацією 246,5г/л), тіамін•НСl (5мл розчину з концентрацією 1мг/мл), глюкозу (30мл 20%-ного розчину, автоклавованого окремо), ДМСО 0,5мл. Нижче наведений більш докладний опис процесу ферментації. Середовище, яке міститься в 10-літровому ферментері, LCM 50 інокулюють, використовуючи як інокулят (200мл) штам E.coli BL21, що виріс у LB-бульйоні, який містить кодон DE3 плюс RIL, що несе ген PAT, і підтримують при 30°C, при швидкості перемішування 200об./хв, рН 6,5, концентрації кисню 50% від насичуваній концентрації у повітрі. Після вирощування протягом 12 год значення ОГ600нм становить ~ 30. Потім у культурі індукують експресію PAT, додаючи 0,2мМ ІПТГ. Через 1,5год, культуру, як правило, вирощують додатково до досягнення ОГ600нм ~ 40, потім клітини збирають центрифугуванням і промивають у 8л мінімального середовища. Клітини знову центрифугують і ресуспендують до кінцевого об'єму 10л у ферментері в мінімальних середовищах, що містять 9,91г амонієвої солі D/Lфосфінотрицину, що надходить у продаж, і доповнених 0,2мм ІПТГ. Температуру підвищують до 37°C і здійснюють моніторинг середовища ферментера за допомогою протонного і фосфорного ЯМР із метою визначення: а) моменту часу, коли рівні глюкози значно падають і необхідно їх поповнення, і б) ступеня перетворення фосфінотрицину в N-ацетилфосфінотрицин. Через ~ 12 год у ферментер додають ~ 500 г глюкози. Встановлено, що утворення N-ацетилфосфінотрицину починається через декілька годин і через ~ 20 год > 93% L-ФФТ (46,5 об. % D/L) перетворюється в N-ацетил-LФФT. Незабаром після цього зброджуване середовище збирають і клітини видаляють за допомогою низькошвидкісного центрифугування. D-ФФТ очищають від зброджуваного середовища за допомогою іонообмінної хроматографії. Зброджуване середовище (~ 9,5л) зберігають при 4°C. Його змішують з 900мл катіоннообмінною смолою типу Dowex 50W-X8, зернистість 200-400 меш (попередньо обробленою HCl) у H+ -формі, так що значення рН супернатанта, що знаходиться над смолою, падає до ~ 3,0. Смолі Dowex дають осадитися під дією сили тяжіння і супернатант разом з 2л водних змивів смоли Dowex зливають і центрифугують до одержання прозорого розчину. Промиту смолу Dowex відкидають (зрештою, повторно використовують у циклі). Прояснений супернатант потім екстрагують за допомогою ділильної лійки етилацетатом (1/4 від об'єму супернатанта) і 82665 58 зберігають водну фракцію (~ 12л). Потім додають ще 2,3л Н+-форми смоли Dowex 50W-X8 і перемішують з ~ 12л. Потім смолі дають осадитися. На цій стадії значення рН супернатанта, що знаходиться над смолою, становить -1,6. Супернатант зливають і відкидають і смолу промивають ~ 12л води і знову дають осадитися. Супернатант знову відкидають і смолу зливають у ділильну лійку Бюхнера, виготовлену із спеченого матеріалу, і промивають ще ~ 4,5л води (для видалення більшої частини N-ацетилфосфінотрицину, який залишився). Більшу частину фракції, яка містить Dфосфінотрицин, елюють із смоли за допомогою 15л 0,4М гідроксиду амонію з наступним промиванням смоли 1,4л води. Значення рН цієї фракції, що містять D-фосфінотрицин, становить ~ 11,4. Необов'язково його знижують до значення ~ 10, додаючи, наприклад, -0,13 молів оцтової кислоти і ~ 600мл катіонообмінної смоли в H+-формі. Якщо додають смолу, то їй дають осадитися. Фракцію, яка містить D-фосфінотрицин (супернатант), потім вносять у колонку об'ємом 565мл (5х28 див), заповнену аніонообмінною смолою Dowex 1X8 - 400 меш у ОН-формі (попередньо врівноважену NaOH і промиту водою). У колонку вносять градієнт ацетату амонію (від 0M до 0,32M), використовуючи його в кількості, що становить до 17 об'ємів колонки. При цьому збирають 55мл фракцій. Фракції оцінюють за допомогою УФ при довжині хвилі 215нм, а також за допомогою протонного ЯМР і 31 Р-ЯМР. Цей аналіз дозволяє встановити, що фосфінотрицин з високою чистотою елюється між фракціями 39 і 78. N-ацетилфосфінотрицин елюють у вигляді незв'язаного продукту на ранніх стадіях елюювання з використанням градієнта, а деяка кількість глутамату елюється пізніше у фракціях 79-90. Фракції 63-78 (що відповідають 6-7,6 об'ємам колонки) містять основну масу чистого фосфінотрицину. Фракції, які містять фосфінотрицин, сушать виморожуванням і підтверджують їх чистоту за допомогою протонного або фосфорного ЯМР (не виявлено ніяких інших піків крім ацетату, > 95% органічного продукту являє собою фосфінотрицин), хоча на основі відмінностей між розрахованою і виявленою сухою масою встановлено, що деяка залишкова кількість неорганічних солей (наприклад, хлориду амонію) присутня у зразках фосфінотрицину. При застосуванні Dфосфінотрицину на практиці (наприклад, для обприскування рослин) неорганічні домішки можна розглядати як інертні добавки, при цьому необхідно тільки здійснювати відповідний перерахунок концентрацій, коли розчини D-фосфінотрицину готують шляхом зважування сухих зразків. Слід очікувати, що фосфінотрицин, виділений за допомогою описаного вище методу, повинен являти собою практично енантіомерно чистий Dфосфінотрицин. Це доводять за допомогою флуоресцентної PXBP відповідно до методу Ноrі і ін., J.Chrom. B 776, стор.191-198, 2002. Наприклад, 50мкл будь-якого DL-фосфінотрицину, що надходить в продаж (0,01-10мк/мл), або тестованого зразка розчиняють у 0,1М боратному буфері, рН 8,5 і змішують з 200мкл такого ж боратного буфе 59 ра. Потім додають 50мкл 18мМ FLEC ((+)-1-(9флуореніл)етилхлорформіат) і суміші додатково інкубуютть протягом 30хв при 40°C. Надлишок FLEC видаляють струшуванням протягом 3хв із 500мкл етилацетату. 100мкл нижнього водного шару видаляють і аналізують за допомогою PXBP. РХВР-колонку Inertsil ODS2 (15x4,6), розмір частинок 5мкм врівноважують, використовуючи суміш: 77% 10мМ водного ацетату амонію (рН 5,0):23% ацетонітрилу при швидкості потоку 0,8мл/хв. Зразок об'ємом 2мкл вводять у колонку і розганяють у ізократичних умовах протягом 60хв і оцінюють шляхом флуоресцентного виявлення при довжині хвилі збудження 260нм і довжині хвилі випромінювання 305нм. Встановлено, що D- і Lізомери фосфінотрицину добре розділяються і елюються через 12,4 і 13,4 хв відповідно. Зразок D-фосфінотрицину, виділений за допомогою способу, запропонованого в даному винаході, розганяють і для нього встановлено, що його енантіомерний надлишок (енантіомерна чистота) перевищує 99%. Це встановлено шляхом введення в колонку відомих кількостей DLфосфінотрицину, що надходить у продаж, і виявлення того, наскільки мале збільшення розташованого праворуч піка, що елююється через 13,4хв, яке можна знайти на фоні, чіткого одиночного піка, що елююється через 12,4хв, що відповідає зразку. Крім того, метод PXBP застосовують для визначення кількості фосфінотрицину на основі інтеграції піка і порівняння із стандартною кривою. Крім того, загальну кількість фосфінотрицину оцінюють шляхом інтеграції ЯМР-сигналів. Встановлено, що в цілому, використовуючи як вихідний продукт -9,91г DL-рацемату, одержують ~ 1,9г (вихід 38%) чистої амонієвої солі Dфосфінотрицину, енантіомерний надлишок якої перевищує 99%. 50-70% сухої маси зразка припадає на частку неорганічних солей, які зберігаються при цій обробці. їх необов'язково видаляють за допомогою додаткових стадій іонообмінної хроматографії і сушіння виморожуванням (після заміни на леткі солі). Приклад 15. Одержання енантіомерно чистих S-флуазифопу і S-флуазифоп-бутилу S-флуазифоп у вигляді кислоти і її ефіру одержують за допомогою методів, аналогічних до добре відомих методів одержання R-флуазифопу й описаних у літературі [див., наприклад, у D. Cartwright у: Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference-Weeds 2, cтop. 707-716 (1989)] і в наведених у цій публікації посиланнях). Методи одержання RS-рацемату також добре відомі. Необов'язково чистий S-флуазифоп одержують за допомогою препаративного хроматографічного розділення з RS-рацемату (наприклад, відповідно до методу, описаному в Bewick (1986) у Pesticide ScL, 17, стор.349-356). З RS-суміші флуазифоп-бутилу виділяють S-енантіомер, енантіомерний надлишок якого перевищує 97%, за допомогою РХВР-методу, описаного в Bewick. B іншому варіанті S-флуазифоп безпосередньо виділяють із суміші RS-кислот за допомогою хроматографії на прийнятній циклодекстриновій колонці [Journal of Chromatography 634(2), 1993, стор. 197-204] або з 82665 60 використанням інших методів хроматографії на колонках [Biomedical Chromatography, 12(6), стор. 309-316, 1998; Journal of Chromatography A, 937(12), стор. 135-138, 2001]. Інші загальні препаративні методи виділення енантіомерно чистих Sарилоксифеноксипропіонових кислот і їх ефірів описані в [Chimiques Des Pays-Bas, 110 (05), 11991, стор.85-188]. У цьому випадку одержують фермент карбоксилестеразу NP і застосовують для енантіоселективного гідролізу рацемічних ефірів арилоксифеноксипропіонатів (кислоти, які утворюються, легко можна відокремлювати від ефірів, що залишилися). Відповідно до переважного методу енантіомерно чистий S-флуазифоп одержують за допомогою безпосереднього синтезу. На першій стадії синтезують проміжний продукт 4-(5трифторметилпіридин -2-ілокси)фенол. Одержання 4-(5-трифторметилопіридин -2ілокси)фенолу До суспензії карбонату калію (13,81г, 99 ммолів) у безводному ДМФ (200мл) додають при кімнатній температурі гідрохінон (10,0г, 91ммоль) і суміш перемішують протягом 30хв. Додають 2хлор-5-трифторметилпіридин (16,49г, 91ммоль) і суміш нагрівають до 90°C протягом 16 год. Реакційну суміш зливають на воду, підкисляють розведеною HCl і потім екстрагують етилацетатом. Об'єднані органічні шари промивають водою, сушать над сульфатом магнію, фільтрують і розчинник видаляють при зниженому тиску. Після хроматографії на колонках на силікагелі з використанням 10-20% етилацетату/гексану як елюента одержують, наприклад, ~ 10,22г 4-(5трифторметилпіридин -2-ілокси)фенолу (вихід ~ 44%). δН (400 МГц; CDCl3) 8,45, s, 1H; 7,9, dd, 1H; 7,0, m, 1H; 7,0, d, 2Н; 6,8, d, 2H; 5,75, s, 1H. На наступній стадії синтезують проміжний продукт бензиловий ефір (R)-2гідроксипропіонової кислоти Одержання бензилового ефіру (R)- 2гідроксипропіонової кислоти До суспензії натрій-D-лактаму в ДМФ при 0°C в атмосфері азоту додають по краплях бензилбромід. Суміш перемішують при 0°C протягом 16 год. Потім розчинник видаляють при зниженому тиску і залишок розподіляють між діетиловим ефіром і водою. Шари розділяють і органічну фазу промивають насиченим розчином бікарбонату натрію, соляним розчином, потім сушать над сульфатом магнію, фільтрують і розчинник видаляють при зниженому тиску, одержуючи бензиловий ефір (R)2-гідроксипропіонової кислоти у вигляді безбарвного масла. Наприклад, одержують 2,81г (вихід 88%). δН (400 МГц; CDCl3) 7,4, m, 5Н; 5,23, s, 2Н; 4,35, q, 1H; 2,85, d, 1H; 1,45, d, 3Н. На наступній стадії синтезують проміжний продукт бензиловий ефір (S)2-[4-(5трифторметилметилпиридин-2илокси)фенокси]пропіонової кислоти. Одержання бензилового ефіру (S)-2-[4-(5трифторметилметилпіридин-2ілокси)фенокси]пропіонової кислоти
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюMethod for selective obtaining of plants with male or female sterility
Автори англійськоюHawkes Timothy Robert, Mitchell Glynn, Hadfield Stephen Thomas, Thompson Paul Anthony, Viner Russel, Zhang Yan
Назва патенту російськоюСпособ выборочного получения растений с мужской или женской стерильностью
Автори російськоюХоукс Тимоти Роберт, Митчелл Глунн, Хедфилд Стефен Томас, Томпсон Пол Энтони, Винер Русселль, Занг Ян
МПК / Мітки
МПК: A01H 5/00, C12N 15/82, A01H 1/00
Мітки: одержання, чоловічою, стерильністю, спосіб, вибірного, жіночою, рослин
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/40-82665-sposib-vibirnogo-oderzhannya-roslin-z-cholovichoyu-abo-zhinochoyu-sterilnistyu.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб вибірного одержання рослин з чоловічою або жіночою стерильністю</a>
Попередній патент: Система охолодження електричних шин струмопроводів електростанцій
Наступний патент: Електрод
Випадковий патент: Землеобробний інструмент для землеробства