Лікування запальних захворювань бета-дефензинами ссавців

Реферат: Винахід стосується застосування бета-дефензину людини, що має щонайменше 80% ідентичність до амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4, при виробництві лікарського препарату для лікування запального захворювання або розладу, вибраного з групи, що включає ревматоїдний артрит, остеоартрит, розсіяний склероз, атеросклероз, склеродермію (системний склероз), вовчак, системний червоний вовчак (SLE), (гострий) гломерулонефрит, астму, хронічні неспецифічні захворювання легенів (COPD), синдром дихальної недостатності (ARDS), васкуліт, увеїт, дерматит, атопічний дерматит, облисіння, риніт (алергічний), алергічний кон'юнктивіт, міастенію gravis, склеродерміт, саркоїдоз, псоріатичний артрит, псоріаз, анкілозуючий спондилоартрит, ювенільний ідіопатичний артрит, базедову хворобу, ксеродерматоз та хворобу Бехчета. UA 99774 C2 (12) UA 99774 C2 UA 99774 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Ця заявка містить Перелік послідовностей у формі, що читається комп'ютером. Форма, що читається комп'ютером, включається в даний документ за посиланням. Даний винахід стосується супресії активності фактора некрозу пухлини-альфа (TNF-альфа або TNF-α) за допомогою введення бета-дефензинів ссавців, які мають практичну значимість при лікуванні різноманітних розладів, включаючи лікування патологічних станів, пов'язаних із запаленням Передумови Дефензини людини Серед багатьох інших елементів ключовими компонентами природженого імунітету є антимікробні пептиди (AMP), які окремо виявляють значну селективність, але разом здатні швидко знищувати широкий спектр бактерій, вірусів та грибів. Біологічне значення AMP підкреслюється повсюдним поширенням у природі, і вони, можливо, продукуються усіма багатоклітинними організмами. У людей переважаючими AMP є дефензини. Дефензини людини являють собою невеликі катіонні пептиди, які можна поділити на α- і β-дефензини на основі топології їх трьох внутрішньомолекулярних цистеїнових дисульфідних зв'язків. α-дефензини далі можна підрозділити на виділені вперше з гранул нейтрофілів (HNP1-4) і такі, що експресуються клітинами Панета в криптах тонкої кишки (HD5 і HD6). β-дефензини переважно експресуються епітеліальними клітинами в різних тканинах і органах, включаючи шкіру, трахею, шлунково-кишковий тракт, сечостатеву систему, нирки, підшлункову та молочну залози. Найкраще охарактеризованими членами родини β-дефензинів є hBD1-3. Проте, за допомогою різних інструментів біоінформатики в людському геномі було відзначено майже 40 відкритих рамок зчитування, що кодують передбачувані гомологи β-дефензину. Деякі з дефензинів людини продукуються конститутивно, в той час як інші індукуються прозапальними цитокінами або екзогенними мікробними продуктами. Стало набагато зрозуміліше, що дефензини людини на додаток до їх безпосередньої антимікробної активності також мають широкий діапазон імуномодуляторних/альтернативних властивостей. Вони включають індукцію різноманітних хемокінів і цитокінів, хемотаксичну і апоптичну активності, індукцію простагландину, вивільнення гістаміну та лейкотрієну, інгібування комплементу, стимуляцію дозрівання дендритних клітин за допомогою проведення сигналу toll-подібним рецептором і стимуляцію кліренсу патогенів нейтрофілами. Крім того, дефензини людини також грають роль у загоєнні ран, проліферації епітеліальних клітин і клітин фібробластів, ангіогенезу і васкулогенезу. Існує все більше доказів того, що дефензини людини відіграють важливу роль в багатьох інфекційних і запальних захворюваннях. Надекспресія дефензинів людини часто спостерігається у запаленій та/або інфікованій шкірі, найбільш ймовірно через місцеву індукцію мікробними компонентами або ендогенними прозапальними цитокінами. При псоріазі hBD2 та hBD3 є надлишковими, та в ураженому епітелії пацієнтів зі звичайними вуграми або поверхневим фолікулітом спостерігалась значуща підвищуюча регуляція hBD2. З іншого боку, даунрегуляцію hBD2 та hBD3 пов'язували з атопічним дерматитом. Клубову хворобу Крона пов'язували з недостатньою експресією HD5 та HD6 та при хворобі Крона в товстій кишці даунрегулюється експресія hBD2-4. Цитокіни Цитокіни являють собою невеликі поліпептиди, що секретуються, з вищих еукаріот, які відповідають за міжклітинну передачу сигналу та які впливають на зростання, поділ та функції інших клітин. Вони являють собою сильнодіючі, плейотропні поліпептиди які, наприклад через відповідні рецептори, діють як місцеві або системні міжклітинні регуляторні фактори та, отже, відіграють вирішальну роль в багатьох процесах, таких як імунітет, запалення та гемопоез. Цитокіни продукуються різноманітними типами клітин, включаючи фібробласти, ендотеліальні клітини, епітеліальні клітини, макрофаги/моноцити та лімфоцити. TNF-α залучається у різних патофізіологічних процесах та може бути або захисним, як при захисті хазяїна, або шкідливим, як при аутоімунітеті. TNF-α є одним з ключових цитокінів, який запускає та підтримує запальну відповідь, та інактивація TNF-α, як було доведено, є важливою у даунрегулюванні запальних реакцій, пов'язаних з аутоімунними захворюваннями. Після інфікування TNF-α секретується у великих кількостях макрофагами та опосередковує рекрутмент нейтрофілів та макрофагів до місць інфікування завдяки стимулюванню ендотеліальних клітин на продукування молекул адгезії та завдяки продукуванню хемокінів, які є хемотаксичними цитокінами. TNF-α допомагає активувати лейкоцити та інші клітини запалення та підвищує судинну проникність в уражених тканинах. TNF-α головним чином продукується макрофагами, моноцитами та дендритними клітинами, але також широкою різноманітністю 1 UA 99774 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інших типів клітин, включаючи лімфоїдні клітини, тучні клітини, ендотеліальні клітини, кардіоміоцити, жирову тканину, фібробласти та нейрональну тканину. Існуючі протизапальні лікарські засоби блокують дію TNF-α завдяки зв'язуванню з ним, та, таким чином, запобігається проведення сигналу рецепторів TNF-α на поверхні клітин. Цей тип блокування має деякі серйозні побічні ефекти, з яких деякі є інфекціями, такими як туберкульоз, сепсис та грибкові інфекції, та можлива підвищена захворюваність на рак. IL-10, також відомий як фактор, що інгібує синтез цитокінів, людини (CSIF), також відіграє ключову роль в імунній регуляції у якості протизапального цитокіну. Цей цитокін продукується декількома типами клітин, включаючи моноцити, макрофаги, T-клітини, В-клітини, дендритні клітини та тучні клітини. Цей цитокін має плейотропні ефекти при імунорегуляції та запаленні. Він даунрегулює експресію прозапальних цитокінів, цитокінів, що секретуються Th1/Th17 клітинами, антигенів МНС класу ІІ та костимуляторних молекул на антигенпрезентуючих клітинах. IL-10 також секретується популяцією T-клітин, що зветься регуляторні T-клітини (Treg). Ці клітини не запобігають початковій активації T-клітин; скоріше вони інгібують стійку відповідь та запобігають хронічним та потенційно небезпечним відповідям. На периферії деякі T-клітини індукуються антигеном та або IL-10, або TGF-β, щоб стати Treg. Treg, індуковані IL-10, є CD4+/CD25+/Foxp3- та позначаються як Tr1 клітини. Ці клітини супресують імунні відповіді завдяки секреції IL-10. Останні дослідження виявили більш велику різноманітність спектра ефекторів T-клітин ніж Th1/Th2/Treg через ідентифікацію Th17 клітин. Ця субпопуляція, як було показано, є патогенною при декількох аутоімунних захворюваннях, таких як хвороба Крона, виразковий коліт, псоріаз та розсіяний склероз, який раніше приписували Th1 лінії диференціювання. Цитокіни, що секретуються Th17, також даунрегулюються IL-10, та блокування TNF запобігає псоріазу через інактивацію Th17 клітин. Загальна активність IL-10 є протизапальною та, як було показано, запобігає запаленню та ушкодженню в декількох дослідженнях тварин, проте клінічне лікування IL-10 залишається незадовільним через труднощі шляху введення IL-10 та його періоду напіввиведення. Застосування дефензинів людини для лікування запалення Примітно, що хворобу Крона в тонкій кишці пов'язували зі зниженими рівнями HD5 та HD6 αдефензинів клітин Панета, в той час як хворобу Крона в товстій кишці пов'язували з зниженим продукуванням hBD2 та hBD3 β-дефензинів (Gersemann et al., 2008; Wehkamp et al, 2005). Крім того, переконливо продемонстровано залучення мікрофлори кишечника у патогенезі хвороби Крона (Swidsinski et al., 2002). За допомогою флуоресцентної гібридизації in situ ці дослідники показали, що при активній хворобі Крона спостерігається різке збільшення пов'язаних з слизовою оболонкою та інвазивних бактерій, у той час як ці бактерії не з'являються в нормальному епітелії тонкої та товстої кишки. Разом ці спостереження об'єдналися в гіпотезу, яка припускає, що у здорових людей належний рівень дефензинів разом з інтестинальним епітеліальним бар'єром контролює склад та кількість бактерій просвіту та утримують їх від прилипання та проникнення до слизу, що починає запалення (Wang et al., 2007). З іншого боку, у людей з недостатньою здатністю продукування захисного рівня дефензинів, які секретуються, змінюється баланс між антимікробним захистом та бактеріями просвіту. В результаті це дозволяє бактеріальну інвазію в інтестинальні тканини, що розміщені нижче, що викликає запальний стан, який, у свою чергу, може розвитися у хворобу Крона. На основі цієї гіпотези WO 2007/081486 розкриває застосування декількох дефензинів людини при лікуванні запальних захворювань кишечника. Винахідники припустили, що дефензини, які вводяться перорально пацієнтам з хворобою Крона, в складі, що дозволяє їх вивільнення у належних локалізаціях у інтестинальному просвіту, може зменшити кількість бактерій, що проникають, відновити нормальну епітеліальну бар'рну функцію та, таким чином, зменшити тяжкість запального захворювання. Відповідно до WO 2007/081486, функція дефензинів полягає в безпосередньому націлюванні та знищенні бактерій у просвіті задля попередження їх інвазії у епітеліальну тканину. Тобто, функція дефензинів є виключно така ж, як протиінфекційної сполуки. Стосовно WO/2007/081486, є несподіваним те, що hBD2, який вводять парентерально, здатний зменшувати тяжкість коліту, викликаного DSS, у мишей завдяки тому, що при застосуванні цього шляху введення пептид ніколи не зустрінеться з бактеріями просвіту. Додатково, в даному описі демонструється, що впливом hBD2 є зниження рівня прозапальних цитокінів TNFα, IL-1β та IL-23, що секретуються PBMC (мононуклеарними клітинами периферичної крові). Ці цитокіни відомі як ключові в багатьох запальних захворюваннях, включаючи запальні захворювання кишечника. Відомо протягом більш ніж десяти років, що дефензини крім їх антимікробних функцій також мають ряд імуномодуляторних функцій. Проте, більшість робіт стосовно властивостей імунної модуляції дефензинів людини описує їх як такі, що мають, перш 2 UA 99774 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 за все, прозапальні функції або функції посилення імунітету (Дивись, наприклад, Niyonsaba et al., 2007; Bowdish et al., 2006; Lehrer, 2004). Тому, є дійсно несподіваним те, що hBD2, що вводиться парентерально, здатний зменшувати тяжкість при запальному захворюванні кишечника. Перш за все, при парентеральному застосуванні hBD2 ніколи не зможе досягти інтестинального просвіту, щоб зустріти шкідливі бактерії, які залучені при збудженні захворювання. Більш того, на основі більшості опублікованої літератури можна очікувати, що дефензин, який попадає в кровотік, може скоріше викликати прозапалення, ніж протизапальну відповідь, як зазначається в роботі, представленій у даному описі. В якості допомоги для розуміння переважних варіантів здійснення тут представлені деякі визначення. Вираз "активність TNF-альфа", як застосовується у даному документі, є загальним виразом, та повинен розумітися фахівцем у даній галузі техніки у його звичайному та традиційному значенні (та не повинен обмежуватися звичайним або традиційним значенням), та стосується, без обмеження, активності або впливу, що опосередковані, принаймні частково, фактором некрозу пухлини-альфа. Вираз "супресор", як застосовується у даному документі, є загальним виразом, та повинен розумітися фахівцем у даній галузі техніки у його звичайному та традиційному значенні (та не повинен обмежуватися звичайним або традиційним значенням), та стосується, без обмеження, молекули (наприклад, природної або синтетичної сполуки), яка може зменшувати, щонайменше, одну активність TNF-альфа. Іншими словами, "супресор" змінює активність, якщо є статистично значуща зміна в кількості виміряного TNF-альфа, в активності TNF-альфа або в TNF-альфа, що виявляється позаклітинно та/або внутрішньоклітинно у випробуванні, що проводиться з супресором, у порівнянні з випробуванням, що проводиться без супресора. Взагалі, супресори TNF-альфа знижують фізіологічну функцію TNF-альфа, наприклад, через зниження секреції TNF-альфа, та, таким чином, є придатними при лікуванні захворювань, де TNF-альфа може бути патогенним, безпосередньо або опосередковано. Вираз "активність IL-10", як застосовується у даному документі, є загальним виразом та повинен розумітися фахівцем у даній галузі техніки у його звичайному та традиційному значенні (та не повинен обмежуватися звичайним або традиційним значенням), та стосується, без обмеження, активності або впливу, що опосередковані, принаймні частково, інтерлейкіном-10. Вираз "індуктор", як застосовується у даному документі, є загальним виразом та повинен розумітися фахівцем у даній галузі техніки у його звичайному та традиційному значенні (та не повинен обмежуватися звичайним або традиційним значенням), та стосується, без обмеження, молекули (наприклад, природної або синтетичної сполуки), яка може підвищувати, щонайменше, одну активність IL-10. Іншими словами, "індуктор" змінює активність, якщо є статистично значуща зміна в кількості виміряного IL-10, в активності IL-10 або в IL-10, що виявляється позаклітинно та/або внутрішньоклітинно у випробуванні, що проводиться з індуктором, у порівнянні з випробуванням, що проводиться без індуктора. Взагалі, індуктори IL-10 підвищують фізіологічну функцію IL-10 та, таким чином, є придатними при лікуванні захворювань, на які впливає IL-10. Вираз "модифікація" позначає в даному описі будь-яку хімічну модифікацію бета-дефензину2 людини. Модифікацією(ями) може бути заміна(и), делеція(ї) та/або інсерція(ї) амінокислоти(амінокислот), а також заміщення(декілька заміщень) амінокислотного(их) бокового(их) ланцюга(ів); або застосування неприродних амінокислот з подібними характеристиками у амінокислотній послідовності. Зокрема модифікацією(ями) можуть бути амідування, такі як амідування C-кінця. Вираз "дефензин", як застосовується у даному документі, стосується поліпептидів, які визнаються фахівцем в даній галузі техніки як ті, що належать до дефензинового класу антимікробних пептидів. Для визначення того, чи є поліпептид дефензином за даним винаходом, амінокислотну послідовність можна порівняти з профілями прихованої марковської моделі (HMM профілі) бази даних PFAM з застосуванням вільно доступного пакета програмного забезпечення HMMER. Дефензинові родини PFAM включають, наприклад, дефензин_1 або "дефензин ссавців" (інвентарний номер PF00323) та дефензин_2 або дефензин_бета, або "бета-дефензин" (інвентарний номер PF00711). Дефензини даного винаходу належать до класу бета-дефензинів. Дефензини з класу бетадефензинів мають загальні структурні ознаки, такі як цистеїновий рисунок. Приклади дефензинів за даним винаходом включають бета-дефензин-1 людини (hBD1; див. SEQ ID NO:1), бета-дефензин-2 людини (hBD2; див. SEQ ID NO:2), бета-дефензин-3 людини 3 UA 99774 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (hBD3; див. SEQ ID NO:3), бета-дефензин-4 людини (hBD4; див. SEQ ID NO:4), та бетадефензин-3 миші (mBD3; див. SEQ ID NO:6). Спорідненість між двома амінокислотними послідовностями або між двома нуклеотидними послідовностями описується параметром "ідентичність". Для цілей даного винаходу ступінь ідентичності між двома амінокислотними послідовностями визначається за допомогою алгоритму Нідлмена-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), як забезпечується в програмі Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277; http://emboss.org), переважно версії 3.0.0 або пізніше. Застосовувані факультативні параметри являють собою штраф за відкриття гепа – 10, штраф за подовження гепа – 0,5 та матрицю замін EBLOSUM62 (EMBOSS версії BLOSUM62). Вихідні дані Needle, що позначаються "найдовша ідентичність" (отримані за допомогою опції –nobrief), використовують як відсоткову ідентичність та підраховують наступним чином: (Ідентичні залишки x 100)/(Довжина вирівнювання – Загальна кількість гепів у вирівнюванні) Для цілей даного винаходу ступінь ідентичності між двома дезоксирибонуклеотидними послідовностями визначається за допомогою алгоритму Нідлмена-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, раніше), як забезпечується в програмі Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, раніше; http://emboss.org), переважно версії 3.0.0 або пізніше. Застосовувані факультативні параметри являють собою штраф за відкриття гепа – 10, штраф за подовження гепа – 0,5 та матрицю замін EDNAFULL (EMBOSS версії NCBI NUC4.4). Вихідні дані Needle, що позначаються "найдовша ідентичність" (отримані за допомогою опції – nobrief), використовують як відсоткову ідентичність та підраховують наступним чином: (Ідентичні дезоксирибонуклеотиди x 100)/(Довжина вирівнювання – Загальна кількість гепів у вирівнюванні) Вираз "виділений варіант" або "виділений поліпептид", як застосовується у даному документі, стосується варіанта або поліпептиду, якого виділено з джерела. В одному аспекті варіант або поліпептид є, щонайменше, 1 % чистоти, переважно, щонайменше, 5 % чистоти, більш переважно, щонайменше, 10 % чистоти, більш переважно, щонайменше, 20 % чистоти, більш переважно, щонайменше, 40 % чистоти, більш переважно, щонайменше, 60 % чистоти, навіть більш переважно, щонайменше, 80 % чистоти та найбільш переважно, щонайменше, 90 % чистоти, як визначено за допомогою SDS-PAGE (електрофорез у поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію). Вираз "по суті чистий поліпептид" позначає в даному описі поліпептидний препарат, що містить не більше 10 %, переважно не більше 8 %, більш переважно не більше 6 %, більш переважно не більше 5 %, більш переважно не більше 4 %, більш переважно не більше 3 %, навіть більш переважно не більше 2 %, найбільш переважно не більше 1 % та навіть найбільш переважно не більше 0,5 % за вагою інших поліпептидних матеріалів, з якими він нативно або рекомбінантно пов'язаний. Отже, переважним є, щоб по суті чистий поліпептид був, щонайменше, 92 % чистоти, переважно, щонайменше, 94 % чистоти, більш переважно, щонайменше, 95 % чистоти, більш переважно, щонайменше, 96 % чистоти, більш переважно, щонайменше, 96 % чистоти, більш переважно, щонайменше, 97 % чистоти, більш переважно, щонайменше, 98 % чистоти, навіть більш переважно, щонайменше, 99 %, найбільш переважно, щонайменше, 99,5 % чистоти та навіть найбільш переважно 100 % чистоти за вагою загального поліпептидного матеріалу, присутнього в препараті. Поліпептиди даного винаходу є переважно в по суті чистій формі. Це можна здійснити, наприклад, отриманням поліпептиду добре відомими рекомбінантними способами або класичними способами очищення. Бета-дефензини ссавців Даний винахід стосується фармацевтичних застосувань бета-дефензинів ссавців, таких як бета-дефензини людини та/або бета-дефензини миші, при лікуванні захворювань, пов'язаних з підвищеними (патогенними) рівнями TNF-альфа, такими як запальні захворювання. Лікування є переважно пов'язаним зі зменшеною активністю TNF-альфа в оброблених тканинах. Таким чином, бета-дефензини ссавців даного винаходу також звуться як супресори TNF-альфа. У варіанті здійснення бета-дефензини ссавців даного винаходу мають ступінь ідентичності, щонайменше, 80 %, переважно, щонайменше, 85 %, більш переважно, щонайменше, 90 % та найбільш переважно, щонайменше, 95 % до будь-якої з амінокислотних послідовностей SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 та/або SEQ ID NO:6. У переважному варіанті здійснення бета-дефензини ссавців даного винаходу мають ступінь ідентичності, щонайменше, 80 %, переважно, щонайменше, 85 %, більш переважно, щонайменше, 90 % та найбільш переважно, щонайменше, 95 % до будь-якої з амінокислотних 4 UA 99774 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовностей SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 та/або SEQ ID NO:4. В більш переважному варіанті здійснення бета-дефензини ссавців даного винаходу включають бетадефензин-1 людини (SEQ ID NO:1), бета-дефензин-2 людини (SEQ ID NO:2), бета-дефензин-3 людини (SEQ ID NO:3), бета-дефензин-4 людини (SEQ ID NO:4), варіант бета-дефензину-4 людини (SEQ ID NO:5) та/або бета-дефензин-3 миші (SEQ ID NO:6). У навіть найбільш переважному варіанті здійснення бета-дефензини ссавців даного винаходу включають бетадефензин-1 людини (SEQ ID NO:1), бета-дефензин-2 людини (SEQ ID NO:2), бета-дефензин-3 людини (SEQ ID NO:3) та/або бета-дефензин-4 людини (SEQ ID NO:4). В іншому варіанті здійснення бета-дефензини ссавців даного винаходу мають ступінь ідентичності, щонайменше, 80 %, переважно, щонайменше, 85 %, більш переважно, щонайменше, 90 % та найбільш переважно, щонайменше, 95 % до амінокислотної послідовності SEQ ID NO:2. У переважному варіанті здійснення бета-дефензини ссавців даного винаходу включають бета-дефензин-2 людини (SEQ ID NO:2). У ще одному варіанті здійснення бета-дефензини ссавців даного винаходу включають бетадефензини людини та/або бета-дефензини мишей та їх функціонально еквівалентні варіанти. Переважно бета-дефензини ссавців включають бета-дефензин-1 людини, бета-дефензин-2 людини, бета-дефензин-3 людини, бета-дефензин-4 людини та бета-дефензин-3 миші та їх функціонально еквівалентні варіанти. Більш переважно бета-дефензини ссавців даного винаходу включають бета-дефензин-2 людини та його функціонально еквівалентні варіанти. Бета-дефензини ссавців даного винаходу також звуться як сполуки переважних варіантів здійснення. В контексті даного винаходу "функціонально еквівалентний варіант" бета-дефензинів ссавців (наприклад, людини) є модифікованим бета-дефензином ссавців (наприклад, людини), що виявляє приблизно такий самий вплив на активність TNF-альфа, як і бета-дефензин ссавців (наприклад, людини), такий як бета-дефензин-2 людини. Більш переважно він також виявляє приблизно такий самий вплив на активність IL-10, як і бета-дефензин ссавців (наприклад, людини), такий як бета-дефензин-2 людини. За даним винаходом функціонально еквівалентний варіант бета-дефензину ссавців (наприклад, людини), такого як бета-дефензин-2 людини, може містити 1-5 амінокислотних модифікацій, переважно 1-4 амінокислотних модифікацій, більш переважно 1-3 амінокислотних модифікацій, найбільш переважно 1-2 амінокислотну(их) модифікацію(ій) та, зокрема, одну амінокислотну модифікацію у порівнянні з амінокислотною послідовністю бета-дефензину ссавців (наприклад, людини), такою як SEQ ID NO:2. Переважно амінокислотні модифікації мають незначний характер, тобто консервативні амінокислотні заміщення або інсерції, які значно не впливають на укладання та/або активність поліпептиду; одиночні делеції; невеликі аміно- або карбоксил-кінцеві подовження; невеликий лінкерний пептид розміром до близько 20-25 залишків; або невелике подовження, яке сприяє очищенню завдяки зміні сумарного заряду або іншої функції, такі як, полігістидинова мітка, антигенний епітоп або зв'язуючий домен. Приклади консервативних заміщень знаходяться у межах групи основних амінокислот (аргінін, лізин та гістидин), кислих амінокислот (глутамінова кислота та аспарагінова кислота), полярних амінокислот (глутамін та аспарагін), гідрофобних амінокислот (лейцин, ізолейцин та валін), ароматичних амінокислот (фенілаланін, триптофан та тирозин) та невеликих амінокислот (гліцин, аланін, серин, треонін та метіонин). Амінокислотні заміщення, які в цілому не змінюють специфічну активність, відомі в даному рівні техніки та описані, наприклад, H. Neurath and R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York. Заміщенями, що зустрічаються найбільш звичайно, є Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu та Asp/Gly. На додаток до 20 стандартних амінокислот, нестандартні амінокислоти (такі як 4гідроксипролін, 6-N-метиллізин, 2-аміноізомасляна кислота, ізовалін та альфа-метилсерин) можуть бути заміщені амінокислотними залишками поліпептиду дикого типу. Обмежена кількість неконсервативних амінокислот, амінокислот, які не кодуються генетичним кодом, та неприродних амінокислот може бути заміщена на амінокислотні залишки. "Неприродні амінокислоти" були модифіковані після синтезу білка та/або мають хімічну структуру в їхньому боковому ланцюгу(ах), яка відрізняється від структури із стандартних амінокислот. Неприродні амінокислоти можна синтезувати хімічно, та, переважно, вони є комерційно доступними та включають піпеколінову кислоту, тіазолідинкарбонову кислоту, дегідропролін, 3- та 4метилпролін та 3,3-диметилпролін. Необхідні амінокислоти в бета-дефензинах ссавців можна ідентифікувати відповідно процедурам, що відомі в даній галузі техніки, таким як сайт-спрямований мутагенез або аланін 5 UA 99774 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 скануючий мутагенез (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). В останній техніці одиничні мутації аланіна вводять в кожний залишок в молекулі та отримані в результаті мутантні молекули тестують на біологічну активність (тобто, супресію активності TNF-альфа) для ідентифікації амінокислотних залишків, що є вирішальними для активності молекули. Див. також Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. Ідентичності необхідних амінокислот можна також вивести з аналізу ідентичностей з поліпептидами, які належать до бетадефензинів ссавців. Одиничні або множинні амінокислотні заміщення можна здійснити та протестувати за допомогою відомих способів мутагенезу, рекомбінації та/або перетасовування з наступною відповідною процедурою скринінгу, таких як описаних Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; або WO 95/22625. Інші способи, які можна застосовувати, включають схильну до помилок ПЛР, фаговий дисплей (наприклад, Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837; патент США № 5223409; WO 92/06204), та ділянка-спрямований мутагенез (Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145; Ner et al., 1988, DNA 7:127). N-кінцеве подовження поліпептидів даного винаходу може придатно складатися з від 1 до 50 амінокислот, переважно 2-20 амінокислот, особливо 3-15 амінокислот. В одному варіанті здійснення N-кінцеве пептидне подовження не містить Arg (R). В іншому варіанті здійснення Nкінцеве подовження містить kex2 або kex2-подібний сайт розщеплення, як буде визначено далі нижче. У переважному варіанті здійснення N-кінцеве подовження являє собою пептид, що містить, щонайменше, два Glu (E) та/або Asp (D) амінокислотні залишки, такий як N-кінцеве подовження, що містить одну з наступних послідовностей: EAE, EE, DE та DD. Способи та застосування Супресори TNF-альфа мають різноманітні прикладні застосування, як зазначено вище. Фахівець в даній галузі визнає, що супресія відбулася, коли спостерігається статистично значуща варіація (зниження) від контрольних рівнів TNF-альфа. Визначено, що бета-дефензин-1 людини, бета-дефензин-2 людини, бета-дефензин-3 людини та варіант бета-дефензину-4 людини знижують активність TNF-альфа та індукують активність IL-10 у LPS(ліпополисахарид)- та LTA(ліпотейхоєві кислоти)- стимульованих клітин. Далі, бета-дефензин-2 людини, як було визначено, знижує секрецію IL-23 у LPS- та LTAстимульованих клітин; та бета-дефензин-3 миші, як було визначено, знижує активність TNF як у мишачих, так і у людських LPS- та LTA-стимульованих клітин. Ці відкриття підтверджують, що протестовані бета-дефензини ссавців виявляють чудову протизапальну активність, зокрема протизапальну активність при аутоімунних захворюваннях або розладах. Фармацевтичні композиції переважних варіантів здійснення можна застосовувати для лікування розладів, які опосередковані активністю TNF-альфа. Також надаються способи лікування розладів, які опосередковані активністю TNF-альфа, чиє лікування включає введення об'єктові, у разі потреби такого лікування, ефективної кількості бета-дефензину ссавців, такого як бета-дефензин-2 людини, наприклад, в формі фармацевтичної композиції. Також надаються бета-дефензини ссавців, такі як бета-дефензин-2 людини, для виготовлення лікарського препарату, та застосування бета-дефензинів ссавців, таких як бета-дефензин-2 людини, для виготовлення лікарського препарату, наприклад, фармацевтичної композиції, для лікування розладів, які опосередковані активністю TNF-альфа. Лікування включає лікування існуючого захворювання або розладу, а також профілактику (запобігання) захворювання або розладу. У варіанті здійснення лікування приводить до зменшеної активності TNF-альфа в оброблених тканинах, переважно зменшеної активності TNF-альфа та підвищеної активності IL10. Захворювання або розлади, які можна лікувати сполуками переважних варіантів здійснення, наприклад, інгібуванням або супресією активності TNF-альфа, включають опосередковані активністю TNF-альфа. Переважно, лікування цих розладів може отримати користь зниженої активності TNF-альфа та/або підвищеної активності IL-10. Такі захворювання або розлади включають запальні захворювання або розлади, алергічні захворювання та аутоімунні захворювання. Більш конкретно, розлади або захворювання включають ревматоїдний артрит, остеоартрит, розсіяний склероз, атеросклероз, склеродермію (системний склероз), системний червоний вовчак (SLE), вовчак, (гострий) гломерулонефрит, астму, таку як бронхіальна астма, хронічні неспецифічні захворювання легенів (COPD), синдром дихальної недостатності (ARDS), запальні захворювання кишечника (наприклад, хвороба Крона), коліт (наприклад, виразковий коліт), васкуліт, увеїт, дерматит (наприклад, запальний дерматит), атопічний дерматит, облисіння, риніт (алергічний), алергічний кон'юктивіт, міастенію gravis, склеродерміт, саркоїдоз, 6 UA 99774 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 псоріатичний артрит, анкілозуючий спондилоартрит, ювенільний ідіопатичний артрит, базедову хворобу, ксеродерматоз та хворобу Бехчета. Супресори TNF-альфа можна застосовувати терапевтично в композиціях, складених для введення будь-яким традиційним шляхом, включаючи ентерально (наприклад, трансбукальний, оральний, назальний, ректальний), парентерально (наприклад, внутрішньовенний, інтракраніальний, інтраперитонеальний, підшкірний або внутрішньом'язовий) або місцево (наприклад, нашкірний, інтраназальний або інтратрахеальний). В інших варіантах здійснення композиції, описані в даному документі, можна вводити як частину імплантату з уповільненим вивільненням. В наступних інших варіантах здійснення композиції переважних варіантів здійснення можуть бути складені у вигляді ліофілізату з використанням відповідних формоутворюючих, що забезпечують стабільність у вигляді ліофілізату, та наступною повторною гідратацією. Фармацевтичні композиції, що містять супресори TNF-альфа переважних варіантів здійснення, можна виготовити відповідно із загальноприйнятими способами, наприклад, за допомогою процесів змішування, гранулювання, покриття, розчинення або ліофілізації. В іншому варіанті здійснення забезпечуються фармацевтичні композиції, що містять один або більше супресорів TNF-альфа. Для цілей введення сполуки переважних варіантів здійснення можна скласти у вигляді фармацевтичних композицій. Фармацевтичні композиції переважних варіантів здійснення містять один або більше супресорів TNF-альфа переважних варіантів здійснення та фармацевтично прийнятний носій та/або розріджувач. Супресор TNF-альфа переважно застосовують у фармацевтичних композиціях у кількості, яка ефективна для лікування конкретного розладу, тобто, в кількості, достатній для досягнення знижених рівнів або активності TNF-альфа, симптомів та/або переважно з прийнятною токсичністю для пацієнта. Для такого лікування придатне дозування буде, звичайно, варіювати в залежності від, наприклад, хімічної природи та фармакокінетичних даних застосовуваної сполуки даного винаходу, окремого хазяїна, способу введення та природи та тяжкості станів, які лікують. Проте, загалом, для задовільних результатів у великих ссавців, наприклад, людей, вказане добове дозування становить переважно від приблизно 0,001 г до приблизно 1,5 г, більш переважно від приблизно 0,01 г до 1,0 г; або від приблизно 0,01 мг/кг ваги тіла до приблизно 20 мг/кг ваги тіла, більш переважно від приблизно 0,1 мг/кг ваги тіла до приблизно 10 мг/кг ваги тіла, наприклад, при введенні невеликими дозами лікарського засобу, повторюваними через певні інтервали часу, до чотирьох разів на добу. Сполуки переважних варіантів здійснення можна вводити великим ссавцям, наприклад, людям, подібними способами введення в подібних дозуваннях, ніж застосовуваних традиційно з іншими посередниками, наприклад, низькомолекулярними інгібіторами, активності TNF-альфа. У певних варіантах здійснення фармацевтичні композиції переважних варіантів здійснення можуть включати супресор(и) TNF-альфа в кількості від приблизно 0,5 мг або менше до приблизно 1500 мг або більше на стандартну лікарську форму в залежності від шляху введення, переважно від приблизно 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 або 0,9 мг до приблизно 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 або 1000 мг та більш переважно від приблизно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 або 25 мг до приблизно 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 або 100 мг. У певних варіантах здійснення, проте, можуть бути переважні нижчі або вищі, ніж згадані вище дозування. Придатні концентрації та дозування можуть бути легко визначені фахівцем в даній галузі. Фармацевтично прийнятні носії та/або розріджувачі добре відомі фахівцям даної галузі техніки. Для композицій, складених у вигляді рідких розчинів, прийнятні носії та/або розріджувачі включають сольовий розчин та стерильну воду та можуть факультативно включати антиоксиданти, буфери, бактеріостатичні фактори та інші звичайні добавки. Композиції можуть також бути складені у вигляді пігулок, капсул, гранул, таблеток (покритих або непокритих), (ін'єкційних) розчинів, твердих розчинів, суспензій, дисперсій, твердих дисперсій (наприклад, у формі ампул, флаконів, кремів, гелів, паст, інгаляційного порошка, пін, тинктур, губних помад, крапель, спреїв або супозиторіїв). Склад може містити (додатково до одного або більше супресорів TNF-альфа та інших факультативних активних інгредієнтів) носії, наповнювачі, розпушувачі, покращувачі сипкості, цукри та підсолоджувачі, віддушки, антикоагулянти, стабілізатори, змочувальні засоби, емульгатори, солюбілізатори, солі для регулювання осмотичного тиску, буфери, розріджувачі, диспергуючі та поверхнево-активні засоби, зв'язувальні речовини, ковзні речовини та/або інші фармацевтичні формоутворюючі, які відомі в даному рівні техніки. Фахівець в даній галузі техніки може додатково скласти супресори TNFальфа відповідним способом та відповідно до визнаних практик, так як описано у Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1990. 7 UA 99774 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Супресори TNF-альфа можна застосовувати окремо або у комбінованих терапіях з однією, двома або більше іншими фармацевтичними сполуками або лікарськими речовинами та/або з одним або більше фармацевтично прийнятним формоутворюючим. У переважних варіантах здійснення супресор TNF-альфа присутній у комбінації з традиційними лікарськими засобами, застосовуваними для лікування хвороб або станів, де TNF-альфа є патогенним, або де TNF-альфа грає головну або іншу роль в процесі захворювання. В особливо переважних варіантах здійснення надаються фармацевтичні композиції, що містять один або більше супресорів TNF-альфа, включаючи, але без обмежень, сполуки переважних варіантів здійснення у комбінації з однією або більше додатковими фармацевтичними сполуками, включаючи, але без обмеження, лікарські засоби для лікування астми або інших респіраторних захворювань, діабетів, артриту або інших запальних захворювань, імунних розладів або інших захворювань або розладів, де TNF-альфа є патогенним. Супресори TNF-альфа переважних варіантів здійснення можна застосовувати для фармацевтичного лікування окремо або у комбінації з одним або більше іншими фармацевтично активними засобами, наприклад, такими як засоби, придатні при лікуванні запалення або пов'язаних захворювань. Такі інші фармацевтично активні засоби включають, наприклад, стероїди, глюкокортикоїди, інгібітори інших запальних цитокінів (наприклад, антитіла проти TNF-альфа, антитіла проти IL-1, антитіла проти IFN-гама) та інших цитокінів, таких як IL-1 RA або IL-10, та інших інгібіторів TNF-альфа. Комбінаційні терапії можуть включати фіксовані комбінації, в яких два або більше фармацевтично активних засоби знаходяться в одному складі; набори, в яких два або більше фармацевтично активних засоби в окремих складах продаються в одній упаковці, наприклад, з інструкціями для сумісного введення; та вільні комбінації, в яких фармацевтично активні засоби упаковані окремо, але надається інструкція для одночасного або послідовного введення. Інші компоненти набору можуть включати діагностику, випробування, множинні лікарські форми для одночасного або послідовного введення, інструкції та матеріали для відтворення ліофілізованої або концентрованої форми фармацевтичної композиції, апарат для введення фармацевтично активних засобів та подібне. Наприклад, надається фармацевтична упаковка, що містить першу лікарську речовину, яка являє собою сполуку переважних варіантів здійснення та, щонайменше, одну другу лікарську речовину, разом з інструкціями для комбінованого введення. Також надається фармацевтична упаковка, що містить сполуку переважних варіантів здійснення, разом з інструкціями для комбінованого введення, щонайменше, з однією другою лікарською речовиною. Також надається фармацевтична упаковка, що містить, щонайменше, одну другу лікарську речовину, разом з інструкціями для комбінованого введення зі сполукою даного винаходу. Лікування комбінаціями відповідно до переважних варіантів здійснення може забезпечити покращення або кращий кінець хвороби у порівнянні з лікуваннями будь-яким компонентом з комбінації окремо. Наприклад, можна застосовувати фармацевтичну комбінацію, що містить кількість сполуки переважних варіантів здійснення та кількість другої лікарської речовини, де кількості є придатними для утворення синергічного терапевтичного ефекту. Також надається спосіб покращення терапевтичної корисності сполуки преважних варіантів здійснення, що включає спільне введення, наприклад, супутнім чином або послідовно, терапевтично ефективної кількості сполуки преважних варіантів здійснення та другої лікарської речовини. Також надається спосіб покращення терапевтичної корисності другої лікарської речовини, що включає спільне введення, наприклад, супутнім чином або послідовно, терапевтично ефективної кількості сполуки преважних варіантів здійснення та другої лікарської речовини. Комбінацію даного винаходу та другу лікарську речовину як складову комбінації можна вводити будь-яким традиційним шляхом, наприклад, як викладено вище для сполуки преважних варіантів здійснення. Другий лікарський засіб можна вводити в дозуваннях за обставинами, наприклад, у діапазонах дозування, які подібні застосовуваним для окремого лікування, або, наприклад, у випадку синергії, навіть нижче традиційних діапазонів дозування. Придатні другі лікарські речовини включають хіміотерапевтичні лікарські засоби, особливо будь-який хіміотерапевтичний засіб, відмінний від супресорів TNF-альфа переважних варіантів здійснення. Такі другі лікарські речовини можуть включати, наприклад, протизапальні та/або імуномодуляторні лікарські засоби та подібне. Протизапальні та/або імуномодуляторні лікарські засоби, які можна застосовувати у комбінації зі сполуками преважних варіантів здійснення, включають, наприклад, інгібітори mTOR, включаючи рапаміцини, наприклад, 40-O-(2-гідроксіетил)-рапаміцин, 32дезоксорапаміцин, 16-O-заміщені рапаміцини, такі як 16-пент-2-інілокси-32-дезоксорапаміцин, 8 UA 99774 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 16-пент-2-інілокси-32 (S або R)-дигідро- рапаміцин, 16-пент-2-інілокси-32(S або R)-дигідро-40-O(2-гідроксіетил)-рапаміцин, 40-[3-гідрокси-2-(гідрокси-метил)-2-метилпропаноат]-рапаміцин (також відомий як CCI779), 40-епі-(тетразоліл)-рапаміцин (також відомий як ABT578), так звані рапалоги, наприклад, як розкрито в міжнародній заявці PCT № WO 98/02441, міжнародній заявці PCT № WO 01/14387 та міжнародній заявці PCT № WO 03/64383, такий як AP23573, та сполуки, розкриті під назвою TAFA-93 та біолімус (біолімус A9); інгібітори кальциневрина, наприклад, циклоспорин A або FK 506; аскоміцини, що мають імуносупресуючі властивості, наприклад, ABT-281, ASM981; кортикостероїди; циклофосфамід; азатіопрен; лефлюномід; мізорибін; мікофенолову кислоту або сіль; мікофенолата мофетіл; 15-деоксиспергуалін або імуносупресуючий гомолог, аналог або їхнє похідне; інгібітори тирозинкінази bcr-abl; інгібітори ckit рецепторної тирозинкінази; інгібітори PDGF рецепторної тирозинкінази, наприклад, Глівек (іматиніб); інгібітори p38 MAP кінази, інгібітори VEGF рецепторної тирозинкінази, PKC інгібітори, наприклад, як розкрито в міжнародній заявці PCT № WO 02/38561 або міжнародній заявці PCT № WO 03/82859, наприклад, сполука прикладу 56 або 70; інгібітори JAK3 кінази, наприклад, Nбензил-3,4-дигідрокси-бензиліден-ціаноацетамід альфа-ціано-(3,4-дигідрокси)-]N-бензиламід коричної кислоти (Тирфостин AG 490), продигіозин 25-C (PNUI 56804), [4-(4'-гідроксифеніл)аміно-6,7-диметоксихіназолін] (WHI-PI 31), [4-(3'-бром-4'-гідроксилфеніл)-аміно-6,7диметоксихіназолін] (WHI-PI 54), [4-(3',5-дибром-4'-гідроксилфеніл)-аміно-6,7диметоксихіназолін] WHI-P97, KRX-211, 3-{(3R, 4R)-4-метил-3-[метил-(7H-піролo[2,3d]піримідин-4-іл)-аміно]-піперидин-1-іл}-3-оксо-пропаннінтрил, у вільній формі або в формі фармацевтично прийнятної солі, наприклад, моноцитрату (так званий CP-690,550), або сполука, як розкрито в міжнародній заявці PCT № WO 2004/052359 або міжнародній заявці PCT № WO 2005/066156; агоністи або модулятори SІP рецептора, наприклад, факультативно фосфорильований FTY720 або його аналог, наприклад, факультативно фосфорильований 2аміно-2-[4-(3-бензилоксифенілтіо)-2-хлорфеніл]етил-1,3-пропандіол або 1-{4-[1-(4-циклогексил3-трифторметил-бензилоксііміно)-етил]-2-етил-бензил}-азетидин-3-карбонова кислота або її фармацевтично прийнятні солі; імуносупресуючі моноклональні антитіла, наприклад, моноклональні антитіла до рецепторів лейкоцитів, наприклад, рецептор Blys/BAFF, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40, CD45, CD52, CD58, CD80, CD86, рецептор IL-12, рецептор IL-17, рецептор IL-23 або їх ліганди; інші імуномодуляторні сполуки, наприклад, рекомбінантна зв'язуюча молекула, яка має, принаймні, частину позаклітинного домену CTLA4 або його мутанта, наприклад, принаймні, позаклітинну частину CTLA4 або його мутанта, з'єднану з не-CTLA4 білковою послідовністю, наприклад, CTLA4Ig (наприклад, позначена ATCC 68629) або його мутант, наприклад, LEA29Y; інгібітори молекул адгезії, наприклад, антагоністи LFA-I, антагоністи ICAM-1 або -3, антагоністи VCAM-4 або VLA-4, антагоністи CCR9, інгібітори MIF, 5-аміносаліцилатні (5-ASA) засоби, такі як сульфасалазин, Азулфідин®, Асакол®, Дипентум®, Пентаса©, Роваса®, Канаса®, Колазал®, наприклад, лікарські засоби, що містять месаламін; наприклад, месалазин у комбінації з гепарином; інгібітори або супресори TNFальфа, наприклад, відмінні від таких даного винаходу, такі як антитіла, які зв'язуються з TNFальфа, наприклад, інфліксимаб (Ремікад®), нестероїдні протизапальні лікарські засоби, що вивільняють оксид азоту (NSAIDs), наприклад, включаючи COX-інгібуючі лікарські засоби, які віддають NO (CINOD); фосфодіестеразу, наприклад, PDE4B-інгібітори, інгібітори каспази, "багатофункціональні протизапальні" лікарські засоби (MFAIDs), наприклад, інгібітори цитозольної фосфоліпази A2 (cPLA2), такі як інгібітори заякореної в мембрані фосфоліпази A2, поєднаної з глікозаміногліканами. В інших переважних варіантах здійснення одна або більше інгібуючих TNF-альфа сполук преважних варіантів здійснення присутні в комбінації з одним або більше нестероїдними протизапальними лікарськими засобами (NSAIDs) або іншими фармацевтичними сполуками для лікування артриту або інших запальних захворювань. Переважні сполуки включають, але без обмежень, целекоксиб; рофекоксиб; NSAIDS, наприклад, аспірин, целекоксиб, холін-магній трисаліцилат, диклофенак калію, диклофенак натрію, дифлунізал, етодолак, фенопрофен, флурбіпрофен, ібупрофен, індометацин, кетопрофен, кеторолак, меленамінову кислоту, набуметон, напроксен, натрію напроксен, оксапрозин, піроксикам, рофекоксиб, салсалат, суліндак та толметин; та кортикостероїди, наприклад, кортизон, гідрокортизон, метилпреднізолон, преднізон, преднізолон, бетаметезон, беклометазона дипропіонат, будезонід, дексаметазона натрію фосфат, флунізолід, флутіказона пропіонат, триамцинолону ацетонід, бетаметазон, флуоцинолон, флуоцинонід, бетаметазону дипропіонат, бетаметазону валерат, дезонід, дезоксиметазон, флуоцинолон, триамцинолон, триамцинолону ацетонід, клобетазолу пропіонат та дексаметазон. 9 UA 99774 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В особливо переважних варіантах здійснення одна або більше інгібуючих TNF-альфа сполук присутні в комбінації з одним або більше бета-стимуляторами, інгаляційними кортикостероїдами, антигістамінами, гормонами або іншими фармацевтичними сполуками для лікування астми, гострої дихальної недостатності або інших респіраторних захворювань. Переважні сполуки включають, але без обмежень, бета стимулятори, наприклад, бронходілататори, які зазвичай прописують; інгаляційні кортикостероїди, наприклад, беклометазон, флутиказон, триамцинолон, мометазон та форми преднізона, такі як преднізон, преднізолон та метилпреднізолон; антигістаміни, наприклад, азатадин, карбіноксамін/псевдоефедрин, цетиризин, ципрогептадин, дексхлорфенірамін, фексофенадин, лоратадин, прометазин, трипеленамін, бромфенірамін, хлорфенірамін, клемастин, дифенгідрамін; та гормони, наприклад, епінефрин. В особливо переважних варіантах здійснення одна або більше інгібуючих TNF-альфа сполук присутні в комбінації з одним або більше анестетиками, наприклад, етанолом, бупівакаїном, хлорпрокаїном, левобупівакаїном, лідокаїном, мепівакаїном, прокаїном, ропівакаїном, тетракаїном, десфлураном, ізофлураном, кетаміном, пропофолом, севофлураном, кодеїном, фентанілом, гідроморфоном, маркаїном, меперидином, метадоном, морфіном, оксикодоном, реміфентанілом, суфентанілом, бутoрфанолом, налбуфіном, трамадолом, бензокаїном, дибукаїном, етилхлоридом, ксилокаїном та феназопіридином. В особливо переважних варіантах здійснення одна або більше інгібуючих TNF-альфа сполук присутні в комбінації з фармацевтичними сполуками для лікування хвороби роздратованої товстої кишки, такими як азатіоприн або кортикостероїди, у фармацевтичній композиції. В особливо переважних варіантах здійснення одна або більше інгібуючих TNF-альфа сполук присутні в комбінації з імуносупресуючими сполуками у фармацевтичній композиції. В особливо переважних варіантах здійснення одна або більше інгібуючих TNF-альфа сполук присутні в комбінації з одним або більше лікарськими засобами для лікування аутоімунного розладу, наприклад, модифікатори біологічної відповіді, такі як, етанерцепт, інфліксимаб та інші сполуки, які інгібують або перешкоджають фактору некрозу пухлини. В особливо переважних варіантах здійснення одна або більше інгібуючих TNF-альфа сполук присутні в комбінації з стероїдами, включаючи кортикостероїди, наприклад, кортизон, гідрокортизон, метилпреднізолон, преднізон, преднізолон, бетаметазон, беклометазон дипропіонат, будезонід, дексаметазону натрію фосфат, флунізолід, флутиказону пропіонат, триамцинолону ацетонід, бетаметазон, флуоцинолон, флуоцинонід, бетаметазону дипропіонат, бетаметазона валерат, дезонід, дезоксиметазон, флуоцинолон, триамцинолон, триамцинолону ацетонід, клобетазолу пропіонат та дексаметазон. При лікуванні конкретних захворювань може бути сприятливо лікувати пацієнта супресором TNF-альфа у комбінації з анестетиком, наприклад, етанолом, бупівакаїном, хлорпрокаїном, левобупівакаїном, лідокаїном, мепівакаїном, прокаїном, ропівакаїном, тетракаїном, десфлураном, ізофлураном, кетаміном, пропофолом, севофлураном, кодеїном, фентанілом, гідроморфоном, маркаїном, меперидином, метадоном, морфіном, оксикодоном, реміфентанілом, суфентанілом, бутoрфанолом, налбуфіном, трамадолом, бензокаїном, дибукаїном, етилхлоридом, ксилокаїном та феназопіридином Синтез in vitro Бета-дефензини ссавців, такі як бета-дефензин-2 людини, можуть бути отримані синтезом in vitro з застосуванням загальноприйнятих способів, як відомо в даній галузі техніки. Доступні різні комерційні прилади для синтезу, наприклад, автоматизовані синтезатори від Applied Biosystems Inc., Beckman, і т.д. За допомогою синтезаторів амінокислоти, що зустрічаються в природі, можуть бути заміщені неприродними амінокислотами, зокрема D-ізомерами (або Dформами), наприклад, D-аланін та D-ізолейцин, діастереоізомерами, боковими ланцюгами з різними довжинами та функціональностями, та подібними. Конкретна послідовність та спосіб отримання буде визначатися за зручністю, економією та необхідною чистотою, та подібним. Хімічне зв'язування може бути забезпечено для різних пептидів або білків, що містять зручні функціональності для утворення зв'язків, такі як аміно групи для утворення аміду або заміщеного аміну, наприклад, відновне амінування, тіольні групи для утворення тіоетерів або дисульфідів, карбоксильні групи для утворення амідів та подібне. За необхідністю під час синтезу або під час експресії в пептид можуть бути введені різні групи, які дозволяють зв'язування з іншими молекулами або з поверхнею. Таким чином цистеїни можна застосовувати для отримання тіоетерів, гістидини – для зв'язування з комплексом іону металу, карбоксильні групи – для утворення амідів або естерів, аміногрупи – для утворення амідів та подібне. 10 UA 99774 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Бета-дефензини ссавців також можна виділити та очистити відповідно до загальноприйнятих способів рекомбінантного синтезу. Лізат можна отримати з хазяїна для експресії та очищений лізат – за допомогою HPLC (високоефективна рідинна хроматографія), ексклюзійної хроматографії, гель-електрофорезу, афінної хроматографії або іншої техніки очищення. Подальші аспекти та варіанти здійснення даного винаходу описані нижче: пункт 10. Бета-дефензин ссавців для лікування запального захворювання або розладу вибраного з групи, що включає ревматоїдний артрит, остеоартрит, розсіяний склероз, атеросклероз, склеродермію (системний склероз), вовчак, системний червоний вовчак (SLE), (гострий) гломерулонефрит, астму, хронічні неспецифічні захворювання легенів (COPD), синдром дихальної недостатності (ARDS), васкуліт, увеїт, дерматит, атопічний дерматит, облисіння, риніт (алергічний), алергічний кон'юктивіт, міастенію gravis, склеродерміт, саркоїдоз, псоріатичний артрит, анкілозуючий спондилоартрит, ювенільний ідіопатичний артрит, базедову хворобу, ксеродерматоз та хворобу Бехчета. пункт 11. Бета-дефензин ссавців за п. 10, який вводять парентерально. пункт 12. Бета-дефензин ссавців за п. 11, який вводять підшкірно або внутрішньовенно. пункт 13. Бета-дефензин ссавців за будь-яким з пп. 10-12, який являє собою бета-дефензин людини. пункт 14. Бета-дефензин ссавців за будь-яким з пп. 10-13, який має, щонайменше, 80 % ідентичність до амінокислотних послідовностей SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 або SEQ ID NO:4. пункт 15. Бета-дефензин ссавців за будь-яким з пп. 10-14, який являє собою бета-дефензин1 людини, бета-дефензин-2 людини, бета-дефензин-3 людини або бета-дефензин-4 людини. пункт 16. Бета-дефензин ссавців за будь-яким з пп. 10-15, який має, щонайменше, 80 % ідентичність до амінокислотної послідовності SEQ ID NO:2. пункт 17. Бета-дефензин ссавців за будь-яким з пп. 10-16, який являє собою бета-дефензин2 людини. пункт 18. Бета-дефензин ссавців за будь-яким з пп. 10-17, де активність TNF-альфа зменшена у тканинах, які піддають лікуванню. Даний винахід далі описується наступними прикладами, які не слід розуміти як обмежуючі обсяг даного винаходу. Приклади Приклад 1 Протизапальна активність бета-дефензину-2 людини (hBD2) Під час тестування hBD2 на імуномодуляторні впливи несподівано спостерігалось, що hBD2 мав значну протизапальну здатність. У культурах PBMC людини спостерігалось, що обробка з hBD2 мала значний вплив на цитокіновий профіль культур, простимульованих LPS, LTA або пептидогліканами. Раніше спостерігали, що hBD2 здатний індукувати прозапальні цитокіни та хемокіни IL-6, IL-1β, RANTES, IP-10 та IL-8 (Niyonsaba et al. 2007, Boniotto M. et al. 2006). В даному описі ми показуємо, що hBD2 має даунрегулюючу здатність на TNF та IL-1β, два прозапальні цитокіни; та hBD2 також індукує IL-10 після індукції запального стимулу ліпосахаридом (LPS), ліпотейхоєвою кислотою (LTA) або пептидогліканом (PGN). IL-10 являє собою потенційний протизапальний цитокін та, тому, кінцевий ефект hBD2 є протизапальним. Це спостерігалось для PBMC людини, лінії моноцитів та лінії дендритних клітин. Матеріали та способи Отримання hBD2 hBD2 отримали рекомбінантно. Фрагмент синтетичної ДНК (ДНК 2.0), що кодує hBD2 клонували в експресуючий вектор pET-32(+) (Novagen). Отримана плазміда кодувала трансляційний гібридний пептид, що містить N-кінцеву тіоредоксинову частину, за якою йде hisмітка, ентерокіназний сайт розщеплення та, зрештою, пептид hBD2. Експресійну плазміду трансформували в штам BL21 E. coli. Добову культуру цього штаму розбавили в 100 разів в TB-гліцерині, що містив 100 мкг/мл ампіциліну, та зрощували до OD600 (оптична щільність) приблизно 8 при 37 °C та індукували за допомогою 0,5 мM IPTG протягом 3 годин, після чого клітини зібрали центрифугуванням. Hisмічений trx-hBD2 гібридний пептид очистили на Ni-NTA кульках (QIAGEN) з застосуванням стандартних протоколів. Очищений гібридний пептид з his-міткою потім піддали діалізу протягом ночі в ентерокіназний буфер (50 мM трис-HCl pH 7,5, 1 мM CaCl2) та розщепили ентерокіназою для вивільнення зрілого hBD2. Пептид hBD2 далі очистили катіон-обмінною хроматографією з застосуванням 15 S матриці Source (Amersham Biosciences). Точну 11 UA 99774 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 молекулярну вагу hBD2 перевірили за допомогою MALDI-TOF (іонізація лазерною десорбцією за сприяння матриці – час прольоту) мас-спектрометрії. Отримання mBD3 (див. Приклад 4) проводили з застосуванням ідентичного протоколу. Належне укладання та топологію дисульфідних містків молекули hBD2 потім перевірили за допомогою трипсинового розщеплення у поєднанні з LC-MS (рідинна хроматографія – масспектрометрія) та NMR (ядерно-магнітний резонанс) спектроскопією. Ендотоксин видалили з препаратів hBD2 та mBD3 препаративною RP-HPLC (HPLC зі зворотною фазою) при низькому pH, та вміст ендотоксину визначили LAL випробуванням (Endosafe KTA2) та рівень, як визначили, був нижче межі виявлення випробування (0,05 EU/мг). Для того, щоб впевнитись, що рівні нижчі ніж межа виявлення випробування ендотоксину не були здатні стимулювати PBMC, побудували криві титрування стимуляції за допомогою дуже сильного ліпополісахариду (E. coli, O111:B4, Sigma L4391). Дуже низькі рівні цього LPS (0,06 нг/мл) були здатні стимулювати PBMC для виявлюваного продукування цитокіну. Виділення та стимуляція PBMC. Отримали периферичну кров від здорових добровольців (з дозволу від відповідного комітету з моралі у Данії). Гепаринізовану кров розбавили 1/1 у об'ємному співвідношенні з RPMI та піддали центрифугуванню в градієнті щільності фіколу протягом 2 годин добування. Зібрали зверху плазму від окремих донорів та витримували на льоді до застосування при 2 % в культуральному середовищі (аутологічному культуральному середовищі). Виділені PBMC ресуспендували в аутологічному культуральному середовищі та висіяли у 96-лункові культуральні планшети з 255000 клітин на лунку в загальному об'ємі 200 мкл. PBMC від того ж донора стимулювали за допомогою 100, 10 або 1 мкг/мл hBD2 або окремо, або разом з LPS при 0,6 нг/мл або 20 нг/мл (E. coli, O111:B4, Sigma L4391), ліпотейхоєвою кислотою (LTA) при 1,25 мкг/мл (з B. subtilis, Sigma L3265) або пептидогліканом (PGN) при 40 мкг/мл (з S. aureus, Sigma 77140). Застосовувані концентрації для стимуляції оптимізували на 3 різних донорах в початкових експериментах, для LPS застосовували дві різні концентрації, щоб впевнитися, що вони на рівні цитокінів, який можливо змінювати. В деяких експериментах PBMC обробляли дексаметазоном та індометацином окремо та разом з LPS або LTA у якості контролю на даунрегуляцію запальних цитокінів. Супернатанти збирали після інкубації при 37 °C протягом 24 годин та зберігали при -80 °C до вимірювання цитокінів. Життєздатність вимірювали за допомогою Alamar Blue (Biosource, DALL 1100) у всіх експериментах та в деяких випадках також за допомогою MTS (нерадіоактивний аналіз клітинної проліферації на основі солі тетразоліну) (Promega) відповідно до інструкції виробника, та в деяких експериментах також оцінювали підрахунком клітин за допомогою Nucleocounter. Культивування та стимуляція MUTZ-3 Клітинну лінію MUTZ-3, отриману від мієлоїдної лейкемії людини (DSMZ, Брауншвейг, Німеччина), підтримували у a-MEM (Sigma M4526), доповненій 20 % [об'єм/об'єм (у об'ємному співвідношенні)] ембріональною телячою сироваткою (Sigma F6178) та 40 нг/мл rhGM-CSF (R&D Systems 215-GM-050). Ці клітини-попередники знаходяться у наступній зазначеній клітинній лінії моноцитів, та ці моноцити стимулювали за допомогою 100, 10 або 1 мкг/мл hBD2 або окремо, або разом з LPS або LTA. Диференціація дендритних клітин Для утворення лінії дендритних клітин лінії клітин мієлоїдної лейкемії людини MUTZ-3 (1 × 5 10 клітин/мл) диференціювались протягом 7 днів в присутності rhGM-CSF (150 нг/мл) та rhIL-4 (50 нг/мл) в зрілі DC (дендритні клітини). Середовище змінювали кожні 2-3 дні. Лінію диференційованих клітин далі стимулювали або LPS, або LTA з та без hBD2 для дослідження впливу hBD2 на дендритні клітини. Вимірювання цитокінів. Продукування цитокінів у супернатантах виміряли проточною цитометрією з застосуванням cytometric bead array (CBA) для запалення у людини відповідно до інструкцій виробника (BD) на проточному цитометрі FACSarray. Вимірювали наступні цитокіни: IL-8, IL-1β, IL-10, TNF, IL-12 p70, IL-6. В деяких експериментах цитокіни вимірювали за допомогою наборів ІФА від R&D systems (IL-10, TNF-α, IL-1β) відповідно до інструкції виробника. Аналіз даних Всі експерименти виконали, щонайменше, двічі, з репрезентативними результатами, що приведені. Представлені дані виражені як середнє плюс/мінус стандартне відхилення (SD). Статистичну значущість визначали 2-факторним дисперсійним аналізом, при цьому змінними були обробка (hBD2, дексаметазон і т.д.) та стимуляція (LPS, LTA, пептидоглікан, і т.д.) з наступним тестом Бонферроні після випробування, як приведено у позначеннях таблиці. Різниці вважали значущими для p