Імунокон’югат для застосування в лікуванні раку або запального порушення

Реферат: Винахід стосується імунокон'югата, який містить перший антигензв'язуючий фрагмент, Fcдомен, націлені на CEA і одиничний ефекторний фрагмент, виділеного полінуклеотиду, експресійного вектора, клітини-хазяїна, фармацевтичної композиції, способу одержання такого імунокон'югата, та спосіб застосування зазначеного імунокон'югата для лікування раку або запального захворювання. UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід належить в цілому до антигенспецифічних імунокон'югатів, призначених для виборчого переносу фрагментів, які мають ефекторну функцію (ефекторних фрагментів), які впливають на клітинну активність. Крім того, даний винахід належить до молекул нуклеїнових кислот, що кодує зазначені імунокон'югати, і векторів і клітин-хазяїв, які містять зазначені молекули нуклеїнових кислот. Винахід належить і до способів отримання імунокон'югатів, запропонованих у винаході, і способам застосування зазначених кон'югатів для лікування захворювання. Відомий рівень техніки У різних клінічних ситуаціях часто потрібна деструкція індивідуальної клітини або конкретного типу клітин. Наприклад, основним завданням при терапії раку є специфічне руйнування пухлинних клітин зі збереженням при цьому в інтактному і непошкодженому стані здорових клітин і тканин. З виживанням і / або загибеллю клітин пов'язано безліч шляхів трансдукції сигналів у клітині. Таким чином, для надання впливу на підтримання клітини або її деструкцію можна застосовувати безпосереднє введення пов'язаного з зазначеним шляхом фактора, що бере участь у забезпеченні виживання або загибелі клітин. Аналогічно цьому, можна вводити специфічні фактори, які стимулюють імунні ефекторні клітини в мікрооточенні пухлини, такі як природні клітини-кілери (NK) або цитотоксичні T-лімфоцити (CTL), для "атаки" на пухлинні клітини і їх руйнування. Цитокіни являють собою молекули, що забезпечують передачу клітинних сигналів, які беруть участь у регуляції імунної системи. При застосуванні в терапії раку цитокіни можуть діяти в якості імуномодуляторів, які мають протипухлинну активність і які можуть підвищувати імуногенність деяких типів пухлин. Однак швидкий кліренс з крові і відсутність специфічності для пухлини обумовлюють необхідність системного введення у високих дозах цитокінів для досягнення концентрації цитокіну в області локалізації пухлини, достатньої для активації імунної відповіді або протипухлинної дії. Такі високі рівні, які мають системну дію цитокінів можуть призводити до прояву серйозної токсичності і небажаних реакцій. Таким чином, для застосування в терапії є бажаним специфічне введення in vivo фактора шляху трансдукції сигналу, такого як цитокін, в конкретну ділянку (наприклад, пухлину або мікрооточення пухлини в разі протиракової терапії). Для досягнення цього можна кон'югувати фактор з таким, що забезпечує спрямоване перенесення фрагментом, наприклад, антитілом або фрагментом антитіла, специфічним для даної галузі. Здійснювані раніше стратегії, метою яких було введення факторів шляхів трансдукції сигналів, таких як цитокіни, в конкретну ділянку in vivo, передбачали застосування важких ланцюгів імуноглобулінів, кон'югованих з різними цитокінами, такими як лімфотоксин, фактор некрозу пухлини-α (TNF-α), інтерлейкін -2 (IL-2) і колонієстимулюючий фактор гранулоцитів і макрофагів (GM-CSF) (див., наприклад, огляд, Lode та ін., Pharmacol Ther 80, 1998, сс. 277-292). Дослідники встановили, що вони не тільки могли забезпечувати спрямоване перенесення цитокінів до конкретних ділянок in vivo, але і мали перевагу, пов'язану з тим, що моноклональні антитіла мали більш тривалий час напівжиття в сироватці, ніж більша частина інших білків. Через системну токсичність, асоційовану з високими дозами певних некон'югованих цитокінів, наприклад, IL-2, можливість застосування злитого білка імуноглобулін-цитокін в більш низьких дозах, які забезпечують максимальне підвищення сприятливої біологічної дії в необхідній ділянці, наприклад, в пухлині, при підтримці системних побічних дій на мінімальному рівні, дозволила дослідникам висловити припущення про те, що імунокон'югати імуноглобулін-цитокін є оптимальними терапевтичними засобами. Однак у даній галузі відомо, що із імунокон'югатами імуноглобулін-цитокін асоційовані певні недоліки. Наприклад, у зазначених імунокон'югатах є щонайменше один цитокін, пов'язаний з кожним з двох важких ланцюгів імуноглобуліну, що призводить до отримання імунокон'югату, має здатність до двовалентного зв'язування з мішенню, і з двома або більшою кількістю залишків цитокіну (див., наприклад, огляд Chang та ін, Expert Opin Drug Discovery 4, 2009, сс. 181-194 або Ortiz-Sanchez та ін, Expert Opin Biol Ther 8, 2008, сс. 609-632). На фіг. 1 представлений загальноприйнятий імунокон'югат імуноглобулін-цитокін, відомий в даній галузі, в якій цитокін злитий з C-кінцем кожного з двох важких ланцюгів антитіла. Через присутність двох або більшої кількості залишків цитокіну вказаний імунокон'югат має високу авідність відносно рецептору відповідного цитокіну (наприклад, афінність, що характеризується пікомолярними величинами у разі IL-2), і в результаті його мішенню є скоріше імунні ефекторні клітини, які експресують рецептор цитокіну, ніж антиген, що є мішенню імуноглобуліну (афінність, що характеризується наномолярними (нМ) величинами), з яким цитокін пов'язаний. Крім того, відомо, що із загальноприйнятими імунокон'югатами можуть бути асоційовані реакції 1 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 на інфузію (див., наприклад, King і ін, J Clin Oncol 22, 2004, сс. 4463-4473), які щонайменше частково пов'язані з активацією цитокінових рецепторів на імунних ефекторних клітинах в периферійній крові залишками цитокінів, які входять у імунокон'югат. Крім того, за допомогою їх Fc-ділянки імунокон'югати імуноглобулін-цитокін можуть активувати комплемент і взаємодіяти з Fc-рецепторами. Цю притаманну імуноглобулінам особливість розглядали як небажану, оскільки мішенню терапевтичних імунокон'югатів можуть бути клітини, що експресують Fc-рецептори, а не клітини, що несуть кращий антиген. Крім того, одночасна активація цитокінових рецепторів і Fc-рецепторів шляхів передачі сигналів призводить до вивільнення цитокінів, насамперед у поєднанні з такими, що мають пролонгований час напівжиття злитими білками, які містять імуноглобулін, що ускладнює їх застосування в терапевтичних цілях через системну токсичність. Один з підходів, що дозволяють долати цю проблему, полягає у застосуванні в імунокон'югатах фрагментів імуноглобуліну, позбавлених Fc-галузі, таких як scFv-або Fabфрагменти. Приклади імунокон'югатів фрагмент імуноглобуліну-цитокін включають імунокон'югат scFv-IL-2, описаний у публікації PCT WO 2001/062298, імунокон'югат scFv-IL-12scFv, описаний у публікації PCT WO 2006/119897 (в яких кожен з двох scFv-фрагментів з'єднаний з субодиницею гетеродимера IL-12, які утримуються разом за допомогою дисульфідного (их) містка (ів)) або імунокон'югати Fab-IL-2-Fab, описані в публікації PCT WO 2011/020783. У більшості імунокон'югатів таких типів зберігаються як реактивність щодо зв'язування з пухлиною батьківської молекули імуноглобуліну, так і функціональна активність цитокіну, однак час напівжиття таких конструкцією істотно коротший порівняно із злитими білками, які містять імуноглобулін. Таким чином, зберігається потреба в імунокон'югатах, які мають поліпшені властивості стосовно більш високої терапевтичної ефективності і зниженого рівня і серйозності побічних дій цих продуктів (наприклад, токсичність, деструкція непухлинних клітин і т.д.). У цьому винаході запропоновані імуноглобулінподібні імунокон'югати, які мають підвищену ефективність, високу специфічність дії, знижену токсичність і поліпшений час напівжиття і стабільність в крові в порівнянні з відомими імунокон'югатами. Короткий виклад суті винаходу Даний винахід грунтується, зокрема, на отриманих заявниками даних про те, що мішенню імунокон'югатів, що містять більше одного ефекторного фрагмента, такого, наприклад, як цитокін, скоріше може бути рецептор відповідного ефекторного фрагмента, а не антиген-мішень антигензв'язуючого фрагмента імунокон'югату. Таким чином, одним з об'єктів винаходу є імунокон'югат, який містить перший антигензв'язуючий фрагмент, Fc-домен, що містить дві субодиниці, і ефекторний фрагмент, в якому присутні не більше одного ефекторного фрагмента. В одному з варіантів здійснення винаходу ефекторний фрагмент злитий з аміно-або карбоксикінцевою амінокислотою однієї з двох субодиниць Fc-домена, необов'язково через лінкерний пептид. В одному з варіантів здійснення винаходу перший антигензв'язуючий фрагмент злитий з амінокінцевою амінокислотою однієї з двох субодиниць Fc-домена, необов'язково через лінкерний пептид або шарнірну ділянку імуноглобуліну. В одному з варіантів здійснення винаходу перший антигензв'язуючий фрагмент містить антигензв'язуючий домен антитіла. У конкретному варіанті здійснення винаходу перший антигензв'язуючий фрагмент являє собою молекулу Fab. У деяких варіантах здійснення винаходу Fc-домен містить модифікацію, посилюючу гетеродимеризацію двох неідентичних поліпептидних ланцюгів. У конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена модифікація являє собою модифікацію типу "knob-in-hole" ("виступ-западина"), яка включає модифікацію, що приводить до утворення "виступу" в одній з субодиниць Fc-домена і "западини" в іншій одній з двох субодиниць Fc-домена. У конкретному варіанті здійснення винаходу ефекторний фрагмент злитий з аміно-або карбоксикінцевою амінокислотою субодиниці Fc-домена, що містить модифікацію, що приводить до утворення "виступу". В одному з варіантів здійснення винаходу Fc-домен являє собою Fc-домен IgG, зокрема, Fcдомен IgG1. У конкретному варіанті здійснення винаходу Fc-домен є людським. У конкретних варіантах здійснення винаходу Fc-домен конструюють так, щоб він мав змінену здатність зв'язуватися з Fc-рецептором, зокрема зміненою здатністю зв'язуватися з Fcγрецептором, та / або змінену ефекторну функцію, зокрема антитіло-обумовлену клітинозалежну цитотоксичність (ADCC). Хоча присутність Fc-домена є важливою для пролонгування часу напівжиття імунокон'югату, при створенні винаходу розглядалася концепція про те, що в деяких ситуаціях може виявитися доцільним елімінувати ефекторні функції, асоційовані з взаємодією Fc-рецепторів з Fcдоменом. Таким чином, в конкретних варіантах здійснення винаходу змінене зв'язування з Fc 2 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рецептором та / або змінена ефекторна функція являє собою знижене зв'язування та / або знижену ефекторну функцію. У конкретному зазначеному варіанті здійснення винаходу Fcдомен містить одну або кілька амінокислотну (і) мутацію (ії), яка (і) знижує (ють) зв'язування Fcдомена з Fc-рецептором, зокрема Fcγ-рецептором. Краще зазначена амінокислотна мутація не може знижувати зв'язування з FcRn-рецепторами. В одному з варіантів здійснення винаходу Fcдомен містить амінокислотну заміну в положенні P329. У конкретному варіанті здійснення винаходу Fc-домен містить амінокислотні заміни L234A, L235A і P329G в кожній з його субодиниць. З іншого боку, можуть мати місце ситуації, при яких потрібно підвищувати ефекторні функції імунокон'югатів. Таким чином, в деяких варіантах здійснення винаходу Fc-домен імунокон'югату, що пропонується у винаході, конструюють так, щоб він мав змінену здатність зв'язуватися з Fcрецептором, зокрема, із Fcγ-рецептором, більш конкретно із FcγIIIa-рецептором, та / або змінену ефекторну функцію, при цьому, змінене зв'язування та / або змінена ефекторна функція являє собою підвищене зв'язування та / або підвищену ефекторну функцію. В одному з таких варіантів здійснення винаходу Fc-домен конструюють так, щоб він мав змінену олігосахаридну структуру у порівнянні з не підданим інженерії Fc-доменом. У конкретному такому варіанті здійснення винаходу Fc-домен має підвищений відносний вміст нефукозильованих олігосахаридів в порівнянні з не підданим інженерії Fc-доменом. У більш конкретному варіанті здійснення винаходу Fc-домен містить щонайменше 20 %, краще щонайменше 50 %, більш переважно щонайменше 70 % нефукозильованих олігосахаридів. В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу Fc-домен має підвищений відносний вміст бісекційних олігосахаридів в порівнянні з не підданим інженерії Fc-доменом. У наступному конкретному варіанті здійснення винаходу Fc-домен має підвищений відносний вміст бісекційних нефукозильованих олігосахаридів в порівнянні з не підданим інженерії Fc-доменом. У деяких варіантах здійснення винаходу зазначена змінена олігосахаридна структура є результатом підвищеної активності β (1,4)-N-ацетилглюкозамінілтрансферази III (GnTIII) в клітині-хазяїні, яка застосовується для експресії імунокон'югату. Конкретним об'єктом винаходу є імунокон'югати, які містять перший і другий антигензв'язуючий фрагмент, Fc-домен, що складається з двох субодиниць, ефекторний фрагмент, в яких є не більше одного ефекторного фрагмента. В одному з варіантів здійснення винаходу перший і другий антигензв'язуючий фрагмент і Fc-домен являють собою частину молекули імуноглобуліну. У деяких варіантах здійснення винаходу імунокон'югат практично складається з молекули імуноглобуліну та ефекторного фрагмента і необов'язково однієї або декількох лінкерних послідовностей. У конкретному варіанті здійснення винаходу молекула імуноглобуліну являє собою імуноглобулін класу IgG. У ще більш конкретному варіанті здійснення винаходу імуноглобулін являє собою імуноглобулін підкласу IgG 1. В одному з варіантів здійснення винаходу ефекторний фрагмент злитий з карбоксикінцевою амінокислотою однієї з важких ланцюгів імуноглобуліну, необов'язково через лінкерний пептид. У конкретному варіанті здійснення винаходу імунокон'югат, пропонований у винаході, містить молекулу імуноглобуліну, яка містить два антигензв'язуючих фрагмента і Fc-домен, і ефекторний фрагмент, злитий з карбоксикінцевою амінокислотою одного з важких ланцюгів імуноглобуліну, в якому присутні не більше одного ефекторного фрагмента і в якому Fc-домен конструюють так, щоб він мав знижену здатність зв'язуватися з Fc-рецептором, зокрема, змінену здатність зв'язуватися з Fcγ-рецептором, та / або знижену ефекторну функцію. У деяких варіантах здійснення винаходу вказаний перший антигензв'язуючий фрагмент або вказані перший і другий антигензв'язуючі фрагменти направлені до антигену, асоційованому із патологічним станом, такому як антиген, що презентується на пухлинній клітині або в оточенні пухлинної клітини, в ділянці запалення або в інфікованій вірусом клітині. У більш конкретному варіанті здійснення винаходу вказаний антиген вибирають з групи, що включає білок активації фібробластів (фібробласт-активуючий білок) (FAP), A1-домен тенасцину-C (TNC A1), A2-домен тенасцину-C (TNC A2), екстра-домен B фібронектину (EDB), карциноембріональний антиген (CEA) і асоційований з меланомою хондроітінсульфат-протеоглікан (MCSP). У деяких варіантах здійснення винаходу ефекторний фрагмент являє собою одноланцюговий ефекторний фрагмент. У конкретному варіанті здійснення винаходу ефекторний фрагмент являє собою цитокін. В одному з варіантів здійснення винаходу вказаний цитокін вибирають з групи, що включає IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IFN-α і IFN-γ. У конкретному варіанті здійснення винаходу вказаний цитокін являє собою IL-2. У ще більш кращому варіанті здійснення винаходу вказаний цитокін являє собою мутантний поліпептид IL-2, що має знижену афінність зв'язування з α-субодиницею IL-2-рецептора. У конкретному варіанті здійснення винаходу вказаний мутантний поліпептид IL-2 містить амінокислотну заміну в одному або 3 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 декількох положеннях, вибраних з положень, які відповідають залишкам 42, 45 і 72 людського IL-2. В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу цитокін являє собою IL-10. Ще в одному варіанті здійснення винаходу цитокін являє собою IL-15, насамперед мутантний поліпептид IL-15, що має знижену здатність зв'язуватися з α-субодиницею IL-15-рецептора. В іншому варіанті здійснення винаходу цитокін являє собою IFN-α. Іншим об'єктом винаходу є виділений полінуклеотид, що кодує імунокон'югат, пропонований у винаході, або його фрагмент. Винахід належить і до експресійного вектору, який містить виділений полінуклеотид, пропонований у винаході, і клітини-хазяїна, яка містить виділений полінуклеотид або експресійний вектор, пропонований у винаході. У деяких варіантах здійснення винаходу клітина-хазяїн являє собою еукаріотичну клітину, зокрема, клітину ссавців. У деяких варіантах здійснення винаходу клітину-хазяїна піддають маніпуляціям, що призводить до експресії підвищених рівнів одного або декількох поліпептидів, які мають активність β (1,4)-Nацетилглюкозамінілтрансферази III (GnTIII). В одному із зазначених варіантів здійснення винаходу клітину-хазяїна піддають додатковій маніпуляції, що приводить до експресії підвищених рівнів одного або декількох поліпептидів, які мають активність α-маннозидази II (ManII). Іншим об'єктом винаходу є спосіб отримання імунокон'югатів, запропонованих у винаході, що полягає в тому, що здійснюють стадії, на яких a) культивують клітину-хазяїна, пропоновану у винаході, в умовах, придатних для експресії імунокон'югату, і б) виділяють імунокон'югат. Винахід належить і до імунокон'югату, отриманого способом, запропонованим у винаході. Винахід належить і до фармацевтичної композиції, що містить імунокон'югат, пропонований у винаході, і фармацевтично прийнятний носій. Винахід належить і до способів застосування імунокон'югатів і фармацевтичних композицій, запропонованих у винаході. Одним з об'єктів винаходу є імунокон'югат або фармацевтична композиція, пропонований / пропонована у винаході, для застосування в якості лікарського засобу. Одним з об'єктів винаходу є імунокон'югат або фармацевтична композиція, пропонований / пропонована у винаході, для застосування для лікування захворювання у індивідуума, що потребує цього. У конкретному варіанті здійснення винаходу захворювання являє собою рак. В інших варіантах здійснення винаходу захворювання являє собою запальне порушення. У зазначеному конкретному варіанті здійснення винаходу імунокон'югат містить ефекторний фрагмент IL-10. Запропоновано також застосування імунокон'югату, що пропонується у винаході, для приготування лікарського засобу, призначеного для лікування захворювання у індивідуума, що потребує цього; а також спосіб лікування захворювання у індивідуума, що полягає в тому, що вводять зазначеному індивідууму в терапевтично ефективній кількості композицію, що містить імунокон'югат, пропонований у винаході, у фармацевтично прийнятній формі. У конкретному варіанті здійснення винаходу захворювання являє собою рак. В інших варіантах здійснення винаходу захворювання являє собою запальне порушення. У зазначеному конкретному варіанті здійснення винаходу імунокон'югат містить ефекторний фрагмент IL-10. У будь-якому з вищевказаних варіантів здійснення винаходу індивідуум краще являє собою ссавця, зокрема людину. Наступним об'єктом винаходу є кон'югат, який містить першу молекулу Fab, яка не зв'язується специфічно ні з яким антигеном, Fc-домен, що складається з двох субодиниць, і ефекторний фрагмент, де в кон'югаті присутні не більше одного ефекторного фрагмента. У конкретному варіанті здійснення винаходу перша молекула Fab містить послідовність варіабельної галузі важкого ланцюга SEQ ID NO: 299 і послідовність варіабельної галузі легкого ланцюга SEQ ID NO: 297. В одному з варіантів здійснення винаходу кон'югат містить (I) молекулу імуноглобуліну, яка містить першу і другу молекулу Fab, яка не зв'язується специфічно ні з яким антигеном, і Fc-домен і (II) ефекторний фрагмент, де в кон'югаті присутні не більше одного ефекторного фрагмента. В одному з варіантів здійснення винаходу молекула імуноглобуліну являє собою імуноглобулін класу IgG, зокрема імуноглобулін підкласу IgG1. У конкретному варіанті здійснення винаходу молекула імуноглобуліну містить послідовність варіабельної галузі важкого ланцюга SEQ ID NO: 299 і послідовність варіабельної галузі легкого ланцюга SEQ ID NO: 297. Зокрема, послідовність варіабельної галузі важкого ланцюга SEQ ID NO: 299 і послідовність варіабельної галузі легкого ланцюга SEQ ID NO: 297 входять в першу і другу молекулу Fab молекули імуноглобуліну. В одному з варіантів здійснення винаходу ефекторний фрагмент злитий з карбоксикінцевою амінокислотою одного з важких ланцюгів імуноглобуліну, необов'язково через лінкерний пептид. У деяких варіантах здійснення винаходу Fc-домен кон'югату конструюють так, щоб він мав знижену здатність зв'язуватися з Fcрецептором, зокрема, знижену здатність зв'язуватися з Fcγ-рецептором, та / або знижену 4 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ефекторну функцію, зокрема, знижену ADCC. У конкретному варіанті здійснення винаходу Fcдомен кон'югату містить амінокислотні заміни L234A, L235A і P329G в кожній з його субодиниць. У деяких варіантах здійснення винаходу Fc-домен кон'югату містить модифікацію, посилюючу гетеродимеризацію двох неідентичних поліпептидних ланцюгів. У конкретному варіанті здійснення винаходу модифікація являє собою модифікацію типу "knob-in-hole" ("виступзападина"), яка включає модифікацію, що приводить до утворення "виступу" в одній з субодиниць Fc-домена і "западини" в інший із зазначених двох субодиниць Fc-домена. У конкретному варіанті здійснення винаходу ефекторний фрагмент злитий з аміно-або карбоксикінцевою амінокислотою субодиниці Fc-домена, що містить модифікацію, що приводить до утворення "виступу". В одному з варіантів здійснення винаходу ефекторний фрагмент являє собою цитокін, зокрема, IL-2. Крім того, кон'югат може включати індивідуально або в поєднанні один з одним будь-яку з характерних особливостей, зазначених вище при описі форматів, Fcдомену або ефекторного фрагмента імунокон'югатів, запропонованих у винаході. Винахід належить і до виділеного полінуклеотиду, що кодує кон'югат, пропонований у винаході, або його фрагмент. У конкретному варіанті здійснення винаходу виділений полінуклеотид містить послідовність, яка щонайменше приблизно на 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентична послідовності SEQ ID NO: 298 або SEQ ID NO: 300. У винаході запропонований також експресійний вектор, що містить виділений полінуклеотид, і клітина-хазяїн, яка містить виділений полінуклеотид або експресійний вектор, пропонований у винаході. Іншим об'єктом винаходу є спосіб одержання кон'югату, що пропонується у винаході, що полягає в тому, що здійснюють стадії, на яких a) культивують клітину-хазяїна, пропоновану у винаході, в умовах, придатних для експресії кон'югату, і б) виділяють кон'югат. Винахід належить і до кон'югату, отриманого способом, запропонованим у винаході. Винахід належить і до фармацевтичної композиції, яка містить кон'югат, пропонований у винаході, і фармацевтично прийнятний носій. Крім того, кон'югат можна використовувати в зазначених у цьому описі способах застосування імунокон'югатів, запропонованих у винаході. Короткий опис креслень На кресленнях показано: на фіг. 1 - схематичне зображення типового імунокон'югату імуноглобулін-цитокін, відомого в даній галузі, в якому цитокін (позначений точками) злитий з C-кінцем кожного з двох важких ланцюгів імуноглобуліну; на фіг. 2 - схематичне зображення нових імунокон'югатів, запропонованих у винаході, які містять не більше одного ефекторного фрагмента (позначений точками). Ефекторний фрагмент злитий, необов'язково через лінкерний пептид (сірі прямокутники) із карбоксикінцевою (формат A і Б) або амінокінцевою амінокислотою (формат В) Fc-домена. Імунокон'югат містить один (формат Б і В) або більшу кількість (як правило, два, формат A) антигензв'язуючих фрагментів, які можуть являти собою Fab-фрагменти, що містять варіабельні домени важкого і легкого ланцюга антитіла (позначені косими лініями). Fc-домен може містити модифікацію, що підсилює гетеродимеризацію двох неідентичних поліпептидних ланцюгів (чорна точка), та / або модифікацію, що приводить до зміни здатності зв'язуватися з Fc-рецептором та / або до зміни ефекторної функції (чорна зірка); на фіг. 3 - результати очищення імунокон'югату на основі IgG клону 4G8 і чотирьохмутантного (qm) IL-2 (IgG-IL-2 qm), мішенню якого є FAP. А) Профіль елюції, отриманий на стадії афінної хроматографії з білком А. Б) Профіль елюції, отриманий на стадії гельфільтрації. В) Результати, отримані для кінцевого продукту за допомогою аналітичного ДСНПААГ (NuPAGE Novex Біс-Тріс-мінігель (фірма Invitrogen), рухливий буфер MOPS. Г) Результати, отримані за допомогою аналітичної гель-фільтрації кінцевого продукту на колонці з Супердекс 200 (зміст мономера 97 %); на фіг. 4 - результати очищення імунокон'югату на основі 28Н1 IgG-IL-2 qm, мішенню якого є FAP. А) Профіль елюції, отриманий на стадії афінної хроматографії з білком А. Б) Профіль елюції, отриманий на стадії гель-фільтрації. В) Результати, отримані для кінцевого продукту за допомогою аналітичного ДСН-ПААГ (у відновлюють умовах: NuPAGE Novex Біс-Тріс-мінігель (фірма Invitrogen), рухливий буфер MOPS; в невідновлювальних умовах: NuPAGE трис-ацетат (фірма Invitrogen), трис-ацетатний рухливий буфер). Г) Результати, отримані за допомогою аналітичної гель-фільтрації кінцевого продукту на колонці з Супердекс 200 (вміст мономера 100 %); на фіг. 5 - результати очищення імунокон'югату на основі 28Н1 IgG-IL-2 qm, мішенню якого є FAP, з CHO-клітин. А) Профіль елюції, отриманий на стадії афінної хроматографії з білком А. Б) Профіль елюції, отриманий на стадії гель-фільтрації. В) Результати, отримані для кінцевого продукту за допомогою аналітичного ДСН-ПААГ (NuPAGE Novex Біс-Тріс-мінігель (фірма 5 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Invitrogen), рухливий буфер MOPS). Г) Результати, отримані за допомогою аналітичної гельфільтрації кінцевого продукту на колонці з Супердекс 200 (вміст мономера 100 %); на фіг. 6 - результати очищення імунокон'югату на основі 4В9 IgG-IL-2 qm, мішенню якого є FAP. А) Профіль елюції, отриманий на стадії афінної хроматографії з білком А. Б) Профіль елюції, отриманий на стадії гель-фільтрації. В) Результати, отримані для кінцевого продукту за допомогою аналітичного ДСН-ПААГ (NuPAGE Novex Біс-Тріс-мінігель (фірма Invitrogen), рухливий буфер MOPS. Г) Результати, отримані за допомогою аналітичної гель-фільтрації кінцевого продукту на колонці з Супердекс 200 (вміст мономера 100 %); на фіг. 7 - результати очищення імунокон'югату на основі CH1A1A 98/99 × 2F1 IgG-IL-2 qm, мішенню якого є CEA. А) Профіль елюції, отриманий на стадії афінної хроматографії з білком А. Б) Профіль елюції, отриманий на стадії гель-фільтрації. В) Результати, отримані для кінцевого продукту за допомогою аналітичного капілярного електрофорезу в присутності ДСН (фірма Caliper). Г) Результати, отримані за допомогою аналітичної гель-фільтрації кінцевого продукту на колонці з TSKgel G3000 SW XL (вміст мономера 98,8 %); на фіг. 8 - результати очищення імунокон'югату на основі 2В10 IgG-IL-2 qm, мішенню якого є TNC A2. А) Профіль елюції, отриманий на стадії афінної хроматографії з білком А. Б) Профіль елюції, отриманий на стадії гель-фільтрації. В) Результати, отримані для кінцевого продукту за допомогою аналітичного капілярного електрофорезу в присутності ДСН (фірма Caliper). Г) Результати, отримані за допомогою аналітичної гель-фільтрації кінцевого продукту на колонці з TSKgel G3000 SW XL (вміст мономера 100 %); на фіг. 9 - результати очищення не має специфічної мішені ("ненаправленого") імунокон'югату на основі DP47GS IgG-IL-2 qm. А) Профіль елюції, отриманий на стадії афінної хроматографії з білком А. Б) Профіль елюції, отриманий на стадії гель-фільтрації. В) Результати, отримані для кінцевого продукту за допомогою аналітичного ДСН-ПААГ (NuPAGE Novex Біс-Тріс-мінігель (фірма Invitrogen), рухливий буфер MOPS). Г) Результати, отримані за допомогою аналітичної гель-фільтрації кінцевого продукту на колонці з Супердекс 200 (вміст мономера 100 %); на фіг. 10 - результати аналізу зв'язування імунокон'югату на основі 4G8 IgG-IL-2 qm, мішенню якого є FAP, з людським FAP, що експресується на стабільно транфектованих клітинах HEK 293, отримані за допомогою FACS, у порівнянні з відповідною конструкцією Fab-IL-2 qmFab; на фіг. 11 - дані про вивільнення інтерферону (IFN)-γ з NK92-клітин, індукованому імунокон'югатом на основі 4G8 IgG-IL-2 qm, мішенню якого є FAP, в розчині в порівнянні з конструкцією на основі 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab; на фіг. 12 - результати визначення фосфорильованого STAT5 за допомогою FACS в різних типах клітин після стимуляції протягом 20 хв імунокон'югатом на основі 4G8 IgG-IL-2 qm, мішенню якого є FAP, в розчині в порівнянні з конструкціями на основі 28H1 Fab-IL-2-Fab і Fab+ + + + IL-2 qm-Fab, а також з пролейкіном. A) NK-клітини (CD3 CD56 ); Б) CD8 -T-клітини (CD3 CD8 ); + + + + + + + В) CD4 -T- клітини (CD3 CD4 CD25 CD127 ); Г) регуляторні T- клітини (CD4 CD25 FOXP3 ); на фіг. 13 - результати аналізу зв'язування імунокон'югату на основі 2В10 IgG-IL-2 qm, мішенню якого є TNC A2, та відповідного некон'югованого IgG із TNC A2, що експресується на U87MG-клітинах, отримані за допомогою FACS; на фіг. 14 - дані про індукцію проліферації NK92-клітин за допомогою імунокон'югатів на основі 2В10 IgG-IL-2 qm, мішенню якого є TNC A2, на основі CH1A1A 98/99 × 2F1 IgG-IL-2 qm, мішенню якого є CEA, і на основі CH1A1A 98/99 × 2F1 IgG-IL-2 wt, мішенню якого є CEA; на фіг. 15 - дані про індукцію проліферації NK92-клітин за допомогою імунокон'югатів, мішенню якого є FAP, таких як 4В9 IgG-IL-2 qm і 4В9 IgG-IL-2 wt; на фіг. 16-дані про знищення (отримані шляхом вимірювання вивільнення LDH) надекспресуючих CEA пухлинних клітин лінії A549 за допомогою PBMC допомогою ADCC, обумовленої створеними за допомогою глікоінженерії (ge) і дикого типу (wt) імунокон'югатами на основі CH1A1A IgG-IL-2 qm, в порівняно з некон'югованим створеним за допомогою глікоінженерії IgG CH1A1A; на фіг. 17 - результати очищення "ненаправленого" імунокон'югату DP47GS IgG-IL-2 wt. А) Профіль елюції, отриманий на стадії афінної хроматографії з білком А. Б) Профіль елюції, отриманий на стадії гель-фільтрації. В) Результати, отримані для кінцевого продукту за допомогою аналітичного ДСН-ПААГ (NuPAGE Novex Біс-Тріс-мінігель (фірма Invitrogen), рухливий буфер MOPS). Г) Результати, отримані за допомогою аналітичної гель-фільтрації кінцевого продукту на колонці з Супердекс 200 (вміст мономера 99,6 %); на фіг. 18 - результати очищення імунокон'югату на основі 28H1 IgG-IL-2, мішенню якого є FAP. А) Профіль елюції, отриманий на стадії афінної хроматографії з білком А. Б) Профіль 6 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 елюції, отриманий на стадії гель-фільтрації. В) Результати, отримані для кінцевого продукту за допомогою аналітичного ДСН-ПААГ (NuPAGE Novex Біс-Тріс-мінігель (фірма Invitrogen), рухливий буфер MOPS. Г) Результати, отримані за допомогою аналітичної гель-фільтрації кінцевого продукту на колонці з Супердекс 200 (вміст мономера 99,6 %); на фіг. 19 - результати очищення імунокон'югату на основі CH1A1A 98/99 × 2F1 IgG-IL-2 wt, мішенню якого є CEA. А) Профіль елюції, отриманий на стадії афінної хроматографії з білком А. Б) Профіль елюції, отриманий на стадії гель-фільтрації. В) Результати, отримані для кінцевого продукту за допомогою аналітичного капілярного електрофорезу в присутності ДСН (фірма Caliper). Г) Результати, отримані за допомогою аналітичної гель-фільтрації кінцевого продукту на колонці з TSKgel G3000 SW XL (вміст мономера 100 %); на фіг. 20 - результати очищення імунокон'югату на основі 4В9 IgG-IL-2 wt, мішенню якого є FAP. A) Профіль елюції, отриманий при об'єднанні афінної хроматографії на білку A і гельфільтрації. Б) Масштабоване зображення профілю елюції, отриманого за допомогою гельфільтрації на стадії А. В) Результати, отримані для кінцевого продукту за допомогою аналітичного ДСН-ПААГ (NuPAGE Novex Біс-Тріс-мінігель (фірма Invitrogen), рухливий буфер MOPS). Г) Результати, отримані за допомогою аналітичної гель-фільтрації кінцевого продукту на колонці з TSKgel G3000 SW XL (вміст мономера 98,5 %); на фіг. 21 - результати аналізу конструкції 2B10 IgG-IL-10M1, отримані за допомогою A) аналітичного ДСН-ПААГ (NuPAGE Novex Біс-Тріс-мінігель (фірма Invitrogen), буфер для зразка NuPAGE LDS (4 ×), який витримували протягом 10 хв при 70° C, MOPS-буфер, 160 В, 60 хв, маркер молекулярної маси (MW) Mark 12, незабарвлений стандарт (фірма Invitrogen, M) у відновлювальних (1) і невідновлювальних (2) умовах. Б) Результати оцінки афінності конструкції 2B10 IgG-IL-10M1 до людського TNC A2 на основі SPR (ProteOn XPR36) шляхом глобальної апроксимації із застосуванням моделі взаємодії 1:1 (чіп: NLC; ліганд: TNCA2 (250 RU); аналізована речовина: 2B10 IgG-IL-10M1, мішенню якої є TNCA2 (TNCA2 2B10 IgG-IL-10M1), 164 кДа; діапазон концентрацій аналізованої речовини: 50, 10, 2, 0,4, 0,08, 0Нм; тривалість асоціації: 6 180 с; тривалість дисоціації: 600 с; швидкість потоку: 50 мкл / хв; k on 1,80 × 10 1/Mс; koff: 9,35× -5 10 1/с; KD: 52пМ). В) Результати оцінки афінності конструкції 2B10 IgG-IL-10M1 до людського IL-10R1 на основі SPR (ProteOn XPR36) шляхом глобальної апроксимації із застосуванням моделі взаємодії 1:1 (чіп: NLC; ліганд: IL-10R1 (1600 RU); аналізована речовина: 2B10 IgG-IL10M1, мішенню якої є TNCA2, 164 кДа; діапазон концентрацій аналізованої речовини: 50, 10, 2, 0,4, 0,08, 0Нм; тривалість асоціації: 180 с; тривалість дисоціації: 600 с; швидкість потоку: 50 мкл 5 -4 / хв; kon 5,56 × 10 1/Mс; koff: 2,89 ×10 1/с; KD: 520пМ); на фіг. 22 - результати аналізу конструкції 4G8 IgG-IL-10M1, отримані за допомогою A) аналітичного ДСН-ПААГ (NuPAGE Novex Біс-Тріс-мінігель (фірма Invitrogen), буфер для зразка NuPAGE LDS (4 ×), який витримували протягом 10 хв при 70° C, MOPS-буфер, 160 В, 60 хв, маркер молекулярної маси (MW) Mark 12, незабарвлений стандарт (фірма Invitrogen, M) у відновлювальних (1) і невідновлювальних (2) умовах. Б) Результати оцінки афінності конструкції 4G8 IgG-IL-10M1 до людського FAP на основі SPR (ProteOn XPR36) шляхом глобальної апроксимації із застосуванням моделі взаємодії 1:1 (чіп: GLM; ліганд: huFAP (500 RU); аналізована речовина: FAP 4G8 IgG-IL-10M1, 164 кДа; діапазон концентрацій аналізованої речовини: 10, 2, 0,4, 0,08, 0Нм; тривалість асоціації: 180 с; тривалість дисоціації: 600 с; 5 -5 швидкість потоку: 50 мкл / хв; k on 6,68 × 10 1/Mс; koff: 1,75 × 10 1/с; KD: 26пМ). В) Результати оцінки афінності конструкції 4G8 IgG-IL-10M1 до людського IL-10R1 на основі SPR (ProteOn XPR36) шляхом глобальної апроксимації із застосуванням моделі взаємодії 1:1 (чіп: NLC; ліганд: IL 10R1 (1600 RU); аналізована речовина: 4G8 IgG-IL-10M1, мішенню якої є FAP, 164 кДа; діапазон концентрацій аналізованої речовини: 50, 10, 2, 0,4, 0,08, 0Нм; тривалість асоціації: 5 180 с; тривалість дисоціації: 600 с; швидкість потоку: 50 мкл / хв; kon: 3,64 × 10 1/Мс; koff: 2,96 × -4 10 1/с; KD: 815пМ); на фіг. 23 - результати очищення імунокон'югату на основі 4B9 "1+1" IgG-IL-2 qm, мішенню якого є FAP. A) Профіль елюції, отриманий при об'єднанні афінної хроматографії на білку A і гель-фільтрації. Б) Результати, отримані для кінцевого продукту за допомогою аналітичного ДСН-ПААГ (NuPAGE Novex Біс-Тріс-мінігель (фірма Invitrogen), рухливий буфер MOPS). В) Результати, отримані за допомогою аналітичної гель-фільтрації кінцевого продукту на колонці з TSKgel G3000 SW XL (вміст мономера 99,2 %); на фіг. 24 - результати очищення імунокон'югату на основі 28Н1 "1+1" IgG-IL-2 qm, мішенню якого є FAP. A) Профіль елюції, отриманий при об'єднанні афінної хроматографії на білку A і гель-фільтрації. Б) Результати, отримані для кінцевого продукту за допомогою аналітичного ДСН-ПААГ (NuPAGE Novex Біс-Тріс-мінігель (фірма Invitrogen), рухливий буфер MOPS). В) Результати, отримані за допомогою аналітичної гель-фільтрації кінцевого продукту на колонці з 7 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 TSKgel G3000 SW XL (вміст мономера 100 %); на фіг. 25 - результати очищення імунокон'югату на основі 4В9 "1+1" IgG-IL-2 qm, мішенню якого є FAP. A) Профіль елюції, отриманий при об'єднанні афінної хроматографії на білку A і гель-фільтрації. Б) Результати, отримані для кінцевого продукту за допомогою аналітичного ДСН-ПААГ (NuPAGE Novex Біс-Тріс-мінігель (фірма Invitrogen), рухливий буфер MOPS). В) Результати, отримані за допомогою аналітичної гель-фільтрації кінцевого продукту на колонці з TSKgel G3000 SW XL (вміст мономера 98,6 %); на фіг. 26 - результати очищення імунокон'югату на основі 4В9 "1+1" IgG IFN-α, мішенню якого є FAP. A) Профіль елюції, отриманий на стадії афінної хроматографії з білком А. Б) Профіль елюції, отриманий на стадії гель-фільтрації. В) Результати, отримані для кінцевого продукту за допомогою аналітичного капілярного електрофорезу в присутності ДСН (фірма Caliper). Г) Результати, отримані за допомогою аналітичної гель-фільтрації кінцевого продукту на колонці з TSKgel G3000 SW XL (вміст мономера 92,8 %); на фіг. 27 - дані про індукцію проліферації NK92-клітин за допомогою імунокон'югатів 4B9 "1+1" IgG-IL-2 qm і 28H1 "1+1" IgG-IL-2 wt, мішенню яких є FAP, у порівнянні з відповідними конструкціями IgG-IL-2; на фіг. 28 - дані про проліферації активованих ФГА (фітогеммагглютінін) CD4-T-клітин (A) і CD8-T-клітин (Б), індукованої імунокон'югатами 4B9 "1+1" IgG-IL-7 та 4B9 "1+1" IgG-IL-2 qm у порівнянні з конструкціями IgG-IL-2 qm і IgG-IL-2 wt; на фіг. 29 - дані про індукцію проліферації клітин Дауді за допомогою 4B9 "1+1" IgG-IFN-α у порівнянні з рофероном A; на фіг. 30 - концентрації у сироватці включають IL-2 імунокон'югатів після одноразового ivвведення конструкцій, мішенню яких є FAP (A), і "ненаправлених" конструкцій IgG-IL-2 (Б), які містять або дикого типу (wt), або чотирьохмутантний (qm) IL-2; на фіг. 31-дані про розподіл у тканинах конструкцій 28H1 IgG-IL qm, мішенню яких є FAP, у порівнянні з некон'югованими 28H1 IgG і 4B9 IgG, мішенню яких є FAP, а також з "ненаправленим" DP47GS IgG, через 24 год. після iv-ін'єкції; на фіг. 32 - дані про зв'язуванні імунокон'югатів 28H1 IgG-IL-2 qm і 28H1 IgG-(IL-2 qm) 2 з NK92-клітинами, отримані за допомогою FACS; на фіг. 33 - дані про проліферацію NK-клітин після інкубації з різними імунокон'югатами 28H1-IL-2, мішенню яких є FAP, або із пролейкіном протягом 4 (A), 5 (Б) або 6 (В) днів; на фіг. 34 - дані про проліферацію CD4-T-клітин після інкубації з різними імунокон'югатами 28H1-IL-2, мішенню яких є FAP, або із пролейкіном протягом 4 (A), 5 (Б) або 6 (В) днів; на фіг. 35 - дані про проліферацію CD8-T-клітин після інкубації з різними імунокон'югатами 28H1-IL-2, мішенню яких є FAP, або із пролейкіном протягом 4 (A), 5 (Б) або 6 (В) днів; на фіг. 36 - дані про проліферацію попередньо активованих CD8-(A) і CD4-T-клітин (Б) після інкубації протягом 6 днів з різними які містять IL-2 імунокон'югатами; + на фіг. 37 - дані про індуковану активацію клітинної загибелі CD3 -T- клітин після інкубації протягом 6 днів з різними які містять IL-2 імунокон'югатами і обробки протягом ночі антитілом до Fas; на фіг. 38 - концентрації у сироватці включають IL-2 імунокон'югатів після одноразового ivвведення "ненаправлених" конструкцій DP47GS IgG-IL-2, що містять або дикого типу (А), або чотирьохмутантний IL-2 (Б); на фіг. 39 - дані про зв'язуванні DP47GS IgG з різними антигенами. Зв'язування оцінювали за допомогою аналізу на основі ELISA з використанням антигенів, іммобілізованих на планшеті. Людське антитіло у вигляді IgG1, яку має здатність до неспецифічного зв'язування практично з усіма іммобілізованими антигенами, застосовували в якості позитивного контролю, "порожні" зразки не містили ніякого антитіла; на фіг. 40 - дані про зв'язуванні DP47GS IgG з мутацією LALA P329G або без зазначеної мутації у Fc-домені, із субпопуляціями необроблених (A), активованих ФГА-L (Б) і повторно стимульованих (В) людських PBMC, отримані за допомогою FACS-аналізу. Ліва верхня панель: B-клітини (A, Б) або CD4 +-T клітини (В); верхня права панель: CD8 +-T-клітини; нижня ліва панель: NK-клітини; нижня права панель: CD14 +-клітини (моноцити / нейтрофіли). Докладний опис винаходу Визначення Поняття, що застосовуються в даному описі, мають значення, загальноприйняті у даній галузі, якщо нижче спеціально не вказано інше. У контексті даного опису поняття "кон'югат" належить до молекули злитого поліпептиду, яка включає одну ефекторну молекулу і додаткову пептидну молекулу, зокрема, молекулу імуноглобуліну. 8 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У контексті даного опису поняття "імунокон'югат" належить до молекули злитого поліпептиду, яка включає один ефекторний фрагмент, щонайменше один антигензв'язуючий фрагмент і Fc-домен, за умови, що присутні не більше одного ефекторного фрагмента. У деяких варіантах здійснення винаходу імунокон'югат містить одну ефекторну молекулу, два антигензв'язуючих фрагмента і Fc-домен. Зокрема, імунокон'югати, пропоновані у винаході, практично складаються з одного ефекторного фрагмента, двох антигензв'язуючих фрагментів і Fc-домена, зчеплених за допомогою однієї або декількох лінкерних послідовностей. Антигензв'язуючий фрагмент і ефекторний фрагмент можуть бути пов'язані з Fc-доменом за допомогою різних взаємодій і у різних конфігураціях, зазначених у цьому описі. У конкретному варіанті здійснення винаходу два антигензв'язуючих фрагмента і Fc-домен зчеплені один з одним у такій конфігурації, щоб утворювати повну молекулу імуноглобуліну. Імунокон'югат у контексті даного винаходу являє собою злитий білок, тобто компоненти імунокон'югату пов'язані один з одним пептидними зв'язками, або безпосередньо, або через лінкерні пептиди. У контексті даного опису поняття "антигензв'язуючий фрагмент" належить до поліпептидної молекулі, яка специфічно зв'язується з антигенною детермінантою. В одному з варіантів здійснення винаходу антигензв'язуючий фрагмент має здатність направляти субстанцію, до якій він приєднаний (наприклад, ефекторний фрагмент або другою антигензв'язуючий фрагмент), до сайту-мішені наприклад, до специфічного типу пухлинної клітини або строми пухлини, що несе антигенну детермінанту. Антигензв'язуючі фрагменти включають антитіла та їх фрагменти, що буде додатково описано нижче. Кращі антигензв'язуючі фрагменти включають антигензв'язуючий домен антитіла, який містить варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла і варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла. У деяких варіантах здійснення винаходу антигензв'язуючі фрагменти можуть включати константні галузі антитіла, що буде додатково описано нижче і відомо у даній галузі. Придатні константні галузі важких ланцюгів включають будь-який з п'яти ізотипів: α, δ, ε, γ або μ. Придатні константні галузі легких ланцюгів включають будь-який з двох ізотипів: κ і λ. У контексті даного опису поняття "антигенна детермінанта" є синонімом понять "антиген" і "епітоп" і належить до сайту (наприклад, ділянці, що складається з суміжних амінокислот, або конформаційної конфігурації, що складається з різних ділянок несуміжних амінокислот) на поліпептидній макромолекулі, з якою зв'язується антигензв'язуючий фрагмент з утворенням комплексу антигензв'язуючий фрагмент-антиген. Придатні антигенні детермінанти можуть бути присутніми, наприклад, на поверхні пухлинних клітин, на поверхні інфікованих вірусом клітин, на поверхні інших хворих клітин, у вільному стані у сироватці крові та / або у позаклітинному матриксі (ECM). У конкретному варіанті здійснення винаходу антигенна детермінанта являє собою людський антиген. Поняття "специфічно зв'язується" означає, що зв'язування є виборчим відносно антигену і його можна відрізняти від небажаних або неспецифічних взаємодій. Здатність антигензв'язуючого фрагмента зв'язуватися зі специфічною антигенною детермінантою можна визначати за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) або інших методик, відомих фахівцеві в даній галузі, наприклад, за допомогою методики на основі резонансу поверхневого плазмону (здійснюючи аналіз за допомогою пристрою BIAcore) (Liljeblad та ін, Glyco J 17, 2000, сс. 323-329), і традиційних аналізів зв'язування (Heeley, Endocr Res 28, 2002, сс. 217-229). В одному з варіантів здійснення винаходу рівень зв'язування антигензв'язуючого фрагмента із неспорідненим білком становить менше ніж приблизно 10 % від рівня зв'язування антигензв'язуючого фрагмента з антигеном, виміряного, наприклад, за допомогою SPR. У деяких варіантах здійснення винаходу антигензв'язуючий фрагмент, який зв'язується з антигеном, або імунокон'югат, який містить антигензв'язуючий фрагмент, характеризується величиною константні дисоціації (KD), що становить ≤ 1мкM, ≤ 100нM, ≤ 10нM, ≤ 1нM, ≤ 0,1нM, ≤ -8 -8 -13 0,01нM або ≤ 0,001нМ (наприклад, 10 M або менше, наприклад, від 10 M до 10 M, наприклад, -9 -13 від 10 M до 10 M). Поняття "афінність" належить до сумарної сили всіх нековалентних взаємодій між індивідуальним сайтом зв'язування молекули (наприклад, рецептора) і її партнера по зв'язування (наприклад, ліганду). Якщо не вказано інше, то в контексті даного опису поняття "афінність зв'язування" належить до властивої компонентам пари, що зв'язується (наприклад, рецептора і ліганду) афінності зв'язування, що відбиває взаємодію по типу 1:1. Афінність молекули X до її партнера Y можна, як правило, характеризувати за допомогою константи дисоціації (KD), яка представляє собою відношення констант швидкості реакції дисоціації та асоціації (koff і kon відповідно). Так, еквівалентні афінності можуть відповідати різним константам швидкості, якщо співвідношення констант швидкості залишається таким же. Афінність можна оцінювати загальноприйнятими методами, відомими в даній галузі, включаючи представлені в 9 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 даному описі. Конкретним методом вимірювання афінності є резонанс поверхневого плазмону (SPR). Поняття "знижене зв'язування (знижена здатність до зв'язування)», наприклад, знижена здатність до зв'язування з Fc-рецептором або CD25, належить до зниження афінності відносно відповідної взаємодії, виміряної, наприклад, за допомогою SPR. Для ясності слід зазначити, що поняття включає також зниження афінності до нуля (або нижче межі виявлення аналітичного методу), тобто повну елімінацію взаємодії. І, навпаки, "підвищене зв'язування (підвищена здатність до зв'язування)» ставиться до підвищення афінності зв'язування щодо відповідної взаємодії. У контексті даного опису поняття "перший" і "другий" щодо антигензв'язуючих фрагментів і т.д. застосовують з метою зручності поділу, коли присутній більше одного типу кожного з фрагментів. Застосування цих понять не має на увазі їх конкретний порядок або орієнтацію в імунокон'югаті, якщо спеціально не вказано інше. У контексті даного опису поняття "ефекторний фрагмент" належить до поліпептиду, наприклад, білку або глікопротеїну, який впливає на клітинну активність, наприклад, через трансдукцію сигналів або за допомогою інших клітинних шляхів. Таким чином, ефекторний фрагмент, пропонований у винаході, може бути асоційований з опосередковуваною рецептором передачею сигналів, що призводить до передачі сигналу від зовнішньої частини клітинної мембрани, модулюючи відповідь у клітині, яка несе один або кілька рецепторів ефекторного фрагмента. В одному з варіантів здійснення винаходу ефекторний фрагмент може викликати цитотоксичну відповідь у клітинах, що несуть рецептори ефекторного фрагмента. В іншому варіанті здійснення винаходу ефекторний фрагмент може викликати проліферативну відповідь у клітинах, несучих один або кілька рецепторів ефекторного фрагмента. В іншому варіанті здійснення винаходу ефекторний фрагмент може викликати диференціювання клітин, які несуть один або кілька рецепторів ефекторного фрагмента. В іншому варіанті здійснення винаходу ефекторний фрагмент може змінювати експресію (тобто може мати здатність здійснювати підвищувальну регуляцію або знижувальну регуляцію) ендогенного клітинного білка в клітинах, які несуть рецептори ефекторного фрагмента. Прикладами ефекторних фрагментів є (але, не обмежуючись лише ними) цитокіни, фактори росту, гормони, ферменти, субстрати і кофактори. Ефекторний фрагмент може бути асоційований з антигензв'язуючих фрагментом або Fcдоменом у різних конфігураціях з утворенням імунокон'югату. У контексті даного опису поняття "цитокін" належить до молекули, яка опосередковує і / або регулює біологічну або клітинну функцію або процес (наприклад, імунітет, запалення і гематопоез). Поняття "цитокін" в контексті даного опису належить до "лімфокінів", "хемокінів", "монокінів" і "інтерлейкінів". Прикладами придатних для застосування цитокінів є (але, не обмежуючись тільки ними) GM-CSF, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TGF-β, TNF-α і TNF-β. Конкретні цитокіни представляють собою IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IFN-α і IFN-γ. У конкретних варіантах здійснення винаходу цитокін являє собою людський цитокін. У контексті даного опису мається на увазі також, що поняття "цитокін" включає також варіанти цитокіну, що містять одну або кілька амінокислотних мутацій у амінокислотних послідовностях відповідного цитокіну дикого типу, такі, наприклад, як варіанти IL-2, описані у Sauvé та ін, Proc Natl Acad Sci USA 88, 1991, сс. 4636-4640; Hu та ін, Blood 101, 2003, сс. 4853-4861 і в публікації патенту США № 2003/0124678; у Shanafelt та ін, Nature Biotechnol 18, 2000, сс. 1197-1202; Heaton та ін, Cancer Res 53, 1993, сс. 2597-2602 і в US № 5229109; в публікації патенту США № 2007/0036752; WO 2008/0034473; WO 2009/061853; або публікації PCT заявки на патент PCT/EP2012/051991. Інші варіанти цитокінів, наприклад, варіанти IL-15, представлені в даному описі. У деяких варіантах здійснення винаходу цитокіни піддавали мутації для елімінації глікозилювання. У контексті даного опису поняття "одноланцюговий" належить до молекули, що містить амінокислотні мономери, пов'язані лінійно за допомогою пептидних зв'язків. В одному з варіантів здійснення винаходу ефекторний фрагмент являє собою одноланцюговий ефекторний фрагмент. Прикладами одноланцюгових ефекторних фрагментів є (але, не обмежуючись лише ними) цитокіни, фактори росту, гормони, ферменти, субстрати і кофактори. Коли ефекторний фрагмент являє собою цитокін, і який представляє собою інтерес цитокін в нормі в природних умовах існує у вигляді мультимера, то кожна субодиниця мультімерного цитокіну послідовно кодується одним ланцюгом ефекторного фрагмента. Таким чином, прикладами придатних для застосування одноланцюгових ефекторних фрагментів є (але, не обмежуючись тільки ними) GM-CSF, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TGF-β, TNF-α і TNF-β. У контексті даного опису поняття "застосовуваний в якості контролю ефекторний фрагмент" 10 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 належить до некон'югованого ефекторного фрагменту. Наприклад, при здійсненні порівняння містить IL-2 імунокон'югату, що пропонується у даному винаході, і що застосовується у якості контролю ефекторного фрагмента, що застосовується в якості контролю ефекторний фрагмент являє собою вільний некон'югований IL-2. Аналогічно цьому, наприклад, при здійсненні порівняння містить IL-12 імунокон'югату, що пропонується у даному винаході, і ефекторного фрагмента що застосовується в якості контролю, ефекторний фрагмент що застосовується в якості контролю являє собою вільний некон'югований IL-12 (наприклад, існуючий у вигляді гетеродимерного білка, коли субодиниці p40 і p35 з'єднані тільки дисульфідним (ими) зв'язком (ами)). У контексті даного опису поняття "рецептор ефекторного фрагмента" належить до поліпептидів молекулі, яка має здатність специфічно зв'язуватися з ефекторним фрагментом. Наприклад, коли ефекторний фрагмент являє собою IL-2, рецептор ефекторного фрагмента, який зв'язується з IL-2 (наприклад, із імунокон'югатом, який містить IL-2), являє собою рецептор IL-2. Аналогічно цьому, наприклад, коли IL-12 являє собою ефекторний фрагмент імунокон'югату, то рецептором ефекторного фрагмента є рецептор IL-12. Коли рецепторний фрагмент специфічно зв'язується більш ніж з одним рецептором, всі рецептори, які специфічно зв'язуються з ефекторним фрагментом, являють собою "рецептори ефекторного фрагмента" для зазначеного ефекторного фрагмента. Поняття "молекула імуноглобуліну" належить до білка, що має структуру такого, що зустрічається в природних умовах антитіла. Наприклад, імуноглобуліни класу IgG являють собою гетеротетрамерні глікопротеїни з молекулярною масою приблизно 150 000 Да, що складаються з двох легких ланцюгів і двох важких ланцюгів, пов'язаних дисульфідними містками. В напрямку від N-кінця до C-кінця кожен важкий ланцюг містить варіабельну ділянку (VH), яку називають також варіабельний важким доменом або варіабельний доменом важкого ланцюга, за яким розташовані три константних домена (CH1, CH2 і CH3), які називають також константною ділянкою важкого ланцюга. Аналогічно цьому, в напрямку від N-кінця до C-кінця кожен легкий ланцюг містить варіабельну ділянку (VL), яку називають також варіабельним легким доменом або варіабельним доменом легкого ланцюга, за якою розташований константний домен легкого ланцюга (CL), який називають також константною ділянкою легкого ланцюга. Важкий ланцюг імуноглобуліну може належати до одного з п'яти типів, позначених як α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG) або μ (IgM), деякі з яких додатково підрозділяють на підтипи, наприклад, γ1 (IgG1), γ2 (IgG2), γ3 (IgG3), γ4 (IgG4), α1 (IgA1) і α2 (IgA2). Легкий ланцюг імуноглобуліну може належати до одного з двох типів, позначених як каппа (κ) і лямбда (λ), на основі амінокислотної послідовності її константного домена. Імуноглобулін, як правило, складається з двох молекул Fab і Fc-домена, які з'єднані через шарнірну ділянку імуноглобуліну. У контексті даного опису поняття "антитіло" використовується в його найбільш широкому сенсі, і воно належить до різних структур антитіл, включаючи (але, не обмежуючись лише ними) моноклональні антитіла, поліклональні антитіла і фрагменти антитіл, за умови, що вони мають необхідну антигензв'язуючу активність. Поняття "фрагмент антитіла" належить до молекули, відмінної від інтактного антитіла, яка містить частину інтактного антитіла, яка зв'язується з антигеном, з яким зв'язується інтактне антитіло. Прикладами фрагментів антитіл є (але, не обмежуючись тільки ними) Fv, Fab, Fab', Fab’-SH, F(ab')2, димерні антитіла, лінійні антитіла, одноланцюгові молекули антитіл (наприклад, scFv) і однодоменні антитіла. Огляд деяких фрагментів антитіл див., наприклад, у Hudson та ін, Nat Med 9, 2003, сс. 129-134. Огляд scFv-фрагментів див., наприклад, у Plückthun в: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, т. 113, під ред. Rosenburg і Moore, вид-во SpringerVerlag, New York, 1994, сс. 269-315; див. також WO 93/16185; і US № № 5571894 і 5587458. Обговорення Fab-і F(ab')2-фрагментів, що містять залишки епітопу, що зв'язується з рецептором порятунку, і мають подовжений час напівжиття in vivo, див. в US № 5869046. Димерні антитіла (діабоді) представляють собою фрагменти антитіл з двома антигензв'язуючими сайтами, які можуть бути двовалентними або біспецифічними (див., наприклад, EP 404097; WO 1993/01161; Hudson та ін, Nat Med 9, 2003, сс. 129-134; і Hollinger та ін., Proc Natl Acad Sci USA 90, 1993, сс. 6444-6448. Тримерні (тріабоді) і тетрамерні (тетрабоді) антитіла описані також у Hudson та ін, Nat Med 9, 2003, сс. 129-134. Однодоменні антитіла представляють собою фрагменти антитіл, які містять весь або частину варіабельного домену важкого ланцюга або весь або частину варіабельного домену легкого ланцюга антитіла. У деяких варіантах здійснення винаходу однодоменне антитіло являє собою людське однодоменне антитіло (фірма Domantis, Inc., Waltham MA; див., наприклад, US № 6248516 B1). Фрагменти антитіл можна створювати за допомогою різних методик, включаючи (але, не обмежуючись лише ними) протеолітичне розщеплення інтактного антитіла, а також отримувати з використанням рекомбінантних клітин 11 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 хазяїнів (наприклад, E. coli або фага), як зазначено в даному описі. Поняття "антигензв'язуючий домен" належить до частини антитіла, яка містить ділянку, специфічно зв'язується і яка є комплементарною частині антигену або повного антигену. Антигензв'язуючий домен може являти собою, наприклад, один або кілька варіабельних доменів антитіла (які називають також варіабельними ділянками антитіла). Переважно антигензв'язуючий домен містить варіабельна ділянка легкого ланцюга (VL) антитіла та варіабельна ділянка важкого ланцюга (VH) антитіла. Поняття "варіабельна ділянка" або "варіабельний домен" належить до домену важкого або легкого ланцюга антитіла, який бере участь у зв'язуванні антитіла з антигеном. Варіабельні домени важкого ланцюга і легкого ланцюга (VH і VL відповідно) нативного антитіла, як правило, мають подібні структури, при цьому кожен домен містить чотири консервативних каркасних ділянки (FR) і три гіперваріабельних ділянки (HVR) (див., наприклад, Kindt та ін, Kuby Immunology, 6-е вид., вид-во WH Freeman and Co., 2007, с. 91). Одного VH-або VL-домену може бути достатньо для забезпечення специфічності зв'язування антигену. Поняття "гіперваріабельна ділянка" або "HVR" в контексті даного опису належить до кожної з ділянок варіабельного домену антитіла, послідовності яких є гіперваріабельні, та / або які утворюють структури у вигляді петель ("гіперваріабельні петлі"). Як правило, нативні чотирьохланцюгові антитіла містять шість HVR; три в VH (H1, H2, H3) і три в VL (L1, L2, L3). HVR, як правило, містять амінокислотні залишки з гіперваріабельних петель і / або з "визначальних комплементарність ділянок" (CDR), останні відрізняються найбільш вираженою варіабельністю послідовності і / або беруть участь у розпізнаванні антигенів. Крім CDR1, присутнього в VH, CDR, як правило, містять амінокислотні залишки, які утворюють гіперваріабельні петлі. Поняття "гіперваріабельні ділянки" (HVR) належить також до "визначальним компліментарність ділянок" (CDR), і в контексті даного опису ці поняття використовуються взаємозамінно щодо положень варіабельної ділянки, які формують антигензв'язуючі ділянки. Ця конкретна ділянка описана у Kabat та ін, US Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 1983 і у Chothia і др., J. Mol. Biol. 196, 1987, сс. 901-917, причому ці визначення належать до амінокислотних залишків що перекриваються або піднаборів амінокислотних залишків при їх порівнянні один з одним. Проте в контексті даного опису мається на увазі можливість застосування будь-якого визначення CDR антитіла або його варіантів. Відповідні амінокислотні залишки, з яких складаються CDR, як вони визначені у кожному з процитованих вище посилань, представлені в порівнянні нижче в таблиці 1. Точні номера залишків, які утворюють конкретний CDR, повинні варіюватися залежно від послідовності та розміру CDR. Фахівці в даній галузі на основі даних про амінокислотну послідовність варіабельної ділянки антитіла легко можуть визначати, які залишки входять в конкретний CDR. Таблиця 1 Визначення CDR VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 VL CDR1 VL CDR2 VL CDR3 Кебот 31-35 50-65 95-102 24-34 50-56 89-97 1 Хотіа 26-32 52-58 95-102 26-32 50-52 91-96 2 АbМ 26-35 50-58 95-102 24-32 50-56 89-97 1 40 45 Нумерація всіх вхідних в CDR залишків у таблиці 1 дана відповідно до номенклатури, запропонованої Кебот з співавторами (див. нижче). 2 Позначення "AbM" з великою буквою "b", використане в таблиці 1, належить до CDR, як вони визначені програмою для моделювання антитіл "AbM" компанії Oxford Molecular Group. Кебот з співавторами запропонували також систему нумерації (номенклатуру) послідовностей варіабельних ділянок, яку можна застосовувати для будь-якого антитіла. Звичайний фахівець у даній галузі може однозначно застосовувати цю систему "нумерації по Кебот" до будь-якої послідовність варіабельної ділянки, не маючи ніяких експериментальних даних, крім відомостей про саму послідовність. У контексті даного опису поняття "нумерація за Кеботом" належить до системи нумерації, описаної у Kabat та ін, "Sequence of Proteins of Immunological Interest", вид-во US Dept. of Health and Human Services, 1983. Якщо не вказано 12 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інше, то посилання на нумерацію положень конкретних амінокислотних залишків у варіабельної ділянки антитіла дані відповідно з системою нумерації по Кебот. Нумерація поліпептидних послідовностей у "Переліку послідовностей" (тобто SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31 і т.д.) не являє собою нумерацію відповідно до системи Кебота. Однак в компетенції звичайного фахівця в даній галузі є перетворення нумерації послідовностей у "Переліку послідовностей" в нумерацію за Кеботом. "Каркасні ділянки »або« FR »-ділянки являють собою ділянки варіабельних доменів, відмінні від залишків гіперваріабельних ділянок (HVR). FR варіабельного домену, як правило, представлені чотирма FR-доменами: FR1, FR2, FR3 і FR4. Таким чином, послідовність HVR і FR, як правило, розташовані в VH (або VL) в наступному порядку: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3H3(L3)-FR4. Поняття "клас" антитіла або імуноглобуліну належить до типу константного домену або константної ділянки, що міститься в важкому ланцюзі. Існує п'ять основних класів антитіл: IgA, IgD, IgE, IgG і IgM, а деякі з них можна додатково поділяти на підкласи (ізотипи), наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 і IgA2. Константні домени важких ланцюгів, які відповідають різним класам імуноглобулінів, позначають як α, δ, ε, γ і μ відповідно. У контексті даного опису поняття "Fc-домен" або "Fc-ділянка" належить до C-кінцевої ділянки важкому ланцюзі імуноглобуліну, яка містить щонайменше частину константної ділянки. Поняття належить до нативної послідовності Fc-ділянок і варіантами Fc-ділянок. Хоча прикордонні послідовності Fc-ділянки в важкому ланцюзі IgG можуть злегка варіюватися, як правило, Fc-ділянка важкого ланцюга людського IgG простягається від Cys226 або від Pro230 до карбоксильного кінця важкого ланцюга. Однак C-кінцевий лізин (Lys447) Fc-ділянки може або бути присутнім, або відсутнім. Якщо спеціально не вказано інше, то нумерація амінокислотних залишків у Fc-ділянці або константній ділянці відповідає системі EU-нумерації, яку називають також EU-індекс, описаної у Kabat і до., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е вид., вид-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Поняття "субодиниця" Fc-домена в контексті даного опису належить до одного з двох поліпептидів, що утворюють димерний Fc-домен, тобто до поліпептиду, який містить C-кінцеві константні ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну, що мають здатність до стабільної самоасоціації. Наприклад, субодиниця Fc-домена IgG містить константний домен CH2 IgG і CH3 IgG. "Модифікація, яка посилює гетеродимерізацію » представляє собою маніпуляцію з пептидним каркасом або пост-трансляційні модифікації поліпептиду, яка зменшує або перешкоджає асоціації поліпептиду з ідентичним поліпептидом з утворенням гомодимеру. У контексті даного опису модифікація, яка посилює гетеродимерізацію, включає, перш за все, різні модифікації, здійснювані з кожним з двох поліпептидів, які потрібні для утворення димеру, при цьому, модифікації доповнюють один одного таким чином, щоб підсилювати асоціацію двох поліпептидів. Наприклад, модифікація, яка посилює гетеродимерізацію, може змінювати структуру або заряд одного або обох поліпептидів, необхідних для утворення димеру, таким чином, щоб покращувати їх асоціацію стерично або електростатично відповідно. Гетеродимерізація має місце між двома неідентичними поліпептидами, такими як дві субодиниці Fc-домена, при цьому додаткові компоненти імунокон'югата злитих один з одним субодиниць (наприклад, антигензв'язуючого фрагмента, ефекторного фрагмента) не є однаковими. У імунокон'югатах, пропонованих в даному винаході, модифікація, яка посилює гетеродимерізацію, зачіпає Fc-домен. У деяких варіантах здійснення винаходу модифікація, яка посилює гетеродимерізацію, являє собою амінокислотну мутацію, зокрема, амінокислотну заміну. У конкретному варіанті здійснення винаходу модифікація, яка посилює гетеродимерізацію, являє собою індивідуальну амінокислотну мутацію, зокрема, амінокислотну заміну, в кожній з двох субодиниць Fc-домена. Поняття "ефекторні функції", що використовується в даному описі, належить до видів біологічної активності, властивим Fc-ділянці антитіла, які варіюються залежно від ізотипу антитіла. Прикладами ефекторних функцій антитіла є: здатність зв'язуватися з C1q і комплементзалежна цитотоксичність (CDC), здатність зв'язуватися з Fc-рецептором, антитілообумовлена клітинозалежна цитотоксичність (ADCC), антитіло-обумовлений клітинозалежний фагоцитоз (ADCP), секреція цитокінів, опосередкована імунним комплексом поглинання антигену антигенпрезентуючими клітинами, понижуюча регуляція рецепторів клітинної поверхні (наприклад, B-клітинного рецептора); та активація B-клітин. У контексті даного опису мається на увазі, що поняття "конструювання, сконструйований, інженерія" включають будь-яку маніпуляцію з пептидним каркасом або пост-трансляційні модифікації такого, що зустрічається в природних умовах або рекомбінантного поліпептиду або його фрагмента. Інженерія включає модифікації амінокислотної послідовності, схеми 13 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 глікозилювання або групи бічних ланцюгів індивідуальних амінокислот, а також комбінації зазначених підходів. Інженерія насамперед з приставкою "гліко", а також "інженерія глікозилювання (глікоінженерія)» (конструювання схеми глікозилювання) включає метаболічне конструювання механізму глікозилювання клітини, в тому числі генетичні маніпуляції, що стосуються шляхів олігосахаридного синтезу, з метою отримання зміненого глікозилювання глікопротеїнів, які експресуються в клітинах. Крім того, конструювання схеми глікозилювання включає впливи мутацій і клітинного оточення на глікозилювання. В одному з варіантів здійснення винаходу глікоінженерію здійснюють з метою зміни глікозилтрансферазної активності. У конкретному варіанті здійснення винаходу інженерія дозволяє змінювати активність глюкозамінілтрансферази та / або активність фукозилтрансферази. Глікоінженерію можна використовувати для отримання "клітини-хазяїна, що має підвищену GnTIII-активність", "клітинихазяїна, що має підвищену ManII-активність" або "клітини-хазяїна, що має підвищену α (1,6) фукозилтрансферазну активність". У контексті даного опису мається на увазі, що поняття "амінокислотна мутація" належить до амінокислотних замін, делецій, інсерцій і модифікацій. Можна застосовувати будь-яку комбінацію заміни, делеції, інсерції і модифікації для створення кінцевої конструкції за умови, що кінцева конструкція має необхідні характеристики, наприклад, знижену здатність зв'язуватися з Fc-рецептором або знижену здатність зв'язуватися з CD25. Амінокислотна послідовність з делеціями і інсерціями включає аміно-та / або карбоксікінцеві делеції і інсерції амінокислот. Конкретними амінокислотними мутаціями є амінокислотні заміни. Для зміни, наприклад, характеристик зв'язування з Fc-ділянкою чи цитокіном, таким як IL-2, найбільш кращими є неконсервативні амінокислотні заміни, тобто заміна однієї амінокислоти на іншу амінокислоту, що має інші структурні та / або хімічні властивості. Амінокислотні заміни включають заміну на такі, що не зустрічаються в природних умовах амінокислоти або на похідні таких, що зустрічаються в природних умовах двадцяти стандартних амінокислот (наприклад, на 4-гідроксипролін, 3-метілгістідін, орнітин, гомосерін, 5-гідроксилізин). Амінокислотні мутації можна створювати за допомогою генетичних або хімічних методів, добре відомих в даній галузі. Генетичні методи можуть включати сайтнаправленний мутагенез, ПЛР, синтез генів і т.п. Мається на увазі, що можна застосовувати також методи зміни бічної групи амінокислоти, відмінні від методів генетичної інженерії, такі як хімічна модифікація. Для позначення однієї і тієї ж амінокислотної мутації можна використовувати різні позначення. Наприклад, заміну проліну в положенні 329 Fc-домена на такі, гліцин можна позначати у якості 329G, G329, G 329, P329G або Pro329Gly. У контексті даного опису поняття "поліпептид" належить до молекули, що складається з мономерів (амінокислот), лінійно пов'язаних амідними зв'язками (які позначають також як пептидні зв'язки). Поняття "поліпептид" належить до будь-якого ланцюга, що складається з двох або більшої кількості амінокислот, і не має на увазі, що продукт має конкретну довжину. Так, пептиди, дипептиди, трипептиди, олігопептиди, "білок", "амінокислотний ланцюг" або будь-яке інше прийняте поняття, що належить до ланцюга, що складається з двох або більшої кількості амінокислот, всі підпадають під визначення "поліпептид", і поняття "поліпептид" можна застосовувати замість або взаємозамінно з будь-яким із зазначених понять. Мається на увазі також, що поняття "поліпептид" належить до продуктів, які несуть пост-експресійні модифікації поліпептиду, включаючи (але, не обмежуючись лише ними) глікозилювання, ацетилювання, фосфорилювання, амідування, дериватизацію з використанням відомих захисних / блокуючих груп, протеолітичне розщеплення або модифікацію за допомогою таких, що не зустрічаються в природних умовах амінокислот. Поліпептид можна отримувати з такого, що зустрічається в природних умовах біологічного джерела або можна отримувати за допомогою технології рекомбінантної ДНК, і його не обов'язково транслювати із створеної нуклеотидної послідовності. Його можна створювати будь-яким шляхом, включаючи хімічний синтез. Поліпептид, пропонований у винаході, може складатися приблизно з 3 або більше, 5 або більше, 10 або більше, 20 або більше, 25 або більше, 50 або більше, 75 або більше, 100 або більше, 200 або більше, 500 або більше, 1000 або більше або 2000 або амінокислот. Поліпептиди можуть мати різну тривимірну структуру, хоча вони необов'язково повинні мати зазначену структуру. Поліпептиди з певною тривимірною структурою позначають як поліпептиди, що мають укладку, а поліпептиди, які не мають певну тривимірну структуру, але які легше можуть адаптуватися до великої кількості різних конформацій, позначають як поліпептиди, що не мають укладку. Під "виділеним" поліпептидом або його варіантом, або похідним мають на увазі поліпептид, який не знаходиться в його природному оточенні. При цьому не потрібно якогось конкретного рівня очищення. Наприклад, виділений поліпептид можна видаляти з його нативного або 14 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 природного оточення. Отримані шляхом рекомбінації поліпептиди і білки, які експресуються в клітинах-хазяїнах, розглядаються як виділені для цілей цього винаходу, якщо вони являють собою нативні або рекомбінантні поліпептиди, які відокремлені, фракціоновані або частково або повністю очищені за допомогою будь-якого прийнятного методу. "Відсоток (%) ідентичності амінокислотної послідовності » щодо поліпептидної референспослідовності визначають як відсоток амінокислотних залишків у послідовності-кандидаті, які ідентичні амінокислотним залишкам в поліпептидній референс-послідовності, після вирівнювання послідовностей та інтродукції при необхідності проломів для досягнення максимального відсотка ідентичності послідовностей, і при цьому будь-які консервативні заміни не враховуються при оцінці ідентичності послідовностей. Порівняльний аналіз для визначення відсотка ідентичності амінокислотних послідовностей можна здійснювати різними шляхами, які знаходяться в компетенції фахівця в даній галузі, наприклад, з використанням публічно доступних комп'ютерних програм, таких як програма BLAST, BLAST-2, ALIGN або Megalign (DNASTAR). Фахівці в даній галузі можуть визначати відповідні параметри для вирівнювання послідовностей, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання по всій довжині порівнюваних послідовностей. Однак для цілей цього винаходу величину % ідентичності амінокислотних послідовностей отримують з використанням призначеної для порівняння послідовностей комп'ютерної програми ALIGN-2. Призначена для порівняння послідовностей комп'ютерна програма ALIGN-2 розроблена фірмою Genentech, Inc., І вихідний код поміщений на зберігання разом з документацією для користувача в US Copyright Office, Washington DC, 20559, де він зареєстрований під реєстраційним номером US Copyright Registration № TXU510087. Програма ALIGN-2 являє собою публічно доступну програму фірми Genentech, Inc., Південний Сан-Франциско, шт. Каліфорнія, або її можна компілювати з вихідного коду. Програму ALIGN-2 можна компілювати для застосування в операційній системі UNIX, включаючи цифрову версію UNIX V4.0D. У програмі ALIGN-2 всі параметри для порівняння послідовностей є заданими та не повинні змінюватися. У ситуаціях, коли ALIGN-2 застосовують для порівняння амінокислотних послідовностей, % ідентичності амінокислотних послідовностей даної амінокислотної послідовності A відносно або в порівнянні з даною амінокислотною послідовністю Б (яку іншими словами можна позначати як дана амінокислотна послідовність A, яка має або відрізняється певним % ідентичності амінокислотної послідовності відносно або в порівнянні з даною амінокислотною послідовністю Б), розраховують таким чином: 100 × приватне X/Y, де X позначає кількість амінокислотних залишків, оцінених програмою порівняльного аналізу послідовностей ALIGN-2 як ідентичні збіги при порівняльному аналізі послідовностей A і Б за допомогою зазначеної програми, і де Y позначає загальну кількість амінокислотних залишків у Б. Повинно бути очевидно, що, коли довжина амінокислотної послідовності A не дорівнює довжині амінокислотної послідовності Б, то % ідентичності амінокислотної послідовності A щодо амінокислотної послідовності Б не повинен бути рівний % ідентичності амінокислотної послідовності Б щодо амінокислотної послідовності А. Якщо спеціально не вказано інше, то в контексті даного опису всі величини % ідентичності амінокислотних послідовностей отримують згідно з процедурою, описаною в останньому з попередніх параграфів, за допомогою комп'ютерної програми ALIGN-2. Поняття "полінуклеотид" належить до виділеної молекули нуклеїнової кислоти або конструкції, наприклад, матричної РНК (мРНК), РНК вірусного походження або плазмідної ДНК (пДНК). Полінуклеотид може містити звичайний фосфодіефірний зв'язок або традиційний зв'язок (наприклад, амідний зв'язок, такий, що є присутнім в пептидних нуклеїнових кислотах (ПНК)). Поняття "молекула нуклеїнової кислоти" належить до будь-якого одного або декількох сегментів нуклеїнової кислоти, наприклад, фрагментів ДНК або РНК, які присутні в полинуклеотиді. Під "виділеною" молекулою нуклеїнової кислоти або полінуклеотидом мається на увазі молекула нуклеїнової кислоти, тобто ДНК або РНК, яка відокремлена від її нативного оточення. Наприклад, рекомбінантний полінуклеотид, що кодує вхідний до вектора терапевтичний поліпептид, розглядається як виділений для цілей цього винаходу. Іншими прикладами виділеного полінуклеотиду є рекомбінантні полінуклеотиди, присутні в гетерологічних клітинаххазяїнах, або очищені (частково або повністю) полінуклеотиди, що знаходяться в розчині. Виділений полінуклеотид включає молекулу полінуклеотиду, що входить в клітини, які в нормі містять молекулу полінуклеотиду, але молекула полінуклеотиду присутній поза хромосоми або має локалізацію в хромосомі, відмінну від її локалізації в хромосомі в природних умовах. Виділені молекули РНК включають отримані in vivo або in vitro РНК-транскрипти, 15 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 запропоновані в даному винаході, а також форми з позитивним і негативним ланцюгом і дволанцюжкові форми. Виділені полінуклеотиди або нуклеїнові кислоти, запропоновані в даному винаході, включають також зазначені молекули, отримані за допомогою синтезу. Крім того, полінуклеотид або нуклеїнова кислота може представляти собою або може включати регуляторний елемент, такий як промотор, сайт звязування рибосом або термінатор транскрипції. Під нуклеїнової кислотою або полінуклеотидом, що має / мають нуклеотидну послідовність, яка, наприклад, на 95 % "ідентична" нуклеотидній референс-послідовності, запропонованій в даному винаході, мається на увазі, що нуклеотидна послідовність полінуклеотиду ідентична референс-послідовності за винятком того, що полінуклеотидна послідовність може включати аж до 5 точкових мутацій на кожні 100 нуклеотидів нуклеотидної референс-послідовності. Іншими словами, для отримання полінуклеотиду, що має нуклеотидну послідовність, яка ідентична щонайменше на 95 % нуклеотидній референс-послідовності, аж до 5 % нуклеотидів в референс-послідовності можна вилучати шляхом делеції або замінювати на інший нуклеотид, або аж до 5 % нуклеотидів від загальної кількості нуклеотидів в референс-послідовності можна вбудовувати в референс-послідовність. Ці зміни референс-послідовності можуть мати місце в положеннях на 5’- або 3’-кінці нуклеотидної референс-послідовності або в іншому положенні між цими кінцевими положеннями, і їх вбудовують або індивідуально між залишками в референспослідовності, або їх вбудовують в референс-послідовність у вигляді однієї або кількох суміжних груп. На практиці вирішення питання про те, чи ідентична конкретна полінуклеотидна послідовність щонайменше на 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % нуклеотидної послідовності, запропонованої в даному винаході, можна вирішувати, як правило, з використанням відомих комп'ютерних програм, наприклад, зазначених вище для поліпептидів (наприклад, ALIGN-2). Поняття "касета експресії" належить до полінуклеотиду, отриманому за допомогою рекомбінації або синтезу, який містить серії специфічних нуклеотидних елементів, які забезпечують транскрипцію конкретної нуклеїнової кислоти в клітині-мішені. Рекомбінантну касету експресії можна вбудовувати в плазміду, хромосому, мітохондріальну ДНК, пластидну ДНК, вірус або фрагмент нуклеїнової кислоти. Як правило, рекомбінантна касета експресії, що представляє собою частину експресійного вектора, включає серед інших послідовностей нуклеотидну послідовність, яка підлягає транскрипції і промотор. У деяких варіантах здійснення винаходу касета експресії, пропонована у винаході, містить полінуклеотидні послідовності, які кодують імунокон'югати, пропоновані у винаході, або їх фрагменти. Поняття "вектор" або "експресійний вектор" є синонімом поняття "експресійна конструкція" і належить до молекули ДНК, яку застосовують для інтродукції та забезпечення експресії конкретного гена, з якою він функціонально пов'язаний в клітині-мішені. Поняття включає вектор, що представляє собою структуру нуклеїнової кислоти, що самореплікується, а також вектор, вбудований в геном клітини-хазяїна, в яку він інтродукований. Експресійний вектор, пропонований в даному винаході, містить касету експресії. Експресійні вектори дозволяють здійснювати транскрипцію стабільної мРНК у великих кількостях. Коли експресійний вектор знаходиться всередині клітини-мішені, то молекула рибонуклеїнової кислоти або білок, який кодується геном, продукується в результаті клітинного механізму транскрипції і / або трансляції. В одному з варіантів здійснення винаходу експресійний вектор, пропонований у винаході, містить касету експресії, яка включає полінуклеотидні послідовності, які кодують імунокон'югати, пропоновані у винаході, або їх фрагменти. Поняття "штучний" належить до синтетичної або отриманої з клітини-хазяїна композиції, наприклад, до синтезованого хімічно олігонуклеотиду. У контексті даного опису поняття "клітина-хазяїн", "клітинна лінія-хазяїн" і "клітинна культура-хазяїн" використовуються взаємозамінно, і вони належать до клітин, в які інтродуковані екзогенна нуклеїнова кислота, включаючи потомство зазначених клітин. До клітинхазяїв належать "трансформанти" і "трансформовані клітини", які включають первинні трансформовані клітини, а також потомство, виведене з них, незалежно від кількості пересівань. Потомство може не бути суворо ідентичним батьківській клітині за складом нуклеїнових кислот, а може нести мутації. Під дане поняття підпадає мутантне потомство, яке має таку ж функцію або біологічну активність, що і відібрана шляхом скринінгу або селекції вихідна трансформована клітина. Клітина-хазяїн являє собою клітинну систему будь-якого типу, яку можна застосовувати для створення імунокон'югатів, запропонованих в даному винаході. В одному з варіантів здійснення винаходу клітину-хазяїна конструюють так, щоб можна було отримувати імунокон'югат з модифікованими олігосахаридами в його Fc-ділянці. У деяких варіантах здійснення винаходу клітини-хазяїни можна піддавати маніпуляціям для експресії 16 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 підвищених рівнів одного або декількох поліпептидів, які мають активність β (1,4)-Nацетилглюкозамілтрансферази III (GnTIII). У деяких варіантах здійснення винаходу клітинихазяїни піддають додатковим маніпуляціям для експресії підвищених рівнів одного або декількох поліпептидів, які мають активністю α-маннозідази II (ManII). Клітини-хазяїни включають культивовані клітини, наприклад, культивовані клітини ссавців, такі як (але, не обмежуючись лише ними) CHO-клітини, BHK-клітини, NS0-клітини, SP2/0-клітини, клітини мієломи лінії YO, клітини мишачої мієломи лінії P3 × 63, PER-клітини, PER.C6-клітини або клітини гібридоми, клітини дріжджів, клітини комах і клітини рослин, але також клітини, що знаходяться в трансгенному тваринному, трансгенному рослині або в культивованій рослинній або тваринній тканині. У контексті даного опису поняття "поліпептид, що має GnTIII-активність" належить до поліпептидів, які мають здатність каталізувати додавання залишку N-ацетилглюкозаміну (GlcNAc) в β-1-4-зв'язку до β-пов'язаного маннозиду тріманнозильного ядра N-пов'язаних олігосахаридів. Поняття належить до злитих поліпептидів, які мають ферментативну активність, подібної, але не обов'язково ідентичної, активності β (1,4)-N-ацетилглюкозамінілтрансферази III, також відомої під назвою β-1,4-маннозил-глікопротеїн-4-бета-Nацетилглюкозамінілтрансфераза (КФ 2.4.1.144) згідно з номенклатурою Комітету Міжнародного союзу з біохімії та молекулярної біології (Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB)), при оцінці за допомогою конкретного біологічного аналізу як у випадку залежності від дози, так і без залежності від дози. У разі, коли існує залежність від дози, фермент не повинен бути обов'язково ідентичний GnTIII, а скоріше він повинен бути практично подібний їй відносно залежності даної активності від дози в порівнянні з GnTIII (тобто поліпептид-«кандидат" повинен мати більш високу активність або не більше ніж приблизно в 25 разів знижену активність, краще не більше ніж приблизно в 10 разів знижену активність, і ще більш краще не більше ніж приблизно в 3 рази знижену активність в порівнянні з GnTIII.). У конкретних варіантах здійснення винаходу поліпептид, що має GnTIII-активність, являє собою злитий поліпептид, містить каталітичний домен GnTIII і домен локалізації в комплексі Гольджі гетерологічного поліпептиду, присутнього в комплексі Гольджі. Зокрема, домен локалізації в комплексі Гольджі являє собою домен локалізації маннозідази II або GnTI, найбільш краще домен локалізації маннозідази II. Альтернативно цьому, домен локалізації в комплексі Гольджі вибирають з групи, включає: домен локалізації маннозідази I, домен локалізації GnTII і домен корової α1,6-фукозілтрансферази. Методи створення зазначених злитих поліпептидів та їх застосування для отримання антитіл з підвищеними ефекторними функціями описані у WO 2004/065540, попередній заявці на патент США № 60/495142 й у публікації заявки на патент США № 2004/0241817, повний зміст яких включено в даний опис в якості посилання. У контексті даного опису поняття "домен локалізації в комплексі Гольджі" належить до амінокислотної послідовності розташованого у комплексі Гольджі поліпептиду, який відповідальний за "заякорювання" поліпептиду у ділянці, що знаходиться всередині комплексу Гольджі. Як правило, домени локалізації містять амінокінцеві "хвости" ферменту. У контексті даного опису поняття "поліпептид, що має ManII-активність" належить до поліпептидів, які мають здатність каталізувати гідроліз кінцевих 1,3 - і 1,6-пов'язаних залишків αD-манози у розгалуженому проміжному продукті, тобто GlcNAcMan5GlcNAc2-манози, Nпов'язаних олігосахаридів. Вони включають поліпептиди, які мають ферментативну активність, подібну, але не обов'язково ідентичну з активністю α-маннозідази II комплексу Гольджі, відому також як маннозілолігосахарід 1,3-1,6-α-маннозідаза II (КФ 3.2.1.114) згідно з номенклатурою Комітету Міжнародного союзу з біохімії та молекулярної біології (NC-IUBMB). "Активуючий Fc-рецептор »являє собою Fc-рецептор, який після взаємодії з Fc-ділянкою антитіла (або імунокон'югата) здійснює процес передачі сигналів, які стимулюють клітину, що несе рецептор здійснювати ефекторні функції. Активуючі Fc-рецептори включають FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32) і FcαRI (CD89). Антитіло-обумовлена клітинозалежна цитотоксичність (ADCC) являє собою імунний механізм, що призводить до лізису сенсибілізованих антитілом клітин-мішеней імунними ефекторними клітинами. Клітини-мішені являють собою клітини, з якими антитіла, імунокон'югати або їх фрагменти, що містять Fc-ділянку, специфічно зв'язуються, як правило, через ділянку білка, яка є N-кінцевою щодо Fc-ділянки. У контексті даного опису поняття "підвищена ADCC" належить або до збільшення кількості лізованих у даний момент часу клітинмішеней при даній концентрації імунокон'югата у середовищі, що оточує клітини-мішені, шляхом зазначеного вище механізму ADCC, та / або до зниження концентрації імунокон'югата у середовищі, що оточує клітини-мішені, що необхідно для досягнення лізису даної кількості клітин-мішеней у даний час за допомогою механізму ADCC. Підвищення ADCC-активності 17 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 порівнюють щодо ADCC, опосередковуваної таким же імунокон'югатом, який одержано за допомогою такого ж типу клітин-хазяїв з використанням однакових стандартних методів отримання, очищення, приготування композицій і зберігання (які відомі фахівцям у даній галузі), але які не піддали інженерії. Наприклад, підвищення ADCC, опосередковуваної імунокон'югатом, одержаних у клітинах-хазяїнах, сконструйованих так, щоб вони мали змінену схему глікозилювання (наприклад, так, щоб вони експресували глікозілтрансферази, GnTIII або інші глікозілтрансферази), за допомогою методів, зазначених у цьому описі, порівнюють з ADCC, опосередковуваної таким же імунокон'югатом, отриманим за допомогою такого ж типу не підданих інженерії клітин-хазяїнів. Під "імунокон'югатом, що має підвищену антитіло-обумовлену клітинозалежну цитотоксичність (ADCC)» мається на увазі імунокон'югат, що має підвищену ADCC при визначенні за допомогою будь-якого прийнятного методу, відомого звичайним фахівцям у даній галузі. Один із прийнятних методів аналізу in vitro ADCC полягає в тому, що: 1) для аналізу застосовують клітини-мішені, для яких відомо, що вони експресують антигенмішень, розпізнаваний антигензв'язуючим фрагментом імунокон'югата; 2) для аналізу в якості ефекторних клітин використовують людські мононуклеарні клітини периферичної крові (PBMC), виділені з крові довільно вибраних здорових донорів; 3) аналіз здійснюють за допомогою наступного протоколу: I) PBMC виділяють за допомогою стандартних методів центрифугування у градієнті 6 щільності і суспендують 5×10 клітин/мл в RPMI-середовищі для культури клітин; II) вирощують клітини-мішені за допомогою стандартних методів культивування тканин, збирають на експоненційній фазі росту, коли життєздатність складає більше 90 %, промивають 51 у RPMI-середовищі для культури клітин, міченому 100 мкКи Cr, двічі промивають за допомогою середовища для культури клітин і ресуспендують у середовищі для культури клітин 5 з щільністю 10 клітин/мл; III) переносять по 100 мкл зазначеної вище кінцевої суспензії клітин-мішеней в кожну лунку 96-лункового титраційного мікропланшету; IV) готують серійні розведення з концентрацією імунокон'югата від 4000 до 0,04 нг / мл у середовищі для культури клітин і додають 50 мкл утворених розчинів імунокон'югатів до клітинмішеней в 96-лунковому титраційному мікропланшеті, оцінюючи в трьох повторностях різні концентрації антитіл, що охоплюють весь зазначений вище діапазон концентрацій; V) для створення контролів з максимальним вивільненням (MR) використовують 3 додаткові лунки в планшеті, які містять мічені клітини-мішені, з додаванням 50 мкл 2 об. % водного розчину неіоногенного детергента (Nonidet, фірма Sigma, Сент-Луїс), замість розчину імунокон'югата (зазначеного у п. IV, вище); VI) для створення контролівзі спонтанним вивільненням (SR), використовують 3 додаткові лунки в планшеті, які містять мічені клітини-мішені, з додаванням 50 мкл RPMI-середовища для культури клітин замість розчину імунокон'югата (зазначеного у п. IV, вище); VII) потім 96-лунковий титраційний мікропланшет центрифугують при 50 × g протягом 1 хв і інкубують протягом 1 год. при 4ºC; VIII) додають в кожну лунку по 50 мкл суспензії PBMC (зазначеної у п. I, вище), отримуючи співвідношення ефекторні клітини: клітини-мішені 25:1, і планшети поміщають в інкубатор у атмосферу, що містить 5 % CO2, і витримують при 37 º C протягом 4 год.; IX) збирають безклітинний супернатант з кожної лунки і кількісно оцінюють виділену в процесі експерименту радіоактивність (ER) за допомогою лічильника гамма-променів; X) розраховують відсоток специфічного лізису для кожної концентрації імунокон'югата згідно з формулою (ER-MR) / (MR-SR) × 100, де ER позначає середню радіоактивність, розраховану (див. п. IX, вище) для зазначеної концентрації імунокон'югата, MR означає середню радіоактивність, розраховану (див. п. IX, вище) для MR-контролів (див. п. V, вище), а SR означає середню радіоактивність, розраховану (див. п. IX, вище) для SR-контролів (см. п. VI, вище); 4) "підвищену ADCC » визначають або як збільшення максимального відсотка специфічного лізису, виявленого для зазначеного вище діапазону концентрацій імунокон'югата, та / або як зниження концентрації імуннокон'югата, що необхідно для досягнення половини від максимального відсотка специфічного лізису, виявленого для зазначеного вище діапазону концентрацій імунокон'югата. Підвищення ADCC оцінюють щодо виміряної тим же самим методом ADCC, опосередкованої таким же імунокон'югатом, продукувати в тому ж типі клітинхазяїнів, з використанням одних і тих же стандартних методів одержання, очищення, приготування композицій і зберігання, які добре відомі фахівцям у даній галузі, але яка не продукувався клітиною-хазяїном, підданій інженерії. 18 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Поняття "ефективна кількість" агента належить до кількості, необхідній для забезпечення фізіологічної зміни в клітині або тканині, в яку його вводять. Поняття "терапевтично ефективна кількість" агента, наприклад, фармацевтичної композиції, належить до кількості, ефективній при застосуванні у дозах і протягом періодів часу, необхідних для досягнення необхідного терапевтичного або профілактичного результату. Терапевтично ефективна кількість агента, наприклад, елімінує, знижує, уповільнює, мінімізує або попереджає небажані явища захворювання. "Індивідуум" або "суб'єкт" представляє собою ссавця. Ссавці являють собою (але, не обмежуючись лише ними) одомашнених тварин (наприклад, корови, вівці, кішки, собаки і коні), приматів (наприклад, люди і примати крім людини, такі як мавпи), кроликів і гризунів (наприклад, миші і щури). Переважно індивідуум або суб'єкт являє собою людину. Поняття "фармацевтична композиція" належить до препарату, який знаходиться у такій формі, що він забезпечує біологічну активність такої, що входить до його складу діючої речовини, яка повинна мати ефективність, і яка не містить додаткових компонентів, які мають неприйнятну токсичність для індивідуума, якому слід вводити композицію. "Фармацевтично прийнятний носій » належить до інгредієнту у фармацевтичній композиції, що відрізняється від діючої речовини, який є нетоксичним для індивідуума. Фармацевтично прийнятні носії включають (але, не обмежуючись лише ними) буфер, ексципієнт, стабілізатор або консервант. У контексті даного опису поняття "лікування" (і його граматичні варіації, такі як "лікувати" або "процес лікування") належить до клінічного втручання з метою зміни природного перебігу хвороби у індивідуума, що підлягає лікуванню, і його можна здійснювати або для профілактики або у процесі розвитку клінічної патології. Необхідними діями лікування є (але, не обмежуючись лише ними) попередження виникнення або рецидиву хвороби, полегшення симптомів, зменшення будь-яких прямих або непрямих патологічних наслідків хвороби, попередження метастазів, зниження швидкості розвитку хвороби, полегшення або тимчасове ослаблення хворобливого стану і ремісія або поліпшення прогнозу. У деяких варіантах здійснення винаходу імунокон'югати, пропоновані у винаході, застосовують для затримки розвитку хвороби або сповільнення прогресування хвороби. Поняття "листівка-вкладиш в упаковку" у контексті даного опису належить до інструкцій, які зазвичай поміщають у упаковки терапевтичних продуктів які надходять у продаж, які містять інформацію про свідчення, застосування, дози, шляхи введення, комбіновану терапію, протипоказання і / або запобіжні заходи при застосуванні зазначених терапевтичних продуктів. Детальний опис варіантів здійснення винаходу Першим об'єктом винаходу є імунокон'югат, який містить перший антигензв'язуючий фрагмент, Fc-домен, що складається з двох субодиниць, і ефекторний фрагмент, в якому не може бути присутнім більше одного ефекторного фрагмента. Відсутність додаткових ефекторних фрагментів може знижувати спрямоване перенесення імунокон'югата до ділянок, в яких присутній рецептор відповідного ефекторного фрагмента, що підвищує спрямоване перенесення і накопичення в ділянках, в яких присутній фактичний антиген-мішень імунокон'югата, який розпізнається антигензв'язуючим фрагментом. Крім того, відсутність явища авідності щодо рецептора відповідного ефекторного фрагмента може знижувати активацію клітин, позитивних за рецептором ефекторного фрагмента в периферійній крові при внутрішньовенному введенні імунокон'югата. Крім того, час напівжиття в сироватці імунокон'югатів, які містять тільки один ефекторний фрагмент, ймовірно, довше в порівнянні з імунокон'югатами, що містять два або більшу кількість ефекторних фрагментів. Формати імуноконъюгатів Компоненти імунокон'югата можна зливати один з одним в різних конфігураціях. Приклади конфігурацій представлені на фіг. 2. В одному з варіантів здійснення винаходу ефекторний фрагмент зливають з аміно-або карбоксикінцевою амінокислотою однієї з двох субодиниць Fcдомена. В одному з варіантів здійснення винаходу ефекторний фрагмент зливають з карбоксикінцевою амінокислотою однієї з двох субодиниць Fc-домена. Ефекторний фрагмент можна зливати з Fc-доменом безпосередньо або через лінкерний пептид, що містить одну або кілька амінокислот, як правило, приблизно 2-20 амінокислот. Лінкерні пептиди відомі в даній галузі або представлені в даному описі. Прийнятними неімуногенними лінкерними пептидами є, наприклад, лінкерні пептиди (G4S) n, (SG4)n або G4(SG4)n, в яких n означає число, як правило, від 1 до 10, як правило, від 2 до 4. Альтернативно цьому, якщо ефекторну молекулу пов'язують з Nкінцем субодиниці Fc-домена, то її можна пов'язувати через шарнірну область імуноглобуліну або її частину за допомогою додаткового лінкерного пептиду або без нього. Аналогічно цьому, перший антигензв'язуючий домен можна зливати з аміно-або 19 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 карбоксикінцевою амінокислотою однієї з двох субодиниць Fc-домена. В одному з варіантів здійснення винаходу перший антигензв'язуючий фрагмент зливають з амінокінцевою амінокислотою однієї з двох субодиниць Fc-домена. Перший антигензв'язуючий фрагмент можна зливати з Fc-доменом безпосередньо або через лінкерний пептид. У конкретному варіанті здійснення винаходу перший антигензв'язуючий фрагмент зливають з Fc-доменом через шарнірну ділянку імуноглобуліну. У конкретному варіанті здійснення винаходу шарнірна ділянку імуноглобуліну являє собою шарнірну ділянку людського IgG1. В одному з варіантів здійснення винаходу перший антигензв'язуючий фрагмент містить антигензв'язуючий домен антитіла, який містить варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла і варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла. У конкретному варіанті здійснення винаходу перший антигензв'язуючий фрагмент являє собою молекулу Fab. В одному з варіантів здійснення винаходу молекулу Fab зливають на карбоксікінці її важкою або легкою ланцюга з амінокінцевою амінокислотою однієї з двох субодиниць Fc-домена. У конкретному варіанті здійснення винаходу молекулу Fab зливають на карбоксикінці її важкого ланцюга з амінокінцевою амінокислотою однієї з двох субодиниць Fc-домена. У більш конкретному варіанті здійснення винаходу молекулу Fab зливають з Fc-доменом через шарнірну ділянку імуноглобуліну. У конкретному варіанті здійснення винаходу шарнірна ділянку імуноглобуліну являє собою шарнірну ділянку людського IgG1. В одному з варіантів здійснення винаходу імунокон'югат практично складається з антигензв'язуючого фрагмента, Fc-домена, який складається з двох субодиниць, ефекторного фрагмента і необов'язково одного або декількох лінкерних пептидів, при цьому зазначений антигензв'язуючий домен являє собою молекулу Fab і злитий на карбоксикінці його важкого ланцюга з амінокінцевою амінокислотою однієї з двох субодиниць Fc-домена, і при цьому зазначений ефекторний фрагмент злитий або з (I) амінокінцевою амінокислотою іншої однієї з двох субодиниць Fc-домена, або (II) з карбоксикінцевою амінокислотою однієї з двох субодиниць Fc-домена. В останньому випадку ефекторний фрагмент і перший антигензв'язуючий фрагмент можуть бути злиті або з однією і тією ж субодиницею Fc-домена, або кожен може бути злитий з різними субодиницями Fc-домена. Формат імунокон'югата з одним антигензв'язуючим фрагментом (наприклад, представлений на фіг. 2Б і 2В), є цінним передусім у тих випадках, коли передбачається, що може відбуватися інтерналізація антигену-мішені після зв'язування з високою афінністю з антигензв'язуючим фрагментом. У таких випадках присутність більше одного антигензв'язуючого фрагмента в імунокон'югаті може посилювати інтерналізацію, знижуючи тим самим доступність антигенумішені. Однак у багатьох інших випадках є доцільним наявність імунокон'югата, що містить два або більшу кількість антигензв'язуючих фрагментів і один ефекторний фрагмент для більш оптимального направленого перенесення до антигену-мішені щодо рецептора ефекторного фрагмента та оптимізації фармацевтичного "вікна" імунокон'югата. Таким чином, в конкретному варіанті здійснення винаходу імунокон'югат, пропонований у винаході, містить перший і другий антигензв'язуючий фрагмент. В одному з варіантів здійснення винаходу кожний із зазначених першого і другого антигензв'язуючих фрагментів злитий з амінокінцевою амінокислотою однієї з двох субодиниць Fc-домена. Перший і другий антигензв'язуючий фрагмент може бути злитий з Fc-доменом безпосередньо або через лінкерний пептид. У конкретному варіанті здійснення винаходу кожний із зазначених першого і другого антигензв'язуючих фрагментів злитий з субодиницею Fc-домена через шарнірну ділянку імуноглобуліну. У конкретному варіанті здійснення винаходу шарнірна ділянка імуноглобуліну являє собою шарнірну ділянку людського IgG1. В одному з варіантів здійснення винаходу кожний із зазначених першого і другого антигензв'язуючих фрагментів містить антигензв'язуючий домен антитіла, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла і варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла. У конкретному варіанті здійснення винаходу кожний із зазначених першого і другого антигензв'язуючих фрагментів являє собою молекулу Fab. В одному з варіантів здійснення винаходу кожна із зазначених молекул Fab злита на карбоксикінці її важкого або легкого ланцюга з амінокінцевою амінокислотою однієї з двох субодиниць Fc-домена. У конкретному варіанті здійснення винаходу кожна з молекул Fab злита на її карбоксикінці з амінокінцевою амінокислотою однієї з двох субодиниць Fc-домена. У більш конкретному варіанті здійснення винаходу кожна із зазначених молекул Fab злита з субодиницею Fc-домена через шарнірну ділянку імуноглобуліну. У конкретному варіанті здійснення винаходу шарнірна ділянка імуноглобуліну являє собою шарнірну ділянку людського IgG 1. В одному з варіантів здійснення винаходу перший і другий антигензв'язуючий фрагмент і Fc 20 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 домен є частиною молекули імуноглобуліну. У конкретному варіанті здійснення винаходу молекула імуноглобуліну являє собою імуноглобулін класу IgG. У ще більш кращому варіанті здійснення винаходу імуноглобулін являє собою імуноглобулін підкласу IgG 1. В іншому кращому варіанті здійснення винаходу імуноглобулін являє собою людський імуноглобулін. В інших варіантах здійснення винаходу імуноглобулін являє собою химерний імуноглобулін або гуманізований імуноглобулін. В одному з варіантів здійснення винаходу ефекторний фрагмент злитий з карбоксикінцевою амінокислотою одним з важких ланцюгів імуноглобуліна. Ефекторний фрагмент може бути злитий з важким ланцюгом імуноглобуліну безпосередньо або через лінкерний пептид. У конкретному варіанті здійснення винаходу імунокон'югат практично складається з молекули імуноглобуліну, ефекторного фрагмента, злитого з карбоксикінцевою амінокислотою одним з важких ланцюгів імуноглобуліну, і необов'язково одного або декількох лінкерних пептидів. В одному з варіантів здійснення винаходу імунокон'югат містить поліпептид, в якому важкий ланцюг Fab об'єднано карбоксикінцевим пептидним зв'язком з субодиницею Fc-домена, і поліпептид, в якому субодиниця Fc-домена об'єднана карбоксикінцевим пептидним зв'язком з поліпептидом ефекторного фрагмента. В іншому варіанті здійснення винаходу імунокон'югат містить поліпептид, в якому важкий ланцюг першого Fab об'єднана карбоксикінцевим пептидним зв'язком з субодиницею Fc-домена, і поліпептид, в якому важкий ланцюг другого Fab об'єднано карбоксикінцевим пептидним зв'язком з субодиницею Fc-домена, що, в свою чергу, об'єднано карбоксикінцевим пептидним зв'язком з поліпептидом ефекторного фрагмента. У наступному варіанті здійснення винаходу імунокон'югат містить поліпептид, в якому важкий ланцюг Fab об'єднано карбоксикінцевим пептидним зв'язком з субодиницею Fc-домена, і поліпептид, в якому поліпептид ефекторного фрагмента об'єднаний карбоксикінцевим пептидним зв'язком з субодиницею Fc-домена. У деяких варіантах здійснення винаходу імунокон'югат містить також поліпептид легкого ланцюга Fab. У деяких варіантах здійснення винаходу поліпептиди з'єднані ковалентним зв'язком, наприклад, за допомогою дисульфідного містка. Відповідно до одного з вищевказаних варіантів здійснення винаходу компоненти імунокон'югата (наприклад, ефекторний фрагмент, антигензв'язуючий фрагмент, Fc-домен) можна пов'язувати безпосередньо або через різні лінкери, зокрема, пептидні лінкери, які містять одну або більшу кількість амінокислот, як правило, приблизно 2-20 амінокислот, які представлені в даному описі або відомі в даній галузі. Прийнятними неімуногенними лінкерними пептидами є, наприклад, лінкерні пептиди (G4S)n, (SG4)n або G4(SG4)n, в яких n означає число, як правило, від 1 до 10, як правило, від 2 до 4. Fc-домен Fc-домен імунокон'югата складається з пари поліпептидних ланцюгів, які містять домени важкого ланцюга молекули імуноглобуліну. Наприклад, Fc-домен молекули імуноглобуліну G (IgG) являє собою димер, кожна з субодиниць якого містить константні домени CH2 і CH3 важкого ланцюга IgG. Дві субодиниці Fc-домена мають здатність до стабільної асоціації один з одним. В одному з варіантів здійснення винаходу імунокон'югат, пропонований у винаході, містить не більше одного Fc-домена. В одному з варіантів здійснення винаходу Fc-домен імунокон'югата являє собою Fc-домен IgG. У конкретному варіанті здійснення винаходу Fc-домен являє собою Fc-домен IgG1. В іншому варіанті здійснення винаходу Fc-домен являє собою Fc-домен IgG4. В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу Fc-домен є людським. Наведена як приклад послідовність Fc-галузі людського IgG1 представлена у SEQ ID NO: 1. Fc-домен надає імунокон'югату в значній мірі подовжений час напівжиття в сироватці в порівнянні з форматами імунокон'югатів, в яких відсутній Fc-домен. Зокрема, у разі, коли імунокон'югат містить ефекторний фрагмент з відносною слабкою активністю (але, наприклад, із зниженою токсичністю) тривалий час напівжиття може мати вирішальне значення для досягнення оптимальної ефективності in vivo. Крім того, Fc-домен може опосередковувати ефекторні функції, що додатково буде описано нижче. Модифікації Fc-домена, що підсилюють гетеродимерізацію Імунокон'югати, пропоновані у винаході, містять тільки один ефекторний фрагмент, злитий з однією з двох субодиниць Fc-домена, таким чином, вони містять два неідентичні поліпептидні ланцюга. Рекомбінантна спільна експресія цих поліпептидів і подальша димеризація призводить до кількох можливим комбінаціям двох поліпептидів, з яких тільки гетеродимери двох неідентичних поліпептидів застосовують згідно винаходу. Для підвищення виходу і чистоти імунокон'югатів при їх отриманні методами рекомбінації доцільним є інтродукція в Fc-домен імунокон'югата модифікації, що перешкоджає утворенню гомодимерів двох ідентичних поліпептидів (тобто двох поліпептидів, що містять ефекторний фрагмент, або двох поліпептидів, 21 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 в яких відсутній ефекторний фрагмент), та / або посилює утворення гетеродимерів поліпептиду, який містить ефекторний фрагмент, і поліпептиду, в якому відсутній ефекторний фрагмент. Таким чином, в деяких варіантах здійснення винаходу Fc-домен імунокон'югата містить модифікацію, яка посилює гетеродимерізацію двох неідентичних поліпептидних ланцюгів. Сайт найбільш сильного білок-білкової взаємодії двох поліпептидних ланцюгів Fc-домена людського IgG знаходиться в CH3-домені Fc-домена. Таким чином, в одному з варіантів здійснення винаходу зазначена модифікація знаходиться в CH3-домені Fc-домена. У конкретному варіанті здійснення винаходу зазначена модифікація являє собою модифікацію типу "knob-in-hole" (типу "виступ-западина"), яка включає модифікацію, що приводить до утворення "виступу" в одній з двох субодиниць Fc-домена і до утворення "западини »в іншій однієї з двох субодиниць Fc-домена. Технологія "knob-into-hole" описана, наприклад, в U.S. № 5731168; U.S. № 7695936; у Ridgway та ін., Prot Eng 9, 1996, сс. 617-621 і Carter, J Immunol Meth 248, 2001, сс. 7-15). В цілому, метод включає інтродукцію опуклості ("виступ") на поверхні розділу першого поліпептиду і відповідної порожнини ("западина") на поверхні розділу другого поліпептиду, в результаті опуклість може поміщатися в порожнину, посилюючи тим самим утворення гетеродимера і перешкоджаючи утворенню гомодимеру. Опуклості конструюють шляхом заміни амінокислот з невеликими бічними ланцюгами на поверхні розділу першого поліпептиду на амінокислоти з більш великими бічними ланцюгами (наприклад, на тирозин або триптофан). Компенсуючі порожнини ідентичного або схожого розміру з опуклостями конструюють на поверхні розділу другого поліпептиду шляхом заміни амінокислот з великими бічними ланцюгами на амінокислоти з менш великими бічними ланцюгами (наприклад, аланін або треонін). Опуклість і порожнину можна створювати шляхом зміни нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептиди, наприклад, за допомогою сайтнаправленного мутагенезу, або за допомогою синтезу пептидів. У конкретному варіанті здійснення винаходу модифікація, що призводить до отримання "виступу", являє собою амінокислотну заміну T366W в одній з двох субодиниць Fcдомена, а модифікація, що призводить до отримання "западини", являє собою амінокислотні заміни T366S, L368A і Y407V в іншій однієї з двох субодиниць Fc-домена. У більш конкретному варіанті здійснення винаходу субодиниця Fc-домена, містить модифікацію, що приводить до отримання "виступу", додатково містить амінокислотну заміну S354C, а субодиниця Fc-домена, що містить модифікацію, що приводить до отримання "западини", додатково містить амінокислотну заміну Y349C. Інтродукція цих двох залишків цистеїну призводить до утворення дисульфідного містка між двома субодиницями Fc-домена, додатково стабілізуючого димер (Carter, J Immunol Methods 248, 2001, сс. 7-15). В альтернативному варіанті здійснення винаходу модифікація, яка посилює гетеродимерізацію двох неідентичних поліпептидних ланцюгів, являє собою модифікацію, опосередковуючу обумовлені електростатичною дією впливу, наприклад, описані в публікації PCT WO 2009/089004. В цілому, вказаний метод включає заміну одного або декількох амінокислотних залишків на поверхні розділу двох поліпептидних ланцюгів на заряджені амінокислотні залишки, в результаті чого утворення гомодимеру стає електростатично невигідним, а гетеродимерізація стає електростатично вигідною. У конкретному варіанті здійснення винаходу ефекторний фрагмент злитий з аміно-або карбоксикінцевою амінокислотою субодиниці Fc-домена, що містить модифікацію, що приводить до утворення "виступу". Не вдаючись у яку теорію, злиття ефекторного фрагмента з містить "виступ" субодиницею Fc-домену має додатково мінімізувати утворення гомодимерних імунокон'югатів, що містять два ефекторних фрагмента (стеричне "зіткнення" двох поліпептидів які містять "виступ"). Модифікації Fc-домена, що змінюють зв'язування з Fc-рецептором У деяких варіантах здійснення винаходу Fc-домен імунокон'югата конструюють так, щоб він мав змінену афінність зв'язування з Fc-рецептором, насамперед змінену афінність зв'язування з Fcγ-рецептором, в порівнянні з не підданим інженерії Fc-доменом. Зв'язування з Fc-рецепторами можна легко визначати, наприклад, за допомогою ELISA або резонансу поверхневого плазмону (SPR) з використанням стандартного обладнання, такого як пристрій BIAcore (фірма GE Healthcare), і з застосуванням таких Fc-рецепторів, які можна отримувати методом рекомбінантної експресії. Прийнятний вказаний аналіз представлений в даному описі. Альтернативно цьому, афінність зв'язування Fc-доменів або імунокон'югатів, які містять Fc-домен, з Fc-рецепторами можна оцінювати з використанням клітинних ліній, для яких відомо, що вони експресують конкретні Fc-рецептори, такі як NK-клітини, які експресують FcγIIIa-рецептор. У деяких варіантах здійснення винаходу Fc-домен імунокон'югата конструюють так, щоб він 22 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мав змінені ефекторні функції, зокрема, змінену ADCC, в порівнянні з не підданим інженерії Fcдоменом. Ефекторну функцію Fc-домену або імунокон'югата, що містить Fc-домен, можна вимірювати методами, відомими в даній галузі. Прийнятний аналіз для оцінки ADCC представлений в даному описі. Інші приклади аналізів in vitro, призначених для оцінки ADCC-активності представляючої інтерес молекули, описані в U.S. № 5500362; у Hellstrom та ін., Proc Natl Acad Sci USA 83, 1986, сс. 7059-7063 і Hellstrom та ін., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1985, сс. 1499-1502; U.S. № 5821337; у Bruggemann та ін., J Exp Med 166, 1987, сс. 1351-1361. Альтернативно цьому, можна застосовувати методи, засновані на нерадіоактивному аналізі (див., наприклад, ACTI ™ нерадіоактивний аналіз цитотоксичності за допомогою проточної цитометрії (фірма ® CellTechnology, Inc. Маунтін-В'ю, шт. Каліфорнія); і CytoTox 96 -нерадіоактивний аналіз цитотоксичності (фірма Promega, Медісон, шт. Вісконсін)). Прийнятними ефекторними клітинами для таких аналізів є мононуклеарні клітини периферичної крові (PBMC) і природні клітини-кілери (NK). В альтернативному або додатковому варіанті ADCC-активність представляючої інтерес молекули можна оцінювати in vivo, наприклад, наприклад, з використанням створених на тварин моделях, описаних у Clynes і др., Proc Natl Acad Sci USA 95, 1998, сс. 652-656. У деяких варіантах здійснення винаходу змінюють зв'язування Fc-домена з компонентом системи комплементу, зокрема з C1q. Таким чином, в деяких варіантах здійснення винаходу, в яких Fc-домен конструюють так, щоб він мав змінену ефекторну функцією, зазначена змінена ефекторна функція включає змінену CDC. Можна здійснювати аналізи зв'язування C1q для вирішення питання про те, чи може імунокон'югат зв'язуватися з C1q і, як наслідок, чи володіє він CDC-активність (див., наприклад, аналізи зв'язування з C1q і C3c за допомогою ELISA, описані в WO 2006/029879 і WO 2005/100402). Для оцінки активації комплементу можна здійснювати аналіз CDC (див., наприклад, Gazzano-Santoro та ін, J Immunol Methods 202, 1996, с. 163; Cragg та ін, Blood 101, 2003, сс. 1045-1052 і Cragg і Glennie, Blood 103, 2004, сс. 27382743). а) Знижена здатність зв'язуватися з Fc-рецептором та / або знижена ефекторна функція Fc-домен надає імунокон'югату кращі фармакокінетичні властивості, включаючи тривалий час напівжиття в сироватці, що забезпечує хороше накопичення в тканині-мішені і найкраще співвідношення розподілів в тканині-крові. Однак у той же час він може приводити до небажаної спрямованості імунокон'югата до клітин, які експресують Fc-рецептори, а не кращим клітинам, які несуть антиген. Крім того, спільна активація шляхів передачі сигналів Fc-рецептора може призводити до вивільнення цитокінів, що в поєднанні з ефекторним фрагментом і тривалим часом напівжиття імунокон'югата, призводить до надмірної активації цитокінових рецепторів і серйозним побічним діям при системному введенні. Відповідно до цього описано, що з імунокон'югатами, що містять канонічний IgG-IL-2, пов'язані реакції на інфузію (див., наприклад, King і др., J Clin Oncol 22, 2004, сс. 4463-4473). Таким чином, в деяких варіантах здійснення винаходу Fc-домен імунокон'югата конструюють так, щоб він мав знижену афінність зв'язування з Fc-рецептором. В одному з таких варіантів здійснення винаходу Fc-домен містить одну або кілька амінокислотних мутацій, які знижують афінність зв'язування Fc-домена з Fc-рецептором. Як правило, одна або кілька однакових амінокислотних мутацій присутній (ють) в кожній з двох субодиниць Fc-домена. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначені амінокислотні мутації знижують афінність зв'язування Fc-домена з Fc-рецептором щонайменше в 2 рази, щонайменше в 5 разів або щонайменше в 10 разів. Згідно варіантів здійснення винаходу, в яких має місце більше однієї амінокислотної мутації, які знижують афінність зв'язування Fc-домена з Fc-рецептором, комбінація зазначених амінокислотних мутацій може знижувати афінність зв'язування Fc-домена з Fc-рецептором щонайменше в 10 разів, за меншій мере в 20 разів або щонайменше в 50 разів. В одному з варіантів здійснення винаходу імунокон'югат, що містить сконструйований Fc-домен, характеризується афінністю, що становить менш ніж 20 %, зокрема, менш ніж 10 %, більш переважно менше ніж 5 % від афінності зв'язування з Fc-рецептором, характерної для імунокон'югата, що містить не підданий інженерії Fc-домен. В одному з варіантів здійснення винаходу Fc-рецептор являє собою активує Fc-рецептор. У конкретному варіанті здійснення винаходу Fc-рецептор являє собою Fcγ-рецептор, більш конкретно FcγRIIIa-, FcγRI-або FcγRIIaрецептор. Переважно зменшується зв'язування з кожним з цих рецепторів. Згідно з деякими варіантами здійснення винаходу знижується також афінність зв'язування з компонентом системи комплементу, зокрема, афінність зв'язування з C1q. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу не знижується афінність зв'язування з неонатальним Fc-рецептором (FcRn). Практично таке ж зв'язування з FcRn, тобто збереження афінності зв'язування Fcдомена з вказаним рецептором, досягається, коли Fc-домен (або імунокон'югат, що містить 23 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вказаний Fc-домен) характеризується афінністю зв'язування з FcRn, складовою більш ніж приблизно 70 % від афінності зв'язування з FcRn не підданих інженерії Fc-домена (або імунокон'югата, що містять не піддану інженерії форму Fc-домена). Fc-домени або імунокон'югати, містять зазначені Fc-домени, можуть характеризуватися афінністю, що становить більше ніж приблизно 80 % і навіть більше ніж приблизно 90 % від вказаної вище афінності. В одному з варіантів здійснення винаходу амінокислотна мутація являє собою амінокислотну заміну. В одному з варіантів здійснення винаходу Fc-домен містить амінокислотну заміну в положенні P329. У більш конкретному варіанті здійснення винаходу амінокислотна заміна являє собою P329A або P329G, зокрема P329G. В одному з варіантів здійснення винаходу Fc-домен містить додаткову аминокислотну заміну в положенні, обраному з S228, E233, L234, L235, N297 і P331. У більш конкретному варіанті здійснення винаходу додаткова амінокислотна заміна являє собою S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D або P331S. У конкретному варіанті здійснення винаходу Fc-домен містить амінокислотні заміни в положеннях P329, L234 і L235. У більш конкретному варіанті здійснення винаходу Fcдомен містить амінокислотні мутації L234A, L235A і P329G (LALA P329G). Така комбінація амінокислотних замін практично повністю анулює зв'язування з Fcγ-рецептором Fc-домена людського IgG, що описано в заявці на європейський патент EP 11160251.2, яка повністю включена в даний опис як посилання. В EP 11160251.2 описані також методи отримання зазначених мутантних Fc-доменів і методи визначення їх властивостей, таких як зв'язування з Fc-рецептором або ефекторні функції. Мутантні Fc-домени можна отримувати за допомогою амінокислотної делеції, заміни, інсерції або модифікації, використовуючи генетичні або хімічні методи, добре відомі в даній галузі. Генетичні методи можуть включати сайтспецифічний мутагенез кодуючої послідовності ДНК, ПЛР, синтез генів і т.п. Правильність нуклеотидних замін можна підтверджувати, наприклад, секвенуванням. В одному з варіантів здійснення винаходу Fc-домен конструюють так, щоб він мав знижену ефекторну функцію в порівнянні з не підданим інженерії Fc-доменом. Знижена ефекторна функція може являти собою (але, не обмежуючись лише ними) знижену (і) одну або декілька з наступних функцій: знижена комплементзалежна цитотоксичність (CDC), знижена антитілообумовлена клітинозалежна цитотоксичність (ADCC), знижений антитіло-обумовлений клітинозалежний фагоцитоз (ADCP), знижена секреція цитокінів, знижене опосередковане імунним комплексом поглинання антигену антигенпрезентуючими клітинами, знижене зв'язування з NK-клітинами, знижене зв'язування з макрофагами, знижене зв'язування з моноцитами, знижене зв'язування з поліморфоядерними клітинами, знижена безпосередня передача сигналу, що індукує апоптоз, знижене перехресне зв'язування пов'язаних з мішенню антитіл, знижене дозрівання дендритних клітин або знижене T-клітинне прімірування. В одному з варіантів здійснення винаходу знижена ефекторна функція являє собою одну або декілька функцій, вибраних з групи, що включає знижену CDC, знижену ADCC, знижений ADCP і знижену секрецію цитокінів. У конкретному варіанті здійснення винаходу знижена ефекторна функція являє собою знижену ADCC. В одному з варіантів здійснення винаходу знижена ADCC становить менше 20 % від ADCC, індукованої не підданим інженерії Fc-доменом (або імунокон'югатом, що містить не підданий інженерії Fc-домен). Крім Fc-доменів, описаних вище і в заявці на європейський патент EP 11160251.2, Fcдомени зі зниженою здатністю зв'язуватися з Fc-рецептором та / або зниженою ефекторну функцію включають також Fc-домени з заміною в одному або декількох Fc-доменів залишків 238, 265, 269, 270, 297, 327 і 329 (US № 6737056). До зазначених мутантам Fc належать мутанти Fc із замінами у двох або більшій кількості амінокислот у положеннях 265, 269, 270, 297 і 327, включаючи так званий мутант "DANA" Fc-галузі, що несе заміну залишків 265 і 297 на аланін (U.S. №. 7332581). Антитіла підтипу IgG4 володіють зниженою афінністю до зв'язування з Fc-рецепторами й зниженими ефекторними функціями в порівнянні з антитілами підтипу IgG1. Таким чином, в деяких варіантах здійснення винаходу Fc-домен Т-клітинних активуючих біспеціфічних антигензв'язуючих молекул, запропонованих у винаході, являє собою Fc-домен IgG4, зокрема Fc-домен людського IgG4. В одному з варіантів здійснення винаходу Fc-домен IgG4 містить амінокислотні заміни в положенні S228, конкретно амінокислотну заміну S228P. Для додаткового зниження афінності зв'язування з Fc-рецептором та / або його ефекторну функції в одному з варіантів здійснення винаходу Fc-домен IgG4 містить амінокислотну заміну в положенні L235, зокрема, амінокислотну заміну L235E. В іншому варіанті здійснення винаходу Fc-домен IgG4 містить амінокислотну заміну в положенні P329, зокрема, амінокислотну заміну P329G. У конкретному варіанті здійснення винаходу Fc-домен IgG4 містить амінокислотні заміни 24 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 в положеннях S228, L235 і P329, зокрема, амінокислотні заміни S228P, L235E і P329G. Зазначені мутанти Fc-домена IgG4 та їх особливості зв'язування з Fcγ-рецептором описані в заявці на європейський патент EP 11160251.2, яка повністю включена в даний опис як посилання. б) Підвищена здатність зв'язуватися з Fc-рецептором та / або підвищена ефекторна функція Можуть зустрічатися ситуації, коли, на противагу вищеописаному, потрібно підтримувати або навіть підвищувати здатність зв'язуватися з Fc-рецептором та / або ефекторні функції імунокон'югатів, наприклад, коли мішенню імунокон'югата є високоспецифічний пухлинний антиген. Таким чином, в деяких варіантах здійснення винаходу Fc-домен імунокон'югатів, запропонованих у винаході, конструюють так, щоб він мав підвищену афінність зв'язування з Fcрецептором. Підвищена афінність зв'язування може представляти собою підвищення афінності зв'язування Fc-домена з Fc-рецептором щонайменше в 2 рази, щонайменше в 5 разів або щонайменше в 10 разів. В одному з варіантів здійснення винаходу Fc-рецептор являє собою активує Fc-рецептор. У конкретному варіанті здійснення винаходу Fc-рецептор являє собою Fcγ-рецептор. В одному з варіантів здійснення винаходу Fc-рецептор вибирають з групи, що включає FcγRIIIa, FcγRI і FcγRIIa. У конкретному варіанті здійснення винаходу Fc-рецептор являє собою FcγRIIIa. В одному із зазначених варіантів здійснення винаходу Fc-домен конструюють так, щоб він мав змінену олігосахарідну структуру в порівнянні з не підданим інженерії Fc-доменом. Зокрема, в такому варіанті здійснення винаходу Fc-домен має підвищений відносний вміст нефукозильованих олігосахаридів в порівнянні з не підданим інженерії Fc-доменом. У більш конкретному варіанті здійснення винаходу щонайменше приблизно 20 %, приблизно 25 %, приблизно 30 %, приблизно 35 %, приблизно 40 %, приблизно 45 %, приблизно 50 %, приблизно 55 %, приблизно 60 %, приблизно 65 %, приблизно 70 %, приблизно 75 %, приблизно 80 %, приблизно 85 %, приблизно 90 %, приблизно 95 % або приблизно 100 %, зокрема, щонайменше приблизно 50 %, більш переважно щонайменше приблизно 70 % N-пов'язаних олігосахаридів в Fc-домені імунокон'югата є нефукозілірованнимі. Нефукозильовані олігосахариди можуть бути гібридного або комплексного типу. В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу Fcдомен має підвищений відносний вміст бісекційних олігосахаридів в порівнянні з не підданим інженерії Fc-доменом. У більш конкретному варіанті здійснення винаходу щонайменше приблизно 10 %, приблизно 15 %, приблизно 20 %, приблизно 25 %, приблизно 30 %, приблизно 35 %, приблизно 40 %, приблизно 45 %, приблизно 50 %, приблизно 55 %, приблизно 60 %, приблизно 65 %, приблизно 70 %, приблизно 75 %, приблизно 80 %, приблизно 85 %, приблизно 90 %, приблизно 95 % або приблизно 100 %, зокрема, щонайменше приблизно 50 %, більш переважно щонайменше приблизно 70 % N-пов'язаних олігосахаридів в Fc-домені імунокон'югата є бісекційними. Бісекційні олігосахариди можуть бути гібридного або комплексного типу. У наступному конкретному варіанті здійснення винаходу Fc-домен має підвищений відносний вміст бісекційних нефукозильованих олігосахаридів в порівнянні з не підданим інженерії Fc-доменом. У більш конкретному варіанті здійснення винаходу щонайменше приблизно 10 %, приблизно 15 %, приблизно 20 %, приблизно 25 %, приблизно 30 %, приблизно 35 %, приблизно 40 %, приблизно 45 %, приблизно 50 %, приблизно 55 %, приблизно 60 %, приблизно 65 %, приблизно 70 %, приблизно 75 %, приблизно 80 %, приблизно 85 %, приблизно 90 %, приблизно 95 % або приблизно 100 %, зокрема, щонайменше приблизно 15 %, більш переважно щонайменше приблизно 25 %, принаймні приблизно 35 % або щонайменше приблизно 50 % N-пов'язаних олігосахаридів в Fc-домені імунокон'югата є бісекційними нефукозілірованнимі. Бісекційні нефукозильовані олігосахариди можуть бути гібридного або комплексного типу. Структури олігосахаридів в Fc-домені імунокон'югата можна аналізувати за допомогою методів, добре відомих в даній галузі, наприклад, методом MALDI TOF-мас-спектрометрії, описаним у Umana та ін, Nat Biotechnol 17, 1999, сс. 176-180 або Ferrara та ін, Biotechn Bioeng 93, 2006, сс. 851-861. Відсоток нефукозильованих олігосахаридів являє собою кількість олігосахаридів, у яких відсутні залишки фукози, щодо всіх олігосахаридів, приєднаних до Asn 297 (наприклад, комплексних, гібридних, з високим вмістом манози структур), і ідентифікованих в обробленому N-глікозідази F зразку (наприклад, комплексних, гібридних структур і структур з високим вмістом манози), яке вимірюють за допомогою MALDI-TOF-МС. Asn297 позначає залишок аспарагіну, локалізований в положенні 297 в Fc-домені (згідно EU-нумерації залишків у Fc), а проте Asn297 може бути локалізована в межах приблизно +3 амінокислоти в зворотному або прямому напрямку щодо положення 297, тобто між положеннями 294 і 300, що пов'язано з мінорними варіаціями в послідовності імуноглобулінів. Аналогічно визначають відсоток бісекційних або бісекційних нефукозильованих олігосахаридів. 25 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для досягнення модифікації глікозилювання в Fc-домені імунокон'югата можна отримувати імунокон'югат в клітині-хазяїні, яку піддавали маніпуляції для експресії змінених рівнів одного або декількох поліпептидів, що мають глікозилтрансферазну активність. В одному з варіантів здійснення винаходу Fc-домен імунокон'югата конструюють так, щоб він мав зміненою структурою олігосахаридів в порівнянні з не підданим інженерії Fc-доменом, шляхом отримання імунокон'югата в клітині-хазяїні із зміненою активність однієї або декількох глікозилтрансфераз. Глікозілтрансферази включають, наприклад, β (1,4)-Nацетилглюкозамилтрансферазу III (GnTIII), β(1,4)-галактозилтрансферазу (GalT), β(1,2)-Nацетилглюкозамілтрансферазу I (GnTI), β(1,2)-N-ацетилглюкозамілтрансферазу II (GnTII) і α(1,6)-фукозилтрансферазу. У конкретному варіанті здійснення винаходу Fc-домен імунокон'югата конструюють так, щоб він мав підвищену відносний вміст нефукозильованих олігосахаридів в порівнянні з не підданим інженерії Fc-доменом, шляхом отримання імунокон'югата в клітині-хазяїні, що має підвищену активність β (1,4)-Nацетилглюкозамілтрансферази III (GnTIII). У ще більш кращому варіанті здійснення винаходу клітина-хазяїн має також підвищену активність α-маннозідази II (ManII). Методологія глікоінженерії, яку можна використовувати для створення шляхом глікоінженерії імунокон'югатів, пропонованих в даному винаході, описана більш детально у Umana та ін, Nat Biotechnol 17, 1999, сс. 176-180; Ferrara і др., Biotechn Bioeng 93, 2006, сс. 851-861; WO 99/54342 (U.S. № 6602684; EP 1071700); WO 2004/065540 (публікація патента США № 2004/0241817; EP 1587921), WO 03/011878 (публікація патенту США № 2003/0175884), зміст кожного з яких повністю включено в даний опис як посилання. Як правило, для створення клітинних ліній, призначених для отримання імунокон'югатів із зміненою схемою глікозилювання, можна застосовувати будь-який тип культивованій лінії клітин, включаючи клітинні лінії, зазначені в цьому описі. Конкретні лінії клітин включають CHOклітини, BHK-клітини, NS0-клітини, SP2/0-клітини, клітини мієломи YO, клітини мишачої мієломи P3 × 63, PER-клітини, PER.C6-клітини або клітини гібридоми та інші клітини ссавців. У певних варіантах здійснення винаходу клітини-хазяїни піддавали маніпуляціям, призводить до експресії підвищених рівнів одного або декількох поліпептидів, які мають активністю β (1,4)-Nацетилглюкозамілтрансферази III (GnTIII). У деяких варіантах здійснення винаходу клітинихазяїни піддавали додатковим маніпуляціям для забезпечення підвищених рівнів експресії одного або декількох поліпептидів, які мають активністю α-маннозідази II (ManII). У конкретному варіанті здійснення винаходу поліпептид, що має GnTIII-активність, являє собою злитий поліпептид, який стримає каталітичний домен GnTIII і домен локалізації в комплексі Гольджі гетерологічного поліпептиду, присутнього в комплексі Гольджі. Зокрема, вказаний домен локалізації в комплексі Гольджі являє собою домен локалізації в комплексі Гольджі маннозідази II. Методи створення зазначених злитих поліпептидів та їх застосування для отримання антитіл з підвищеними ефекторними функціями описані у Ferrara та ін, Biotechn Bioeng 93, 2006, сс. 851-861 і в WO 2004/065540, повний зміст яких включено в даний опис як посилання. Клітини-хазяїни, які містять послідовність, що кодує імунокон'югата, пропонованого у винаході, та / або послідовність, що кодує поліпептидів, що володіють глікозилтрансферазної активністю, і які експресують біологічно активні генні продукти, можна ідентифікувати, наприклад, за допомогою гібридизації ДНК-ДНК або ДНК-РНК; по присутності або відсутності функцій певних "маркерних" генів; шляхом оцінки рівня транскрипції, вимірюваного за експресії відповідних мРНК-транскриптів в клітині-хазяїні; або шляхом виявлення генного продукту за допомогою імуноаналізу або за його біологічної активності - тобто методів, добре відомих в даній галузі. Активність GnTIII або Man II можна визначати, наприклад, застосовуючи лектин, який зв'язується з продуктами біосинтезу GnTIII або ManII відповідно. Прикладом зазначеного лектина є лектин E4-PHA, який зв'язується переважно з олігосахаридами, що містять дворозсічний GlcNAc. Продукти біосинтезу (тобто специфічні олігосахаридні структури) поліпептидів, які мають активність GnTIII або ManII, можна виявляти також за допомогою масспектрометричного аналізу олігосахаридів, що вивільняються з глікопротеїнів, які продукуються клітинами, експресуючими зазначені поліпептиди. В альтернативному варіанті можна використовувати функціональний аналіз, в якому вимірюють підвищену ефекторну функцію і / або підвищену здатність зв'язуватися з Fc-рецептором, опосередковувану імунокон'югатами, які продукуються клітинами, створеними з використанням поліпептидів, які мають активність GnTIII. В іншому варіанті здійснення винаходу Fc-домен конструюють так, щоб він мав підвищений відносний вміст нефукозильованих олігосахаридів в порівнянні з не підданим інженерії Fcдоменом, шляхом отримання імунокон'югата в клітині-хазяїні із зниженою α (1,6)фукозилтрансферазною активністю. Клітина-хазяїн із зниженою α (1,6)-фукозілтрансферазною активністю може являти собою клітину, в якій ген α (1,6)-фукозілтрансферази зруйнований або 26 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 деактивований іншим чином, наприклад, "вимкнений" (див. Yamane-Ohnuki та ін, Biotech Bioeng 87, 2004, с. 614; Kanda та ін, Biotechnol Bioeng 94 (4), 2006, сс. 680-688; Нива та ін., J Immunol Methods 306, 2006, сс. 151-160). Іншими прикладами клітинних ліній, які мають здатність продукувати дефукозильовані імуноглобуліни, є Lec13 CHO-клітини з дефіцитом білкової фукозилювання (Ripka та ін, Arch. Biochem. Biophys. 249, 1986, сс. 533-545; заявка на патент США № US 2003 / 0157108 та WO 2004/056312, насамперед у прикладі 11). В альтернативному варіанті імунокон'югати, запропоновані в даному винаході, можна піддавати глікоінженерії, що призводить до присутності у них зниженого кількості фукозних залишків у Fc-домені, з використанням методик, описаних в EP 1176195 A1, WO 03/084570, WO 03/085119 і опублікованих заявках на патент США № № 2003/0115614, 2004/093621, 2004/110282, 2004/110704, 2004/132140, US № 6946292 (на ім'я фірми Kyowa), наприклад, шляхом зниження або елімінації активності білкатранспортера ГДФ-фукози, в клітинах-хазяїнах, які застосовують для отримання імунокон'югата. Піддані глікоінженеріі імунокон'югати, пропоновані у винаході, можна отримувати також у системах експресії, які продукують модифіковані глікопротеїни, наприклад, описаних в WO 2003/056914 (фірма GlycoFi, Inc.) Або WO 2004/057002 та WO 2004/024927 (на ім'я фірми Greenovation). В одному з варіантів здійснення винаходу Fc-домен імунокон'югата конструюють так, щоб він мав підвищену ефекторну функцію в порівнянні з не підданим інженерії Fc-доменом. Підвищена ефекторна функція може являти собою (але, не обмежуючись лише ними) одну або декілька функцій, вибраних з групи, що включає: підвищену комплементзалежну цитотоксичність (CDC), підвищену антитіло-обумовлену клітинозалежну цитотоксичність (ADCC), підвищений антитіло-обумовлений клітинозалежний фагоцитоз (ADCP), підвищену секрецію цитокінів, підвищене опосередковане імунним комплексом поглинання антигену антигенпрезентуючими клітинами, підвищене зв'язування з NK-клітинами, підвищене зв'язування з макрофагами, підвищене зв'язування з моноцитами, підвищене зв'язування з поліморфоядерними клітинами, підвищену безпосередню передачу сигналу, що індукує апоптоз, підвищене перехресне зв'язування пов'язаних з мішенню антитіл, підвищене дозрівання дендритних клітин або підвищене T-клітинне прімірування. У конкретному варіанті здійснення винаходу підвищена ефекторна функція являє собою одну або декілька функцій, вибраних з групи, що включає підвищену CDC, підвищену ADCC, підвищений ADCP і підвищену секрецію цитокінів. У конкретному варіанті здійснення винаходу підвищена ефекторна функція являє собою підвищену ADCC. В одному з варіантів здійснення винаходу ADCC, індукована сконструйованим Fc-доменом (або імунокон'югатом, який містить сконструйований Fc-домен) щонайменше в 2 рази вище, ніж ADCC, індукована не підданим інженерії Fc-доменом (або імунокон'югатом, з не підданий інженерії Fc-домен). Ефекторні фрагменти Ефекторні фрагменти, призначені для застосування у винаході, являють собою, як правило, поліпептиди, які впливають на клітинну активність, наприклад, через колії трансдукції сигналів. Таким чином, ефекторний фрагмент імунокон'югата, застосовуваного у винаході, може бути асоційований з опосередковуваною рецептором передачею сигналів, що призводить до передачі сигналу від зовнішньої частини клітинної мембрани, модулюючи відповідь в клітині. Наприклад, ефекторний фрагмент імунокон'югата може являти собою цитокін. У конкретних варіантах здійснення винаходу ефекторний фрагмент є людським. У деяких варіантах здійснення винаходу ефекторний фрагмент являє собою одноланцюговий ефекторний фрагмент. У конкретному варіанті здійснення винаходу ефекторний фрагмент являє собою цитокін. Прикладами прийнятнихцитокінів є (але, не обмежуючись тільки ними) GM-CSF, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-21, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TGF-β, TNF-α і TNF-β. В одному з варіантів здійснення винаходу ефекторний фрагмент імунокон'югата являє собою цитокін, вибраний з групи, що включає GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21, IFN-α, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β та TGF-β. В одному з варіантів здійснення винаходу ефекторний фрагмент імунокон'югата являє собою цитокін, вибраний з групи, що включає IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IFN-α і IFN-γ. У деяких варіантах здійснення винаходу цитокіновий ефекторний фрагмент піддають мутації для видалення N-і/абоO-пов'язаних сайтів глікозилювання. Елімінація глікозилювання підвищує вихід гомогенного продукту, одержуваного за допомогою методів рекомбінації. У конкретному варіанті здійснення винаходу ефекторний фрагмент імунокон'югата являє собою IL-2. У конкретному варіанті здійснення винаходу ефекторний фрагмент IL-2 може обумовлювати один або кілька клітинних відповідей, вибраних з групи, що включає: проліферацію активованого Т-лімфоциту, диференціювання активованого T-лімфоциту, 27 UA 115034 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 активність цитотоксичної T-клітини (CTL), проліферацію активованої В-клітини, диференціювання активованої В-клітини, проліферацію природної клітини-кілера (NK), диференціювання NK-клітини, секрецію цитокінів активованої T-клітиною або NK-клітиною і протипухлинну цитотоксичність NK / лімфоцит-активованих клітин-кілерів (LAK). В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу ефекторний фрагмент IL-2 являє собою мутантний ефекторний фрагмент IL-2, що має знижену афінність зв'язування з α-субодиницею IL-2рецептора. У поєднанні з β-та γ-субодиницями (які відомі також як CD122 та CD132 відповідно) α-субодиниця (відома також як CD25) утворює гетеротримерний високоафінний IL-2-рецептор, в той час як димерний рецептор, що складається тільки з β-та γ-субодиниць, позначають як IL-2рецептор з проміжною афінністю. Як описано в заявці на патент PCT PCT/EP2012/051991, яка повністю включена в даний опис як посилання, мутантний поліпептид IL-2, що має знижену здатність зв'язуватися з α-субодиницею IL-2 рецептор має знижену здатність індукувати передачу сигналів IL-2 в регуляторних T-клітинах, індукує знижену індуковану активацією клітинну загибель (AICD) T-клітин і має знижений профіль токсичності in vivo в порівнянні з поліпептидом IL-2 дикого типу. Застосування такого ефекторного фрагмента, що має знижену токсичність, найбільш доцільно в імунокон'югаті, пропонованому у винаході, що має тривалий час напівжиття в сироватці через присутність Fc-домена. В одному з варіантів здійснення винаходу представляє собою мутантний IL-2 ефекторний фрагмент імунокон'югата, пропонованого у винаході, містить щонайменше одну амінокислотну мутацію, що знижує або елімінує афінність ефекторного фрагмента що містить мутантний IL-2 до α-субодиниці IL-2рецептора (CD25), але зберігає афінність ефекторного фрагмента що містить мутантний IL-2 до IL-2-рецептором з проміжної афінність (який складається з β-та γ-субодиниць IL-2-рецептора) порівняно з ефекторним фрагментом містить немутантий IL-2. В одному з варіантів здійснення винаходу одна або кілька амінокислотних мутацій являють собою амінокислотні заміни. У конкретному варіанті здійснення винаходу представляє собою мутантний IL-2 ефекторний фрагмент несе одну, дві або три амінокислотні заміни в одному, двох або трьох положенні (ях), вибраних з положень, які відповідають залишкам 42, 45 і 72 людського IL-2. У більш конкретному варіанті здійснення винаходу такий, що представляє собою мутантний IL-2 ефекторний фрагмент, несе три амінокислотні заміни в положеннях, відповідних залишку 42, 45 і 72 людського IL-2. У ще більш конкретному варіанті здійснення винаходу представляє собою мутантний IL-2 ефекторний фрагмент являє собою людський IL-2, який містить амінокислотні заміни F42A, Y45A та L72G. В одному з варіантів здійснення винаходу що представляє собою мутантний IL-2 ефекторний фрагмент додатково містить амінокислотну мутацію в положенні, відповідному положенню 3 людського IL-2, що призводить до елімінації сайту O-глікозилювання в IL-2. Зокрема, зазначена додаткова амінокислотна мутація являє собою амінокислотну заміну залишку треоніну на залишок аланіну. Конкретний що представляє собою мутантний IL-2 ефекторний фрагмент, який можна застосовувати у винаході, містить чотири амінокислотні заміни в положеннях, відповідних залишкам 3, 42, 45 і 72 людського IL-2. Конкретні амінокислотні заміни являють собою T3A, F42A, Y45A та L72G. Як продемонстровано в заявці на патент PCT PCT/EP2012/051991 та в доданих до неї прикладах, зазначений чотирьохмутантний поліпептид IL-2 (IL-2 qm) не має виявляємої здатності до зв'язування з CD25, має знижену здатність індукувати апоптоз T-клітин, знижену здатність індукувати передачу сигналів IL-2 у Treg-клітинах і зниженим профілем токсичності in vivo. Однак він зберігає здатність активувати передачу сигналів IL-2 в ефекторних клітинах, індукувати проліферацію ефекторних клітин і створення NK-клітинами IFN-γ у якості вторинного цитокіну. IL-2 або мутантний IL-2, що представляє собою ефекторний фрагмент, зазначений у будьякому з перерахованих вище варіантів здійснення винаходу, може містити додаткові мутації, які забезпечують додаткові переваги, такі як підвищений рівень експресії або підвищена стабільність. Наприклад, цистеїн в положенні 125 можна заміняти на нейтральну амінокислоту, таку як аланін, що дозволяє уникати утворення пов'язаних дисульфідними містками димарів IL2. Так, в деяких варіантах здійснення винаходу IL-2 або мутантний IL-2, що представляє собою ефекторний фрагмент імунокон'югата, пропонованого у винаході, містить додаткову амінокислотну мутацію в положенні, відповідному залишку 125 людського IL-2. В одному з варіантів здійснення винаходу зазначена додаткова амінокислотна мутація являє собою амінокислотну заміну C125A. У конкретному варіанті здійснення винаходу IL-2, що представляє собою ефекторний фрагмент імунокон'югата, містить поліпептидну послідовність SEQ ID NO: 2. В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу IL-2, що представляє собою ефекторний фрагмент імунокон'югата, містить поліпептидну послідовність SEQ ID NO: 3. В іншому варіанті здійснення винаходу ефекторний фрагмент імунокон'югата являє собою 28