Антитіла до cxcr4 та їх застосування у лікуванні раку

Реферат: Винахід стосується нового ізольованого антитіла або його похідного, або функціонального фрагмента, здатного зв'язуватися з CXCR4, а також викликати конформаційні зміни гомодимерів та/або гетеродимерів CXCR4, зокрема даний винахід стосується антитіл 414Н5 та 515Н7, специфічних для білка CXCR4, а також їх застосування для лікування раку і способу відбору таких антитіл. UA 102867 C2 (12) UA 102867 C2 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід відноситься до нових антитіл, зокрема до мишачих моноклональних антитіл, химерних і гуманізованих, які здатні специфічно зв'язуватися з хемокіновими рецепторами (CXCR), а також до амінокислотних і нуклеїновокислотних послідовностей, що кодують такі антитіла. В одному аспекті винахід відноситься до нових антитіл, похідних сполук або функціональних фрагментів, що виявляють високу протипухлинну активність, та здатні специфічно зв'язуватися з CXCR4. Винахід також включає застосування таких антитіл як лікарського препарату для профілактики та/або терапевтичного лікування раку, а також у процедурах або наборах, пов'язаних з діагностикою раку. Нарешті, винахід включає композиції, що містять такі антитіла в сполученні або кон'югації з іншими протипухлинними сполуками, такими як антитіла, токсини, цитотоксичні/цитостатичні агенти, та їх застосування у профілактиці та/або лікуванні деяких раків. Хемокіни є малими секретованими пептидами, які контролюють міграцію лейкоцитів по хімічному градієнту ліганду, відомому як хемокіновий градієнт, особливо в імунних реакціях (Zlotnick A. et al., 2000). Вони розділені на дві основні підродини, CC і CXC, залежно від положення їх NH2-кінцевих залишків цистеїну, і зв'язуються з рецепторами, спряженими з Gбілком, дві основні підродини яких позначаються як CCR і CXCR. Дотепер було виявлено більше ніж 50 людських хемокінів, та 18 хемокінових рецепторів. Багато раків мають складну хемокінову мережу, яка впливає на імунно-клітинну інфільтрацію пухлини, а також на зростання, виживання, міграцію пухлинних клітин, і ангіогенез. Імунні клітини, ендотеліальні клітини та пухлинні клітини самі експресують хемокінові рецептори і можуть реагувати на хемокінові градієнти. Дослідження зразків біопсії людського раку та мишачих моделей раку показали, що експресія хемокінових рецепторів раковими клітинами пов'язана зі збільшенням метастатичного потенціалу. Злоякісні клітини від різних типів раку мають різні профілі експресії хемокінових рецепторів, але найбільш поширеним є хемокіновий рецептор-4 (CXCR4). Клітини щонайменше 23 різних типів людських раків епітеліального, мезенхимального та гемопоетичного походження експресують CXCR4-рецептор (Balkwill F. et al., 2004). Хемокіновий рецептор-4 (також відомий як фузин, CD184, LESTR або HUMSTR) існує у вигляді двох ізоформ, які містять 352 або 360 амінокислот. Залишок Asn11 гліколізований, залишок Tyr21 модифікований шляхом додавання сульфатної групи, а Cys109 і Cys186 зв'язані дисульфідним містком на позаклітинній частині рецептора (Juarez J. et al., 2004). Цей рецептор експресований різними видами нормальних тканин, наївними T-клітинами (не T-клітинами пам'яті), регуляторними Т-клітинами, В-клітинами, нейтрофілами, ендотеліальними клітинами, первинними моноцитами, дендритними клітинами, натуральними кілерами, CD34+ гемопоетичними стовбуровими клітинами, й на низькому рівні у серці, кишечнику, печінці, нирках і головному мозку. CXCR4 відіграє ключову роль у переміщенні лейкоцитів, B-клітинному лімфопоезі та мієлопоезі. CXCR4-рецептор надекспресований у великій кількості раків, включаючи, але не обмежуючись ними, рак товстої кишки (Ottaiano A. et al., 2004), молочної залози (Kato M. et al., 2003), передміхурової залози (Sun Y.X. et al., 2003), легенів [дрібноклітинна й недрібноклітинна карцинома (Phillips R.J. et al., 2003)], яєчника (Scotton C.J. et al., 2002), підшлункової залози (Koshiba T. et al., 2000), нирок і головного мозку (Barbero S et al., 2002), гліобластому та лімфоми. Унікальним лігандом рецептора CXCR4, описаним на даний час, є фактор стромальних клітин-1 (SDF-1) або CXCL12. SDF-1 секретується у великій кількості в лімфатичних вузлах, кістковому мозку, печінці, легенях і меншою мірою в нирках, головному мозку й шкірі. CXCR4 також розпізнається антагоністичним хемокіном, вірусним макрофагальним запальним білком II (vMIP-II), який кодується людським вірусом герпесу III типу. Вісь CXCR4/SDF-1 відіграє ключову роль у раку, та безпосередньо бере участь у міграції, інвазії, що веде до метастазування. Дійсно, ракові клітини експресують CXCR4-рецептор, вони мігрують і входять у системний кровотік. Потім ракові клітини затримуються в судинному руслі в органах, що продукують високі рівні SDF-1, де вони проліферують, індукують ангіогенез та формують метастатичні пухлини (Murphy PM., 2001). Ця вісь також бере участь у проліферації клітин через активацію шляху позаклітинної сигнал-регульованої кінази (ERK) (Barbero S. et al., 2003) та ангіогенезі (Romagnani P., 2004). Дійсно, CXCR4-рецептор і його ліганд SDF-1 чітко підсилюють ангіогенез шляхом стимуляції експресії VEGF-А, який у свою чергу збільшує експресію CXCR4/SDF-1 (Bachelder R.E. et al., 2002). Відомо також, що пухлинно-асоційовані макрофаги (TAM) накопичуються в гіпоксичних областях пухлин і стимулюються до взаємодії з пухлинними клітинами, та підсилюють ангіогенез. Було визначено, що гіпоксія селективно підвищує експресію CXCR4 у різних типах клітин, включаючи TAM (Mantovani A. et al., 2004). 1 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Недавно було показано, що вісь CXCR4/SDF-1 регулює переміщення/хомінг CXCR4+ гемопоетичних стовбурових клітин/клітин-попередників (HSC) і може відігравати роль у неоваскуляризації. Дані свідчать про те, що крім HSC функціональний CXCR4 також експресований на стовбурових клітинах з інших тканин (ранніх тканинних стовбурових клітинах = TCSC), так що SDF-1 може відігравати ключову роль у хемотаксисі CXCR4+TCSC, необхідному для регенерації органа/тканини, але ці TCSC можуть також бути клітинним джерелом розвитку раку (теорія ракових стовбурових клітин). Походження раку зі стовбурових клітин було продемонстровано для людської лейкемії, та недавно для декількох солідних пухлин, таких як пухлини головного мозку й молочної залози. Є кілька прикладів CXCR4+ пухлин, що можуть походити з нормальних CXCR4+ тканинно-/органоспецифічних стовбурових клітин, наприклад, лейкемії, пухлини головного мозку, дрібноклітинний рак легенів, рак молочної залози, гепатобластома, рак яєчників та шийки матки (Kucia M. et al., 2005). Вплив на метастази раку шляхом впливу на рецептор CXCR4 було продемонстровано in vivo за допомогою моноклональних антитіл, спрямованих проти рецептора CXCR4 (Muller A. et al., 2001). Стисло, було показано, що моноклональне антитіло, спрямоване проти CXCR4рецептора (МКА 173 R&D Systems), значно зменшує кількість метастазів у лімфатичних вузлах на моделі ортотопічного раку молочної залози (MDA-MB231) у мишей SCID. Інше дослідження (Phillips R.J et al., 2003) також показало важливу роль осі SDF-1/CXCR4 у метастазуванні на моделі ортотопічної карциноми легенів (A549) за допомогою поліклональних антитіл проти SDF1, але у даному дослідженні не було впливу ані на зростання пухлини, ані на ангіогенез. Ряд інших досліджень також описує інгібування чи то метастазів in vivo за допомогою кіРНКдуплексів CXCR4 (Liang Z. et al., 2005), біостійких антагоністів пептиду CXCR4 (Tamamura H. et al., 2003), чи то пухлинного росту in vivo з використанням низькомолекулярного антагоніста CXCR4, такого як AMD 3100 (Rubin J.B. et al., 2003; De Falco V. et al., 2007), або МКА (патент WO2004/059285 A2). Таким чином, CXCR4 є затвердженою терапевтичною мішенню при раках. Хемокіновий рецептор-2 (CXCR2), інший хемокіновий рецептор, також описується як цікава мішень в онкології. Дійсно, CXCR2 передає аутокринний клітинний ростовий сигнал у декількох типах пухлинних клітин, і також може впливати на зростання пухлини непрямим шляхом, за рахунок посилення ангіогенезу (Tanaka T. et al. 2005). Хемокіновий рецептор CXCR2 включає 360 амінокислот. Він експресується головним чином в ендотеліальних клітинах, і специфічно під час неоваскуляризації. CXCR2-рецептор зв'язують декілька хемокінів: CXCL5,-6,-7, IL-8, GRO-α, -β і -γ, які належать до ERL+ проангіогенних хемокінів. CXCR2-рецептор частково має гомологічну послідовність із CXCR4-рецептором: 37 % ідентичної послідовності та 48 % гомологічної послідовності. Вісь CXCR2/ліганди задіяна в декількох механізмах пухлинного росту, таких як метастазування (Singh RK. et al., 1994), клітинна проліферація (Owen J.D. et al., 1997) і ERL+ хемокін-опосередкований ангіогенез (Strieter R.M. et al., 2004; Romagnani et al., 2004). Нарешті, пухлинно-асоційовані макрофаги та нейтрофіли є ключовими елементами індукованого запаленням пухлинного росту, і хемокіни, такі як CXCL5, IL-8 та GRO-α, ініціюють залучення нейтрофілів. Димеризація з'явилася як загальний механізм регуляції функції рецепторів, пов'язаних з Gбілком, до яких належать хемокінові рецептори (Wang J. and Norcross M., 2008). Було показано, що гомо- і гетеродимеризація у відповідь на зв'язування хемокіном необхідна для ініціювання й зміни передачі сигналу від великої кількості хемокінових рецепторів. Усе більше фактів підтверджують концепцію, що рецепторні димери або олігомери, імовірно, є основною функціональною одиницею хемокінових рецепторів. Димери хемокінових рецепторів присутні за відсутності лігандів, а хемокіни індукують конформаційні зміни рецепторних димерів.CXCR4, як відомо, формує гомодимери, а також гетеродимери, наприклад, з δ-опіоїдним рецептором (DOR) (Hereld D., 2008) або CCR2 (Percherancier Y. et al., 2005). В останньому прикладі пептиди, отримані з трансмембранних доменів CXCR4, інгібували активацію шляхом блокування лігандіндукованих конформаційних переходів димеру (Percherancier Y. et al., 2005). Інше дослідження показало, що пептид CXCR4-ТМ4, синтетичний пептид трансмембранної ділянки CXCR4, зменшує перенесення енергії між протомерами гомодимерів CXCR4 та інгібує SDF-1-індуковану міграцію й полімеризацію актину в злоякісних клітинах (Wang J. et al., 2006). Зовсім недавно також було описано, що CXCR7 формує функціональні гетеродимери з CXCR4 та підсилює SDF-1-індуковану передачу сигналу (Sierro F. et al., 2007). Інші приклади конститутивних гетеродимерів включають дослідження, що показують взаємодію CXCR1 і CXCR2, а також формування відповідних гомодимерів. Для будь-якого з них була відзначена відсутність взаємодій з іншим GPCR (альфа(1А)-адренорецептором), що вказує на специфічність взаємодії CXCR1 з CXCR2 (Wilson S. et al., 2005). Як згадувалося раніше, рецептори CXCR4 і CXCR2 є цікавими пухлинними мішенями. Вплив 2 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 на ці рецептори повинен дуже ефективно інгібувати пухлинний ріст і метастазування шляхом зменшення проліферації пухлинних клітин, ангіогенезу, міграції та інвазії пухлинних клітин, залучення нейтрофілів та макрофагів у пухлину й шляхом інгібування CXCR4-ракових стовбурових клітин. Одним із пропонованих аспектів даного винаходу є створення мишачого моноклонального антитіла, що індукує конформаційні зміни CXCR4-димерів. Винахід охоплює CXCR4-МКА 414H5 (або його фрагменти), здатне зв'язувати та індукувати конформаційні зміни як гомодимерів CXCR4, так і гетеродимерів CXCR4/CXCR2, і яке має високу протипухлинну активність як на мишачій моделі з ксенотрансплантатом, так і на моделях виживаності. Винахід також охоплює CXCR4-МКА 515H7 (або його фрагменти), здатне зв'язувати та індукувати конформаційні зміни як гомодимерів CXCR4, так і гетеродимерів CXCR4/CXCR2, і яке має високу протипухлинну активність. Анти-CXCR4-МКА 414H5 інгібує пухлинний ріст на моделі з ксенотрансплантатом MDA-MB-231, та збільшує виживаність мишей на моделі U937. Вони індукують конформаційні зміни в гомодимерах CXCR4, а також у гетеродимерах CXCR4/CXCR2. Ця нова властивість повинна становити інтерес для застосування у терапії раку з урахуванням важливої ролі цих двох хемокінових рецепторів при раку. Вже виявлено, що вплив як гомо-, так і гетеродимерів рецепторів підсилює терапевтичний ефект МКА. Дійсно, було продемонстровано, наприклад, що МКА (h7C10), який впливає на обидва гібридних рецептора IGF-1R та інсулін/IGF-1, сильніше інгібує пухлинний ріст in vivo, ніж МКА, який впливає винятково на IGF-1R (Pandini G., 2007). Крім того, анти-CXCR4-МКА 414H5 і 515H7 є мовчазними антагоністами для CXCR4, вони не змінюють базальний сигнал в аналізах in vitro, але інгібують SDF-1-індуковану передачу сигналу в різних аналізах (GTPγS-зв'язування, вивільнення цАМФ), а також здатні інгібувати SDF-1індуковану проліферацію й міграцію пухлинних клітин in vitro. Молекули, що діють або як часткові агоністи, або як зворотні агоністи, демонструють внутрішню активність за відсутності лігандів. Ці типи молекул стабілізують, відповідно, високоафінний або низькоафінний стан GPCR, навіть за відсутності ліганду, тим самим активуючи або інгібуючи низхідні сигнальні каскади (Galandin et al., 2007; Kenakin, 2004). У випадку МКА 414H5 і 515H7, ці молекули поводяться як мовчазні антагоністи, без будьякої внутрішньої активності по відношенню до CXCR4-рецептора за відсутності SDF-1. Ця фармакологічна риса може бути пов'язана з менш несприятливими побічними ефектами в порівнянні з частковими або зворотними агоністами, що ми вже відзначали для лігандів опіоїдних рецепторів (Bosier and Hermans, 2007). Дійсно, функціональна активність обох МКА 414H5 і 515H7 повністю залежить від наявності SDF-1, і відсутність модуляції активності рецептора CXCR4 буде спостерігатися в тканинах і органах, у яких ліганд SDF-1 не експресується, не секретується або не доставляється кровообігом. Таким чином, МКА 414H5 і 515H7, імовірно, будуть менш токсичними у порівнянні з іншими лігандами рецептора CXCR4 з позитивною або негативною ефективністю. Крім того, мовчазні антагоністи становлять меншу частину видів у фармакологічній галузі (Wurch et al., 1999, Kenakin, 2004). Несподівано, вперше винахідникам вдалося створити антитіла, які здатні зв'язуватися з CXCR4, а також здатні викликати конформаційні зміни гомодимерів та/або гетеродимерів CXCR4. Зокрема, антитіла за винаходом здатні викликати конформаційні зміни гомодимерів CXCR4, а також гетеродимерів CXCR4/CXCR2. У заявці далі вислів у множині "димери CXCR4" слід розуміти як такий, що охоплює гомодимери CXCR4, а також гетеродимери CXCR4/CXCR2. На даному етапі слід зазначити, що такі антитіла ніколи не були описані на відомому рівні техніки. Крім того, необхідно відзначити, що існування гетеродимерів CXCR4/CXCR2 ніколи не було описано. Частиною винаходу є відкриття існування гетеродимеру, утвореного CXCR4 і CXCR2. Так, в окремому аспекті, даний винахід відноситься до ізольованого комплексу, що включає, або складається з гетеродимеру CXCR4/CXCR2. Краще, коли сполука CXCR4-частини зазначеного гетеродимерного комплексу CXCR4/CXCR2 є однією з двох людських ізоформ CXCR4, вибраних з групи, що складається з: - хемокінового (С-X-C-мотив) рецептора 4 ізоформи b [Homo Sapiens], що має послідовність, вказану під реєстраційним номером Genbank NP_003458 SEQ ID № 29: MEGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGNGLVILVMGYQKK LRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIV HATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQHIMVGL ILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENTVHKW ISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSFHSS; 3 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - хемокінового (С-X-C-мотив) рецептора 4 ізоформи а [Homo Sapiens], що має послідовність, вказану під реєстраційним номером Genbank NP_001008540 SEQ ID № 30: MSIPLPLLQIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGNGLVILVMG YQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDR YLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQHI MVGLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENT VHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSS FHSS; - альтернативного транскрипційного варіанта сплайсингу або природного варіанта, що має щонайменше 95 % ідентичність відносно однієї з цих ізоформ b або a, з SEQ ID № 29 або 30; та - його фрагмента, що може специфічно розпізнаватися природним лігандом фактором стромальних клітин-1 (SDF-1), і у кращому випадку має щонайменше 100, 150 та 200 амінокислот у довжину. Краща сполука CXCR2-частини зазначеного гетеродимерного комплексу CXCR4/CXCR2 вибрана з групи, що складається з: - рецептора бета інтерлейкіну-8 [Homo Sapiens], що має послідовність, вказану під реєстраційним номером Genbank NP_001548 SEQ ID № 31: MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIYALVFLLSLLGNS LVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNGWIFGTFLCKVVSLLKEVNFYSGILLLA CISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFICLSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDMGNNTANW RMLLRILPQSFGFIVPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIFAVVLIFLLCWLPYNLVLLADTLM RTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKILAIHGLISKDSLPKDSRPSFV GSSSGHTSTTL; - альтернативного транскрипційного варіанта сплайсингу або природного варіанта, що має щонайменше 95 % ідентичність із цим рецептором b інтерлейкіну-8 з SEQ ID № 31; та - його фрагмента, що може специфічно розпізнаватися ІЛ-8 і у кращому випадку має щонайменше 100, 150 і 200 амінокислот у довжину. У даному окремому аспекті даний винахід також включає ізольовану РНК або ДНК, що кодує поліпептид, який включає вказаний гетеродимерний комплекс CXCR4/CXCR2. Цей винахід також включає нуклеїнову конструкцію, краще - експресійний вектор, наприклад, плазміду, що кодує зазначений гетеродимерний комплекс CXCR4/CXCR2. Винахід також включає композицію, яка включає щонайменше одну нуклеїнову конструкцію, краще, експресійний вектор, наприклад, плазміду, що кодує CXCR4-частину зазначеного гетеродимерного комплексу CXCR4/CXCR2, і другу конструкцію, краще, експресійний вектор, наприклад, плазміду, що кодує CXCR2-частину зазначеного гетеродимерного комплексу CXCR4/CXCR2. У цьому аспекті винахід також включає спосіб отримання рекомбінантної приймаючої клітини (клітини-хазяїна), що експресує зазначений гетеродимерний комплекс CXCR4/CXCR2, де цей спосіб включає етап трансформації зазначеної приймаючої клітини: а) нуклеїновою конструкцією, краще, експресійним вектором, наприклад, плазмідою, що кодує зазначений гетеродимерний комплекс CXCR4/CXCR2; або б) щонайменше однією нуклеїновою конструкцією, краще, експресійним вектором, наприклад, плазмідою, що кодує CXCR4-частину зазначеного гетеродимерного комплексу CXCR4/CXCR2, і другою конструкцією, краще, експресійним вектором, наприклад, плазмідою, що кодує CXCR2-частину зазначеного гетеродимерного комплексу CXCR4/CXCR2. У кращому втіленні зазначена приймаюча клітина є еукаріотичною клітиною, наприклад, клітиною ссавця. У кращому втіленні нуклеїнова конструкція (конструкції), що кодує зазначений гетеродимерний комплекс CXCR4/CXCR2, кодує також перший маркер, який зв'язаний (зокрема, за допомогою ковалентного зв'язку) з CXCR4-послідовністю, наприклад, маркер LUC (люциферази), і другий маркер, який зв'язаний (зокрема, за допомогою ковалентного зв'язку) з CXCR2-послідовністю, наприклад, - маркер GFP (тобто, для аналізу BRET). Винахід також включає спосіб вибору сполуки, що виявляє протиракову активність, або може бути використана для отримання композиції для лікування раку, який характеризується тим, що включає етап: а) контактування рекомбінантної приймаючої клітини за даним винаходом, яка експресує зазначений гетеродимерний комплекс CXCR4/CXCR2, з тестованою сполукою; та б) визначення того, чи є ця сполука здатною модулювати, краще - інгібувати активність цього гетеродимерного комплексу CXCR4/CXCR2 у рекомбінантній приймаючій клітині. У першому аспекті предметом даного винаходу є спосіб створення й вибирання антитіл 4 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відповідно до винаходу. Конкретніше, винахід відноситься до способу вибирання анти-CXCR4-антитіла або одного з його функціональних фрагментів чи похідних, здатних інгібувати як ліганд-залежну, так і ліганднезалежну активацію CXCR4, при цьому зазначений спосіб включає такі етапи: i) скринінг створених антитіл і вибирання антитіл, здатних специфічно зв'язувати CXCR4, а також модулювати CXCR4-активацію; ii) тестування антитіл, відібраних на етапі i), та вибирання антитіл, здатних індукувати конформаційні зміни гомодимерів CXCR4, а потім iii) тестування антитіл, відібраних на етапі ii), і вибирання антитіл, здатних індукувати конформаційні зміни гетеродимерів CXCR4/CXCR2. Під висловом "модулювати" слід розуміти збільшення або інгібування. У кращому випадку, відібрані антитіла за винаходом повинні інгібувати CXCR4-активацію. Як було пояснено раніше, індукція конформаційних змін димерів CXCR4 є основним аспектом винаходу, тому що такі антитіла будуть становити реальний інтерес для більшої кількості пацієнтів. Створення антитіла може бути реалізоване будь-яким способом, відомим фахівцям у даній галузі, таким як, наприклад, злиття мієломної клітини з клітинами селезінки від імунізованих мишей або інших видів, сумісних з вибраними мієломними клітинами [Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497]. Імунізовані тварини можуть включати трансгенних мишей з людськими імуноглобуліновими локусами, які потім безпосередньо продукують людські антитіла. Інше можливе втілення могло б полягати у застосуванні методики фагового дисплею для скринінга бібліотек. Етап скринінга i) може бути реалізований будь-яким способом або процесом, відомим фахівцям у даній галузі. Як необмежуючі приклади можна згадати ІФА, Biacore, імуногістохімію, FACS-аналіз та функціональні скринінги. Кращий спосіб полягає у скринінгу за допомогою FACS-аналізу на CXCR4-трансфектантах і щонайменше на пухлинній клітинній лінії, щоб переконатися, що продуковані антитіла також здатні розпізнавати нативний рецептор на пухлинних клітинах. Цей спосіб буде описаний точніше у подальших прикладах. Під висловом "модулювати CXCR4-активацію" розуміється модуляція щонайменше однієї активності, зазначеної в прикладах 4, 5, 7 і 13 нижче: Кращими для модуляції є: - специфічне зв'язування на клітинних мембранах лігандом SDF-1 рецептора CXCR4 (див. приклад 4), зокрема, шляхом конкурування на мембрані еукаріотичних трансформованих клітин, таких як мембрани СНО-К1, що стабільно експресують людський рецептор CXCR4 дикого типу; - специфічне зв'язування на клітинних мембранах GTPγS рецептора CXCR4 (див. приклад 5), зокрема, на мембрані еукаріотичних трансформованих клітин, наприклад, клітин NIH-3T3, що стабільно й конститутивно експресують рецептор CXCR4 дикого типу; - CXCR4-опосередковане інгібування продукування цАМФ (див. приклад 7); і - CXCR4-рецептор-опосередкована мобілізація внутрішньоклітинних депо кальцію (див. приклад 13). Ще краще, коли ця модуляція щонайменше одного з цих видів активності є інгібуванням активності. У кращому втіленні етапів вибирання ii) й iii) способу за винаходом зазначені етапи ii) й iii) полягають в оцінюванні антитіл за допомогою BRET-аналізу на клітинах, що експресують CXCR4-Rluc/CXCR4-YFP і CXCR4-Rluc/CXCR2-YFP, відповідно, і у відбиранні антитіл, здатних інгібувати щонайменше 40 %, а краще, 45 %, 50 %, 55 % і ще краще, -60 % BRET-сигналу. Методика BRET є методикою, що відома як репрезентативна для білкової димеризації [Angers et al., PNAS, 2000, 97:3684-89]. Методика BRET, використовувана в етапах способу ii) і iii), добре відома фахівцям у даній галузі, і буде докладно описана в подальших прикладах. Конкретніше, BRET (bioluminescence resonance energy transfer, резонансне перенесення енергії біолюмінесценції) є нерадіаційним перенесенням енергії, що виникає між біолюмінесцентним донором (люциферазою Renilla (Rluc)) і флуоресцентним акцептором, мутантом GFP (green fluorescent protein, зелений флуоресцентний білок) або YFP (yellow fluorescent protein, жовтий флуоресцентний білок). У цьому випадку був використаний EYFP (enhanced yellow fluorescent protein, посилений жовтий флуоресцентний білок). Ефективність перенесення залежить від орієнтації та відстані між донором і акцептором. Крім того, передача енергії може відбуватися тільки тоді, коли дві молекули перебувають у безпосередній близькості (1-10 нм). Ця властивість використовується для проведення аналізу білково-білкових взаємодій. Дійсно, з метою вивчення взаємодії між двома учасниками, перший з них генетично зливають з люциферазою Renilla, а другий з жовтим 5 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мутантом GFP. Гібридні білки, як правило, але не обов'язково, експресуються клітинами ссавців. У присутності свого мембранно-проникного субстрату (коелентеразину) Rluc випромінює синє світло. Якщо мутант GFP знаходиться ближче, ніж за 10 нм до Rluc, то може виникнути передача енергії, і буде виявлений додатковий жовтий сигнал. Сигнал BRET вимірюється як співвідношення між світлом, випромінюваним акцептором, і світлом, випромінюваним донором. Так, BRET-сигнал буде збільшуватися в міру зближення двох гібридних білків або якщо конформаційна зміна зблизить Rluc і GFP-мутант. Якщо BRET-аналіз включений у краще втілення, то для вимірювання конформаційних змін димерів CXCR4 можна використовувати будь-який спосіб, відомий фахівцям у даній галузі. Не обмежуючись ними, можна зазначити такі методики: FRET (fluorescence resonance energy transfer, резонансне перенесення енергії флуоресценції), HTRF (homogenous time resolved fluorescence, гомогенна флуоресценція з часовим розділенням), FLIM (fluoroscence lifetime imaging microscopy, флуоресцентна мікроскопія із зображенням за часом життя флуоресценції) або SW-FCCS (single wavelength fluoroscence cross-correlation spectroscopy, крос-кореляційна спектроскопія флуоресценції однієї довжини хвилі). Також можуть бути використані інші класичні методики, наприклад, коімунопреципітація, Alpha Screen, хімічне зшивання, подвійний гібрид, афінна хроматографія, ІФА й фар-вестернблотінг. У окремому аспекті способу відповідно до винаходу етап ii) полягає в оцінюванні антитіл за допомогою BRET-аналізу на клітинах, що експресують обидва CXCR4-Rluc/CXCR4-YFP, та у відбиранні антитіл, здатних інгібувати щонайменше 40 % BRET-сигналу. В іншому окремому аспекті способу відповідно до винаходу етап iii) полягає в оцінюванні антитіл за допомогою BRET-аналізу на клітинах, що експресують обидва CXCR4-Rluc/CXCR4YFP, і у відбиранні антитіл, здатних інгібувати щонайменше 40 % BRET-сигналу. У другому аспекті предметом винаходу є ізольоване антитіло, або один з його функціональних фрагментів чи похідних, отримуваних зазначеним способом. Зазначене антитіло, або один з його зазначених фрагментів чи похідних, є здатними специфічно зв'язуватися з людським CXCR4 і, більш того, при необхідності, у кращому випадку, є здатними інгібувати природне приєднання його ліганду; також зазначене антитіло здатне індукувати конформаційні зміни димерів CXCR4. Вислови "функціональні фрагменти й похідні" докладно будуть визначені нижче в даному описі. Тут слід розуміти, що винахід не стосується антитіл у природній формі, тобто вони перебувають не в їх природному середовищі, але вони можуть бути виділені або отримані шляхом очищення з природних джерел, або отримані шляхом генетичної рекомбінації, або шляхом хімічного синтезу, і що вони можуть включати неприродні амінокислоти, як буде описано нижче. Зокрема, відповідно до іншого аспекту винаходу, заявлене антитіло або один з його функціональних фрагментів чи похідних, при цьому зазначене антитіло характеризується тим, що воно містить щонайменше одну ділянку, що визначає комплементарність (CDR), вибрану з CDR, які включають амінокислотну послідовність SEQ ID №№ 1-12. Зокрема, відповідно до іншого аспекту винаходу, заявлене антитіло або один з його функціональних фрагментів чи похідних, при цьому зазначене антитіло характеризується тим, що воно включає щонайменше одну ділянку, що визначає комплементарність (CDR), вибрану з CDR, які включають амінокислотну послідовність SEQ ID №№ 2, 5 або 40-49. Відповідно до першого аспекту, винахід відноситься до ізольованого антитіла або похідної сполуки, або її функціонального фрагмента, що включає щонайменше один CDR, вибраний з CDR послідовностей SEQ ID № 1, 2, 3, 4, 5 чи 6, або щонайменше один CDR послідовності, яка щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 %, ідентична після оптимального вирівнювання послідовностям SEQ ID №№ 1, 2, 3, 4, 5 або 6. Відповідно до іншого аспекту, винахід відноситься до ізольованого антитіла або похідної сполуки або її функціонального фрагмента, що включає щонайменше один CDR, вибраний з CDR послідовностей SEQ ID №№ 40, 2, 41, 42, 5 чи 43, або щонайменше один CDR послідовності, яка щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентична після оптимального вирівнювання послідовностям SEQ ID №№ 40, 2, 41, 42, 5 або 43. Під "функціональним фрагментом" антитіла розуміється, зокрема, фрагмент антитіла, такий як фрагменти Fv, scFv (sc позначає один ланцюг), Fab, F(ab') 2, Fab', scFv-Fc, або димерні антитіла, або будь-який фрагмент, час напівжиття якого був збільшений. Такі функціональні фрагменти будуть докладно описані нижче в даному описі. Під "похідною сполукою" або "похідним" антитіла розуміється, зокрема, зв'язувальний білок, 6 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що включає пептидну матрицю та щонайменше один CDR вихідного антитіла для підтримання здатності розпізнавати CXCR4. Такі похідні сполуки, добре відомі фахівцям у даній галузі, будуть описані докладніше в даному описі. Ще кращий варіант винаходу включає антитіла, їх похідні сполуки, або їх функціональні фрагменти відповідно до даного винаходу, особливо, химерні або гуманізовані, отримані шляхом генетичної рекомбінації або хімічного синтезу. Відповідно до кращого втілення, антитіло відповідно до винаходу, або його похідні сполуки або функціональні фрагменти, характеризуються тим, що вони складаються з моноклональних антитіл. Під "моноклональним антитілом" розуміється антитіло, отримане з популяції по суті однорідних антитіл. Конкретніше, окремі антитіла популяції є ідентичними, за винятком можливих природних мутацій, які можуть бути присутними у мінімальних пропорціях. Іншими словами, моноклональне антитіло є однорідним антитілом, отриманим в результаті росту одного клону клітин (наприклад, гібридомної клітини, еукаріотичної приймаючої клітини, трансфекованої молекулою ДНК, що кодує однорідне антитіло, прокаріотичної приймаючої клітини, трансфекованої молекулою ДНК, що кодує однорідне антитіло і т.д.), і в цілому характеризується важкими ланцюгами одного й тільки одного класу та підкласу, і легкими ланцюгами тільки одного типу. Моноклональні антитіла є високо специфічними та спрямовані проти одного антигену. Крім того, на відміну від отримання поліклональних антитіл, які звичайно включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант, або епітопів, кожне моноклональне антитіло спрямоване проти одного епітопу антигену. Тут слід розуміти, що винахід не відноситься до антитіл у природній формі, тобто вони взяті не з їх природного середовища, але вони виділені або отримані шляхом очищення з природних джерел, або отримані шляхом генетичної рекомбінації, або шляхом хімічного синтезу, і, таким чином, вони можуть включати неприродні амінокислоти, як буде описано нижче. Зокрема, відповідно до кращого втілення винаходу, антитіло або його похідні сполуки, або функціональні фрагменти характеризуються тим, що вони включають легкий ланцюг, що включає щонайменше один CDR, вибраний з CDR амінокислотних послідовностей SEQ ID №№ 1, 2 чи 3, або щонайменше один CDR послідовності, яка щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентична після оптимального вирівнювання послідовностям SEQ ID №№ 1, 2 або 3; або вони включають важкий ланцюг, що включає щонайменше один CDR, вибраний з CDR амінокислотних послідовностей SEQ ID №№ 4, 5 чи 6, або щонайменше один CDR послідовності, яка щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентична після оптимального вирівнювання послідовностям SEQ ID №№ 4, 5 чи 6. Відповідно до іншого втілення, антитіла за винаходом або одна з їх похідних сполук або функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають легкий ланцюг, що включає щонайменше один із трьох CDR послідовностей SEQ ID №№ 1, 2 або 3, або щонайменше однієї послідовності, яка щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентична після оптимального вирівнювання послідовностям SEQ ID №№ 1, 2 або 3. Краще, антитіла за винаходом або одна з їх похідних сполук або функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають легкий ланцюг, який включає такі три CDR, відповідно, CDR-L1, L2-CDR і CDR-L3, де: - CDR-L1 включає послідовність SEQ ID № 1 або 9, або послідовність, щонайменше на 80 % ідентичну після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 1 або 9; - CDR-L2 включає послідовність SEQ ID № 2 або 10 або послідовність, щонайменше на 80 % ідентичну після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 2 або 10, і - CDR-L3 включає послідовність SEQ ID № 3 або послідовність, щонайменше на 80 % ідентичну після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 3. Відповідно до окремого варіанта втілення антитіла або одна з їх похідних сполук або функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають легкий ланцюг, який включає CDR-L1 послідовності SEQ ID № 1, CDR-L2 послідовності SEQ ID № 2 і CDR-L3 послідовності SEQ ID № 3. Відповідно до іншого окремого варіанта втілення антитіла або одна з їх похідних сполук або функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають легкий ланцюг, який включає CDR-L1 послідовності SEQ ID № 9, CDR-L2 послідовності SEQ ID № 10 і CDR-L3 послідовності SEQ ID № 3. Зокрема, антитіла за винаходом або одна з їх похідних сполук або функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають важкий ланцюг, який включає щонайменше один із трьох CDR послідовностей SEQ ID №№ 4, 5 або 6, або щонайменше однієї послідовності, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичної після 7 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 оптимального вирівнювання послідовностям SEQ ID №№ 4, 5 або 6. Ще краще, коли антитіла за винаходом або одна з їх похідних сполук або функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають важкий ланцюг, який включає такі три CDR, відповідно, CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, де: - CDR-H1 включає послідовність SEQ ID № 4, 7 або 11, або послідовність, щонайменше на 80 % ідентичну після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 4, 7 або 11; - CDR-H2 включає послідовність SEQ ID № 5 або 12, або послідовність, щонайменше на 80 % ідентичну після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 5 або 12, і - CDR-H3 включає послідовність SEQ ID № 6 або 8, або послідовність, щонайменше на 80 % ідентичну після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 6 або 8. Відповідно до окремого варіанта втілення антитіла або одна з їх похідних сполук або функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають важкий ланцюг, який включає CDR-H1 послідовності SEQ ID № 7, CDR-H2 послідовності SEQ ID № 5 і CDR-H3 послідовності SEQ ID № 8. Відповідно до іншого окремого варіанта втілення антитіла або одна з їх похідних сполук або функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають важкий ланцюг, який включає CDR-H1 послідовності SEQ ID № 11, CDR-H2 послідовності SEQ ID № 12 і CDR-H3 послідовності SEQ ID № 6. Зокрема, відповідно до кращого втілення винаходу антитіло або його похідні сполуки або функціональні фрагменти характеризуються тим, що вони включають легкий ланцюг, який включає щонайменше один CDR, вибраний з CDR амінокислотних послідовностей SEQ ID №№ 40, 2 або 41, або щонайменше один CDR послідовності, яка щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентична після оптимального вирівнювання послідовностям SEQ ID №№ 40, 2 або 41; або вони включають важкий ланцюг, що включає щонайменше один CDR, вибраний з CDR амінокислотних послідовностей SEQ ID №№ 42, 5 або 43, або щонайменше один CDR послідовності, яка щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентична після оптимального вирівнювання послідовностям SEQ ID №№ 42, 5 або 43. Відповідно до іншого втілення, антитіла за винаходом або одна з їх похідних сполук або функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають легкий ланцюг, який включає щонайменше один із трьох CDR послідовностей SEQ ID №№ 40, 2 або 41, або щонайменше однієї послідовності, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовностям SEQ ID №№ 40, 2 або 41. У кращому випадку антитіла за винаходом або одна з їх похідних сполук або функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають легкий ланцюг, який включає такі три CDR, відповідно CDR-L1, L2-CDR і CDR-L3, де: - CDR-L1 включає послідовність SEQ ID № 40 або 46, або послідовність, щонайменше на 80 % ідентичну після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 40 або 46; - CDR-L2 включає послідовність SEQ ID № 2 або 47, або послідовність, щонайменше на 80 % ідентичну після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 2 або 47; і - CDR-L3 включає послідовність SEQ ID № 41 або послідовність, щонайменше на 80 % ідентичну після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 41. Відповідно до окремого варіанта втілення, антитіла або одна з їх похідних сполук або функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають легкий ланцюг, який включає CDR-L1 послідовності SEQ ID № 40, CDR-L2 послідовності SEQ ID № 2 і CDR-L3 послідовності SEQ ID № 41. Відповідно до іншого окремого варіанта втілення антитіла або одна з їх похідних сполук або функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають легкий ланцюг, який включає CDR-L1 послідовності SEQ ID № 46, CDR-L2 послідовності SEQ ID № 47 і CDR-L3 послідовності SEQ ID № 41. Зокрема, антитіла за винаходом або одна з їх похідних сполук або функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають важкий ланцюг, який включає щонайменше один з трьох CDR послідовностей SEQ ID №№ 42, 5 або 43, або щонайменше однієї послідовності, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовностям SEQ ID №№ 42, 5 або 43. І ще краще, коли антитіла за винаходом або одна з їх похідних сполук або функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають важкий ланцюг, який включає такі три CDR, відповідно CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, де: - CDR-H1 включає послідовність SEQ ID № 42, 44 або 48, або послідовність, щонайменше на 80 % ідентичну після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 42, 44 або 48; - CDR-H2 включає послідовність SEQ ID № 5 або 49, або послідовність, щонайменше на 8 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 80 % ідентичну після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 5 або 49; і - CDR-H3 включає послідовність SEQ ID № 45 або 43, або послідовність, щонайменше на 80 % ідентичну після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 45 або 43. Відповідно до окремого варіанта втілення антитіла або одна з їх похідних сполук або функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають важкий ланцюг, який включає CDR-H1 послідовності SEQ ID № 44, CDR-H2 послідовності SEQ ID № 5 і CDR-H3 послідовності SEQ ID № 45. Відповідно до іншого окремого варіанта втілення антитіла або одна з їх похідних сполук або функціональних фрагментів характеризуються тим, що вони включають важкий ланцюг, який включає CDR-H1 послідовності SEQ ID № 48, CDR-H2 послідовності SEQ ID № 49 і CDR-H3 послідовності SEQ ID № 43. У даному описі терміни "поліпептиди", "поліпептидні послідовності", "пептиди" і "білки", застосовувані до сполук, антитіл або їх послідовностей, є взаємозамінними. Тут слід розуміти, що винахід не відноситься до антитіл у природній формі, тобто вони взяті не з їх природного середовища, але вони виділені або отримані шляхом очищення із природних джерел, або отримані шляхом генетичної рекомбінації, або шляхом хімічного синтезу, і, таким чином, вони можуть включати неприродні амінокислоти, як буде описано нижче. У першому втіленні ділянка, що визначає комплементарність, або CDR, позначає гіперваріабельні ділянки важких і легких ланцюгів імуноглобулінів відповідно до визначення th Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5 Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, і пізніші видання). Існує три CDR важкого ланцюга й три CDR легкого ланцюга. Термін "CDR" у однині або множині застосовується тут для позначення, залежно від випадку, однієї, або більшої кількості, або навіть усіх цих ділянок, які включають більшість амінокислотних залишків, відповідальних за афінне зв'язування антитіла з антигеном або епітопом, який воно розпізнає. У другому втіленні, під CDR-ділянками, або CDR, розуміються гіперваріабельні ділянки важких і легких ланцюгів імуноглобулінів відповідно до визначення IMGT. Унікальна нумерація IMGT була створена для порівняння варіабельних доменів незалежно від антигенного рецептора, типу ланцюга або виду [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. В унікальній нумерації IMGT консервативні амінокислоти завжди займають ту саму позицію, наприклад, цистеїн 23 (1-CYS), триптофан 41 (CONSERVED-TRP), гідрофобна амінокислота 89, цистеїн 104 (2-CYS), фенілаланін або триптофан 118 (J-PHE або J-TRP). Унікальна нумерація IMGT передбачає стандартизоване розмежування каркасних ділянок (FR1IMGT: позиції 1-26, FR2-IMGT: 39-55, FR3-IMGT: 66-104 і FR4-IMGT: 118-128) і ділянок, що визначають комплементарність: CDR1-IMGT: 27-38, CDR2-IMGT: 56-65 і CDR3-IMGT: 105-117. Т.к. розриви є незайнятими позиціями, то довжини CDR-IMGT (показані в дужках і розділені крапками, наприклад, [8.8.13]) стають важливою інформацією. Унікальна нумерація IMGT використовується в 2D-графічному відображенні, позначеному як IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], і в 3D-структурах в IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]. Існує три CDR важкого ланцюга й три CDR легкого ланцюга. Термін "CDR" у однині або множині використовується тут для позначення, залежно від випадку, однієї або декількох цих ділянок, або навіть усіх цих ділянок, які включають більшість амінокислотних залишків, відповідальних за афінне зв'язування антитіла з антигеном або епітопом, який воно розпізнає. Для більшої ясності необхідно розуміти, що в подальшому описі, і зокрема в таблицях 2 і 3, CDR будуть визначені відповідно до нумерації IMGT, нумерацією Кабата й загальною нумерацією. Загальна нумерація об'єднує залишкові частини кожного CDR, які є спільними для CDR, визначеного відповідно до систем нумерації IMGT і Кабата. Система нумерації IMGT визначає CDR відповідно до IMGT-системи, як визначено вище, у той час як система нумерації Кабата визначає CDR відповідно до системи Кабата, як визначено вище. Зокрема, CDR-L1 включає SEQ ID № 1 (QSLYNSRTRKNY) у загальній системі нумерації та системі нумерації IMGT і SEQ ID № 9 (KSSQSLYNSRTRKNYLA) у системі нумерації Кабата. Що стосується CDR-L2, він включає SEQ ID № 2 (WAS) у загальній системі нумерації та системі нумерації IMGT і SEQ ID № 10 (WASTRES) у системі нумерації Кабата. CDR-L3 включає SEQ ID № 3 (KQSYNLRT) у кожній з трьох систем нумерації. 9 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У важкому ланцюзі, CDR-H1 включає SEQ ID № 4 (TDYY) у загальній системі нумерації, SEQ ID № 7 (GFTFTDYY) у системі нумерації IMGT і SEQ ID № 11 (TDYYMS) у системі нумерації Кабата. CDR-H2 включає SEQ ID № 5 (IRNKANGYTT) у загальній системі нумерації та системі нумерації IMGT і SEQ ID № 12 (FIRNKANGYTTEYSASVKG) у системі нумерації Кабата. Нарешті, CDR-H3 включає SEQ ID № 6 (DIPGFAY) у загальній системі нумерації та системі нумерації Кабата, у той час як у системі нумерації IMGT він включає SEQ ID № 8 (ARDIPGFAY). Зокрема, CDR-L1 включає SEQ ID № 40 (QSLFNSRTRKNY) у загальній системі нумерації та системі нумерації IMGT, і SEQ ID № 46 (KSSQSLFNSRTRKNYLA) у системі нумерації Кабата. Що стосується CDR-L2, він включає SEQ ID № 2 (WAS) у загальній системі нумерації та системі нумерації IMGT, і SEQ ID № 47 (WASARDS) у системі нумерації Кабата. CDR-L3 включає SEQ ID № 41 (MQSFNLRT) у кожній з трьох систем нумерації. У важкому ланцюзі, CDR-H1 включає SEQ ID № 42 (DNY) у загальній системі нумерації, SEQ ID № 44 (GFTFTDNY) у системі нумерації IMGT і SEQ ID № 48 (DNYMS) у системі нумерації Кабата. CDR-H2 включає SEQ ID № 5 (IRNKANGYTT) у загальній системі нумерації й системі нумерації IMGT, та SEQ ID № 49 (FIRNKANGYTTDYSASVRG) у системі нумерації Кабата. Нарешті, CDR-H3 включає SEQ ID № 43 (DVGSNYFDY) у загальній системі нумерації та системі нумерації Кабата, у той час як у системі нумерації IMGT він включає SEQ ID № 45 (ARDVGSNYFDY). У контексті даного винаходу "відсоток ідентичності" двох нуклеїновокислотних або амінокислотних послідовностей позначає відсоток ідентичних нуклеотидів або амінокислотних залишків у двох порівнюваних послідовностях, отриманий після оптимального вирівнювання; цей відсоток не є чисто статистичним, і відмінності між двома послідовностями розподіляються випадково по всій їх довжині. Порівняння двох нуклеїновокислотних або амінокислотних послідовностей традиційно проводиться шляхом порівняння цих послідовностей після вирівнювання їх в оптимальний спосіб; зазначене порівняння може здійснюватися по сегментах або за допомогою "вікна порівняння". Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння може бути здійснене, на додаток до ручного, за допомогою алгоритму локальної гомології Сміта-Уотермана (1981) [Ad. App. Math. 2:482], за допомогою алгоритму локальної гомології Нідлмана-Вунша (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443], за допомогою способу пошуку подібності Пірсона й Ліпмана (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444), або за допомогою комп'ютерного програмного забезпечення з використанням цих алгоритмів (GAP, BESTFIT, FASTA і TFASTA у пакеті програмного забезпечення Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, або за допомогою програмного забезпечення для порівняння BLAST N або BLAST P). Відсоток ідентичності двох нуклеїновокислотних або амінокислотних послідовностей визначають шляхом порівняння двох послідовностей, вирівняних в оптимальний спосіб, при цьому порівнювана нуклеїновокислотна або амінокислотна послідовність може включати додання або делеції в порівнянні з референсною послідовністю, для оптимального вирівнювання цих двох послідовностей. Відсоток ідентичності розраховується шляхом визначення числа позицій, у яких нуклеотид або амінокислотний залишок ідентичний у двох послідовностях, краще, у двох повних послідовностях, ділення цієї кількості ідентичних позицій на загальну кількість позицій у вікні вирівнювання, та множення отриманого результату на 100, щоб отримати відсоток ідентичності цих двох послідовностей. Наприклад, програма BLAST "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al, "Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol, 1999, Lett. 174:247-250), доступна на сайті http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, може бути використана зі стандартними параметрами (зокрема, з параметрами "штраф за відкриття делеції": 5 і "штраф за подовження делеції": 2; вибраною матрицею буде, наприклад, матриця "BLOSUM 62", запропонована у програмі); відсоткова ідентичність двох порівнюваних послідовностей розраховується безпосередньо в програмі. Серед амінокислотних послідовностей, які мають щонайменше 80 %, краще, 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичність з референсною амінокислотною послідовністю, кращими прикладами є ті, що включають референсну послідовність, певні модифікації, зокрема делецію, додання або заміну щонайменше однієї амінокислоти, усікання або подовження. У випадку заміни однієї або більш послідовних або непослідовних амінокислот кращими є такі заміни, у яких замінені амінокислоти є заміненими "еквівалентними" амінокислотами. Вислів "еквівалентні амінокислоти" використовується тут для позначення будь-якої амінокислоти, яка може бути замінена однією зі структурних амінокислот, але без значної модифікації біологічних 10 UA 102867 C2 5 активностей відповідних антитіл і таких специфічних прикладів, які будуть визначені пізніше. Еквівалентні амінокислоти можуть бути визначені або на підставі їх структурної гомології з амінокислотами, які вони заміняють, або за результатами порівняльних досліджень біологічної активності різних антитіл, на яку вони здатні. Як необмежуючий приклад, наведена нижче таблиця 1 показує заміни, допустимі без отримання значної модифікації біологічної активності відповідного модифікованого антитіла; зворотні заміни, зрозуміло, також допустимі за тих же умов. Таблиця 1 Вихідний залишок Ala (A) Arg (R) Asn (N) Asp (D) Cys (C) Gln (Q) Glu (G) Gly (G) His (H) Ile (I) Leu (L) Lys (K) Met (M) Phe (F) Pro (P) Ser (S) Thr (T) Trp (W) Tyr (Y) Val (V) 10 15 20 25 30 35 Заміна(и) Val, Gly, Pro Lys, His Gln Glu Ser Asn Asp Ala Arg Leu Ile, Val, Met Arg Leu Tyr Ala Thr, Cys Ser Tyr Phe, Trp Leu, Ala Фахівцям у даній галузі відомо, що на нинішньому рівні техніки найбільша варіабельність (довжини й складу) серед шести CDR є у трьох CDR важкого ланцюга, і, зокрема, у CDR-H3 цього важкого ланцюга. Отже, буде очевидно, що кращими характерними CDR антитіл за винаходом або однієї з їх похідних сполук або функціональних фрагментів будуть три CDR важкого ланцюга, тобто для 414H5 CDR - кодовані послідовностями SEQ ID №№ 7, 5, 8 і 11, 12, 6, визначеними згыдно з IMGT і Кабат, відповідно, а для 515H7 CDR - кодовані послідовностями SEQ ID №№ 44, 5, 45 і 48, 49, 43, визначеними згыдно з IMGT і Кабат, відповідно. Ще кращий CDR, що відповідає CDR-H3, э кодованим послідовністю SEQ ID № 8 або 6 для 414H5 і 45 або 43 для 515H7. У конкретному втіленні даний винахід відноситься до мишачого антитіла або його похідних сполук або функціональних фрагментів. Інше втілення винаходу розкриває антитіло або його похідні сполуки або функціональні фрагменти, що включають легкий ланцюг із трьома такими CDR: CDR-L1 послідовності SEQ ID № 1 або послідовності, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичної після оптимальної відповідності послідовності SEQ ID № 1; CDR-L2 послідовності SEQ ID № 2 або послідовності, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичної після оптимальної відповідності послідовності SEQ ID № 2; і CDR-L3 послідовності SEQ ID № 3 або послідовності, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичної після оптимальної відповідності послідовності SEQ ID № 3; і важкий ланцюг із трьома такими CDR: CDR-H1 послідовності SEQ ID № 4 або послідовності, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичної після оптимальної відповідності послідовності SEQ ID № 4; CDR-H2 послідовності SEQ ID № 5 або послідовності, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичної після оптимальної відповідності послідовності SEQ ID № 5; і CDR-H3 послідовності SEQ ID № 6 або послідовності, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичної після оптимальної відповідності послідовності SEQ ID № 6. Ще одне втілення винаходу розкриває антитіло або його похідну сполуку або 11 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 функціональний фрагмент, що включає легкий ланцюг із трьома такими CDR: - CDR-L1 послідовності SEQ ID № 1 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимальної відповідності послідовності SEQ ID № 1; - CDR-L2 послідовності SEQ ID № 2 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимальної відповідності послідовності SEQ ID № 2; і - CDR-L3 послідовності SEQ ID № 3 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимальної відповідності послідовності SEQ ID № 3; і важкий ланцюг із трьома такими CDR: - CDR-H1 послідовності SEQ ID № 7 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимальної відповідності послідовності SEQ ID № 7; - CDR-H2 послідовності SEQ ID № 5 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимальної відповідності послідовності SEQ ID № 5; і - CDR-H3 послідовності SEQ ID № 8 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимальної відповідності послідовності SEQ ID № 8. Ще одне втілення винаходу розкриває антитіло або його похідну сполуку або функціональний фрагмент, що включає легкий ланцюг із трьома такими CDR: - CDR-L1 послідовності SEQ ID № 9 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимальної відповідності послідовності SEQ ID № 9; - CDR-L2 послідовності SEQ ID № 10 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимальної відповідності послідовності SEQ ID № 10; і - CDR-L3 послідовності SEQ ID № 3 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимальної відповідності послідовності SEQ ID № 3; і важкий ланцюг із трьома такими CDR: - CDR-H1 послідовності SEQ ID № 11 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимальної відповідності послідовності SEQ ID № 11; - CDR-H2 послідовності SEQ ID № 12 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимальної відповідності послідовності SEQ ID № 12; і - CDR-H3 послідовності SEQ ID № 6 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимальної відповідності послідовності SEQ ID № 6. Антитіло або його похідна сполука або функціональний фрагмент відповідно до винаходу характеризується тим, що включає: - легкий ланцюг, що включає CDR-L1 послідовності SEQ ID № 1, CDR-L2 послідовності SEQ ID № 2 і CDR-L3 послідовності SEQ ID № 3; і - важкий ланцюг, що включає CDR-H1 послідовності SEQ ID № 7, CDR-H2 послідовності SEQ ID № 5 і CDR-H3 послідовності SEQ ID № 8. В іншому втіленні антитіло або його похідна сполука або функціональний фрагмент відповідно до винаходу характеризується тим, що включає: - легкий ланцюг, що включає CDR-L1 послідовності SEQ ID № 9, CDR-L2 послідовності SEQ ID № 10 і CDR-L3 послідовності SEQ ID № 3; і - важкий ланцюг, що включає CDR-H1 послідовності SEQ ID № 11, CDR-H2 послідовності SEQ ID № 12 і CDR-H3 послідовності SEQ ID № 6. Відповідно до ще одного втілення антитіло за винаходом або його похідні сполуки або функціональні фрагменти характеризуються тим, що включають послідовність легкого ланцюга з амінокислотною послідовністю SEQ ID № 13 або послідовністю, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичною після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 13; і тим, що вони включають послідовність важкого ланцюга з амінокислотною послідовністю SEQ ID № 14 або послідовністю, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичною після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 14. Інше втілення винаходу розкриває антитіло або його похідні сполуки або функціональні фрагменти, що включають легкий ланцюг із трьома такими CDR: CDR-L1 послідовності SEQ ID № 40 або послідовності, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 40; CDR-L2 послідовності SEQ ID № 2 або послідовності, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 2; і CDR-L3 послідовності SEQ ID № 41 або послідовності, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 41; і важкий ланцюг із трьома такими CDR: 12 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CDR-H1 послідовності SEQ ID № 42 або послідовності, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 42; CDR-H2 послідовності SEQ ID № 5 або послідовності, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 5; і CDR-H3 послідовності SEQ ID № 43 або послідовності, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 43. Ще одне втілення винаходу розкриває антитіло або його похідну сполуку або функціональний фрагмент, що включає легкий ланцюг із трьома такими CDR: - CDR-L1 послідовності SEQ ID № 40 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 40; - CDR-L2 послідовності SEQ ID № 2 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 2; і - CDR-L3 послідовності SEQ ID № 41 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 41; і важкий ланцюг із трьома такими CDR: - CDR-H1 послідовності SEQ ID № 44 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 44; - CDR-H2 послідовності SEQ ID № 5 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 5; і - CDR-H3 послідовності SEQ ID № 45 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 45. Ще одне втілення винаходу розкриває антитіло або його похідну сполуку або функціональний фрагмент, що включає легкий ланцюг із трьома такими CDR: - CDR-L1 послідовності SEQ ID № 46 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 46; - CDR-L2 послідовності SEQ ID № 47 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 47; і - CDR-L3 послідовності SEQ ID № 41 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 41; і важкий ланцюг із трьома такими CDR: - CDR-H1 послідовності SEQ ID № 48 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 48; - CDR-H2 послідовності SEQ ID № 49 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 49; і - CDR-H3 послідовності SEQ ID № 43 або послідовності, щонайменше на 80 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 43. Антитіло або його похідна сполука або функціональний фрагмент відповідно до винаходу характеризується тим, що включає: - легкий ланцюг, що включає CDR-L1 послідовності SEQ ID № 40, CDR-L2 послідовності SEQ ID № 2 і CDR-L3 послідовності SEQ ID № 41; і - важкий ланцюг, що включає CDR-H1 послідовності SEQ ID № 44, CDR-H2 послідовності SEQ ID № 5 і CDR-H3 послідовності SEQ ID № 45. В іншому втіленні антитіло або його похідна сполука або функціональний фрагмент відповідно до винаходу характеризується тим, що включає: - легкий ланцюг, що включає CDR-L1 послідовності SEQ ID № 46, CDR-L2 послідовності SEQ ID № 47 і CDR-L3 послідовності SEQ ID № 41; і - важкий ланцюг, що включає CDR-H1 послідовності SEQ ID № 48, CDR-H2 послідовності SEQ ID № 49 і CDR-H3 послідовності SEQ ID № 43. Відповідно до ще одного втілення, антитіло за винаходом або його похідні сполуки або функціональні фрагменти характеризуються тим, що вони включають послідовність легкого ланцюга з амінокислотною послідовністю SEQ ID № 50 або послідовністю, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичною після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 50; і тим, що вони включають послідовність важкого ланцюга з амінокислотною послідовністю SEQ ID № 51 або послідовністю, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичною після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 51. Як було сказано вище, винахід також відноситься до будь-якої сполуки, отриманої з 13 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіла, описаного у винаході. Зокрема, антитіло за винаходом або його похідні сполуки або функціональні фрагменти характеризуються тим, що зазначені похідні сполуки складаються із зв'язувального білка, що включає пептидну матрицю, до якої прищеплений щонайменше один CDR для збереження цілком або частково властивостей паратопа вихідного антитіла з розпізнавання. На різних імуноглобулінових білкових матрицях може бути присутня одна або більше послідовностей з числа шести CDR-послідовностей, описаних у даному винаході. У цьому випадку білкова матриця уможливлює відтворення білкового кістяка з відповідним згортанням привитих CDR, тим самим дозволяючи їх паратопу зберігати властивості з розпізнавання антигену. Як правило, фахівцям у даній галузі відомо, як вибирати тип білкової матриці, до якої можна прищепити щонайменше один CDR, узятий з вихідного антитіла. Зокрема, відомо, що такі матриці, щоб бути вибраними, повинні відповідати максимальній кількості з таких критеріїв (Skerra A., J. Mol. Recogn., 13, 2000, 167-187): - філогенетично добра збережність; - відома тривимірна структура (наприклад, за допомогою кристалографії або ЯМРспектроскопії або будь-яких інших методик, відомих фахівцям у даній галузі); - малий розмір; - відсутність або наявність тільки у малій кількості посттрансляційних модифікацій; та/або - легкість продукування, експресії та очищення. Така білкова матриця може бути структурою, вибраною з: фібронектину, й краще, десятого домену фібронектину III типу, ліпокаліну, антикаліну (Skerra A., J. Biotechnol., 2001, 74(4):25775), білка Z, отриманого з домену B білка А Staphylococcus aureus, тіоредоксину A, або білків з повторюваним мотивом, таким як "анкіриновий повтор" (Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705), "повтор Армаділа", "повтор, багатий лейцином" або "тетратрикопептидний повтор", але без обмеження ними. Також можна згадати матриці, отримані з токсинів, таких як, наприклад, токсини скорпіонів, комах, рослин, молюсків і т.д., або білкових інгібіторів нейронної сінтази оксиду азоту (PIN). Як необмежуючий приклад таких гібридних конструкцій можна зазначити вставку CDR-H1 (важкий ланцюг) анти-CD4-антитіла, а саме антитіла 13B8.2, в одну з петель PIN; зв'язувальні властивості отриманого в такий спосіб нового зв'язувального білка залишаються схожими зі зв'язувальними властивостями вихідного антитіла (Bes et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006, 343(1), 334-344). Виключно для ілюстрації можна також згадати щеплення CDR-H3 (важкий ланцюг) анти-лізоцим-VHH антитіла у петлю неокарциностатину (Nicaise et al., Protein Science, 2004, 13(7):1882-1891). Нарешті, як згадувалося вище, такі пептидні матриці можуть включати від одного до шести CDR з вихідного антитіла. Краще, але без будь-яких обмежень, фахівець у даній галузі може вибрати щонайменше один CDR з важкого ланцюга, що, як відомо, є головним чином відповідальною за специфічність антитіла. Вибір одного або декількох релевантних CDR буде очевидним для фахівця в даній галузі, який також вибере придатну з відомих методик (Bes et al., FEBS letters 508, 2001, 67-74). Специфічний аспект даного винаходу відноситься до способу вибирання сполуки, отриманої з антитіла відповідно до винаходу, де зазначена похідна сполука здатна інгібувати in vitro та/або in vivo ріст пухлинних клітин, і де зазначена похідна сполука включає пептидну матрицю, до якої прищеплений щонайменше один CDR антитіла, який характеризується тим, що він (спосіб) включає такі етапи: а) контактування in vitro сполуки, що складається з пептидної матриці, до якої прищеплений щонайменше один CDR антитіла, з біологічним зразком, що містить пухлинні клітини, здатні до росту в умовах, що дозволяють цим клітинам рости; і б) вибір зазначеної сполуки, якщо зазначена сполука здатна інгібувати ріст цих пухлинних клітин, і характеризується тим, що щонайменше один щеплений CDR вибраний з таких CDR: - CDR послідовності SEQ ID № 1, 9, 40, 46 або послідовності, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 1, 9, 40, 46; - CDR послідовності SEQ ID № 2, 10, 47 або послідовності, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 2, 10, 47; - CDR послідовності SEQ ID № 3, 41 або послідовності, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 3, 14 UA 102867 C2 41; 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - CDR послідовності SEQ ID № 4, 7, 11, 42, 44, 48 або послідовності, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 4, 7, 11, 42, 44, 48; - CDR послідовності SEQ ID № 5, 12, 49 або послідовності, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 5, 12, 49; і - CDR послідовності SEQ ID № 6, 8, 43, 45 або послідовності, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 % ідентичної після оптимального вирівнювання послідовності SEQ ID № 6, 8, 43, 45. Відповідно до кращого режиму спосіб може включати на етапі а) контактування in vitro сполуки, що включає пептидну матрицю, до якої прищеплено щонайменше два або три CDR антитіла. Відповідно до ще кращого режиму цього способу, пептидну матрицю вибирають поміж матриць або зв'язувальних білків, структури яких були згадані вище. Очевидно, що ці приклади ніякою мірою не є обмежуючими, і будь-які інші структури, відомі або очевидні фахівцям у даній галузі, слід розглядати як такі, що перебувають під захистом, надаваним даною патентною заявкою. Даний винахід також відноситься до антитіла або його похідних сполук або функціональних фрагментів, що характеризуються тим, що пептидна матриця вибрана з білків, які мають а) філогенетично добру збережність, б) надійну архітектуру, в) добре відому тривимірну організацію, г) малий розмір та/або д) включають області, які можна модифікувати шляхом делеції та/або вставки без модифікації властивостей стабільності. Відповідно до кращого втілення, антитіло за винаходом або його похідні сполуки або функціональні фрагменти характеризуються тим, що зазначена пептидна матриця вибрана з i) матриць, отриманих з фібронектину, краще, – з десятого домену фібронектину III типу, ліпокаліну, антикаліну, білка Z, отриманого з домену B білка А Staphylococcus aureus, тіоредоксину A або білків з повторюваним мотивом, таким як "анкіріновий повтор" (Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705), "повтор Армаділа", "повтор, багатий лейцином" і "тетратрикопептидний повтор", або iii) білкових інгібіторів нейронної синтази оксиду азоту (PIN). Інший аспект винаходу відноситься до функціональних фрагментів антитіла, описаних вище. Конкретніше, винахід націлений на антитіло або його похідні сполуки або функціональні фрагменти, які характеризуються тим, що зазначений функціональний фрагмент вибраний з фрагментів Fv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv, scFv-Fc, або димерних антитіл, або будь-яких фрагментів, час напівжиття яких був збільшений, наприклад, пегільованих фрагментів. Такі функціональні фрагменти антитіла відповідно до винаходу складаються, наприклад, з фрагментів Fv, scFv (sc позначає один ланцюг), Fab, F(ab') 2, Fab', scFv-Fc, або димерних антитіл або будь-яких фрагментів, час напівжиття яких був збільшений у результаті хімічної модифікації, такої як додавання поліалкіленгліколю, такого як поліетиленгліколь (пегілювання) (пегільовані фрагменти називаються Fv-ПЕГ, ScFv-ПЕГ, Fab-ПЕГ, F(ab') 2-ПЕГ або Fab'-ПЕГ), або шляхом включення в ліпосому; мікросферу або PLGA (частинки на основі співполімерів молочної та гліколевої кислот), при цьому зазначений фрагмент має щонайменше один характерний CDR за винаходом, який здатний проявляти в загальному виді навіть часткову активність антитіла, з якого він узятий. Краще, щоб зазначені функціональні фрагменти складалися з, або включали часткову послідовність варіабельного важкого або легкого ланцюга антитіла, з якого вони отримані, при цьому зазначена часткова послідовність повинна бути достатньою, щоб зберегти таку ж специфічність зв'язування, як у антитіла, з якого вона отримана, і достатню афінність, краще, дорівнюючу щонайменше 1/100, ще краще, - щонайменше 1/10 афінності антитіла, з якого вона отримана. Такий функціональний фрагмент буде включати як мінімум 5 амінокислот, а краще, 6, 7, 8, 10, 15, 25, 50 або 100 послідовних амінокислот послідовності антитіла, з якого він отриманий. Краще, щоб цими функціональними фрагментами були фрагменти типу Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc або димерні антитіла, які в цілому мають таку ж специфічність зв'язування, як і антитіло, з якого вони отримані. Відповідно до даного винаходу, фрагменти антитіла за винаходом можуть бути отримані з антитіл описаними вище способами, такими як розщеплення ферментами, такими як пепсин або папаїн, та/або розщеплення дисульфідних містків шляхом хімічного відновлення. Фрагменти антитіла також можуть бути отримані за допомогою методик генетичної рекомбінації, також відомих фахівцям у даній галузі, або шляхом пептидного синтезу, наприклад, за допомогою автоматичних пептидних синтезаторів які, 15 UA 102867 C2 наприклад, поставляються компанією Applied Biosystems і т.д. Для більшої ясності в таблиці 2 нижче наведені різні амінокислотні послідовності, що відповідають антитілу за винаходом. Таблиця 2 (де м = мишаче та х = химерне) Антитіло Нумерація CDR Загальна IMGT 414H5 Кабата Важкий ланцюг Легкий ланцюг CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 М. варіабельний домен М. варіабельний домен Х. варіабельний домен Х. варіабельний домен Загальна IMGT 515H7 Кабата CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 М. варіабельний домен М. варіабельний домен Х. варіабельний домен Х. варіабельний домен SEQ ID № 1 2 3 4 5 6 1 2 3 7 5 8 9 10 3 11 12 6 13 14 64 65 40 2 41 42 5 43 40 2 41 44 5 45 46 47 41 48 49 43 50 51 66 67 5 Інший конкретний аспект даного винаходу відноситься до химерного антитіла або його похідних сполук або функціональних фрагментів, які характеризуються тим, що зазначене антитіло також включає константні ділянки легкого ланцюга й важкого ланцюга, отримані з антитіла видів, гетерологічних миші, зокрема, людини. 16 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ще один конкретний аспект даного винаходу відноситься до гуманізованого антитіла або його похідних сполук або функціональних фрагментів, які характеризуються тим, що константні ділянки легкого ланцюга й важкого ланцюга, отримані з людського антитіла, є відповідно ділянками лямбда або каппа та ділянками гамма-1, гамма-2 або гамма-4. Відповідно до іншого аспекту, винахід відноситься до мишачої гібридоми, здатної секретувати моноклональне антитіло відповідно до винаходу, зокрема, до гібридоми мишачого походження, зареєстрованої у Французькій колекції культур мікроорганізмів (CNCM, Інститут Пастера, Париж, Франція) 22 жовтня 2007 за номером I-3860. Зазначена гібридома була отримана шляхом злиття спленоцитів імунізованих мишей BALB/c і клітин мієломної лінії Sp 2/O-Ag 14. Моноклональне антитіло, позначуване в даному документі як 414H5, або його похідні сполуки або функціональні фрагменти, які характеризуються тим, що зазначене антитіло секретується гібридомою, зареєстрованою в CNCM 22 жовтня 2007 року за номером I-3860, очевидно, є частиною даного винаходу. Відповідно до іншого аспекту, винахід відноситься до мишачої гібридоми, здатної секретувати моноклональне антитіло відповідно до винаходу, зокрема до гібридоми мишачого походження, зареєстрованої у Французькій колекції культур мікроорганізмів (CNCM, Інститут Пастера, Париж, Франція) 25 червня 2008 за номером I-4019. Зазначена гібридома була отримана шляхом злиття спленоцитів імунізованих мишей BALB/c і клітин мієломної лінії Sp 2/O-Ag 14. Моноклональне антитіло, позначуване в даному документі як 515H7, або його похідні сполуки або функціональні фрагменти, які характеризуються тим, що зазначене антитіло секретується гібридомою, зареєстрованою в CNCM 25 червня 2008 року за номером I-4019, очевидно, є частиною даного винаходу. Антитіло за винаходом також включає химерні або гуманізовані антитіла. Химерне антитіло є антитілом, яке включає природну варіабельну ділянку (легкого ланцюга й важкого ланцюга), отриману з антитіла даного виду, у поєднанні з константними ділянками легкого ланцюга й важкого ланцюга антитіла виду, гетерологічного зазначеному даному виду. Антитіла або їх химерні фрагменти можуть бути отримані за допомогою методик генетичної рекомбінації. Наприклад, химерне антитіло може бути отримане шляхом клонування рекомбінантної ДНК, що включає промотор і послідовність, що кодує варіабельну ділянку нелюдського, особливо мишачого, моноклонального антитіла відповідно до винаходу, і послідовність, що кодує константну ділянку людського антитіла. Химерне антитіло відповідно до винаходу, закодоване таким рекомбінантним геном, буде, наприклад, химерою миші й людини, при цьому специфічність цього антитіла буде визначатися варіабельною ділянкою, отриманою з мишачої ДНК, а його ізотип буде визначатися константною ділянкою, отриманою з людської ДНК. Для способів отримання химерних антитіл можна, наприклад, послатися на Verhoeyn et al. (Bioessays, 8:74, 1988). В іншому аспекті винахід описує антитіло або його похідну сполуку або функціональний фрагмент, що складається з химерного антитіла. В окремому кращому втіленні химерне антитіло або його похідна сполука або функціональний фрагмент відповідно до винаходу включає послідовність легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID № 64, та послідовність важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID № 65. В іншому кращому втіленні химерне антитіло або його похідна сполука або функціональний фрагмент відповідно до винаходу включає послідовність легкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID № 66, і послідовність важкого ланцюга, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID № 67. Під "гуманізованими антитілами" розуміються антитіла, які включають CDR-ділянки, отримані з антитіла нелюдського походження, при цьому інші частини молекули антитіла отримані з одного (або декількох) людських антитіл. Крім того, деякі залишки сегментів кістяка (називані FR, каркасні ділянки) можуть бути змінені з метою збереження афінності зв'язування (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988). Гуманізовані антитіла за винаходом або їх фрагменти можуть бути отримані за допомогою методик, відомих фахівцям у даній галузі (наприклад, таких, які описані в документах Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992; і Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992). Такі гуманізовані антитіла є кращими для їх застосування у способах, використовуваних у діагностиці in vitro або профілактиці, та/або терапевтичному лікуванні in vivo. Іншою методикою гуманізації, також відомою фахівцям у даній 17 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 галузі, є, наприклад, методика "CDR-щеплення", описана PDL у патентах EP 0451261, EP 0682040, EP 09127, EP 0566647 або US 5530101, US 6180370, US 5585089 і US 5693761. Також можна зазначити патенти США 5639641 або 6054297, 5886152 і 5877293. Крім того, винахід також відноситься до гуманізованих антитіл, отриманих з мишачих антитіл, описаних вище. У кращому варіанті константні ділянки легких ланцюгів і важких ланцюгів, отримані з людського антитіла, є відповідно ділянками лямбда або каппа та ділянками гамма-1, гамма-2 або гамма-4. У втіленні, що відповідає IgG1 ізотипу IgG1, додаткові характеристики антитіла включають ефекторні функції, такі як антитіло-залежну клітинну цитотоксичність (antibody-dependent cellmediated cytotoxicity, ADCC); та/або комплемент-залежну цитотоксичність (complement dependent cytotoxicity, CDC). Новий аспект даного винаходу відноситься до ізольованої нуклеїнової кислоти, яка характеризується тим, що вона вибрана з таких нуклеїнових кислот (включаючи будь-який вироджений генетичний код): - нуклеїнової кислоти, ДНК або РНК, що кодує антитіло або його похідну сполуку або функціональний фрагмент відповідно до винаходу; - нуклеїнової кислоти, комплементарної нуклеїновій кислоті, визначеній в а); - нуклеїнової кислоти з не менш ніж 18 нуклеотидів, здатної до гібридизації за умов високої жорсткості щонайменше з одним CDR нуклеїновокислотних послідовностей SEQ ID №№ 15-26 або SEQ ID №№ 52-61 або послідовностей, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 %, ідентичних після оптимального вирівнювання, послідовностям SEQ ID №№ 15-26 або SEQ ID №№ 52-61; і - нуклеїнової кислоти з не менш ніж 18 нуклеотидів, здатної до гібридизації за умов високої жорсткості щонайменше з легким ланцюгом нуклеїновокислотної послідовності SEQ ID № 27 або SEQ ID № 62 або SEQ ID № 68 або 70, та/або важким ланцюгом нуклеїновокислотної послідовності SEQ ID № 28 або SEQ ID № 63 або SEQ ID № 69 або 71 або послідовностей, щонайменше на 80 %, а краще, на 85 %, 90 %, 95 % і 98 %, ідентичних після оптимального вирівнювання, послідовностям SEQ ID №№ 27 та/або 28 або SEQ ID № 62 та/або 63 або SEQ ID №№ 68 та/або 69 або SEQ ID №№ 70 та/або 71. У таблиці 3 наведені різні нуклеотидні послідовності, що відносяться до антитіла за винаходом. 18 UA 102867 C2 Таблиця 3 Антитіло Нумерація CDR Загальна IMGT 414H5 Кабата Важкий ланцюг Легкий ланцюг CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 М. варіабельний домен М. варіабельний домен Х. варіабельний домен Х. варіабельний домен Загальна IMGT 515H7 Кабата CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 М. варіабельний домен М. варіабельний домен Х. варіабельний домен Х. варіабельний домен 5 10 SEQ ID № 15 16 17 18 19 20 15 16 17 21 19 22 23 24 17 25 26 20 27 28 68 69 52 16 53 54 19 55 52 16 53 56 19 57 58 59 53 60 61 55 62 63 70 71 Терміни "нуклеїнова кислота", "нуклеїнова послідовність" або "нуклеїновокислотна послідовність", "полінуклеотид", "олігонуклеотид", "полінуклеотидна послідовність" і "нуклеотидна послідовність", які використовуються рівнозначно в даному описі, позначають чітку послідовність нуклеотидів, модифікованих або не модифікованих, що визначає фрагмент або ділянку нуклеїнової кислоти, яка включає або не включає неприродні нуклеотиди, і яка є або дволанцюговою ДНК, або одноланцюговою ДНК, або продуктами транскрипції зазначених ДНК. Тут також слід згадати, що даний винахід не відноситься до нуклеотидних послідовностей в їх природному хромосомному середовищі, тобто у природному стані. Послідовності за даним 19 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходом були виділені та/або очищені, тобто були взяті прямо чи опосередковано, наприклад, - шляхом копіювання, при цьому їх середовище було щонайменше частково модифіковане. Таким чином, тут також слід розуміти ізольовані нуклеїнові кислоти, отримані шляхом генетичної рекомбінації, наприклад, - за допомогою приймаючих клітин (клітин-хазяїв), або отримані шляхом хімічного синтезу. Під "нуклеїновими послідовностями, що демонструють відсоток ідентичності щонайменше 80 %, краще, 85 %, 90 %, 95 % і 98 %, після оптимального вирівнювання із кращою послідовністю" розуміють нуклеїнові послідовності, що демонструють у порівнянні з референсною нуклеотидною послідовністю певні модифікації, такі як, зокрема, делецію, усікання, подовження, химерне злиття та/або заміщення, зокрема, точкове. Краще, коли це послідовності, які кодують ті ж самі амінокислотні послідовності, що й референсна послідовність, та пов'язані з виродженням генетичного коду, або комплементарні послідовності, які можуть специфічно гібридизуватися з референсними послідовностями, краще, за умов високої жорсткості, зокрема таких, які визначені нижче. Гібридизація за умов високої жорсткості означає, що температурні умови й умови іонної сили вибирають таким чином, щоб вони дозволяли зберігати гібридизацію двох комплементарних фрагментів ДНК. Винятково як приклад, умови високої жорсткості етапу гібридизації для визначення полінуклеотидних фрагментів, описаних вище, краще, є такими, як описано нижче. ДНК-ДНК- або ДНК-РНК-гібридизацію здійснюють у два етапи: (1) прегібридизація при 42 °C протягом трьох годин у фосфатному буфері (20 мМ, рН 7,5), що містить 5х SSC (цитратносольовий буфер) (1х SSC відповідає розчину 0,15 M NaCl+0,015 М цитрату натрію), 50 % формаміду, 7 % додецилсульфату натрію (SDS), 10х розчин Денхардта, 5 % сульфату декстрану й 1 % ДНК сперми лосося; (2) власне гібридизація протягом 20 годин при температурі залежно від довжини зонда (наприклад: 42 °C для зонда довжиною більше 100 нуклеотидів), а потім два 20-хвилинних промивання при температурі 20 °C у 2х SSC+2 % SDS, одне 20хвилинне промивання при 20 °C у 0,1х SSC+0,1 % SDS. Останнє промивання здійснюють в 0,1х SSC+0,1 % SDS протягом 30 хвилин при температурі 60 °C для зонда довжиною більше 100 нуклеотидів. Гібридизаційні умови високої жорсткості, описані вище для полінуклеотиду певного розміру, фахівець у даній галузі може адаптувати для олігонуклеотидів більшої або меншої довжини відповідно до процедур, описаних в Sambrook, et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition, 2001). Винахід також відноситься до вектора, що включає нуклеїнову кислоту, описану у винаході. Винахід особливо націлений на клонувальні та/або експресійні вектори, які включають таку нуклеотидну послідовність. Вектори за винаходом у кращому випадку включають елементи, які дозволяють експресувати та/або секретувати нуклеотидні послідовності в даній приймаючій клітині (клітиніхазяїні). Таким чином, вектор повинен включати промотор, сигнали ініціації й термінації трансляції, а також придатні ділянки регуляції транскрипції. Він повинен бути здатний підтримувати в стабільному стані приймаючу клітину (клітину-хазяїна), і додатково може мати специфічні сигнали, які обумовлюють секрецію трансльованого білка. Фахівці в даній галузі вибирають і оптимізують ці різні елементи відповідно до використовуваної приймаючої клітини. Із цією метою нуклеотидні послідовності можуть бути вставлені у вектори автономної реплікації у вибраному хазяїні, або можуть бути інтегративними векторами вибраного хазяїна. Такі вектори отримують за допомогою способів, що використовуються зараз фахівцями в даній галузі, і отримані клони можуть бути введені до придатного хазяїна за допомогою стандартних способів, таких як ліпофекція, електропорація, тепловий шок або хімічні способи. Вектори є, наприклад, векторами плазмідного або вірусного походження. Вони використовуються для трансформації приймаючих клітин (клітин-хазяїв), щоб клонувати або експресувати нуклеотидні послідовності винаходу. Винахід також включає приймаючі клітини, трансформовані за допомогою вектора, описаного в даному винаході, або такі, що містять його. Приймаюча клітина може бути вибрана з прокаріотичних або еукаріотичних систем, наприклад, бактеріальних клітин, а також дріжджових клітин або клітин тварин, зокрема клітин ссавців. Можна також використовувати клітини комах або рослин. Винахід також відноситься до тварин, за винятком людини, які включають щонайменше одну трансформовану клітину відповідно до винаходу. Інший аспект винаходу пов'язаний зі способом продукування антитіла відповідно до винаходу, або одного з його функціональних фрагментів, який характеризується тим, що включає такі етапи: 20 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 а) культивування приймаючої клітини відповідно до винаходу в середовищі у придатних культуральних умовах; і b) відновлення зазначеного антитіла або одного з його функціональних фрагментів, отриманих таким чином, з культурального середовища або зазначених культивованих клітин. Трансформовані клітини відповідно до винаходу можуть бути використані в способах отримання рекомбінантних поліпептидів відповідно до винаходу. Способи отримання поліпептиду відповідно до винаходу в рекомбінантній формі, що характеризуються використанням вектора та/або клітини, трансформованої вектором відповідно до винаходу, також входять до даного винаходу. Краще, коли клітину, трансформовану вектором відповідно до винаходу, культивують в умовах, що дозволяють експресувати зазначений поліпептид, і зазначений рекомбінантний пептид відновлюють. Як вже було сказано, приймаюча клітина (клітина-хазяїн) може бути вибрана з прокаріотичних або еукаріотичних систем. Зокрема, можна визначити нуклеотидні послідовності винаходу, що сприяють секреції в такій прокаріотичній або еукаріотичній системі. Вектор відповідно до винаходу, що несе таку послідовність, таким чином, може бути вигідно використаний для продукування рекомбінантних білків, призначених для секреції. Дійсно, очищенню цих цільових рекомбінантних білків буде сприяти той факт, що вони знаходяться у супернатанті клітинної культури, а не усередині приймаючих клітин. Також можна отримати поліпептиди за винаходом шляхом хімічного синтезу. Такий спосіб отримання також є предметом винаходу. Фахівцю в даній галузі відомі способи хімічного синтезу, наприклад, методики з використанням твердих фаз [див. Steward et al., 1984, Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed., (1984)] або методики з використанням частково твердих фаз, шляхом конденсації фрагментів або шляхом класичного синтезу в розчині. Поліпептиди, отримані шляхом хімічного синтезу й здатні містити відповідні неприродні амінокислоти, також входять до винаходу. Антитіла або їх похідні сполуки або функціональні фрагменти, які можуть бути отримані за допомогою способу за винаходом, також входять до даного винаходу. Відповідно до ще одного аспекту, даний винахід відноситься до антитіла, описаного вище, яке характеризується тим, що воно, крім того, є здатним специфічно зв'язуватися з рецептором сімейства людських хемокінів, та/або здатним специфічно інгібувати передачу сигналу від такого рецептора. Відповідно до нового втілення винахід відноситься до антитіла або його похідних сполук або функціональних фрагментів, що складаються з антитіла, яке є біспецифічним у тому розумінні, що воно включає другий мотив, здатний взаємодіяти з будь-яким рецептором, задіяним у розвитку пухлини, таким як, наприклад, VEGFR, VEGF, EGFR, IGF-1R, HER2neu, HGF, CMET, FGF, тетраспаніни, інтегрини, CXCR4 (крім антитіла за даним винаходом, тобто орієнтований на інший епітоп), CXCR7 або CXCR2. Біспецифічні або біфункціональні антитіла є другим поколінням моноклональних антитіл, у яких дві різні варіабельні ділянки об'єднані в одну молекулу (Hollinger and Bohlen, 1999, Cancer and metastasis, rev. 18:411-419). Як у діагностичній, так і в терапевтичній областях була продемонстрована їх корисність за рахунок їх здатності задіювати нові ефекторні функції або впливати на деякі молекули на поверхні пухлинних клітин; такі антитіла можуть бути отримані за допомогою хімічних способів (Glennie M.J. et al., 1987, J. Immunol. 139, 2367-2375; Repp R. et al., 1995, J. Hemat., 377-382) або соматичних способів (Staerz U.D. and Bevan M.J., 1986, PNAS 83, 1453-1457; Suresh M.R. et al., 1986, Method Enzymol., 121:210-228), а також, краще, за допомогою методик генної інженерії, які уможливлюють гетеродимеризацію, й тим самим полегшують очищення антитіла пошуку (Merchand et al., 1998, Nature Biotech., 16:677-681). Ці біспецифічні антитіла можуть бути побудовані як цілий IgG, біспецифічний Fab'2, Fab'ПЕГ, димер антитіла або біспецифічний scFv, а також як чотиривалентне біспецифічне антитіло, у якому присутні два сайти зв'язування для кожного цільового антигену (Park et al., 2000, Mol. Immunol., 37(18):1123-30) або його фрагментів, описаних вище. На додаток до економічних переваг, враховуючи, що виготовлення й уведення біспецифічного антитіла дешевше за виготовлення двох специфічних антитіл, застосування таких біспецифічних антитіл має перевагу в плані зниження токсичності лікування. Дійсно, застосування біспецифічного антитіла дозволяє зменшити загальну кількість циркулюючих антитіл і, таким чином, можливу токсичність. У кращому втіленні винаходу біспецифічне антитіло є двовалентним або чотиривалентним антитілом. Нарешті, даний винахід відноситься до описаного вище антитіла або його похідних сполук або функціональних фрагментів, для застосування їх як лікарського засобу. 21 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід також відноситься до фармацевтичної композиції, що включає як активний інгредієнт сполуку, яка містить антитіло за винаходом або одну з його похідних сполук або функціональних фрагментів. Краще, коли зазначене антитіло доставляється ексципієнтом та/або фармацевтично прийнятним носієм. Винахід також відноситься до композиції, яка характеризується тим, що вона, як комбінований продукт для одночасного, роздільного або розширеного застосування, включає крім того протипухлинне антитіло, відмінне від антитіла, спрямованого проти CXCR4. Відповідно до ще одного втілення, даний винахід також відноситься до описаної вище фармацевтичної композиції, яка включає щонайменше другу протипухлинну сполуку, вибрану зі сполук, здатних специфічно інгібувати тирозинкіназну активність рецепторів, таких як IGF-IR, EGFR, HER2/neu, cmet, VEGFR або VEGF, або будь-яких інших протипухлинних сполук, відомих фахівцям у даній галузі. У другому кращому аспекті винаходу зазначена друга сполука може бути вибрана з антиEGFR, антиIGF-IR, антиHER2/neu, антиcMET, VEGFR, VEGF і т.д., ізольованих, або функціональних фрагментів чи похідних сполук, здатних інгібувати проліферативну, та/або антиапоптотичну, та/або ангіогенну, та/або індукційну активність метастатичної дисемінації, яку підтримують зазначені рецептори. Також слід згадати антиCD20-антитіла, такі як ритуксимаб, ібритумомаб або тоситумомаб; антиCD33-антитіла, такі як гемтузумаб або лінтузумаб; антиCD22-антитіла, такі як епратузумаб; антиCD52-антитіла, такі як алемтузумаб; антиEpCAM-антитіла, такі як едреколомаб, Ch 17-1A 131 або IGN-101; антитіла антиCTP21 або 16, такі як Xactin; антиДНК-Ag-антитіла, такі як I-Cotara TNT-1; антиMUC1-антитіла, такі як пемтумомаб або R1150; антиMUC18-антитіла, такі як ABXMA1; антиGD3-антитіла, такі як мітумомаб; антиECA-антитіла, такі як CeaVac або лабетузумаб; антиCA125-антитіла, такі як OvaRex; антиHLA-DR-антитіла, такі як аполізумаб; антиCTLA4111 90 177 антитіла, такі як MDX-010; антиPSMA-антитіла, такі як MDX-070, In та Y-J591, Lu J591, J591-DM1; анти-Л'юїс Y-антитіла (антитіла до антигену Y Л'юїса), такі як IGN311; антиангіогенні антитіла, такі як AS1405 і 90YmuBC1; антиTrail-R1-антитіла, такі як МКА TRAIL R1 або МКА TRAIL R2. Інше втілення, що доповнює винахід, складається з композиції, описаної вище, яка як комбінований або кон'югований продукт для одночасного, роздільного або розширеного застосування містить, окрім іншого, цитотоксичний/цитостатичний агент. Під "одночасним застосуванням" розуміється введення обох сполук композиції в єдиній фармацевтичній формі. Під "роздільним застосуванням" розуміється одночасне введення обох сполук композиції в різних фармацевтичних формах. Під "розширеним застосуванням" розуміється послідовне введення обох сполук композиції, кожної в окремій фармацевтичній формі. У цілому, композиція відповідно до винаходу значно підвищує ефективність лікування раку. Іншими словами, терапевтичний ефект антитіла за винаходомнесподівано посилюється при введенні цитотоксичного агента. Інша важлива подальша перевага, отримана завдяки композиції за винаходом, полягає у можливості використання менших ефективних доз активного інгредієнта, що дозволяє уникнути або зменшити ризик виникнення побічних ефектів, зокрема, впливів цитотоксичного агента. Крім того, ця композиція дозволяє швидше досягати очікуваного терапевтичного ефекту. Під "терапевтичним протираковим агентом" або "цитотоксичним агентом" розуміється речовина, яка при введенні її пацієнту лікує, або запобігає розвитку раку у пацієнта. Необмежуючі приклади таких агентів включають "алкілувальні" агенти, антиметаболіти, протипухлинні антибіотики, мітотичні інгібітори, інгібітори функціонування хроматину, антиангіогенні агенти, антиестрогени, антиандрогени або імуномодулятори. Такими агентами є, наприклад, агенти, згадані у виданні VIDAL на сторінці, присвяченій сполукам, застосовуваним в онкології та гематології, у колонці "Цитотоксичні речовини"; цитотоксичні сполуки, які цитують відповідно до даного документа, приводяться тут як кращі цитотоксичні агенти. Під "алкілувальним агентом" розуміється будь-яка речовина, що може ковалентно зв'язувати або алкілувати будь-яку молекулу, краще, нуклеїнову кислоту (наприклад, ДНК) у клітині. Приклади таких алкілувальних агентів включають азотні аналоги гірчичного газу, такі як мехлоретамін, хлорамбуцил, мелфалан, хлоргідрат, піпоброман, преднімустин, гідрофосфат натрію або естрамустин; оксазафосфорини, такі як циклофосфамід, алтретамін, трофосфамід, сульфофосфамід або іфосфамід; азиридини або етиленіміни, такі як тіотепа, триетиленамін або алтретамін; нітрозосечевини, такі як кармустин, стрептозоцин, фотемустин або ломустин; 22 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 алкілсульфонати, такі як бусульфан, треосульфан або імпросульфан; триазени, такі як дакарбазин; або платинові комплекси, такі як цисплатин, оксаліплатин або карбоплатин. Під "антиметаболітом" розуміється речовина, яка блокує ріст та/або клітинний метаболізм, втручаючись у певні види активності, як правило, у синтез ДНК. Приклади антиметаболітів включають метотрексат, 5-фторурацил, флоксуридин, 5-фтородезоксиуридин, капецитабін, цитарабін, флударабін, цитозинарабінозид, 6-меркаптопурин (6-MP), 6-тіогуанін (6-TG), хлородезоксіаденозин, 5-азацитидин, гемцитабін, кладрибін, дезоксикоформіцин і пентостатин. Під "протипухлинним антибіотиком" розуміється сполука, яка може запобігати або інгібувати синтез ДНК, РНК та/або білків. Приклади таких протипухлинних антибіотиків включають доксорубіцин, даунорубіцин, ідарубіцин, валрубіцин, мітоксантрон, дактиноміцин, мітраміцин, плікаміцин, мітоміцин C, блеоміцин і прокарбазин. "Мітотичні інгібітори" запобігають нормальному розвитку клітинного циклу та мітозу. Як правило, інгібітори мікротрубочок, або "таксоїди", такі як паклітаксел і доцетаксел, здатні інгібувати мітоз. Алкалоїди барвінку (Vinca), такі як вінбластин, вінкристин, віндезин і вінорелбін, також здатні інгібувати мітоз. До "інгібіторів хроматину" або "інгібіторів топоізомерази" відносяться речовини, що інгібують нормальне функціонування білків, які моделюють хроматин, таких як топоізомераза I або топоізомераза II. Приклади таких інгібіторів включають, у випадку топоізомерази I, камптотецин і його похідні, такі як іринотекан або топотекан, та, у випадку топоізомерази II, етопозид, фосфат етопозиду й теніпозид. Під "антиангіогенним агентом" розуміється будь-який лікарський препарат, сполука, речовина або агент, який інгібує ріст кровоносних судин. Приклади антиангіогенних агентів включають, без обмеження ними, разоксин, маримастат, батімастат, приномастат, таномастат, іломастат, CGS-27023A, галофугінон, COL-3, неовастат, BMS-275291, талідомід, CDC 501, DMXAA, L-651582, скваламін, ендостатин, SU5416, SU6668, інтерферон-альфа, EMD121974, інтерлейкін-12, IM862, ангіостатин і вітаксин. Під "антиестрогеном" або "антагоністом естрогену" розуміється будь-яка речовина, яка зменшує, протидіє або інгібує дію естрогену. Прикладами таких агентів є тамоксифен, тореміфен, ралоксифен, дролоксифен, йодоксифен, анастрозол, летрозол і екземестан. Під "антиандрогеном" або "антагоністом андрогену" розуміється будь-яка речовина, яка зменшує, протидіє або інгібує дію андрогену. Приклади антиандрогенів включають флутамід, нілутамід, бікалютамід, спіроналоктон, ацетат ципротерону, фінастерид та цимітидин. Імуномодулятори є речовинами, що стимулюють імунну систему. Приклади імуномодуляторів включають інтерферон, інтерлейкіни, такі як алдеслейкін, ОСТ-43, денілейкін дифтитокс та інтерлейкін-2, фактори некрозу пухлини, такі як тазонермін, або інші типи імуномодуляторів, такі як лентінан, сизофіран, рохінімекс, підотимод, пегадемаза, тімопентин, полі(I:C) (співполімер поліінозинової та поліцитидилової кислот) або левамізол у поєднанні з 5фторурацилом. За докладнішою інформацією фахівець у даній галузі може звернутися до посібника, випущеного під редакцією French Association of Therapeutic Chemistry Teachers і озаглавленого "Therapeutic chemistry, vol. 6, Antitumor drugs and perspectives in the treatment of cancer, TEC and DOC edition, 2003" (французькою мовою). У окремому, кращому, втіленні зазначена композиція за винаходом як комбінований продукт характеризується тим, що зазначений цитотоксичний агент хімічно зв'язаний із зазначеним антитілом для одночасного застосування. У окремому, кращому, втіленні зазначена композиція характеризується тим, що зазначений цитотоксичний/цитостатичний агент вибраний з інгібіторів або стабілізаторів веретена ділення, краще, – вінорелбіну, та/або вінфлуніну, та/або вінкристину. Для полегшення зв'язування зазначеного цитотоксичного агента й антитіла відповідно до винаходу, можливе введення між двома сполуками, які мають бути зв'язані, молекулрозділювачів, наприклад, полі(алкілен)гліколю, поліетиленгліколю або амінокислот; або, в іншому втіленні, використання активних похідних зазначених цитотоксичних агентів, до яких були введені функціональні структури, здатні взаємодіяти із зазначеним антитілом. Ці методики зв'язування добре відомі фахівцям у даній галузі, та не будуть докладніше розглядатися в даному описі. Інші інгібітори EGFR включають, без обмеження ними, моноклональні антитіла C225 і антиEGFR 22 (Imclone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck Kgaa) або сполуку ZD-1834, ZD-1838 і ZD-1839 (Astrazeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGP75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), флуномід (Pharmacia/Sugen), CI-1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI-1033/PD 183, 805 (Warner Lambert Parke Davis), CL-387, 785 23 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GMBH/Roche), Naamidine A (Bristol-board Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co), VRCTC-310 (Ventech Research), гібридний токсин EGF (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial Cancer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Center Cancer), WHI-P97 (Parker Hughes Center Cancer), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) або "вакцину EGFR" (York Medical/Centro of Immunologia Molecular). Інший аспект винаходу відноситься до композиції, яка характеризується тим, що щонайменше одне з зазначених антитіл, або одна з їх похідних сполук або функціональних фрагментів комбіновані або кон'юговані з клітинним токсином, та/або радіоізотопом. Краще, коли зазначений токсин, або зазначений радіоізотоп здатний запобігати росту або проліферації пухлинної клітини, особливо - повністю інактивуючи зазначену пухлинну клітину. Також краще, коли зазначений токсин є ентеробактеріальним токсином, особливо екзотоксином А від Pseudomonas. Радіоізотопи, переважно кон'юговані з терапевтичними антитілами, є радіоізотопами, що 131 90 199 100 67 217 випромінюють гамма-промені, і краще, – йод , ітрій , золото , паладій , мідь , вісмут і 211 сурма . Радіоізотопи, що випромінюють альфа- і бета-промені, також можуть бути використані в терапії. Під "токсином або радіоізотопом, комбінованим щонайменше з одним антитілом за винаходом, або його функціональним фрагментом" розуміють будь-який засіб, що дозволяє зазначеному токсину, або зазначеному радіоізотопу зв'язуватися щонайменше з одним антитілом, особливо шляхом ковалентного зв'язування двох сполук, із введенням зв'язувальної молекули або без нього. Приклади агентів, що дозволяють зв'язувати хімічно (ковалентно), електростатично або нековалентно усі, або частину елементів кон'югата, включають, зокрема, бензохінон, карбодіїмід, і краще, EDC (1-етил-3-[3-диметиламінопропіл]карбодіїміду гідрохлорид), дималеімід, дитіобіс-нітробензойну кислоту (DTNB), сукцинімідил-S-ацетилтіоацетат (SATA), зв'язувальні агенти, які мають одну чи декілька фенілазидних груп, що реагують з ультрафіолетовими (УФ) променями, найкраще, N-[-4-(азидосаліциламіно)бутил]-3'-(2'піридилдитіо)пропіонамід (APDP), N-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіо)пропіонат (SPDP), та гідразино-нікотинамід (HYNIC). Інша форма зв'язування, особливо для радіоізотопів, може полягати у використанні біфункціональних іонних хелатуючих агентів. Приклади таких хелатуючих агентів включають хелатуючі агенти, отримані з EDTA (етилендіамінтетраоцтової кислоти) або DTPA (діетилентриамінпентаоцтової кислоти), які були розроблені для зв'язування металів, зокрема радіоактивних металів, та імуноглобулінів. Таким чином, DTPA та її похідні можуть бути замінені різними групами у вуглецевому ланцюзі з метою підвищення стабільності та жорсткості комплексу ліганд-метал (Krejcarek et al. (1977); Brechbiel et al. (1991); Gansow (1991); патент США 4831175). Наприклад, DTPA (діетилентриамінпентаоцтова кислота) та її похідні, які широко використовуються в медицині й біології протягом тривалого часу, або у своїй вільній формі, або в комплексі з іоном металу, має варту уваги особливість формувати стабільні хелати з іонами металу, які можуть бути пов'язані з білками терапевтичного або діагностичного інтересу, такими як антитіла, для отримання радіоімунокон'югатів для терапії раку (Meases et al., 1984; Gansow et al. 1990). Також краще, коли зазначене щонайменше одне антитіло за винаходом, що формує зазначений кон'югат, вибирають з його функціональних фрагментів, особливо - фрагментів з видаленим Fc-компонентом, таких як scFv-фрагменти. Даний винахід також включає використання композиції для виготовлення лікарського засобу, застосовуваного для профілактики або лікування раку. Даний винахід також відноситься до застосування антитіла або його похідної сполуки або функціонального фрагмента, краще, гуманізованого, та/або композиції відповідно до винаходу для виготовлення лікарського засобу, призначеного для інгібування росту пухлинних клітин. Головним чином, даний винахід також відноситься до застосування антитіла або його похідної сполуки або функціонального фрагмента, краще, гуманізованого, та/або композиції для виготовлення лікарського засобу для профілактики або лікування раку. У кращому випадку раки, при яких можна проводити профілактику та/або лікування, включають рак передміхурової залози, остеосаркому, рак легені, рак молочної залози, рак ендометрію, рак товстої кишки, множинну мієлому, рак яєчників, рак підшлункової залози або будь-який інший рак. Винахід також відноситься до застосування антитіла, або його похідної сполуки, або 24 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 функціонального фрагмента та/або композиції, описаної вище, для виготовлення лікарського препарату для модуляції CXCR4-активності в клітині. Інший аспект даного винаходу відноситься до застосування антитіла відповідно до опису в способі діагностики, краще, in vitro, захворювань, пов'язаних з рівнем експресії CXCR4. Краще, коли зазначеними захворюваннями, пов'язаними з білком CXCR4, у зазначеному діагностичному способі будуть раки. Таким чином, антитіла за винаходом або їх похідні сполуки або функціональні фрагменти можуть бути використані у способі виявлення, та/або кількісного оцінювання білка CXCR4 у біологічному зразку in vitro, зокрема, для діагностики захворювань, пов'язаних з ненормальною експресією цього білка, таких як рак, де зазначений спосіб включає такі етапи: а) поміщення біологічного зразка в контакт із антитілом відповідно до винаходу, або із його похідною сполукою або функціональним фрагментом; б) демонстрація можливо сформованого комплексу антиген-антитіло. Таким чином, даний винахід також включає набори або пристрої для реалізації описаного способу, що включають такі елементи: а) поліклональне або моноклональне антитіло за винаходом; б) можливо, реагенти для утворення середовища, сприятливого для імунологічних реакцій; в) можливо, реагенти, що виявляють комплекси антиген-антитіл, отримані в імунологічній реакції. Краще, коли антитіла або їх функціональні фрагменти можуть бути іммобілізовані на підкладці, зокрема на білковому чипі. Один з таких білкових чипів є об'єктом винаходу. Краще, коли білкові чипи можуть бути використані в наборах або пристроях, необхідних для виявлення та/або кількісного оцінювання білка CXCR4 у біологічному зразку. Треба зазначити, що термін "біологічний зразок" у даному документі відноситься до зразка, узятого у живого організму (зокрема, кров, тканина, орган або інші зразки, узяті у ссавців, особливо у людини), або будь-якого зразка, який може включати один такий білок CXCR4 (такого як зразки клітин, трансформовані при необхідності). Зазначене антитіло, або його функціональний фрагмент може бути у формі імунокон'югата або міченого антитіла для отримання сигналу, який можна виявити та/або кількісно оцінити. Мічені антитіла за винаходом або їх функціональні фрагменти включають, наприклад, кон'югати антитіл (імунокон'югати), які можуть бути комбіновані, наприклад, з ферментами, такими як пероксидаза, лужна фосфатаза, α-D-галактозидаза, глюкозооксидаза, глюкозоамілаза, карбоангідраза, ацетилхолінестераза, лізоцим, малатдегідрогеназа або глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа, або з молекулами, такими як біотин, дигоксигенін або 5бромдезоксиуридин. Флуоресцентні мітки також можуть бути комбіновані з антитілами за винаходом, або їх функціональними фрагментами, особливо включаючи флуоресцеїн та його похідні, флуорохром, родамін та його похідні, зелений флуоресцентний білок (GFP), дансил, умбеліферон і т.д. У таких кон'югатах антитіла за винаходом або їх функціональні фрагменти можуть бути отримані за допомогою способів, відомих фахівцям в даній галузі. Вони можуть бути зв'язані з ферментами або флуоресцентними мітками безпосередньо; за допомогою роздільної групи, або зв'язувальної групи, такої як поліальдегід, глутаральдегід, етилендіамінтетраоцтова кислота (EDTA) або діетиленглікольтриамінпентаоцтова кислота (DPTA); або в присутності зв'язувальних агентів, таких як згадані вище для терапевтичних кон'югатів. Кон'югати, що несуть флуоресцеїнові мітки, можуть бути отримані шляхом реакції з ізотіоціанатом. Інші кон'югати можуть також включати хемілюмінесцентні мітки, такі як люмінол і діоксетан, біолюмінесцентні мітки, такі як люцифераза та люциферин, або радіоактивні мітки, такі як 123 125 126 133 77 99m 111 113m 67 68 95 йод , йод , йод , йод , бром , технецій , індій , індій , галій , галій , рутеній , 97 103 105 107 203 99m 101 105 47 рутеній , рутеній , рутеній , меркурій , меркурій , реній , реній , реній , скандій , 121m 122m 125m 165 167 168 18 199 131 телурій , телурій , телурій , тулій , тулій , тулій , фтор , ітрій та йод . Способи, відомі фахівцеві в даній галузі, які існують для зв'язування терапевтичних радіоізотопів з антитілами або безпосередньо, або через хелатуючий агент, такий як згадані вище EDTA або DTPA, можуть бути використані для діагностичних радіоізотопів. Також можна згадати мітку з 125 [I ]Na за допомогою хлораміну Т [Hunter W.M. and Greenwood F.C. (1962) Nature 194:495], або 99m також з технецієм за описом Crockford et al. (патент США 4424200), або через DTPA, як описано у Hnatowich (патент США 4479930). Винахід також відноситься до застосування антитіла відповідно до винаходу для отримання лікарського препарату для специфічної дії сполуки, яка є біологічно активною по відношенню до клітин з експресією або надекспресією CXCR4. У контексті даного опису "біологічно активною сполукою" є будь-яка сполука, здатна 25 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 модулювати, зокрема, інгібувати, клітинну активність, зокрема ріст, проліферацію, транскрипцію й трансляцію гена. Винахід також відноситься до реагентів для діагностики in vivo, що складаються з антитіла відповідно до винаходу або його функціонального фрагмента, краще, міченого, зокрема міченого радіоактивною міткою, та до їх застосування в медичній візуалізації, зокрема для виявлення раку, пов'язаного з клітинною експресією, або надекспресією CXCR4. Винахід відноситься також до композиції у вигляді комбінованого продукту, або кон'югата антиCXCR4/токсину або радіоізотопу, відповідно до винаходу, використовуваного як лікарський препарат. Краще, якщо зазначена композиція як комбінований продукт або як зазначений кон'югат відповідно до винаходу буде змішана з ексципієнтом та/або фармацевтичним носієм. У даному описі під "фармацевтичним носієм" розуміється сполука або комбінація сполук, які входять до фармацевтичної композиції, не провокують вторинні реакції, і дозволяють, наприклад, полегшити введення активних сполук, збільшити час їх життя, та/або їх ефективність в організмі, підвищити їх розчинність у розчині, або поліпшити їх збережність. Такі фармацевтичні носії добре відомі та будуть адаптовані фахівцем у даній галузі залежно від природи й способу введення вибраних активних сполук. Краще, якщо такі сполуки будуть вводитися системним шляхом, зокрема внутрішньовенно, внутрішньом'язово, внутрішньошкірно, внутрішньочеревинно, підшкірно або пероральним шляхом. Ще краще, якщо композиція, яка включає антитіло відповідно до винаходу, буде вводитися декількома дозами через рівні проміжки часу. Способи введення, графіки дозувань та оптимальні галенові форми можна визначити відповідно до критеріїв, звичайно прийнятих при визначенні лікування, адаптованого для пацієнтів, таких як, наприклад, вік або вага тіла пацієнта, тяжкість його загального стану, його толерантність до лікування й виявлені побічні ефекти. Таким чином, винахід відноситься до застосування антитіла, або одного з його функціональних фрагментів для виготовлення лікарського препарату для специфічної дії сполуки, яка є біологічно активною по відношенню до клітин з експресією або надекспресією CXCR4. Інші характеристики й переваги винаходу з'являться у подальшому описі з прикладами й фігурами, легенда до яких наведена нижче. Легенда до графічних матеріалів Фіг. 1А та 1В показують експресію,відповідно, CXCR4 і CXCR2 у ракових клітинах, за допомогою аналізу кількісної ПЦР. Фіг. 2 показує білкову експресію CXCR4 і CXCR2 у ракових клітинах, за допомогою аналізу FACS. 125 Фіг. 3A і 3B показують конкуренцію специфічного [ I]SDF1-зв'язування неміченим SDF-1 (фіг. 3А) й моноклональними антитілами 414H5 і 515H7 (фіг. 3В) на клітинних мембранах клітин СНО-К1, що стабільно експресують людський CXCR4 дикого типу (T: загальне зв'язування; NS: неспецифічне зв'язування). Фіг. 4А й 4В показують модуляцію активації білка G моноклональними антитілами 414H5 35 (фіг. 4А) і 515H7 (фіг. 4B) шляхом моніторингу реакцій [ S]GTPγS-зв'язування рецептора CXCR4 дикого типу, що стабільно експресується у клітинах NIH-3T3. Фіг. 5 показує модуляцію активації білка G моноклональними антитілами 414H5 (фіг. 4А) і 35 515H7 (фіг. 4B) шляхом моніторингу реакцій [ S]GTPγS-зв'язування на людських пухлинних клітинах HeLa, стимульованих SDF-1 (10 і 100 нМ). Фіг. 6А-6F показують модуляцію асоціації рецептора CXCR4 з різними взаємодіючими учасниками SDF-1 та моноклональними антитілами 414H5 і 515H7, за допомогою підходу резонансного перенесення енергії біолюмінесценції (BRET) у клітинах НЕК293. (Фіг. 6А й 6В: CXCR4:CXCR4-гомодимеризація; фіг. 6C і 6D: CXCR2:CXCR4-гетеродимеризація; та фіг. 6E і 6F: CXCR4-опосередковане залучення β-арестину). Фіг. 7А та 7В показують інгібування форсколін-стимульованого продукування цАМФ SDF-1 і моноклональними антитілами 414H5 і 515H7 у клітинах NIH3T3, що стабільно експресують рецептор CXCR4. Фіг. 8 показує модуляцію активації білка G анти-CXCR4-моноклональними антитілами 414H5 35 і 515H7 шляхом моніторингу реакцій [ S]GTPγS-зв'язування конститутивно активного 119 мутантного рецептора Asn Ser CXCR4, що стабільно експресується в клітинах СНО-К1. Фіг. 9 ілюструє інгібування SDF-1-індукованої проліферації клітин HeLa моноклональним антитілом 414H5 in vitro. Фіг. 10А й 10В показують інгібування SDF-1-індукованої міграції клітин U937 CXCR4 26 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 моноклональним антитілом 414H5 (фіг. 10А), і моноклональним антитілом 515H7 (фіг. 10В) in vitro. Фіг. 11 показує інгібування зростання ксенотрансплантатної пухлини MDA-MB-231 антиCXCR4-моноклональними антитілами 414H5 (А) і 515H7 (B) у мишей Nod/SCID. Фіг. 12 показує активність анти-CXCR4-МКА 414H5 на мишачих моделях виживання U937 Nod/Scid. Фіг. 13A-13C показують інгібування SDF-1-індукованого вивільнення кальцію анти-CXCR4моноклональним антитілом 515H7 у клітинах СНО-CXCR4 (фіг. 13А) і MDA-MB-231 (фіг. 13В), ракових клітинах U937 (фіг. 13С). Фіг. 14 показує інгібування зростання Т-клітинної ксенотрансплантатної пухлини KARPAS 299 у мишей Nod/ Scid моноклональним антитілом 414H5. Фіг. 15 показує активність мишачого анти-CXCR4-МКА m515H7 на мишачих моделях виживання U937 Nod/ Scid. Фіг. 16 показує активність мишачого анти-CXCR4-МКА m515H7 у інгібуванні зростання Тклітинної ксенотрансплантатної пухлини KARPAS 299 у мишей Nod/ Scid. 125 Фіг. 17 показує конкуренцію специфічного [ I]SDF1-зв'язування мишачими МКА m414H5 і m515H7 і химерними МКА c414H5 і c515H7 на клітинних мембранах клітин СНО-К1, що стабільно експресують людський CXCR4 дикого типу (T: загальне зв'язування; NS: неспецифічне зв'язування). Фіг. 18 показує модуляцію активації білка G мишачими МКА m414H5 і m515H7, та 35 химерними МКА c414H5 і c515H7 шляхом реакцій [ S]GTPγS-зв'язування рецептора CXCR4 дикого типу, стабільно експресованого в клітинах NIH-3T3, стимульованих SDF-1 (10 нМ). Фіг. 19 показує модуляцію активації білка G анти-CXCR4 мишачими МКА m414H5 і m515H7, і 35 химерними МКА c414H5 і c515H7, шляхом моніторингу реакцій [ S]GTPγS-зв'язування на людських пухлинних клітинах HeLa, стимульованих SDF-1 (10 нМ). Фіг. 20A-20C показують модуляцію асоціації рецептора CXCR4 з різними взаємодіючими учасниками SDF-1 та моноклональними антитілами m414H5, c414H5, m515H7 і c515H7, за допомогою підходу резонансного перенесення енергії біолюмінесценції (BRET) у клітинах НЕК293. (Фіг. 20А: CXCR4:CXCR4-гомодимеризація; фіг. 20В: CXCR2:CXCR4гетеродимеризація; і фіг. 20С: CXCR4-опосередковане залучення β-арестину). Фіг. 21А й 21В показують інгібування SDF-1-індукованого вивільнення кальцію у клітинах СНО-CXCR4 (фіг. 21А) і клітинах U937 (фіг. 21В). Фіг. 22А та 22В показують інгібування SDF-1-індукованої міграції клітин U937 CXCR4моноклональними антитілами m414H5 і c414H5 (фіг. 22А), та m515H7 і c515H7 (фіг. 22В) in vitro. Фіг. 23 показує активність анти-CXCR4 химерних МКА c414H5 і c515H7 на мишачих моделях виживання U937Nod/ Scid. ПРИКЛАДИ Приклад 1: Експресія CXCR4 і CXCR2 у ракових клітинах - кількісний ПЦР-аналіз (qPCR): Для того, щоб кількісно оцінити відносну експресію CXCR4 і CXCR2 у різних ракових клітинних лініях, використовується ОТ-ПЦР у режимі реального часу (real time RT-PCR). Зразки РНК виділяли з різних клітинних ліній за допомогою протоколів Rneasy Mini або Midi (Qiagen Corporation, Франція). Потім РНК-зразки перевіряли за допомогою автоматизованої системи електрофорезу Experion (BIO-RAD Corporation, Франція), була показана добра якість/цілісність. Один мкг кожного зразка РНК переводили в кДНК-матрицю за допомогою набору для синтезу кДНК iScript cDNA Syntesis (BIO-RAD Corporation, Франція). Рівні кДНК кількісно оцінювали за допомогою кількісної ПЦР із зондом TaqMan для CXCR2 або SYBERGreen для CXCR4. Порівнювані зразки вимагали нормалізації, тому був введений внутрішній референс RPL0. Зонди TaqMan (використовувані для CXCR2) несли 5'-FAMрепортерну мітку й 3'-TAMRA-групу-гасник. Фермент ПЦР активували нагріванням протягом 2 хв при 50 °C, й 10 хв при 95 °C. Використовували двоетапну процедуру, 15 сек при 95 °C, та 1 хв при 62 °C протягом 40 або 45 циклів із ПЦР-сумішшю, що включає 5 мкл кДНК-матриці (розведення 1/20), 1х qPCR Mastermix (TaqMan Universal PCR Master Mix, Applied Biosystems corporation, Бранчбург, Нью-Джерсі, США), 50-900 нМ кожного праймеру й 50-100 нМ зонда у загальному об'ємі 50 мкл. Усі реакції проводили за допомогою інструмента iCycler (BIO-RAD Corporation). Кількісна ПЦР дозволяла визначити пороговий цикл (Ct, cycle threshold). Чим більше значень Ct є низькими, тим більше тестованих генів експресується. Праймери й зонди для великого людського рибосомального білка, P0, були такими: прямий праймер, 5'-GAAACTCTGCATTCTCGCTTCCTG-3 '(SEQ ID № 32); зворотний праймер, 5'-AGGACTCGTTTGTACCCGTTGA-3 '(SEQ ID № 33); 27 UA 102867 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зонд, 5'-(FAM)-TGCAGATTGGCTACCCAACTGTTGCA-(TAMRA)-3' (SEQ ID № 34). Праймери для людського CXCR4 (хемокінового рецептора-4) були такими: прямий праймер, 5'-CTCCTTCATCCTCCTGGAAATC-3 '(SEQ ID № 35); зворотний праймер, 5'-CCAAGGAAAGCATAGAGGATGG-3 '(SEQ ID № 36). Праймери й зонд для людського CXCR2 (хемокінового рецептора-2) були такими: прямий праймер, 5'-GTGGTCATTATCTATGCCCTGG-3' (SEQ ID № 37); зворотний праймер, 5'-CGACCCTGCTGTATAAGATGAC-3' (SEQ ID № 38); зонд, 5'-(FAM)-TATTCCTGCTGAGCCTGCTGGGAAA-(TAMRA)-3' (SEQ ID № 39). У нашому порівняльному дослідженні експресію двох генів [тестованого гена (CXCR4 або CXCR2) і RPL0] кількісно оцінювали у двох різних зразках: тестованій клітинній лінії та референсній клітинній лінії. Референсна клітинна лінія відповідала клітинній лінії, що містить найнижчу експресію оцінюваного гена. Порівняльні розрахунки експресії генів були зроблений з використанням такої формули: -ΔCt(1) -ΔCt(2) Відносна експресія гена = (1+Eгена) / (1+ERPL0) Eгена = ефективність ПЦР при використанні праймерів/зонда для оцінюваного гена ERPL0 = ефективність ПЦР при використанні праймерів/зонда для RPL0 Ct = пороговий цикл ΔCt(1)= Ctгена (тестована клітинна лінія) - Ctгена (референсна клітинна лінія) ΔCt(2)= Ctrpl0 (тестована клітинна лінія) - Ctrpl0 (референсна клітинна лінія). Для кожної серії ПЦР розраховували відносне кількісне значення гена, і ракові клітинні лінії класифікували по групах з урахуванням рівня їх експресії від максимальної до від'ємної. Усі дані показані на фіг. 1А й 1В. Усі тестовані ракові клітинні лінії експресували CXCR4 (фіг. 1А) і CXCR2, за винятком DU145 і U-87MG по відношенню до CXCR2 (фіг. 1В). - FACS аналіз: Ракові клітинні лінії MDA-MB-231, PC3 і U937 піддавали пермеабілізації, а потім інкубували або з 10 мкг/мл анти-CXCR4-моноклональних антитіл [44717 (R&D Systems) у порівнянні з ізотиповим контролем IgG2b (SIGMA), або з 10 мкг/мл анти-CXCR2-моноклональних антитіл (анти-h-CXCR2, клон 48311, R&D Systems, МКА 331) у порівнянні з ізотиповим контролем IgG2a. Потім клітини промивали 1 % BSA/PBS/0,01 % NaN3. Потім до клітин додавали Alexa-мічені вторинні антитіла та інкубували при 4 °C протягом 20 хв. Потім клітини знову промивали два рази. Після другого промивання проводили FACS-аналіз. Результати цих досліджень зв'язування показані на фіг. 2. Таким чином, пухлинні клітини, такі як MDA-MB-231, PC3 і U937, експресують як CXCR4-, так і CXCR2-білки. Приклад 2: Створення моноклональних антитіл (МКА) проти людського CXCR4 Для створення моноклональних антитіл до CXCR4 мишей BALB/c імунізували рекомбінантними клітинами NIH3T3-CXCR4 та/або пептидами, що відповідають позаклітинному N-кінцю й петлям CXCR4. Мишей 6-16-тижневого віку при першій імунізації імунізували один раз антигеном у повному ад'юванті Фрейнда підшкірно (s.c.), а потім від 2 до 6 раз антигеном у неповному ад'юванті Фрейнда підшкірно. Імунну відповідь контролювали в крові з ретроорбітального синуса. Скринінг сироваток проводили за допомогою ІФА (як описано нижче), і мишей з більш високим титром анти-CXCR4-антитіл використовували для злиття. Мишей бустирували внутрішньовенно антигеном за два дні до умертвіння й забирання селезінки. - ІФА Щоб вибрати мишей, продукуючих анти-CXCR4-антитіла, сироватки від імунізованих мишей перевіряли за допомогою ІФА. Стисло, мікротитрувальні планшети покривали очищеним [1-41] N-кінцевим пептидом, кон'югованим з BSA (бичачим сироватковим альбуміном) у кількості 5 мкг еквівалентного пептиду/мл, 100 мкл/лунку, інкубували при 4 °C протягом ночі, а потім блокували 250 мкл/лунку 0,5 % желатином в PBS (фосфатно-сольовому буфері). До кожної лунки додавали розведення плазми від CXCR4-імунізованих мишей, та інкубували протягом 2 годин при 37 °C. Плати промивали PBS, а потім інкубували із козячим противомишачим IgGантитілом, кон'югованним з HRP (Jackson Laboratories), протягом 1 години при 37 °C. Після промивання в плати вносили субстрат ТМВ (тетраметилбензоїдин), реакцію зупиняли через 5 хвилин шляхом додавання 100 мкл/лунку 1M H2SO4. Мишей, у яких розвивалися високі титри анти-CXCR4-антитіл, використовували для створення антитіл. - створення гібридом, продукуючих МКА до CXCR4 Мишачі спленоцити, виділені з мишей BALB/c, у яких розвивалися найвищі титри антиCXCR4–антитіл, зливали за допомогою ПЕГ з мишачою мієломною клітинною лінією Sp2/О. 5 Клітини висівали у кількості приблизно 1 × 10 /лунку в мікротитрувальні плати, потім інкубували два тижні у селективному середовищі, що включає ультра культуральне середовище + 2 мМ Lглутамін + 1 мМ піруват натрію + 1x HAT. Скринінг лунок проводили за допомогою ІФА з анти 28