Антитіла, спрямовані проти пептиду бета-амілоїду, та способи їх застосування

1. Моноклональне антитіло, що специфічно зв'язується з А-пептидом, що містить варіабельний регіон важкого ланцюга, який містить три CDR, показані в SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 і SEQ ID NO:5, і варіабельний регіон легкого ланцюга, який містить три CDR, показані в SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 і SEQ ID NO:8. 2. Антитіло за п. 1, де згаданий варіабельний регіон важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:1. 3. Антитіло за п. 1, де згаданий варіабельний регіон легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:2. 4. Антитіло за п. 1, де згадана амінокислотна послідовність важкого ланцюга показана в SEQ ID 2 (19) 1 3 96917 4 16. Фрагмент за п. 15, де фрагментом є Fab, Fab', F(ab')2 або Fv. 17. Полінуклеотид, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує варіабельний регіон важкого ланцюга антитіла, показаного в SEQ ID NO:1, та легкого ланцюга антитіла, показаного в SEQ ID NO:2. 18. Вектор, що містить полінуклеотид, де полінуклеотид містить нуклеотидну послідовність, що кодує варіабельний регіон важкого ланцюга антитіла з SEQ ID NO:1 та легкого ланцюга антитіла з SEQ ID NO:2. 19. Вектор за п. 18, де згаданим вектором є pDb.6G.hFc2a з депозитарним номером у депозитарії культур ATCC No. PTA-6786 і згаданим вектором є pEb.6G.hK з депозитарним номером у депозитарії культур ATCC No. PTA-6787. 20. Клітина-хазяїн, що містить один або більше полінуклеотидів, де полінуклеотид містить нуклеотидну послідовність, що кодує варіабельний регіон важкого ланцюга антитіла з SEQ ID NO:1 та легкого ланцюга антитіла з SEQ ID NO:2. 21. Спосіб одержання антитіла, що включає культивування клітини-хазяїна за п. 20 за умов, необхідних для вирощування антитіла, і виділення антитіла з клітини-хазяїна або культури. 22. Фармацевтична композиція, що містить ефективну кількість антитіла за п. 1 або фрагмент за пунктом 15 і фармацевтично прийнятний носій. 23. Застосування фармацевтичної композиції антитіла за п. 22 для одержання медикаменту для профілактики, лікування, інгібування або відстрочення розвитку захворювання, пов'язаного із зміненою експресією А або АРР або акумулюванням А-пептиду. 24. Застосування за п. 23, де захворюванням є мультиінфарктна деменція, помірне когнітивне порушення, церебральна амілоїдна ангіопатія, синдром Дауна, хвороба Паркінсона, хвороба Крейтцфельда-Якоба, деменція з тільцями Леві або СНІД. 25. Застосування антитіла за п. 1 для одержання медикаменту для лікування хвороби Альцгеймера або відстрочки розвитку симптому, пов'язаного з хворобою Альцгеймера, у суб'єкта. 26. Застосування антитіла за п. 1 для одержання медикаменту для пригнічення утворення або відновлення амілоїдних бляшок у суб'єкта. 27. Застосування антитіла за п. 1 для одержання медикаменту для поліпшення впізнавання або обернення когнітивних відхилень, пов'язаних з амілоїдним відкладанням А у суб'єкта. ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ У цій заявці заявлено пріоритет на основі попередньої заявки США 60/696,093, поданої 29 квітня 20065 року і 60/704,818, поданої 1 серпня 2005 року, кожна з яких повністю включена в цей опис сюди через посилання на них. ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Винахід стосується антитіл до пептидів бетаамілоїду. Винахід також стосується застосування цих антитіл в лікуванні та/або профілактиці хвороб, таких як хвороба Альцгеймера. ЗАУВАЖЕННЯ СТОСОВНО ДОСЛІДЖЕНЬ АБО РОЗРОБОК, ФІНАНСОВАНИХ З ФЕДЕРАЛЬНОГО БЮДЖЕТУ Не зазначено. ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ Хвороба Альцгеймера (ХА, AD) є дегенеративним розладом мозку, який клінічно характеризується прогресуючою недостатністю пам'яті, замішанням, поступовим погіршенням фізичного стану та, в результаті, смертю. В усьому світі приблизно 15 мільйонів людей уражені хворобою Альцгеймера, і ця кількість посилено зростатиме зі зростанням тривалості життя. За гістологією, захворювання характеризується нейритними бляшками, які переважно знаходяться в асоціативній зоні, лімбічній системі та базальних гангліях. Основним компонентом цих бляшок є бета-амілоїдний пептид (Αβ), який є продуктом розщеплення попередника бета-амілоїдного протеїну (βΑΡΡ або АРР). АРР є трансмембранним глікопротеїном І типу, який містить великий ектопічний N-кінцевий домен, трансмембранний домен, та невеликий цитоплазматичний С-кінцевий хвіст. Альтернативний сплайсинг транскрипту одиничного гену АРР в 21 хромосомі в результаті дав декілька ізоформ, які відрізняються декількома амінокислотами. Виявляється, що Αβ відіграє центральну роль в нейропатології хвороби Альцгеймера. Сімейні форми хвороби пов'язані з мутаціями в генах АРР та презениліну (Tanzi et al., 1996, Neurobiol. Dis. 3:159-168; Hardy, 1996, Ann. Med. 28:255-258). Мутації пов'язані з цими генами призводять до підвищеного вироблення 42-амінокислотної форми Αβ, домінуючу форму якого знайдену в амілоїдних бляшках. Більш того, імунізація трансгенних мишей, які надекспресували мутантну форму АРР з Αβ людини, знижує навантаженість бляшками та пов'язані з цим патології (Schenk et al., 1999, Nature 400:173-177; WO 99/27944), й периферичне застосування антитіл спрямованих до Αβ, також знижує навантаженість бляшками в мозку (Bard et al., 2000, Nature Medicine 6(8):916-919; WO 2004/032868; WO 00/72880). Було показано, що опосередковане фагоцитоз мікрогліальними клітинами Fc є важливим для звільнення від бляшок in vivo. Bard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 2023-2028 (2003). Однак, було повідомлено про те, що в звільнення від бетаамілоїду залучені механізми не опосередковані Fc при імунотерапії in vivo. Bacskai et al., J. Neurosci. 22:7873-7878 (2002); Das et al., J. Neurosci. 23:8532-8538 (2003). Таким чином, лікування антитілами пропонує перспективний підхід до лікування та хвороби Альцгеймера. Однак, клінічні випробування на людях вакцини, що містить Αβ1-42 були призупинені із-за менінгоенцефаліту в певної частини пацієнтів. Orgogozo et al., Neruology 61:7-8 (2003); Ferrer et al., Brain Pathol. 14:11-20 (2004). Також було повідомлено, що пасивна імунізація N-кінцево 5 специфічними антитілами до Αβ вела до значного зниження переважно дифузного амілоїду, але викликала збільшення церебрального мікрокрововитоку у трансгенних мишей, які мали залежний від віку розвиток амілоїдних бляшок та нейродегенерації, а також церебральної амілоїдної ангіопатії (САА) подібної до такої, що спостерігалася в мозку людей з ХА. Pfeifer et al., Science 298:1379 (2002). Було припущено, що загострення у АРРтрансгенних мишей мікрокрововиливу пов'язаного з церебральною амілоїдною ангіопатією (САА) пасивною імунізацією антитілами спрямованими до бета-амілоїду залежить від розпізнавання антитілами депонованих форм бета-амілоїду. Racke et al., J. Neurosci. 25:629-636 (2005). Для зниження ризику запалення було перевірено припущення про пасивну імунізацію антитілами до пептидного компоненту амілоїдних відкладень, антитілами позбавленими ділянок Fc. WO 03/086310. Залишалася ще потреба в антитілах та інших імунотерапевтичних засобах спрямованих проти Αβ, які мають покращену ефективність та показники безпеки, та які придатні для застосування на людях. У цій заявці робляться посилання на різноманітні публікації (включаючи патенти та патентні заявки). Описи цих публікацій повністю включено сюди через посилання. КОРОТКИЙ ВИКЛАД СУТІ ВИНАХОДУ Описаний тут винахід стосується антитіл і поліпептидів, які зв'язуються з С-кінцем пептиду Αβ. В одному аспекті винахід стосується антитіла або поліпептиду, який зв'язується з Αβ1-40, Αβ1-42 і Αβ143, де таке антитіло або поліпептид зв'язується з Αβ1-40 з вищою афінністю, ніж з Αβ1-42 і Αβ1-43, і де таке антитіло або поліпептид зв'язується з епітопом на Αβ1-40, який включає амінокислоти 25-34 і 40. В деяких варіантах втілення антитіло зв'язується з Αβ1-40 з афінністю, щонайменше у 40 разів вищою, ніж при зв'язуванні з Αβ1-42 і/або Αβ1-43. У деяких варіантах антитіло не є антитілом 2294. Відповідно до ще одного аспекту винахід стосується антитіла 6G (яке також позначається як "6G"). Амінокислотні послідовності варіабельних регіонів важкого і легкого ланцюга 6G показані на Фіг.1. Частини гіперваріабельного регіону (CDR) антитіла 6G (включно з Chothia та Kabat CDR) також наведені на Фіг.1. В іншому аспекті, винаходом пропонуються варіанти антитіла 6G в яких амінокислотні послідовності є наведеними в Таблиці 3. В іншому аспекті винаходом є антитіло, яке включає фрагмент або регіон антитіла 6G або його варіанти, наведені в Таблиці 3. В одній з реалізацій фрагмент є легким ланцюгом антитіла 6G. В наступній реалізації фрагмент є важким ланцюгом антитіла 6G. В наступній реалізації фрагмент містить один або більше варіабельних регіонів з легкого та/або тяжкого ланцюгів антитіла 6G. В наступній реалізації фрагмент містить один або більше варіабельних регіонів з легкого та/або тяжкого ланцюгів, показаних на Фіг.1. В наступній реалізації фрагмент містить один або більше CDR з легкого та/або тяжкого ланцюгів антитіла 6G. В іншому аспекті винаходом пропонуються поліпептиди (які можуть бути або не бути антитілом) 96917 6 які включають один або більше з наступного: а) один або більше CDR(s) антитіла 6G або його варіантів, показаних в Таблиці 3; b) CDR H3 з важкого ланцюга антитіла 6G або його варіантів, показаних в Таблиці 3; с) CDR L3 з легкого ланцюга антитіла 6G або його варіантів, показаних в Таблиці 3; d) три CDR з легкого ланцюга антитіла 6G або його варіантів, показаних в Таблиці 3; е) три CDR з важкого ланцюга антитіла 6G або його варіантів, показаних в Таблиці 3; f) три CDR з легкого ланцюга антитіла CDR з важкого ланцюга антитіла 6G або його варіантів, показаних в Таблиці 3. Винаходом також пропонуються поліпептиди (які можуть бути або не бути антитілом), які включають один або більше з наступного: а) один або більше (один, два, три, чотири, п'ять або шість) CDR(s), що походять з антитіла 6G або його варіантів, показаних в Таблиці 3; b) CDR, що походять з CDR H3, що походять з важкого ланцюга антитіла 6G; та/або с) CDR, що походять з CDR L3, що походять з легкого ланцюга антитіла 6G. В одній з реалізацій, CDR є CDR показаним на Фіг.1. У деяких реалізаціях, один або більше CDR, що походять з антитіла 6G або його варіантів, показаних в Таблиці 3 мають принаймні, приблизно, 85 %, принаймні, приблизно, 86 %, принаймні, приблизно, 87 %, принаймні, приблизно, 88 %, принаймні, приблизно, 89 %, принаймні, приблизно, 90 %, принаймні, приблизно, 91 %, принаймні, приблизно, 92 %, принаймні, приблизно, 93 %, принаймні, приблизно, 94 %, принаймні, приблизно, 95 %, принаймні, приблизно, 96 %, принаймні, приблизно, 97 %, принаймні, приблизно, 98 %, або принаймні, приблизно, 99 % ідентичності принаймні до одного, принаймні до двох, принаймні до трьох, принаймні до чотирьох, принаймні до п'ятьох, або принаймні до шести CDR з 6G або його варіантів. У деяких реалізаціях CDR є Kabat CDR. У інших реалізаціях, CDR є Chothia CDR. У інших реалізаціях, CDR є поєднанням Kabat та Chothia CDR (які також називаються "комбінованим CDR" або "розширеним CDR"). Іншими словами, для будьякої даної реалізації, що містить один або більше CDR, CDR може бути як Kabat, так і Chothia, та/або їхньою комбінацією. У деяких реалізаціях антитіло винаходу є антитілом людини. У інших реалізаціях, антитіло винаходу є гуманізованим антитілом. У деяких реалізаціях, антитіло є моноклональним. У деяких реалізаціях, антитіло (або поліпептид) є виділеним. У деяких реалізаціях, антитіло (або поліпептид) є значною мірою очищеним. Константний регіон важкого ланцюга антитіл може походити з різних типів константних регіонів, таких як IgG, IgM, IgD, IgA, та IgE; та походити з будь-яких ізотипів, таких як lgG1, lgG2, lgG3, та lgG4. У деяких варіантах антитіло або поліпептид, описані в цій заявці, має погіршене функціонування ефектора. У деяких варіантах антитіло або поліпептид містить константний регіон важкого ланцюга, що має погіршене функціонування ефектора, де такий константний регіон важкого ланцюга включає Fc-регіон. У деяких варіантах Nглікозилювання в Fc-регіоні виключають. У деяких 7 варіантах Fc-регіон має мутацію урозпізнавальній послідовності N-глікозилювання, тоді як Fc-регіон антитіла або поліпептину не є N- глікозильованим. У деяких варіантах Fc-регіон PEG-льований. У деяких варіантах константний регіон важкого ланцюга антитіла або поліпептиду є константним регіоном людського важкого ланцюга lgG2a, який має наступні мутації: А330Р331 - S330S331 (амінокислотна нумерація на еонові послідовності lgG2a дикого типу). У деяких реалізаціях, антитіло містить константний регіон lgG4, який має наступні мутації: E233F234L235 на P233V234A235. Ці положення амінокислот грунтуються на нумерації Kabat. В іншому аспекті винаходом пропонується полінуклеотид (який може бути виділений), який включає полінуклеотид, що кодує фрагмент або регіон антитіла 6G або його варіанти наведені в Таблиці 3. В одній з реалізацій, фрагмент є легким ланцюгом антитіла 6G. В наступній реалізації, фрагмент є важким ланцюгом антитіла 6G. В наступній реалізації, фрагмент містить один або більше варіабельних регіонів з легкого та/або тяжкого ланцюгів антитіла 6G. В наступній реалізації, фрагмент містить один або більше (а саме, один, два, три, чотири, п'ять, шість) гіперваріабельних регіонів (CDR) з легкого та/або тяжкого ланцюгів антитіла 6G. В іншому аспекті винаходом є полінуклеотид (який може бути виділений), який включає полінуклеотид, що кодує антитіло 6G або його варіанти, наведені в Таблиці 3. У деяких реалізаціях, полінуклеотид містить один з або обидва полінуклеотиди, наведені в SEQ ID NО:9 та SEQ ID NО:10. В іншому аспекті винаходом пропонуються полінуклеотиди, які кодують будь-яке з описаних тут антитіл (включаючи фрагменти антитіл) або поліпептидів. В іншому аспекті винаходом пропонуються вектори (включаючи експресійні або клонувальні вектори) та клітини хазяїни які містять будь-який з описаних тут полінуклеотидів. В іншому аспекті винаходом є клітина-хазяїн, яка містить полінуклеотид, що кодує будь-яке з описаних тут антитіл. В іншому аспекті винаходом є комплекс Αβ1-40, зв'язаний антитілом 6G, або його варіанти, наведені в Таблиці 3. В іншому аспекті винаходом є комплекс Αβ1-40, зв'язаний будь-яким з антитіл, або описані тут поліпептиди. В іншому аспекті винаходом є фармацевтична композиція, яка містить ефективну кількість будьякого описаного тут антитіла, поліпептиду або полінуклеотиду і фрамацевтично прийнятний наповнювач. У деяких варіантах антитіла або поліпептиди містять один або більше CDR антитіла 6G. В іншому аспекті винаходом є спосіб одержання антитіла 6G, який включає культивування клітини хазяїна або потомства за умов, які дозволяють отримувати антитіло 6G, де клітина хазяїн містить експресійний вектор, який кодує антитіло 6G; та в деяких реалізаціях, очищення антитіла 6G. В деяких реалізаціях експресійний вектор включає одну з або обидві полінуклеотидні послі 96917 8 довності, показані на SEQ ID NО:9 та SEQ ID NO:10. В іншому аспекті винаходом пропонуються способи отримання таких описаних антитіл або поліпептидів експресуванням одного або більше полінуклеотидів, які кодують антитіло (які можуть експресуватися окремо як легкий або важкий ланцюг, або разом легкий та важкий ланцюг експресується з одного вектора) або поліпептид в придатній клітині, в загальному випадку отримуванням та/або виділенням цільового антитіла або поліпептиду. Винаходом також пропонується спосіб попередження, лікування, пригнічування або затримки розвитку хвороби Альцгеймера або інших захворювань, пов'язаних із зміненим Αβ або експресією βΑΡΡ, накопичуванням Αβ у пацієнта, таких як синдром Дауна, хвороба Паркінсона, мультиінфарктна деменція, легкий когнітивний розлад, церебральна амілоїдна ангіопатія, депресія, хвороба Кройтцфельдт-Якоба, деменція з тільцями Леві та СНІД. Спосіб включає призначення пацієнту ефективної дози фармацевтичної композиції, яка містить антитіло, поліпептид або полінуклеотид даного винаходу. Винаходом також пропонується спосіб затримки розвитку симптому, пов'язаного із хворобою Альцгеймера або іншими захворюваннями, пов'язаними із відкладаннями Αβ пептиду у пацієнта, який включає призначення пацієнту ефективної дози фармацевтичної композиції, яка містить антитіло, поліпептид або полінуклеотид даного винаходу. Винаходом також пропонується спосіб пригнічення утворення амілоїдних бляшок та/або амілоїдних накопичень у пацієнта, який включає призначення пацієнту ефективної дози фармацевтичної композиції, яка містить антитіло, поліпептид або полінуклеотид даного винаходу. У деяких реалізаціях амілоїдні бляшки знаходяться в мозку (мозковій тканині) пацієнта. У деяких реалізаціях амілоїдні бляшки знаходяться в церебро-васкулярній системі. У інших реалізаціях амілоїдні накопичення знаходяться в серцево-судинній системі. Винаходом також пропонується спосіб зменшення амілоїдних бляшок та/або амілоїдних накопичень у пацієнта, який включає призначення пацієнту ефективної дози фармацевтичної композиції, яка містить антитіло, поліпептид, полінуклеотид даного винаходу. У деяких реалізаціях амілоїдні бляшки знаходяться в мозку (мозковій тканині) пацієнта. У деяких реалізаціях амілоїдні бляшки знаходяться в церебро-васкулярній системі. У інших реалізаціях амілоїдні накопичення знаходяться в серцево-судинній системі. Винаходом також пропонується спосіб видалення або вичищення амілоїдних бляшок та/або амілоїдних накопичень у пацієнта, який включає призначення пацієнту ефективної дози фармацевтичної композиції, яка містить антитіло, поліпептид, полінуклеотид даного винаходу. У деяких реалізаціях, амілоїдні бляшки знаходяться в мозку (мозковій тканині) пацієнта. У деяких реалізаціях, амілоїдні бляшки знаходяться в цереброваскулярній системі. У інших реалізаціях, амілоїдні 9 накопичення знаходяться в серцево-судинній системі. Крім того, винаходом пропонується спосіб пригнічення накопичень пептиду Αβ в тканині, який включає контактування тканини з антитілом або поліпептидом даного винаходу. Винахід також стосується способів зменшення пептиду Αβ (таких форм як розчинна, олігомерна та відкладена) в мозку пацієнта, який включає введення пацієнту ефективної кількості антитіла або поліпептиду даного винаходу. У деяких реалізаціях, накопичення пептиду Αβ пригнічується та/або знижується в мозку. У деяких реалізаціях, токсичний вплив пептиду Αβ пригнічується та/або знижується. Таким чином, спосіб даного винаходу може бути застосований для лікування будь-якого захворювання при якому має місце або може бути накопичення пептиду Αβ, таких як хвороба Альцгеймера, синдром Дауна, хвороба Паркінсона, мультиінфарктна деменція, легкий когнітивний розлад, церебральна амілоїдна ангіопатія, депресія, хвороба Кройтцфельдт-Якоба або деменція з тільцями Леві. Винахід також стосується способів покращення розпізнавання або обернення когнітивних відхилень, пов'язаних із захворюваннями, що викликаються амілоїдним відкладанням Αβ у пацієнта, такими як хвороба Альцгеймера, які включають призначення ефективної дози фармацевтичної композиції, яка містить антитіло, поліпептид або полінуклеотид даного винаходу. Будь-які описані тут антитіла, поліпептиди або полінуклеотиди можуть бути використаними в методах даного винаходу. У деяких реалізаціях, антитіло є антитілом 6G. Антитіла та поліпептиди даного винаходу також можуть використовуватися для визначення, діагностування та моніторингу хвороби Альцгеймера та інших захворювань із зміненим Αβ або експресією βΑΡΡ, таких як синдром Дауна та СНІД. Спосіб включає контактування зразка пацієнта, стосовно якого маються підозри щодо змін Αβ або експресії βΑΡΡ з антитілами даного винаходу, та визначення рівня Αβ або βΑΡΡ, який відрізняється від такого у контролі або порівняльному зразку. У деяких реалізаціях рівень Αβ у сироватці визначається перед та після введення антитіл до Αβ; й визначається збільшення рівня Αβ у сироватці. Призначення антитіла або поліпептиду даного винаходу може бути виконане будь-яким відомим способом, зокрема: внутрішньовенно, підшкірно, інгаляцією, внутрішньоартеріально, внутрішньом'язово, внутрішньосерцево, інтравентрикулярно, парентерально, внутрішньооболонково та внутрішньочеревинно. Застосування може бути системне, наприклад, внутрішньовенно, або місцеве. Це загалом стосується поліпептидів та полінуклеотидів даного винаходу. В іншому аспекті винаходом пропонуються набори та композиції, які включають одну або більше описані тут композиції. Ці набори, зазвичай знаходяться у відповідній упаковці та супроводжуються відповідними інструкціями, і також є придатними для будь-якого описаного тут способу. СТИСЛИЙ ОПИС ДЕЯКИХ ФІГУР(И) 96917 10 На Фіг.1 показана амінокислотна послідовність варіабельного регіону важкого ланцюга (SEQ ID NО:1) і варіабельного регіону легкого ланцюга (SEQ ID NО:2) антитіла 6G. Kabat CDR показано жирним шрифтом, Chothia CDR підкреслені. Амінокислотні залишки варіабельних регіонів важкого та легкого ланцюгів пронумеровано послідовно. На Фіг.2 показане епітопне картування антитіла 6G твердофазним імуноферментним аналізом ELISA. Пептиди Αβ (1-16, 1-28, 17-40, 17-42, 22-35, 28-40, 28-42, 1-38, 1-40, 1-42, 1-43 і 33-40) були імобілізовані на пластинці ELISA. Моноклональне антитіло 6G (20 нМ) було інкубоване протягом 1 години із різними імобілізованими пептидами. Антитіло 6G, зв'язане з імобілізованими Αβ пептидами, визначали з допомогою козиного антилюдського каппа HRP-кон'югованого вторинного антитіла. На Фіг.3 показане епітопне картування антитіла 6G твердофазним імуноферментним аналізом ELISA. Різні Αβ пептиди (позначені SEQ ID NO: 1829 зверху донизу) були імобілізовані на пластинці ELISA. Антитіло 6G було інкубоване протягом 1 години із різними імобілізованими пептидами. Антитіло 6G, зв'язане з імобілізованими Αβ пептидами, визначали з допомогою козиного антилюдського каппа HRP-кон'югованого вторинного антитіла. "ΝΒ" вказує на відсутність зв'язування. На Фіг.4 представлена схематична діаграма епітопа, на якому антитіло 6G зв'язується з Αβ. Показані відносні положення Αβ в протеїні амілоїдного прекурсора (АРР) і частині АРР в клітинній мембрані. "СТ99" означає С-кінець 99 амінокислот АРР. Показана амінокислотна послідовність позначена як SEQ ID NО:30. На Фіг.5 показана фотографія, на якій представлене імунозабарвлення експресійних клітин АРР моноклональним антитілом, спрямованим проти Αβ1-16 (m2324), і антитілом 6G. Верхні панелі показують клітини під флуоресцентним мікроскопом після того, як такі клітини були інкубовані з m2324 або 6G (кожна 5 мкг/мл), і встановлювали зв'язування вторинним Су3-кон'югованим козиним антимишиним або анти-людським антитілом. Нижня панель відображає клітини під мікроскопом. На Фіг.6 показане епітопне картування антитіла 2294 і 6G твердофазним імуноферментним аналізом ELISA. Різні Αβ пептиди (позначені SEQ ID NO:18-26, 31 і 27-29 зверху донизу) були імобілізовані на пластинці ELISA. Антитіла були інкубовані протягом 1 години із різними імобілізованими пептидами. Антитіло 6G, зв'язане з імобілізованими Αβ пептидами, визначали з допомогою козиного анти-людського каппа HRP-кон'югованого вторинного антитіла. Антитіло 2294, зв'язане з імобілізованими Αβ пептидами, визначали з допомогою козиного анти-мишиного антитіла, яке зв'язується як з важким, так і легким ланцюгом, і є HRP-кон'югованим вторинним антитілом. "ΝΒ" вказує на відсутність зв'язування.Цифри у колонках під "2294" і "6G" відповідають значенням абсорбції при 450 нм. ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Описаний винахід стосується антитіл і поліпептидів, які зв'язуються з С-кінцем пептиду Αβ. Ви 11 нахід також стосується полінуклеотидів, які кодують такі антитіла і/або поліпептиди. Винахід також стосується способів одержання і застосування таких антитіл і поліпептидів. Загальні методики При виконанні даного винаходу можуть використовуватися, якщо не зазначено інше, звичайні методи молекулярної біології (включно з рекомбінантними методами), мікробіології, клітинної біології, біохімії та імунології, якими володіють звичайні фахівці в даній галузі. Такі методики докладно описані в літературі, такій як, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and С.С. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and С Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995). Визначення "Антитіло" - молекула імуноглобуліну здатна специфічно зв'язуватися з мішенню, такою як, вуглеводи, полінуклеотиди, ліпіди, поліпептиди та інше, за допомогою, принаймні одного сайту розпізнавання, розташованого в варіабельному регіоні молекули імуноглобуліну. У контексті цього винаходу термін охоплює не лише інтактні поліклональні або моноклональні антитіла, але й їх фрагменти (такі як Fab, Fab', F(ab')2, Fv), бічні ланцюги (ScFv), їх мутанти, злиті протеїни які включають частину антитіла, та будь-які інші модифіковані конфігурації молекули імуноглобуліну, яка включає сайт розпізнавання антигену. Антитіло включає антитіло будь-якого класу, таке як IgG, IgA, або IgM (або їх підкласи), при цьому антитіла не повинні належати до якогось певного класу. Залежно від амінокислотної послідовності константного домену свого важкого ланцюга, імуноглобуліни можуть бути віднесені до різних класів. Існує п'ять основних класів імуноглобулінів: IgA, IgD, IgE, IgG, та IgM, при цьому деякі з них можуть бути також поділені на підкласи (ізотипи), наприклад lgG1, 96917 12 lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 та ІgА2. Константні домени важкого ланцюга, які відповідають різним класам імуноглобулінів також відповідно називаються альфа, дельта, іпсилон, гама та мю. Добре відомими є субодиничні структури та тривимірні конфігурації різних класів імуноглобулінів. У контексті цього винаходу "моноклональне антитіло" вказує на антитіло, отримане з популяції значною мірою гомогенних антитіл, тобто окремих антитіл, які представляють собою ідентичну популяцію за винятком можливих природних мутацій, які представлені в незначній кількості. Моноклональні антитіла є високо специфічними, спрямованими до єдиного антигенного сайту. Також, на відміну від отримування поліклональних антитіл, які звичайно включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінантів (епітопів), кожне моноклональне антитіло спрямовується до одного детермінанту на антигені. Прикметник "моноклональне" вказує на характер антитіла як такого, що отримане від значною мірою гомогенної популяції антитіл, та не може розумітися як таке, що потребує отримування антитіла будь-яким окремим способом. Наприклад, моноклональні антитіла, що використовуються згідно з цим винаходом, можуть бути створені за допомогою методу гібридоми, вперше описаного в Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495, або можуть бути отримані методом рекомбінантної ДНК, так як описано в патенті США 4,816,567. Також, моноклональні антитіла можуть бути виділені з фагових бібліотек, отриманих за допомогою методів описаних, наприклад, в McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554. У контексті цього винаходу "гуманізовані" антитіла вказує на форми антитіл не людського походження (наприклад, мишиних), які є специфічними химерними імуноглобулінами, ланцюгами імуноглобулінів, або їх фрагментами (такими як Fv, Fab, Fab', F(ab')2 або іншими підпослідовностями антитіл, що зв'язують антиген), які містять мінімальну послідовність, отриману з нелюдинного імуноглобуліну. Головним чином, гуманізовані антитіла є імуноглобулінами людини (антитіла реципієнти) в яких залишки гіперваріабельного регіону (CDR) реципієнта заміщені на залишки з CDR інших видів, крім людини (донорське антитіло), таких як миші, щурі, або кролі, які мають потрібну специфічність, афінність та здатність. У деяких випадках фрагменти каркасної області Fv (FR) від імуноглобуліну людини замінюються відповідними фрагментами нелюдського походження. Також гуманізоване антитіло може включати фрагменти, які не знайдені ні в антитілі реципієнта, ні в імпортованому CDR або каркасних послідовностях, але включаються для подальшого очищення та оптимізації характеристик антитіла. Загалом гуманізоване антитіло буде включати майже цілий з принаймні одного, та зазвичай двох, варіабельних доменів, в яких усі або значною мірою усі з областей CDR відповідають таким у імуноглобуліні не-людини та усі або значною мірою усі з регіонів FR є такими, як в консенсусній послідовності імуноглобуліну людини. Оптимально гуманізоване антитіло людини також буде включати принаймні частину константного регіону або домену імуног 13 лобуліну (Fc), звичайно, імуноглобуліну людини. Антитіла можуть мати модифіковані регіони Fc, як це показано в WO 99/58572. Інші форми гуманізованих антитіл мають один або більше CDR (один, два, три, чотири, п'ять, шість), які змінено порівняно з оригінальним антитілом, і які також називають одна або більше CDR, "похідні з" одного або більше CDR з оригінального антитіла. У контексті цього винаходу "антитіло людини" означає антитіло, яке має амінокислотну послідовність, яка відповідає такій, що продукується людиною та/або може бути створена за допомогою відомих на практиці методик створення антитіл людини або розкритих тут. Це визначення антитіла людини включає антитіла, які містять принаймні один поліпептид важкого ланцюга людини або принаймні один поліпептид легкого ланцюга людини. Одним з прикладів є антитіло, яке включає поліпептиди легкого ланцюга миші та важкого ланцюга людини. Антитіла людини можуть бути отримані за допомогою добре відомих з рівня техніки методів. В одній з реалізацій антитіло людини вибране з фангової бібліотеки, якщо ця фангова бібліотека експресує антитіла людини (Vaughan et аІ., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. МоІ. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. МоІ. Biol., 222:581). Антитіла людини також можуть бути створені введенням локусів імуноглобуліну людини в трансгенні тварини, наприклад, миші, в яких гени ендогенного імуноглобуліну частково або повністю інактивовані. Цей підхід описано в патентах США 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; та 5,661,016. Також, антитіло людини може бути виготовлене імобілізацією В-лімфоцитів людини, які виробляють антитіла спрямовані до цільового антигену (такі В-лімфоцити можуть бути отримані від особи або можуть бути імунізовані in vitro). Дивись, наприклад, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):8695; and U.S. 5,750,373. У контексті цього винаходу терміни "6G " та "антитіло 6G" використовуються взаємозамінно та вказують на антитіло, яке має амінокислотну послідовність важкого ланцюга, показану на SEQ ID NO:11, і амінокислотну послідовність легкого ланцюга, показану на SEQ ID NO:12. Амінокислотна послідовність варіабельних регіонів важкого та легкого ланцюгів показано на Фіг.1. Частини CDR антитіла 6G (включаючи Chothia та Kabat CDR) схематично показано на Фіг.1. Полінуклеотиди, які кодують важкий та легкий ланцюги наведені в SEQ ID NО:13 та SEQ ID NО:14. Характеристики 6G описані в Прикладах. Терміни "поліпептид", "пептид", "олігопептид", "поліпептид", "протеїн" використовуються тут взаємозамінно для позначення полімерів амінокислот будь-якої довжини. Полімер може бути лінійним або розгалуженим, він може містити модифіковані амінокислоти та може перериватися неамінними кислотами. Ці терміни також охоплюють амінокислотні полімери, які змінено природним шляхом або втручанням, наприклад, утворенням дисульфідних 96917 14 зв'язків, глікозилюванням, ліпідизацією, ацетилуванням, фосфорилуванням або будь-яким іншим впливом або маніпулюванням, таким як кон'югація з маркерним компонентом. Також в це визначення включаються, наприклад, поліпептиди, які містять один або більше аналогів амінокислот (включно, наприклад, з неприродними амінокислотами та ін.), а також інші відомі на практиці модифікування. Зрозуміло, що оскільки поліпептиди даного винаходу мають за основу антитіло, поліпептиди можуть зустрічатися як окремі ланцюги, так і зв'язані ланцюги. "Полінуклеотид" або "нуклеїнова кислота, " синонімічні терміни, вказує на полімери нуклеотидів будь-якої довжини, й включають ДНК та РНК. Нуклеотиди можуть бути дезоксирибонуклеотидами, рибонуклеотидами, модифікованими нуклеотидами або основами та/або їх аналогами або будьяким субстратом, який може бути включений до полімеру за допомогою ДНК або РНК полімерази. Полінуклеотид може містити модифіковані нуклеотиди, такі як метильовані нуклеотиди та їх аналоги. За їх наявності модифікації до структури нуклеотидів можуть вводитися до або після їхнього включення в полімер. Послідовність нуклеотидів може бути перервана ненуклеотидними компонентами. Полінуклеотид також може бути модифікований після полімеризації, наприклад, кон'югацією із маркерним компонентом. Інші типи модифікацій включають, наприклад, "кепи", заміна одного або більше природного нуклеотиду на аналог, міжнуклеотидні модифікації, такі як, наприклад, заміна незарядженими зв'язками (наприклад, метилфосфонатами, фосфотриестерами, фосфоамідатами, карбаматами, та ін.) та зарядженими зв'язками (наприклад, фосфоротіоатами, фосфородитіоатами, та ін.) такі, що містять навісні частки, такі як, наприклад, протеїни (наприклад, нуклеази, токсини, антитіла, сигнальні пептиди, ply-L-лізин, та ін.), такі що містять інтеркалятори (наприклад, акридин, псорален та ін.), такі, що містять хелатори (наприклад, метали, радіоактивні мітки, бор, окислювальні метали, та ін.), такі, що містять акілатори, із модифікованими зв'язками (наприклад, альфа аномерні нуклеїнові кислоти, та ін.), а також немодифіковані форми полінуклеотиду(ів). Також будь-яка з гідроксильних груп, які звичайно знаходяться на цурках. можуть бути заміщені, наприклад, фосфонатними групами, фосфатними групами, захищені стандартними захисними групами, або активовані для підготування додаткових зв'язків для додаткових нуклеотидів, або можуть бути кон'юговані з твердою підкладкою. 5' та 3' кінцеві ОН можуть бути фосфорильовані або заміщені амінами або органічними кер-групами, які мають від 1 до 20 атомів вуглецю. Інші гідроксили можуть бути модифіковані стандартними захисними групами. Полінуклеотиди також можуть містити аналогові форми цукрів рибози або дезоксирибози які є добре відомими, включаючи, наприклад, 2'-Ометил-, 2'-О-аліл, 2'-фторо- або 2'-азидо-рибозу, карбоксильні аналоги цукрів, -аномерні цукри, епімерні цукри, такі як арабіноза, ксилоза або ликсоза, піранозні цукри, фуранозні цукри, седогептулози, ациклічні аналоги та абазичні аналоги основ, 15 такі як метилрибозид. Один або більше фосфодіестерних зв'язків можуть бути заміщені альтернативними лінкерними групами. Ці альтернативні лінкерні групи включають, але не обмежуються, такими варіантами, в яких фосфат заміщено на P(O)S ("тіоат"), P(S)S ("дитіоат"), "(O)NR2 ("амідат"), P(O)R, P(O)OR', CO або ріСН2 ("формацеталь"), в яких кожний R або R' є, незалежно, Η або заміщеним або незаміщеним алкілом (1-20 °С), який можливо містить етерний (-О-) зв'язок, арил, алкеніл, циклоалкіл, циклоалкеніл або аралдил. Не всі зв'язки в полінуклеотиді повинні бути однакові. Даним описом заявляються усі згадані тут полінуклеотиди, включно з РНК та ДНК. "Варіабельний регіон" антитіла вказує на варіабельний регіон легкого ланцюга антитіла або варіабельний регіон важкого ланцюга антитіла, окремо або в комбінації. Варіабельні регіони важкого або легкого ланцюгів кожний складається з чотирьох каркасних регіонів (FR), зв'язаних трьома областями, що визначають компліментарність (CDR), також відомими як гіперваріабельні регіони. CDR в кожному ланцюзі тримаються разом в тісній близькості до FRs та, та з CDR з іншого ланцюга, формуючи сайт зв'язування антигену антитіла. Є принаймні дві методики визначення CDR: (1) підхід базується на міжвидовій варіабельності послідовностей (наприклад, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); та (2) підхід базується на кристалографічних дослідженнях комплексів антиген-антитіло (Al-lazikani et al. (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). У контексті цього винаходу CDR може вказувати на CDR, визначені іншим підходом або комбінацією обох підходів. "Константний регіон" антитіла вказує на константний регіон легкого ланцюга антитіла або константний регіон важкого ланцюга антитіла, окремо або в комбінації. Епітоп, який "переважно зв'язується" або "специфічно зв'язується" (у цьому описі терміни є взаємозамінними) з антитілом або поліпептидом є добре відомим терміном у практиці, а також методи визначення такого специфічного переважного зв'язування добре відомі на практиці. Про молекулу кажуть, що вона проявляє "специфічне зв'язування" або "переважне зв'язування", якщо вона взаємодіє або зв'язується більш часто, більш швидко, з більшою тривалістю та/або з більшою афінністю з певною клітиною або речовиною, ніж це відбувається з іншими клітинами або речовинами. Антитіло "специфічно зв'язується" або "переважно зв'язується" з мішенню, якщо воно зв'язується з більшою афінністю, авідністю, більш швидко та/або з більшою тривалістю ніж воно зв'язується з іншими речовинами. Наприклад, антитіло, яке специфічно або переважно зв'язується з епітопом Αβ1-40, є антитілом, яке зв'язується з більшою афінністю, авідністю, більш швидко та/або з більшою тривалістю, ніж воно зв'язується з іншими епітопами Αβ1-40 або не-Αβ1-40 епітопами. З даного визначення також зрозуміло, що, наприклад, антитіло (або частина або епітоп), який специфічно або переважно зв'язується з первинною мішенню, мо 96917 16 же або не може специфічно або переважно зв'язуватися із вторинною мішенню. Як таке, "специфічне зв'язування" або "переважне зв'язування" не обов'язково потребує (хоча може включати) виключного зв'язування. Взагалі, але необов'язково, зазначення зв'язування означає переважне зв'язування. Як використовується тут, "по суті чистий" вказує на матеріал, який принаймні, на 50 % чистий (тобто позбавлений домішок), більш переважно принаймні, на 90 % чистий, більш переважно принаймні, на 95 % чистий, більш переважно принаймні, на 98 % чистий, більш переважно принаймні, на 99 % чистий. "Клітина хазяїн" включає окрему клітину або культуру клітин, які можуть бути або були реципієнтами вектора(ів) для включення полінуклеотидних вставок. Клітини хазяїни включають потомство окремої клітини хазяїна, при цьому потомство може не бути повністю ідентичним (за морфологією або за геномною ДНК) до початкової материнської клітини, внаслідок природної, випадкової, або вимушеної мутації. Клітина хазяїн включає клітини in vivo, трансфіковані полінуклеотидом(ами) згідно даного винаходу. Термін "регіон Fc" використовується для позначення С-кінцевої області важкого ланцюга імуноглобуліну. "Регіон Fc" може бути природною послідовністю регіону Fc або варіантом регіону Fc. Хоча межі регіону Fc важкого ланцюга імуноглобуліну можуть змінюватися, регіон Fc важкого ланцюга IgG людини зазвичай визначається відрізком від амінокислотного залишку в положенні Cys226, або від Рrо230 до його карбоксильного кінця. Нумерація залишків в регіоні Fc є такою як число EU за Kabat. Kabat et al., Sequences of Proteins of Imunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. Регіон Fc імуноглобуліну звичайно включає два константні домени, СН2 та СН3. У контексті цього винаходу "рецептор Fc" та "FcR" описують рецептор, який зв'язується з регіоном Fc антитіла. Переважний FcR є природною послідовністю FcR людини. Більше того, переважний FcR є таким, що зв'язує антитіло IgG (гамарецептор) та включає рецептори підкласів FcRI, FcRII, та FcRIII, включно з алельними варіантами та альтернативними сплайсерними формами цих рецепторів. Рецептори FcRII включають FcRIIA ("активуючий рецептор") та FcRIIB ("інгібуючий рецептор"), які мають подібні амінокислотні послідовності, які в першу чергу відрізняються своїми цитоплазматичними доменами. FcRs розглянуто в Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:45792; Capel et al, 1994, Immunomethods, 4:25-34; та de Haas et aІ., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41. "FcR" також включає неонатальний рецептор, FcRn, який відповідає за перенесення материнського IgGs до плода (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; and Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249). "Цитотоксичність залежна від комплементу" та "CDC" вказує на лізинг мішені в присутності комплементу. Шлях активації комплементу ініціюється зв'язуванням першого компоненту системи компонентів (C1q) з молекулою (наприклад, антитілом), 17 яка утворює комплекс з розпізнаваним антигеном. Для оцінювання активації комплементу, можна було провести аналіз CDC, наприклад, як описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol.Methods, 202:163(1996). "Функціональний регіон Fc" має принаймні одну ефекторну функцію природної послідовності регіону Fc. Типові "ефекторні функції" включають зв'язування C1q; цитотоксичність, пов'язану із комплементом (CDC); зв'язування рецептора Fc; клітинно-опосередковану залежну від антитіла цитотоксичність (ADCC); фагоцитоз; клітинноповерхневі рецептори негативного регулювання (наприклад, рецептор В-клітин; BCR), та ін. Такі ефекторні функції зазвичай потребують, щоб регіон Fc був об'єднаний із доменом зв'язування (наприклад, варіабельним доменом антитіла), та може бути оцінений за допомогою різноманітних методів для оцінювання ефекторної функції таких антитіл, відомих на практиці. "Природна послідовність регіону Fc" включає амінокислотну послідовність, ідентичну до послідовності регіону Fc, знайдену в природі. "Варіант регіону Fc" включає амінокислотну послідовність, яка відрізняється від такої ж природної послідовності регіону Fc наявністю принаймні однієї амінокислотної модифікації, та при збереженні принаймні однієї ефекторної функції природної послідовності регіону Fc. Переважно варіант регіону Fc має принаймні одну амінокислотну заміну порівняно із природною послідовністю регіону Fc або з регіоном Fc батьківського поліпептиду, наприклад, від майже однієї до десяти амінокислотних замін, та переважно від майже однієї до п'яти амінокислотних замін в природній послідовності регіону Fc або в регіоні Fc батьківського поліпептиду. Варіант регіону Fc тут буде переважно мати принаймні майже 80 % ідентичності до природної послідовності регіону Fc та регіону Fc батьківського поліпептиду, та найбільш переважно принаймні майже 90 % ідентичності до послідовності, ще більш переважно принаймні майже 95 %, принаймні майже 96 %, принаймні майже 97 %, принаймні майже 98 %, принаймні майже 99 % ідентичності до послідовності. У контексті цього винаходу "антитіло-залежна клітинно-опосередкована цитотоксичність" та "ADCC" вказує на клітинно-опосередковану реакцію, в якій моноспецифічні клітини, які експресують рецептори Fc (FcRs) (наприклад, природні клітиникілери (NK), нейтрофіли, та макрофаги) розпізнають зв'язане антитіло на клітині-мішені і потім спричиняють лізис клітини-мішені. ADCC активність потрібної молекули може бути визначена за допомогою ADCC аналізу in vitro, такого як описано в патенті США 5,500,362 або 5,821,337. Придатні ефекторні клітини для такого аналізу включають мононуклеари периферичної крові (РВМС) та NK-клітини. Крім того або додатково, ADCC активність потрібної молекули може бути визначена in vivo, наприклад, на тваринній моделі, такій як описано в Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656. У контексті цього винаходу "ефективна доза" або "ефективна кількість" ліків, сполуки, або фармацевтичної композиції є кількістю, достатньою 96917 18 для досягнення лікувального або бажаного результату. Для профілактичного використання лікувальні або бажані результати включають такі результати, як виключення або зниження ризику, зменшення тяжкості або відтермінування початку хвороби, включаючи біохімічні, гістологічні та/або поведінкові симптоми хвороби, її ускладнення та проміжні патологічні фенотипи, представлені під час розвитку хвороби. Для терапевтичного застосування лікувальні або бажані результати включають такі клінічні результати, як пригнічення, пригнічення або зменшення утворення амілоїдних бляшок, зменшення, видалення, вичищення амілоїдних бляшок, покращення розпізнавання, обернення або затримування когнітивних відхилень, відділення або збільшення циркуляції розчинного пептиду Αβ в біологічних рідинах, зменшення одного або більше симптомів, спричинених хворобою (біохімічних, гістологічних та/або поведінкових), включно з їх ускладненнями та проміжними фенотипами, які мають місце під час розвитку захворювання, підвищення якості життя хворих на ці захворювання, зменшення дози інших медикаментів потрібних для лікування захворювання, посилення дії інших медикаментів, затримка розвитку хвороби та/або продовження життя пацієнтів. Ефективна доза може забезпечуватись в одному або більше призначеннях. Для цілей цього винаходу ефективна доза ліків, сполуки або фармацевтичної композиції є кількістю, достатньою для досягнення профілактичного або терапевтичного впливу, як прямо, так і опосередковано. Як розуміється в клінічному контексті ефективна доза ліків, сполуки або фармацевтичної композиції може бути досягнена або не досягнена поєднанням з іншими ліками, сполукою або фармацевтичною композицією. Отже, "ефективна доза" в цьому контексті може розумітися як застосування одного або більше терапевтичних агентів, при цьому у разі призначення одного агенту, він вважається призначеним у ефективній кількості, якщо в поєднанні з одним або більше іншими агентами може досягатися або досягається бажаний результат. У контексті цього винаходу "лікування" або "оброблення" є підходом до одержання лікувального або бажаного результатів, включно з клінічними результатами. Для цілей даного винаходу лікувальні або бажані результати включають, але не обмежуються наступними: інгібування, пригнічення або зменшення утворення амілоїдних бляшок, зменшення, видалення або вичищення амілоїдних бляшок, покращення розпізнавання, обернення або затримування когнітивних відхилень, відділення або збільшення циркуляції розчинного пептиду Αβ в біологічнихрідинах, зменшення пептиду Αβ (включно з розчинним, олігомерним та осадженим) в тканині (такій як мозок), інгібування, гальмування та/або зменшення накопичення пептиду Αβ в мозку, інгібування, гальмування та/або зменшення токсичної дії пептиду Αβ в тканині (такій як мозок), зменшення симптомів, спричинених хворобою, підвищення якості життя хворих на захворювання, зменшення дози інших медикаментів, потрібних для лікування за 19 хворювання, затримка розвитку хвороби та/або продовження життя пацієнтів. У контексті цього винаходу "затримування" розвитку хвороби Альцгеймера означає затримати, перешкодити, уповільнити, загальмувати, стабілізувати та/або відкласти розвиток хвороби. Ця затримка може бути різною за часом, залежно від історії хвороби та/або особи, що лікується. Спеціалісту в даній галузі зрозуміло, що достатня або значна затримка може, в дійсності, означати профілактику, внаслідок чого у індивіда не розвинеться хвороба. Способи, які "затримують" розвиток хвороби Альцгеймера, є способами, які знижують ймовірність розвитку хвороби у певний проміжок часу і/або знижують тривалість хвороби в такому проміжку часу порівняно з іншими способами. Такі порівняння зазвичай ґрунтуються на клінічних дослідженнях з використанням статистично значущої кількості суб'єктів. "Розвиток" хвороби Альцгеймера означає початок та/або розвиток хвороби Альцгеймера у індивіда. Розвиток хвороби Альцгеймера може бути визначений за допомогою стандартних клінічних методів, як ті, що описані у цій заявці. Однак, розвиток також вказує на те, що хвороба прогресує, тоді як на початку це може бути не виявлено. У контексті цього винаходу прогресування вказує на біологічний перебіг хворобливого стану, у цьому випадку, як визначається стандартною неврологічною експертизою, опитуванням пацієнта, або, можливо, визначається більш спеціалізованими дослідженнями. Перелік таких діагностичних досліджень включає, але не обмежується, нейрографію, виявляння зміни рівнів специфічних білків в сироватці або спинномозковій рідині (наприклад, амілоїдного пептиду та Таu), комп'ютерну томографію (СТ), та магнітно-резонансне дослідження (MRI). "Розвиток" включає виникнення, повторення, і початок. У контексті цього винаходу "початок" або "виникнення" хвороби Альцгеймера включає первинне виникнення та/або повторення. У контексті цього винаходу застосування "в поєднанні" включає одночасне застосування та/або застосування в різний час. Застосування в поєднанні також охоплює застосування в одній композиції або застосування в різних композиціях. У контексті цього винаходу застосування в поєднанні повинне охоплювати будь-який випадок, де антитіло до Αβ та інший агент вводяться індивіду, що може відбуватися одночасно та/або окремо. Як описано далі, зрозуміло, що антитіло до Αβ та інший агент можуть призначатися з різною частотою або проміжками. Наприклад, антитіло до Αβ може застосовуватися щотижня, тоді як інший агент може застосовуватися з меншою частотою. Зрозуміло, що антитіло до Αβ та інший агент можуть застосовуватися одним і тим самим шляхом або різними шляхами призначення. "Біологічний зразок" охоплює ряд зразків, які отримуються від індивідууму та можуть бути використані в діагностичних та моніторингових аналізах. Це визначення охоплює зразки крові та інших рідин біологічного походження, зразки щільних тканин, такі як зразки тканин, отриманих біопсією, або культура тканини або клітини, отримані з неї, 96917 20 та їхнє потомство. Визначення також включає зразки, якими маніпулювали будь-яким шляхом після їх отримування, як наприклад оброблянням реактивами, солюбілізацією або збагаченням певними компонентами, як наприклад білки або полінуклеотиди, або, заключенням в напівтверду або тверду масу для отримування зрізів. Термін "біологічний зразок" охоплює клінічний зразок, а також включає клітини в культурі, супернатантні клітини, клітинні лізати, сироватку, плазму, біологічну рідину і зразки тканин. "Індивід" (який також позначається як "суб'єкт") є ссавцем, більш переважно людиною. Ссавці також включають, але не обмежуються, сільськогосподарських тварин (такі я к корови), спортивних тварин, домашніх тварин (таких як коти, собаки, коні), приматів, мишей та щурів. У контексті цього винаходу "вектор" означає конструкт, здатний доставляти, та переважно експресувати один або більше потрібний ген(и) або послідовність(і) в клітині хазяїні. Приклади векторів включають, але не обмежуються цим переліком, вірусні вектори, голі експресійні вектори ДНК абоРНК, плазміди, косміди або фагові вектори, експресійні вектори ДНК або РНК, зв'язані із катіонними конденсуючими агентами, експресійні вектори ДНК або РНК, інкапсульовані в ліпосомах, і певні еукаріотичні клітини, як наприклад, клітини продуценти. У контексті цього винаходу "послідовність керування експресією" означає послідовність нуклеїнової кислоти, яка спрямовує транскрипцію нуклеїнової кислоти. В одній з реалізацій послідовність керування може бути промотором, таким як конститутивний промотор або індуцибельний промотор, або енхансер. Послідовність керування експресією є функціонально зв'язаною з послідовністю нуклеїнової кислоти, яка має транскрибуватися. У контексті цього винаходу "фармацевтично прийнятний носій" включає будь-який матеріал, який у поєднанні з активним інгредієнтом дозволяє інгредієнту зберігати біологічну діяльність і не реагувати з імунною системою суб'єкта. Приклади включають, але не обмежуються цим переліком, будь-який із стандартних фармацевтичних носіїв, як наприклад фосфатний буферний соляний розчин, воду, емульсії, як наприклад олійно/водна емульсія, і різні види зволожувачів. Розріджувачами, яким надається перевага, для аерозолю або парентерального застосування є буферний фосфатний розчин або нормальний (0,9 %) сольовий розчин. Склади, які містять ці носії, можуть бути отримані звичайними відомими методами (дивись, наприклад, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990; and Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000). Термін "kon" у контексті цього винаходу повинен вказувати значення константи швидкості асоціації антитіла з антигеном. Термін "koff" у контексті цього винаходу повинен вказувати значення константи швидкості дисоціації антитіла з комплексу антиген/антитіло. 21 Термін "KD" у контексті цього винаходу повинен вказувати на баланс константи дисоціації взаємодії антитіло-антиген. Композиції і способи одержання композицій анти-β-амілоїдних антитіл і поліпептидів Цей винахід стосується антитіла, яке зв'язується з С-кінцем Αβ пептиду. Винахід стосується антитіла або поліпептиду, який зв'язується з Αβ1-40, Αβ1-42 і Αβ1-43. У деяких варіантах антитіло або поліпептид зв'язується з Αβ1-40 з більш високою афінністю, ніж з Αβ1-42 і Αβ1-43. У деяких варіантах антитіло зв'язується з Αβ1-36, Αβ1-37, Αβ1-38 і Αβ1-39. У деяких варіантах антитіло зв'язується з Αβ22-35. У деяких варіантах антитіло зв'язується з Αβ28-40. У деяких варіантах антитіло або поліпептид зв'язується з епітопом на Αβ1-40, який включає амінокислоти 25-34 і 40. Цей винахід також стосується композицій, зокрема фармацевтичних композицій, які містять будь-яке з описаних антитіл або поліпептидів (таких як 6G і його варіантів, показаних в Таблиці 3, або поліпептид, отриманий з антитіла 6G і його варіантів, показаних в Таблиці 3; або описані тут полінуклеотиди. У контексті цього винаходу композиції включають одне або більше антитіл або поліпептидів (які можуть бути або не бути антитілом), які зв'язуються з С-кінцем Αβ1-40, та/або одним або більше полінуклеотидами, які включають послідовності, що кодують одне або більше антитіло або поліпептид, які зв'язуються з С-кінцем Αβ1-40. Ці композиції також можуть включати придатні ексципієнти, такі як фармацевтично прийнятні ексципієнти, включно з буферами, які добре відомі у даній галузі. Антитіла й поліпептиди даного винаходу характеризуються будь-якою (однією або більше) з наступних характеристик: (а) зв'язуються з Αβ1-40, Αβ1-42 і Αβ1-43; (b) зв'язуються з Αβ1-40, Αβ1-42 і Αβ1-43, при цьому з Αβ1-40 вони зв'язуються з більшою афінністю, ніж з Αβ1-42 і Αβ1-43; (с) зв'язуються з епітопом на Αβ1-40, який включає амінокислоти 2534 і 40; (d) зв'язуються з Αβ1-36, Αβ1-37, Αβ1-38 і Αβ139, але з меншою афінністю, ніж з Αβ1-40; (e) зв'язуються з Αβ22-37 з KD менше, ніж приблизно 1 мкМ; (f) зв'язуються з Αβ22-35; (g) зв'язуються з Ар28-40; (h) не зв'язуються з експресією АРР у клітині; (і) пригнічують утворення амілоїдних бляшок у суб'єкта; (j) зменшують амілоїдні бляшки у суб'єкта; (к) лікують, попереджують, полегшують один або більше симптоми хвороби Альцгеймера або інших захворювань, пов'язаних з накопиченням Αβ (наприклад, синдром Дауна, хвороба Паркінсона, мультиінфарктна деменція, легкий когнітивний розлад, церебральна амілоїдна ангіопатія, депресія, хвороба Кройтцфельдт-Якоба або деменція з тільцями Леві; (І) поліпшують когнітивну функцію. Антитіла та поліпептиди з порушеною функцією ефектора можуть демонструвати потрібні показники безпеки порівняно із іншими антитілами до Αβ. Наприклад, композиції даного винаходу не можуть спричиняти значні неприйнятні рівні одного або більше станів: кровотеча судин мозку (церебральний крововилив); менінгоенцефаліт (включно із зміною показників магнітно-резонансного сканування); підвищене число білих кров'яних тілець в 96917 22 спинномозковій рідині; запалення центральної нервової системи. Відповідно, винахід стосується будь-якого з наступних об'єктів або композицій (включно з фармацевтичними композиціями), які включають будь-який з зазначених об'єктів: (а) антитіло 6G або його варіанти, представлені в Таблиці 3; (b) фрагмент або регіон антитіла 6G або його варіанти, представлені в Таблиці 3; (с) легкий ланцюг антитіла 6G або його варіанти, представлені в Таблиці 3; (d) важкий ланцюг антитіла 6G або його варіанти, представлені в Таблиці 3; (е) один або більше варіабельних регіон(ів) з легкого ланцюга та/або важкого ланцюга антитіла 6G або його варіанти, представлені в Таблиці 3; (f) один або більше CDR(n) (один, два, три, чотири, п'ять або шість CDR) антитіла 6G або його варіанти, представлені в Таблиці 3; (g) CDR Н3 з важкого ланцюга антитіла 6G; (h) CDR L3 з легкого ланцюга антитіла 6G або його варіанти, представлені в Таблиці 3; (і) три CDR з легкого ланцюга антитіла 6G або його варіанти, представлені в Таблиці 3; (j) три CDR з важкого ланцюга антитіла 6G або його варіанти, представлені в Таблиці 3; (k) три CDR з легкого ланцюга антитіла та три CDR з важкого ланцюга, антитіла 6G або його варіанти, представлені в Таблиці 3; та (І) та антитіло, яке включає будьякий від (b) до (k). Винахід також стосується поліпептидів, які містять один або більше з вищевказаних об'єктів. Частини CDR антитіла 6G (включаючи Chothia та Kabat CDR) схематично показано на Фіг.1. Фахівець у цій галузі може визначити регіони CDR. Зрозуміло, що в деяких варіантах реалізації CDR може бути поєднанням Kabat та Chothia CDR (які також називаються "комбінованим CDR" або "розширеним CDR"). У деяких варіантах CDR є Kabat CDR. У деяких варіантах CDR є Chothia CDR. Інакше кажучи, у варіантах із більш ніж одним CDR, CDR може бути як Kabat, так і Chothia, комбінацією CDR, або їхньою комбінацією. У деяких варіантах винахід стосується поліпептиду (який може бути або не бути антитілом), який включає принаймні один CDR, принаймні два, принаймні три, принаймні чотири, принаймні п'ять або принаймні усі шість, які є значною мірою ідентичними до принаймні одного CDR, принаймні двох, принаймні трьох, принаймні чотирьох, принаймні п'ятьох або принаймні до усіх шести CDR з 6G або його варіантів, наведених у Таблиці 3. Інші варіанти реалізації включають антитіла, які мають принаймні два, три, чотири, п'ять або шість CDR(s), які є значною мірою ідентичними до принаймні двох, трьох, чотирьох, п'ятьох, шести CDR 6G або похідних 6G. У деяких варіантах реалізації принаймні один, два, три, чотири, п'ять або шість CDR(s) принаймні на 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, або 99 % ідентичні до принаймні одного, двох, трьох, чотирьох, п'ятьох, шести CDR з 6G або його варіантів, наведених в Таблиці 3. Зрозуміло, що для цілей даного винаходу специфічність зв'язування та/або загальна активність взагалі зберігається, хоча тривалість активності може змінюватися порівняно із 6G 23 або його варіантами, представленими в Таблиці 3 (може бути більшою або меншою). Винахід також стосується поліпептиду (який може бути або не бути антитілом), який включає амінокислотну послідовність 6G або її варіанти, показані в Таблиці 3, які мають будь-який із зазначених складових: принаймні 5 послідовних амінокислот, принаймні 8 послідовних амінокислот, принаймні майже 10 послідовних амінокислот, принаймні майже 15 послідовних амінокислот, принаймні майже 20 послідовних амінокислот, принаймні майже 25 послідовних амінокислот, принаймні майже 30 послідовних амінокислот з послідовності 6G або її варіантів, представлених в Таблиці 3, де принаймні 3 амінокислоти взяті з варіабельного регіону 6G (Фіг.1) або його варіантів, показаних в Таблиці 3. В одному з варіантів реалізації варіабельний регіон походить з легкого ланцюга 6G. В наступному варіанті реалізації варіабельний регіон походить з важкого ланцюга 6G. Приклад поліпептиду має послідовні амінокислоти (довжину вказано вище) з легкого та важкого ланцюга варіабельного регіону 6G. В наступному варіанті реалізації 5 (або більше) послідовних амінокислот утворюють гіперваріабельний регіон (CDR) 6G, показаний на Фіг.1. У деяких варіантах реалізації послідовні амінокислоти утворюють варіабельний регіон 6G. Афінність зв'язування антитіл та поліпептидів цього винаходу може бути різною і може не належати (але може й належати) до певних значень або діапазонів, які наведено щодо описаних нижче варіантів реалізації винаходу. Афінність зв'язування (KD) антитіл та поліпептидів даного винаходу з Αβ1-40 може бути приблизно від 0,10 до 0,80 нМ, приблизно від 0,15 до 0,75 нМ та приблизно від 0,18 до 0,72 нМ. У деяких реалізаціях, афінність зв'язування становить приблизно 2 пМ, приблизно 5 пМ, приблизно 10 пМ, приблизно 15 пМ, приблизно 20 пМ, приблизно 40 пМ або більше ніж приблизно 40 пМ. В одному з варіантів реалізації афінність зв'язування становить приблизно від 2 пМ до 22 пМ. У інших варіантах реалізації афінність зв'язування менша ніж приблизно 10 нМ, приблизно 5 нМ, приблизно 4нМ, приблизно 3 нМ, приблизно 2 н приблизно, приблизно 1 нМ, приблизно 900 пМ, приблизно 800 пМ, приблизно 700 пМ, приблизно 600 пМ, приблизно 500 пМ, приблизно 400 пМ, приблизно 300 пМ, приблизно 200 пМ, приблизно 150 пМ, приблизно 100 пМ, приблизно 90 пМ, приблизно 80 пМ, приблизно 70 пМ, приблизно 60 пМ, приблизно 50 пМ, приблизно 40 пМ, приблизно 30 пМ, приблизно 10 пМ. В інших варіантах реалізації афінність зв'язування становить майже 10 нМ. У інших варіантах реалізації афінність зв'язування менша ніж приблизно 10 нМ, менша ніж приблизно 50 нМ, менша ніж приблизно 100 нМ, менша ніж приблизно 150 нМ, менша ніж приблизно 200 нМ, менша ніж приблизно 250 нМ, менша ніж приблизно 500 нМ, або менша ніж приблизно 1000 нМ. У інших варіантах реалізації афінність зв'язування менша ніж приблизно 5 нМ. У інших варіантах реалізації афінність зв'язування менша ніж майже 1 нМ. У інших варіантах реалізації афінність зв'язування становить приблизно 0,1 нМ або приблизно 96917 24 0,07 нМ. У інших варіантах реалізації афінність зв'язування менша ніж приблизно 0,1 нМ або менша ніж приблизно 0,07 нМ. В інших варіантах реалізації афінність зв'язування має будь-яка з перерахованих значень: приблизно 10 нМ, приблизно 5 нМ, приблизно 1 нМ, приблизно 900 пМ, приблизно 800 пМ, приблизно 700 пМ, приблизно 600 пМ, приблизно 500 пМ, приблизно 400 пМ, приблизно 300 пМ, приблизно 200 пМ, приблизно 150 пМ, приблизно 100 пМ, приблизно 90 пМ, приблизно 80 пМ, приблизно 70 пМ, приблизно 60 пМ, приблизно 50 пМ, приблизно 40 пМ, приблизно 30 пМ, приблизно 10 пМ, приблизно 2 пМ, приблизно 5 пМ, приблизно 10 пМ, приблизно 15 пМ, приблизно 20 пМ, або приблизно 40 пМ. У деяких варіантах реалізації афінність має будь-яке із вказаних значень: приблизно 10 нМ, приблизно 5 нМ, приблизно 1 нМ, приблизно 900 пМ, приблизно 800 пМ, приблизно 700 пМ, приблизно 600 пМ, приблизно 500 пМ, приблизно 400 пМ, приблизно 300 пМ, приблизно 200 пМ, приблизно 150 пМ, приблизно 100 пМ, приблизно 90 пМ, приблизно 80 пМ, приблизно 70 пМ, приблизно 60 пМ, приблизно 50 пМ, приблизно 40 пМ, приблизно 30 пМ, приблизно 10 пМ. В інших варіантах реалізації афінність зв'язування становить приблизно 2 пМ, приблизно 5 пМ, приблизно 10 пМ, приблизно 15 пМ, приблизно 20 пМ, приблизно 40 пМ, або більша ніж приблизно 40 пМ. Антитіла і поліпептиди згідно з винаходом також може зв'язуватися з будь-яким одним або більше Αβ1-36, Αβ1-37, Αβ1-38, Αβ1-39, Αβ1-42 і Αβ1-43, але афінність зв'язування з будь-яким одним або більше з цих пептидів є меншою, ніж їх афінність зв'язування з Αβ1-40. У деяких варіантах реалізації винаходу KD антитіл або поліпептидів до будьякого одного або більше з Αβ1-36, Αβ1-37, Αβ1-38, Αβ139, Αβ1-42 і Αβ1-43 є щонайменше в 5 разів більшою, принаймні у 10 разів більшою, принаймні у 20 разів більшою, принаймні у 30 разів більше, принаймні у 40 разів більше, принаймні у 50 разів більше, принаймні у 80 разів більше, принаймні у 100 разів більше, принаймні у 150 разів більше, принаймні приблизно у 200 разів більше або принаймні приблизно у 250 разів більше, ніж KD до Αβ1-40. Винахід також стосується способів одержання будь-яких з цих антитіл або поліпептидів. Антитіла цього винаходу можуть бути одержані способами, які добре відомі у даній галузі техніки. Наприклад, таке антитіло може бути одержане імунізацією ссавця Αβ пептидом (таким як Αβ25-40 в якості імуногена). Поліпептиди можуть бути одержані протеолітичним або іншим розщепленням антитіл, методами рекомбінації (тобто окремими або злитими протеїнами) як описано вище або хімічним синтезом. Поліпептиди антитіл, зокрема коротші поліпептиди, які мають приблизно до 50 амінокислот, можуть бути легко виготовлені хімічним синтезом. Способи хімічного синтезу добре відомі спеціалістам у цій галузі або доступні комерційно. Наприклад, антитіла можуть бути отримані за допомогою автоматичного поліпептидного синтезатора, за допомогою твердофазного методу. Дивись наприклад, патента США 5,807,715; 4,816,567 та 6,331,415. 25 Відповідно до ще однієї альтернативи антитіла можуть бути одержані рекомбінантним шляхом методами, які добре відомі у цій галузі техніки. В одному з варіантів реалізації полінуклеотиди включають кодуючі послідовності важкого та/або легкого ланцюгів варіабельного регіону антитіла 6G, наведені в SEQ ID NО:9 та SEQ ID NО:10. В інших варіантах реалізації полінуклеотиди, які включають нуклеотидну послідовність, наведену в SEQ ID NО:9 та SEQ ID NО:10, клоновані в один або більше векторів для експресії або розмноження. Послідовність потрібного антитіла може підтримуватися у векторі в клітині-хазяїні, а клітина хазяїн може бути розведена та заморожена для подальшого використання. Вектори (включно з експресійними векторами) та клітини-хазяїни описуються далі у цій заявці. Цей винахід також охоплює фрагменти одноланцюгового варіабельного регіону ("scFv") антитіл винаходу, таких як 6G. Фрагменти одноланцюгового варіабельного регіону можуть бути отримані зв'язуванням варіабельних регіонів з легкого та/або тяжкого ланцюгів за допомогою коротких зв'язуючих пептидів. Bird et al. (1988) Science 242:423-426. Прикладом короткого зв'язуючого пептиду є (GGGGS)3, який утворює місток приблизно у 3,5 нм карбоксильним кінцем одного варіабельного регіону та амінним кінцем іншого варіабельного регіону. Також створені та використані лінкери інших послідовностей. Bird et al. (1988). Лінкери, у свою чергу, можуть бути модифіковані для додаткових функцій, таких як приєднання ліків або приєднання до твердої підкладинки. Одноланцюгові варіанти можуть бути отримані як рекомбінантно так і шляхом синтезу. Для синтетичного продукування scFv може бути використаний автоматичний синтезатор. Для рекомбінантного продукування scFv в придатну клітину-хазяїн, таку як еукаріотична, дріжджова, рослинна, клітина комахи або ссавця або прокаріотична, така як Е. соІі, може бути введена плазміда, яка кодує scFv. Полінуклеотиди, які кодують потрібний scFv, можуть бути отримані звичайним методом маніпулювання, таким як лігування полінуклеотидів. Отримані scFv можуть бути виділені за допомогою добре відомих з рівня техніки методів очищення протеїнів. Також охоплюються інші форми антитіл, такі як діабоді. Діабоді є бівалентними, біспецифічними антитілами, в яких домени VH та VL експресується на одному поліпептидному ланцюзі, але за допомогою лінкера, який занадто малий, щоб дозволити поділити ланцюг між двома доменами, таким чином примушує домени з'єднуватися з комплементарними доменами іншого ланцюга й створювати два сайти зв'язування антигену (Дивись, наприклад, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Наприклад, біспецифічні антитіла, моноклональні антитіла, які мають специфічність зв'язування з принаймні двома різними агентами, можуть бути отримані за допомогою описаних тут антитіл. Способи створення біспецифічних антитіл добре відомі спеціалістам в цій галузі. (Дивись, наприклад, Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 96917 26 121:210). Традиційно рекомбінантне отримування біспецифічних антитіл базувалося на сумісній експресії двох імуноглобулінових ланцюгових пар легкий ланцюг-важкого ланцюг з двома важкими ланцюгами, які мають різні специфічності (Millstein and Cuello, 1983, Nature 305, 537-539). Згідно з одним із підходів створення біспецифічних антитіл варіабельні домени антитіла з потрібними зв'язувальними специфічностями (сайтами комбінуючими антитіло-антиген) злиті в послідовності константного домену імуноглобуліну. Злиття переважно відбувається з константним доменом важкого ланцюга імуноглобуліну, який має принаймні одну частину шарніру, регіони СН2 та СН3. Бажано мати перший константний регіон важкого ланцюга (СН1), який має сайт, необхідний для зв'язування легкого ланцюга, який представлено в принаймні одному злитті. ДНК, які кодують злиття важкого ланцюга імуноглобуліну і, якщо необхідно, легкого ланцюга імуноглобуліну, вставлені в окремі експресійні вектори й сумісно трансфікуються в придатний організм хазяїн. Це забезпечує високу гнучкість у виборі взаємних співвідношень трьох поліпептидних фрагментів у варіантах реалізації, де рівні кількості трьох поліпептидних ланцюгів, використаних при конструюванні, забезпечують найвищий результат. Однак, можливо вставляти кодуючі послідовності для двох або усіх трьох поліпептидних ланцюгів в один експресійний вектор, коли експресія принаймні двох поліпептидних ланцюгів в рівних співвідношеннях дає високі результати або коли співвідношення не мають практичного значення. У одному підході біспецифічні антитіла складені з гібридного важкого ланцюга імуноглобуліну із сайтом специфічності зв'язування на одному кінці, гібридної імуноглобулінової пари важкий ланцюг-легкий ланцюг (забезпечення другої специфічності зв'язування) на іншому кінці. Ця асиметрична структура з легким ланцюгом імуноглобуліну тільки в одній половині біспецифічної молекули полегшує розділення бажаної біспецифічної суміші від небажаних комбінацій ланцюгів імуноглобулінів. Цей підхід описано в заявці РСТ No. WO 94/04690, опублікованій 3 березня 1994. Гетерокон'югатні антитіла, які включають два ковалентно з'єднаних антитіла, також становлять частину об'єму правової охорони винаходу. Такі антитіла були використані для націлювання клітин імунної системи на небажані клітини (патент США 4,676,980) та для лікування інфекції ВІЛ (заявки WO 91/00360 та WO 92/200373; ЕР 03089). Гетерокон'югатні антитіла можуть бути отримані за допомогою звичайних методів перехресного зшивання. Придатні агенти для перехресного зшивання та методи добре відомі спеціалістам в даній галузі та описані в патенті США 4,676,980. Химерні або гібридні антитіла можуть бути отримані in vitro за допомогою відомих методів хімії протеїнового синтезу, включно із залученням агентів для перехресного зшивання. Наприклад, імунотоксини можуть бути сконструйовані за допомогою реакції дисульфідного обміну або утворенням тіоестерних зв'язків. Приклади придатних 27 96917 реагентів для цих цілей включають імінотіолат та метил-4-меркаптобутирімідат. Гуманізовані антитіла, які включають один або більше CDR антитіла 6G один або більше CDR похідних антитіла 6G можуть бути одержані будьяким відомим з рівня техніки методом. Наприклад, для гуманізації антитіла можуть бути застосовані чотири загальні етапи. Це: (1) визначення нуклеотидної та вирахування амінокислотної послідовності початку варіабельних доменів легкого ланцюга та важкого ланцюга антитіла (2) створення гуманізованого антитіла, тобто визначення який каркасний регіон антитіла використовуватиметься у процесі гуманізації; (3) власне методи/методики гуманізації; (4) трансфікування та експресія гуманізованого антитіла. Дивись наприклад, патент США 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 6,331,415; 5,530,101; 5,693,761; 5,693,762; 5,585,089; 6,180,370; 5,225,539; 6,548,640. В гуманізованих рекомбінантних антитілах, частина Fсможе бути змінена для уникнення взаємодії із Fс рецептором та комплементом імунної системи. Цей тип модифікування було розроблено доктором Майком Кларком з Департаменту патології Кембріджського університету та методи отримання таких антитіл описані в заявці WO 99/58572, опублікованій 18 листопада 1999. Наприклад, константний регіон може бути створений з декількох розібраних константних регіонів людини, щоб уникати імунної відповіді, якщо антитіло призначене для використання в клінічних випробуваннях і лікування людей. Дивись, наприклад, патент США 5,997,867 та 5,866,692. Цей винахід охоплює модифікації антитіла 6G, включно з функціонально еквівалентними антитілами, які значно не впливають на їх властивості та варіанти, які посилюють або знижують активність та/або афінність. Наприклад, амінокислотна послі 28 довність антитіла 6G може бути мутована для отримання антитіла з потрібною афінністю зв'язування з пептидом Αβ1-40. Модифікування поліпептидів є звичайною практикою і не потребує подальшого докладного опису. Модифікування поліпептидів наведено в Прикладах. Приклади змінених поліпептидів включають поліпептиди з консервативними замінами амінокислотних залишків, одним або більше видаленням або доповненням амінокислот, які не спричиняють значної зміни функціональної активності, або використання хімічних аналогів. Вставки амінокислотних послідовностей включають аміно- та/або карбокси-термінальні злиття, розташовані від одного залишку до поліпептиду, що містить сто або більше залишків, а також вставки всередину послідовності одного або багатьох амінокислотних залишків. Приклади термінальних вставок включають антитіло з Ν-термінальним метіонільним залишком або антитіло, злите з тегом епітопу. Інші інсерційні варіанти молекули антитіла включають злиття до Ν- або С-кінця антитіла ферменту або поліпептиду, який збільшує період сироваткового напіврозпаду антитіла. Варіанти замін мають як мінімум один видалений амінокислотний залишок в молекулі антитіла та інший залишок, вставлений на його місце. Сайти, які представляють найбільший інтерес для мутагенезу замінами, включають гіперваріабельний регіон, але також беруться до уваги зміни в FR. Консервативні заміни наведені в Таблиці 1 під заголовком "консервативні заміни". Якщо такі заміни призводять до зміни біологічної активності, тоді можуть бути введені більш значні заміни, позначені як "приклад замін" в Таблиці 1, або як це описується нижче по відношенню до класів амінокислот, й проведено скринінг продукту. Таблиця 1 Амінокислотні замісники Оригінальний залишок Ala (A) Arg (R) Asn (N) Asp (D) Cys (C) GІn (Q) Glu (E) Gly (G) His (H) He (I) Leu (L) Lys (K) Met (M) Phe (F) Pro (P) Ser (S) Thr (T) Trp (W) Tyr (Y) Val (V) Консервативні заміни Val Lys GІn Glu Ser Asn Asp Ala Arg Leu He Arg Leu Tyr Ala Thr Ser Tyr Phe Leu Типові заміни Val; Leu; He Lys; GІn; Asn GІn; His; Asp, Lys; Arg Glu; Asn Ser; Ala Asn; Glu Asp; GІn Ala Asn; GІn; Lys; Arg Leu; Val; Met; Ala; Phe; Норлейцин Норлейцин; Не; Val; Met; Ala; Phe Arg; GІn; Asn Leu; Phe; He Leu; Val; He; Ala; Tyr Ala Thr Ser Tyr; Phe Trp; Phe; Thr; Ser He; Leu; Met; Phe; Ala; Норлейцин 29 Істотні модифікації в біологічних властивостях антитіла виконані підбором замін, які значно відрізняються в їх дії на підтримання (а) структури каркасу поліпептиду в області заміни, наприклад, як листова або спіральна конформація, (b) заряд або гідрофобність молекули на цільовому сайті, або (с) більша частина бічного ланцюга. Природні залишки поділені на дві групи, за властивостями їх бічних ланцюгів: (1) Неполярні: Норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, He; (2) Полярні незаряджені: Cys, Ser, Thr, Asn, GІn; (3) Кислотні (негативно заряджені): Asp, Glu; (4) Основні (позитивно заряджені): Lys, Arg; (5) Залишки які впливають на орієнтацію ланцюга: Gly, Pro; та (6) Ароматичні: Trp, Tyr, Phe, His. Неконсервативні заміни виконуються змінюванням члену з числа цих класів на інший клас. Будь-який цистеїновий залишок, не залучений до підтримування правильної конформації антитіла, може бути заміщений звичайно серином для покращення окисної стабільності молекули та попередження зайвих поперечних зшивок. Натомість, цистеїнові зв'язки можуть бути додані в антитіло для покращення його стабільності, зокрема у випадках, коли антитіло є фрагментом антитіла, таким як фрагмент Fv. Амінокислотні модифікації можуть представляти собою від заміни або модифікації однієї або більше амінокислот до перебудови цілого регіону, такого як варіабельний регіон. Зміни у варіабельному регіоні можуть змінювати афінність та/або специфічність зв'язування. У деяких варіантах реалізації в домені CDR можуть бути виконані не більше, ніж від однієї до п'яти консервативних амінокислотних замін. У інших варіантах реалізації в домені CDR можуть бути виконані не більше, ніж від однієї до трьох консервативних амінокислотних замін. В інших варіантах реалізації домен CDR є CDR H3 та/або CDR L3. Модифікації також включають глікозильовані та неглікозильовані поліпептиди, а також поліпептиди з іншими пост-трансляційними модифікаціями, як наприклад, глікозилювання з різними цукрами, ацетилування і фосфорилування. Антитіла є глікозильованими в консервативних положеннях своїх константних регіонів (Jefferis and Lund, 1997, Chem. lmmunol. 65:111-128; Wright and Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). Олігосахаридні бічні ланцюги імуноглобулінів впливають на функцію протеїнів (Boyd et al., 1996, МоІ. Immunol. 32:13111318; Wittwe and Howard, 1990, Biochem. 29:41754180) та на міжмолкекулярні взаємодії між частинами глікопротеїнів, які можуть впливати на конформацію та представлення тривимірної поверхні глікопротеїну (Hefferis and Lund, supra; Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416). Олігосахариди також можуть спрямовувати певний глікопротеїн до певних молекул завдяки розпізнаванню специфічних структур. Глікозилювання антитіл також впливає на антитіло-залежну клітинну цитотоксичність (ADCC). Зокрема, було повідом 96917 30 лено, що клітини СНО з експресією β(1,4)-Nацетилглюкозамінілтрансферази III (GnTIII), що регулюється тетрацикліном, де глюкозилтрансфераза каталізує розрізання GlcNAc, мають покращену активність ADCC (Umana et al., 1999, Mature Biotech. 17:176-180). Глікозилювання антитіл зазвичай буває Nзв'язане або О-зв'язане. N-зв'язаність вказує на приєднання вуглеводної частини до бічного ланцюга аспарагінового залишку. Трипептидна послідовність аспарагін-Х-серин, аспарагін-Х-треонін, та аспарагін-Х-цистеїн, де X є будь-якою амінокислотою, за виключенням проліну, є розпізнавальними послідовностями для ферментативного приєднування вуглеводної частини до бічного ланцюга аспарагінового залишку. Отже, присутність одного з цих трипептидних послідовностей в поліпептиді створює потенціальний сайт глікозилювання. О-зв'язане глікозилювання вказує на приєднання N-ацетилгалактозаміну, галактози або ксилози до гідроксиамінокислоти, найчастіше серину або треоніну, хоча також може використовуватися 5-гідроксипролін або 5-гідроксилізин. Приєднання сайтів глікозилювання до антитіла може бути легко здійснене шляхом зміни послідовності амінокислот таким чином, що вона містить один або більше з описаних вище трипептидних послідовностей (N-зв'язаних сайтів глікозилювання). Зміна також може здійснюатися доповненням або заміною одним або більше сериновими або треоніновими залишками до оригінальної послідовності антитіла(О-зв'язаних сайтів глікозилювання). Тип глікозилювання антитіл також може бути змінений без зміни відповідної нуклеотидної послідовності. Глікозилювання сильно залежить від клітини хазяїна, яка використовується для експресії антитіла. Оскільки типи клітин, які використовуються для експресування рекомбінантних глікопротеїнів, наприклад антитіл, в якості можливих ліків дуже рідко бувають природними клітинами, можна очікувати варіативність у типаху глікозилювання антитіл (Дивись, наприклад, Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070). До того ж, до вибору клітини хазяїна, факторів, які впливають на глікозилювання під час створення рекомбінантних антитіл, додаються спосіб вирощування, склад середовища, щільність культури, оксигенація, рН, схеми очищення та подібне. Для зміни типу отриманого глікозилювання в певних організмах-хазяїнах були запропоновані різні методи, включно з введенням або надекспресуванням певних ферментів, включених у продукування олігосахаридів (патента США 5,047,335; 5,510,261 та 5,278,299). Глікозилювання або певні типи глікозилювання можуть бути усунені з глікопротеїну ферментативно, наприклад за допомогою ендонуклеази Η (Endo Η), N-глікозидази F як описано в прикладі 1, ендоглікозидази F1, ендоглікозидази F2, ендоглікозидази F3. До того ж, рекомбінантні клітини хазяїни можуть бути створені з допомогою генної інженерії дефективними по відношенню до деяких типів полісахаридів. Ці та подібні методики добре відомі фахівцям у цій галузі. 31 Інші методи або модифікації включають багато загальновідомих на практиці методів, включно з, але не обмежуючись цим переліком, ферментативними засобами, оксидативним заміщенням та хелатуванням. Можуть застосовуватися модифікації, наприклад для приєднання мітки при імуноаналізі. Модифіковані поліпептиди 6G, отримані загальноприйнятими на практиці методами, можуть бути скринінговані загальноприйнятими методами. Деякі з них будуть описані нижче в Прикладах. Інші модифікації антитіл включають антитіла, які були модифіковані як описано в публікації РСТ WO 99/58572, опублікованій 18 листопада 1999 року. Ці антитіла охоплюють на додаток до домену зв'язування, спрямованого на цільову молекулу, ефекторний домен, що має амінокислотну послідовність істотно гомологічну до всієї або частини константного домену важкого ланцюга імуноглобуліну людини. Ці антитіла здатні зв'язуватися з молекулою-мішенню без запуску значного комплемент-залежного лізису або клітинноопосередкованого руйнування мішені. У деяких варіантах реалізації винаходу ефекторний домен здатний специфічно зв'язуватися з FcRn та/або FcRllb. Вони зазвичай створені на основі химерних доменів, які походять з двох або більше доменів СН2 важких ланцюгів імуноглобуліну людини. Модифіковані таким чином антитіла частково придатні для використання в терапії хронічних захворювань з використанням антитіл для запобігання запаленню та інших побічних реакцій при звичайній терапії антитілами. Винахід включає методи афінного процесингу. Наприклад, афінно оброблені антитіла можуть бути отримані добре відомими у даній галузі методами (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779783; Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Schier et al., 1995, Gene, 169:147155; Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9; Hawkins et al, 1992, J. МоІ. Biol., 226:889-896 та WO 2004/058184). Наступні методи можуть використовуватися для підбору антитіл та для характеристики CDR. Одним із шляхів охарактеризування CDR антитіла та/або зміни (зокрема покращення) афінності зв'язування поліпептиду, такого як антитіло, називається "скануванням бібліотеки мутагенезу". Зазвичай, сканування бібліотеки мутагенезу працює наступним чином. Одне або більше амінокислотне положення в CDR заміщується двома або більше (наприклад, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, або 20) амінокислотами за допомогою загальновизнаних методів. Це дає невелику бібліотеку клонів (у деяких варіантах по одній на кожну аналізовану амінокислоту), кожна нараховує два або більше члени (якщо заміщені дві або більше амінокислоти в кожній позиції). Зазвичай бібліотека також включає клон, який містить природну (незаміщену) амінокислоту. Невелика кількість клонів, наприклад приблизно 20-80 клонів (залежно від складності бібліотеки), з кожної бібліотеки скринінгуються на афінність зв'язування з цільовим поліпептидом (або іншою мішенню для 96917 32 зв'язування), й визначаються кандидати зі збільшеною, такою самою, зменшеною або відсутньою афінністю. Способи визначення афінності зв'язування добре відомі спеціалістам в даній галузі. Афінність зв'язування може бути визначена за допомогою аналізу поверхневого плазмонного резонансу ВІАсоrе, який чутливий до афінності зв'язування, більшої у 2 рази або більше. ВІАсоrе, зокрема, є корисним, коли початкове антитіло вже зв'язується з порівняно високою афінністю, наприклад KD приблизно 10 нМ або нижче. Скринінг за допомогою поверхневого плазмонного резонансу ВІАсоrе описаний у Прикладах до цієї заявки. Афінність зв'язування може бути визначена за допомогою Kinexa Biocensor, аналізів сцинтиляторної близькості, ELISA, імуноаналізу ORIGEN (IGEN), затухання флуоресценції, переносу флуоресценції та/або виявлення дріжджами. Афінність зв'язування може бути скринінгована за допомогою відповідного біоаналізу. У деяких варіантах реалізації кожне амінокислотне положення CDR заміщене (у деяких варіантах по одній) усіма 20 природними амінокислотами за допомогою загальноприйнятих методів (деякі з них описані тут). Це дає невелику бібліотеку клонів (у деяких варіантах по одній на кожну аналізовану амінокислоту), кожна з яких нараховує 20 членів (якщо заміщені 20 амінокислот в кожній позиції). У деяких варіантах бібліотека, що скринінгується, включає заміну в двох або більше положеннях, які можуть бути такими самими в CDR або в двох або більше CDR. Отже, бібліотека може містити заміщення в одному положенні CDR. Бібліотека може містити заміщення в двох або більше положеннях CDR. Бібліотека може містити заміщення в 3, 4, 5, більше положеннях. Вказані положення можуть знаходитися в двох, трьох, чотирьох, п'ятьох або шести CDR. Заміщення можуть бути отримані за допомогою кодонів низької надлишковості. Дивись, наприклад, Таблицю 2 в Balint et al., (1993) Gene 137(1):109-18). CDR може бути CDR H3 та/або CDR13. CDR може бути одним або більше з CDR11, CDR12, CDR13, CDR H1, CDR H2, та/або CDR H3. CDR може бути Kabat CDR, Chothia CDR, або подовженим CDR. Кандидати з покращеним зв'язуванням можуть бути секвеновані, для того щоб визначити мутантне заміщення в CDR, яке призводить до поліпшеної афінності (що також називають "покращеним" заміщенням). Кандидати з покращеним зв'язуванням можуть бути секвеновані, для того щоб визначити мутантне заміщення в CDR, яке зберегло зв'язування. Може бути проведено багато циклів скринінгу. Наприклад, кандидати (кожний має амінокислотні заміни в одному або більше положеннях в одному або більше CDR) з покращеним зв'язуванням також є корисними для створювання вторинної бібліотеки, яка містить принаймні оригінальні та заміщені амінокислоти в кожному поліпшеному положенні CDR (тобто амінокислотне положення CDR, при якому заміщений мутант має поліпшене зв'язування). Виготовлення, скринінг або селектування цієї бібліотеки обговорюватиметься далі. 33 Сканування бібліотеки мутагенезу також надає засоби характеризування CDR на предмет частоти клонів з покращеним зв'язуванням, таким самим зв'язуванням, зниженим зв'язуванням та відсутнім зв'язуванням, також надає інформацію про важливість кожного амінокислотного положення для стабільності комплексу антиген-антитіло. Наприклад, якщо в положенні CDR зв'язування зберігається, коли змінено щодо всіх 20 амінокислот, то це положення визнається як таке, що найменше потребує антигенного зв'язування. Навпаки, якщо в положенні CDR зв'язування зберігається лише при невисокому відсотку замін, то це положення визнається як таке, що є важливим для функціонування CDR. Отже, методи сканування бібліотеки мутагенезу дають інформацію про положення в CDR, які можуть бути збіднені на багато різних амінокислот (включно з усіма 20 амінокислотами), та положення в CDR, які не можуть бути змінені або які можуть бути змінені лише щодо декількох амінокислот. Кандидати з покращеною афінністю можуть бути об'єднані у вторинну бібліотеку, яка включає поліпшені амінокислоти, природні амінокислоти цього положення, а також може включати додаткові заміни в цьому положенні залежно від складності потрібної бібліотеки або дозволяє використовувати метод скринінгу або селектування. Також, якщо потрібно, близькі амінокислотні положення можуть бути рандомізовані до принаймні двох або більше амінокислот. Рандомізування сусідніх амінокислот може забезпечити додаткову конформаційну гнучкість в мутантному CDR, який, в свою чергу, може, забезпечувати або полегшувати введення більшої кількості покращуючих мутацій. Бібліотека може також охоплювати заміну в положеннях, які не показали поліпшену афінність в першому скринінгу· Друга бібліотека скринінгована та селектована на виявлення членів із поліпшеною та/або зміненою афінністю за допомогою відомих на практиці методів, включно з аналізом поверхневого плазмонного резонансу ВІАсоrе та селектування за допомогою будь-якого відомого на практиці методу селектування, включно з фаговим дисплеєм, дріжджовим дисплеєм та рибосомним дисплеєм. Винаходом також охоплюються злиті протеїни, які включають один або більше фрагментів або регіонів з антитіл (таких як 6G) або поліпептидів даного винаходу. В одному з варіантів пропонується злитий поліпептид, який включає принаймні 10 послідовних амінокислот варіабельного регіону легкого ланцюга, показаного на SEQ ID NО:2 (Фіг.1) та/або принаймні 10 послідовних амінокислот варіабельного регіону важкого ланцюга, показаного на SEQ ID NО:1 (Фіг.1). В одному з варіантів пропонується злитий поліпептид, який включає принаймні майже 10, принаймні майже 15, принаймні майже 20, принаймні майже 25 або принаймні майже 30 послідовних амінокислот варіабельного регіону легкого ланцюга, показаного на SEQ ID NО:2 (Фіг.1) та/або принаймні майже 10, принаймні майже 15, принаймні майже 20, принаймні майже 25 або принаймні майже 30 послідовних амінокислот варіабельного регіону важкого 96917 34 ланцюга, показаного на SEQ ID NO:1 (Фіг.1). В іншому варіанті реалізації злитий поліпептид включає варіабельний регіон важкого ланцюга та/або варіабельний регіон легкого ланцюга 6G як показано на SEQ ID NО:2 та SEQ ID NО:1 на Фіг.1. В іншій реалізації, злитий поліпептид включає один або більше CDR(s) 6G. В інших реалізаціях, злитий поліпептид включає CDR Н3 та/або CDR L3 антитіла 6G. Для цілей даного винаходу злитий протеїн 6G включає одне або більше антитіло 6G та іншу амінокислотну послідовність, до якої він не приєднаний в природній молекулі, наприклад, гетерологічну послідовність або гомологічну послідовність з іншого регіону. Типові гетерологічні послідовності включають, але не обмежуються "тегами", такими як тег FLAG або тег 6His. Теги добре відомі спеціалістам в даній галузі. Злитий поліпептид 6G може бути створений з допомогою добре відомих з рівня техніки методів, наприклад, рекомбінантно або синтетично. Зазвичай 6G злиті протеїни даного винаходу одержують препаруванням експресуючого полінуклеотиду, який їх кодує, за допомогою описаних тут методів рекомбінації, хоча вони також можуть бути препаровані іншими методами, відомими на практиці, включно з, наприклад, хімічним синтезом. Винахід також стосується композицій, які включають антитіла або поліпептиди 6G, кон'юговані (наприклад, зв'язані) з агентом, який сприяє приєднанню до щільної основи (такі як біотин або авідин). Для спрощення посилання робиться на 6G або антитіла в цілому, виходячи з того, що ці методи стосуються будь-якого описаного тут варіанту зв'язування з Αβ1-40. Кон'югація загалом вказує на зв'язування цих компонентів, як описано тут. Зв'язування (яке зазвичай зв'язує ці компоненти в близькому зв'язку, принаймні підчас введення) може бути досягнене будь-якими способами. Наприклад, пряме реагування між агентом та антитілом можливе, коли кожен з них має замісника, здатного реагувати з іншим. Наприклад, нуклеофільна група, така як аміно або сульфгідрильна група, з одного боку може бути здатною реагувати з групою, що містить карбоніл, такою як ангідрид або галід кислоти, або з алкільною групою, яка має відхідну групу (наприклад, галід) з іншого боку. Антитіло або поліпептид даного винаходу можу бути зв'язані з маркерним агентом (який також називається "міткою"), таким як флуоресцентна молекула, радіоактивна молекула або будь-які інші мітки, відомі на практиці. Мітки відомі на практиці звичайно дають сигнал (або прямо або опосередковано). Винахід також стосується композицій (включно з фармацевтичними композиціями) та наборів, які містять антитіло 6G, та, як випливає з цього опису, будь-яке з усіх антитіл та/або поліпептидів, описаних тут. Антитіла до Пептиду Αβ та поліпептиди, які мають послаблену дію ефектора Антитіла та поліпептиди (включно з фармацевтичними композиціями, що містять антитіла та поліпептиди), описані в цій заявці, можуть мати погіршене функціонування ефектора. У контексті цього винаходу антитіло або поліпептид, які мають 35 "погіршене функціонування ефектора" (використовується взаємозамінно з "імунологічно інертний" або "частково імунологічно інертний") вказує на антитіла або поліпептиди, які не мають будь-якого функціонування ефектора або мають знижену активність або активності функціонування ефектора (порівняно з антитілами або поліпептидами, які мають немодифікований або природний ефекторний регіон), наприклад, які не мають активності або знижену активність в одному з наступних: а) запуск лізису, опосередкованого комплементом; b) стимулювання цитотоксичності, опосередкованої антитіло-залежними клітинами (ADCC); та с) активує мікроглію. Ефекторна функція може бути знижена на приблизно будь-який відсоток: 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % та 100 %. У деяких варіантах антитіло зв'язується з бета-амілоїдним пептидом без запуску значного лізису, опосередкованого комплементом, або клітинно-опосередкованого руйнування мішені. Наприклад, сайт зв'язування з рецептором Fc в константному регіоні може бути модифікований або мутований для позбавлення або зниження афінності зв'язування з певними рецепторами Fc, такими як FcRI, FcRII, та/або FcRIII. Для спрощення посилання робитиметься без вказуватися антитіла, виходячи з того, що також маються на увазі поліпептиди. Система нумерації EU (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest; 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Healthy, Bethesda, Md., 1991) використовується для позначання амінокислотних залишків в константному регіоні (наприклад, антитіла IgG), який змінено або мутовано. Нумерація може застосовуватися для специфічного типу антитіл (наприклад, lgG1) або видів (наприклад, людей), маючи на увазі те, що подібні зміни можуть бути зроблені в різних типах та видах антитіл. У деяких варіантах антитіло, яке специфічно зв'язується пептидом Αβ, містить константний регіон важкого ланцюга, який має погіршене функціонування ефектора. Константний регіон важкого ланцюга може мати природну послідовність або бути варіантом. У деяких реалізаціях амінокислотна послідовність природного константного регіону важкого ланцюга мутована, наприклад, амінокислотною заміною, вставкою та/або делецією, причому функціонування ефектора константного регіону порушено. У деяких реалізаціях Nглікозилювання регіону Fc константного регіону важкого ланцюга також може бути змінене, наприклад, повним або частковим видаленням, причому функціонування ефектора константного регіону порушено. У деяких варіантах функціонування ефектора порушене видаленням N-глікозилювання регіону Fc (наприклад, в домені СН2 в IgG) пептиду проти Αβ. У деяких варіантах N-глікозилювання регіону Fc видаляється мутуванням глікозильованої амінокислоти або фланкуванням залишків, які є частиною послідовності розпізнавання Nглікозилювання в константному регіоні. Трипептидна послідовність аспарагін-Х-серин, аспарагін-Хтреонін та аспарагін-Х-цистеїн, де X є будь-якою амінокислотою, за виключенням проліну, є розпі 96917 36 знавальними послідовностями для ферментативного приєднання вуглеводної частини до бічного ланцюга N-глікозилювання. Матування будь-яких амінокислот в трипептидних послідовностях константного регіону призводить до аглікозилювання IgG. Наприклад, сайт N-глікозилювання N297 lgG1 та lgG3 людини може бути мутований в A, D, Q, К, або Н. дивись, Tao et al., J. Immunology 143: 25952601 (1989); та Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76 (1998). Було показано, що lgG1 та lgG3 людини із заміною в Asn-297 на GІn, His, або Lys не зв'язується з FcRI людини й не активує комплемент із повністю втраченою здатністю зв'язування C1q у lgG1 та значно зниженою у lgG3. У деяких варіантах, амінокислота N в трипептидних послідовностях мутована в одну з перерахованих амінокислот: А, С, D, Е, F, G, Н, І, К, L, М, Р, Q, R, S, Т, V, W, Y. У деяких варіантах амінокислота N в трипептидних послідовностях мутована із консервативною заміною. У деяких варіантах амінокислота X в трипептидних послідовностях мутована в пролін. У деяких варіантах амінокислота S в трипептидних послідовностях мутована в A, D, Е, F, G, Н, І, К, L, Μ, Ν, Р, Q, R, V, W, Y. У деяких варіантах амінокислота Τ в трипептидних послідовностях мутована в A, D, Е, F, G, Н, І, К, L, Μ, Ν, Р, Q, R, V, W, Y. У деяких варіантах амінокислота С в трипептидних послідовностях мутована в A, D, Е, F, G, Н, І, К, L, Μ, Ν, Р, Q, R, V, W, Y. У деяких варіантах амінокислота, яка іде наступною за три пептидом, мутована в Р. У деяких варіантах ферментативно видалено N-глікозилювання в константному регіоні (наприклад, N-глікозидазою F, як описано в прикладі 1, ендоглікозидазою F1, ендоглікозидазою F2, ендоглікозидазою F3, та ендоглікозидазою Н). Видалення N-глікозилювання також може бути досягнуте виробленням антитіла в клітинній лінії, яка дефіцитна на N-глікозилювання. Wright et al., J. lmmunol.160(7):3393-402 (1998). У деяких варіантах амінокислотний залишок взаємодіє з олігосахаридом, приєднаним до сайту N-глікозилювання константного регіону, є мутованим для зменшення афінності зв'язування FcRI. Наприклад, можуть бути мутовані F241, V264, D265 в lgG3 людини. Дивись, Lund et al., J. Immunology 157:4963-4969 (1996). У деяких варіантах функціонування ефектора порушено модифікуванням таких регіонів як 233236, 297 і/або 327-331 в IgG людини, як це описано в заявці РСТ WO 99/58572 та Armour et aІ., Molecular Immunology 40: 585-593 (2003); Reddy et al., J. Immunology 164:1925-1933 (2000). Антитіла, описані в РСТ WO 99/58572 та Armour et al., включають, на додаток до домену зв'язування, спрямованого на цільову молекулу, ефекторний домен, що має амінокислотну послідовність, по суті гомологічну до всієї або частини константного домену важкого ланцюга імуноглобуліну людини. Ці антитіла здатні зв'язуватися з молекулою-мішенню без запуску значного комплемент-залежного лізису, або клітинно-опосередкованого руйнування мішені. У деяких варіантах ефекторний домен має знижену афінність зв'язування з FcRI, FcRlla, та FcRIII. У деяких варіантах ефекторний домен здатний специфічно зв'язуватися з FcRn та/або 37 FcRllb. Вони звичайно створені на основі химерних доменів, які походять з двох або більше доменів СН2 важких ланцюгів імуноглобуліну людини. Модифіковані таким чином антитіла частково придатні для використання в терапії хронічних захворювань антитілами, для запобігання запаленню та інших побічних реакцій при звичайній терапії антитілами. У деяких варіантах константний регіон важкого ланцюга антитіла є важким ланцюгом lgG1 людини який має будь-які наступні мутації: 1) А327А330Р331 на G327S330S331; 2) E233L234L235G236 на P233V234A235 із видаленням G236; 3) E233L234L235 на P233V234A235; 4) E233L234L235G236A327A330P331 на P233V234A235G327S330S331 із видаленням G236; 5) E233L234L235A327A330P331 на P233V234A235G327S330S331; та 6) N297 на А297 або будь-яку іншу амінокислоту за виключенням N. Такі мутації можуть поєднуватися, наприклад, будь-які з мутацій 1)-5) можуть поєднуватися з 6). У деяких варіантах константний регіон важкого ланцюга антитіла є важким ланцюгом lgG4, який має наступні мутації: E233F234L235G236 на P233V234A235 із видаленим G236; E233F234L235 на P233V234A235; P228L235 на S228E235; N297 на Q297; та E233F234L235G236N297 на P233V234A235G236Q297. Константний регіон антитіл також може бути модифікований для зниження активації комплементу. Наприклад, активація комплементу антитіл IgG після зв'язування з компонентом С1 може бути знижена мутуванням амінокислотних залишків в константному регіоні фрагменту зв'язування С1 (наприклад, C1q фрагмент зв'язування). Було показано, що мутування Ala для кожного D270, К322, Р329, Р331 в ІgG1 людини значно знижує здатність антитіла до зв'язування з C1q та активації комплементу. Для мишачого lgG2b, фрагмент зв'язування C1q містить залишки Е318, К320, та К322. Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184 (2000); Duncan et al., Nature 322: 738-740 (1988). Фрагмент зв'язування C1q в E318, K320 та К322, визначений для мишачого lgG2b, вважається спільним для усіх інших ізотипів антитіл. Duncan et al., Nature 322: 738-740 (1988). Активність зв'язування C1q для lgG2b може бути порушена заміною одного з трьох зазначених залишків на залишки, які мають невідповідну функціональність на бічному ланцюзі. Необов'язково замінювати іонні залишки лише на Ala для порушення зв'язування C1q. Також можна використовувати інші алкілзаміщені залишки, такі як Gly, lІe, Leu або Val, або такі ароматичні залишки, як Phe, Туr, Тrр та Pro замість будь-якого з трьох залишків для порушення зв'язування C1q. Також можна використовувати такі полярні неіонні залишки як Ser, Thr, Cys та Met замість залишків 320 на 322, але не 318, для порушення зв'язування C1q. Винахід також стосується антитіл, які мають погіршене функціонування ефектора, де антитіло має модифікований шарнірний регіон. Афінність зв'язування в IgG людини для рецептора Fc може бути модульована модифікуванням шарнірного регіону. Canfield et al., J. Exp. Med. 173:1483-1491 (1991); Hezareh et al., J. Virol. 75:12161-12168 96917 38 (2001); Redpath et al., Human Immunology 59:720727 (1998). Такі амінокислотні залишки можуть бути мутовані або видалені. Модифікований шарнірний регіон може включати цілий шарнірний регіон, отриманий з антитіла іншого класу або підкласу антитіл з домену СН1. Наприклад, домен (СН1) класу антитіла IgG може бути приєднаний до шарнірного регіону антитіла класу lgG4. Також новий шарнірний регіон може включати частину природного або повторну одиницю, в якій кожна одиниця в повторі походить з природного шарнірного регіону. У деяких варіантах природний шарнірний регіон змінено перетворенням одного або більше цистеїнового залишку на нейтральний залишок, такий як аланін, або перетворенням відповідно заміщених залишків на цистеїнові залишки. Патент США 5,677,425. Такі заміни проводяться за допомогою відомих методів протеїнової хімії та переважно методик генної інженерії, описаних в цій заявці. Також в описаних тут методах можуть бути застосовані поліпептиди, які специфічно зв'язуються з пептидом Αβ та злиті з константним регіоном важкого ланцюга, який має погіршене функціонування ефектора. У деяких варіантах поліпептид містить послідовність, отриману з антитіла 6G або його варіантів, наведених у Таблиці 3. У деяких варіантах поліпептид є отриманим з однодоменного антитіла, яке зв'язує пептид Αβ. Однодоменні антитіла можуть бути отримані за допомогою добре відомих з рівня техніки методів. Omidfaret al., Tumour Biol. 25:296-305 (2004); Herring et al., Trends in Biotechnology 21:484-489(2003). У деяких варіантах антитіло або поліпептид не є фрагментом F(ab')2. У деяких варіантах антитіло або поліпептид не є фрагментом Fab. У деяких варіантах антитіло або поліпептид не є одноланцюговим антитілом scFv. У деяких варіантах антитіло або поліпептид є ПЕГільованим фрагментом F(ab')2. У деяких варіантах антитіло або поліпептид не є фрагментом Fab. У деяких варіантах антитіло або поліпептид є ПЕГільованим одноланцюговим антитілом scFv. Також можуть застосовуватися інші відомі на практиці методи отримування антитіл, які мають погіршене функціонування ефектора. Антитіла й поліпептиди з модифікованими константними регіонами можуть аналізуватися одним або більше методами для визначення рівня зниження біологічної активності функціонування ефектора порівняно з вихідним антитілом. Наприклад, здатність антитіла або поліпептиду зі зміненим регіоном Fc зв'язувати комплемент або рецептори Fc (наприклад, рецептори Fc на мікроглії), або змінений шарнірний регіон може бути оцінений за допомогою описаних тут аналізів, а також загальновизнаних аналізів. РСТ WO 99/58572; Armour et al., Molecular Immunology 40: 585-593 (2003); Reddy et al., J. Immunology 164:1925-1933 (2000); Song et al., Infection and Immunity 70:5177-5184 (2002). Конкурентний аналіз може використовуватися для визначення чи зв'язуються два антитіла із одним тим самим епітопом, розпізнаючи ідентичні або просторово перекривні епітопи або антитіло 39 конкурентно інгібує інше антитіло. Ці методи є добре відомими на практиці. Звичайно, антиген імобілізується на багатолунковій планшеті й визначається здатність немічених антитіл блокувати зв'язування мічених антитіл. Звичайними мітками для конкурентних аналізів є радіоактивні мітки або ферментні мітки. Антитіла та поліпептиди, які специфічно зв'язуються з Αβ, можуть бути скринінговані на ефективність видалення амілоїдних відкладень та інші корисні ефекти, такі як покращення розпізнавання. Наприклад, антитіла та поліпептиди можуть бути введені тварині, яка має патологію Альцгеймера. Відомі різні тваринні моделі хвороби Альцгеймера. Після введення можуть бути досліджені звичайними методами рівень компактних та дифузних амілоїдних бляшок, аналіз поведінки на розпізнавання, активація мікроглії та мікрокрововитоку, як це показано в Прикладі 2. РСТ WO 2004/032868; Wilcock et al., J. Neurosci. 23:3745-3751 (2003); Wilcock et al., J. Neuroinflammation 1:24 (2004). Полінуклеотиди, вектори і клітини-хазяї Винахід також стосується виділених полінуклеотидів, які кодують антитіла та поліпептиди даного винаходу (включно з антитілами, які містять поліпептидні послідовності варіабельних регіонів легкого ланцюга та важкого ланцюга, показаних на Фіг.1), та векторів й клітин-хазяїнів, які містять цей полінуклеотид. Відповідно, винахід стосується полінуклеотидів (або композицій, включно з фармацевтичними композиціями), які включають будь-яке з наступних: (а) антитіло 6G або його варіанти, показані в Таблиці 3; (b) фрагмент або регіон антитіла 6G або його варіанти, показані в Таблиці 3; (с) легкий ланцюг антитіла 6G або його варіанти, показані в Таблиці 3; (d) важкий ланцюг антитіла 6G або його варіанти, показані в Таблиці 3; (e) один або більше варіабельних регіон(ів) з легкого ланцюга та/або важкого ланцюга антитіла 6G або його варіанти, показані в Таблиці 3; (f) один або більше CDR(n) (один, два, три, чотири, п'ять або шість CDR) антитіла 6G або його варіанти, показані в Таблиці 3; (g) CDR Н3 з важкого ланцюга антитіла 6G; (h) CDR L3 з легкого ланцюга антитіла 6G або його варіанти, показані в Таблиці 3; (і) три CDR з легкого ланцюга антитіла 6G або його варіанти, показані в Таблиці 3; (j) три CDR з важкого ланцюга антитіла 6G або його варіанти, показані в Таблиці 3; (k) три CDR з легкого ланцюга антитіла та три CDR з важкого ланцюга, антитіла 6G або його варіанти, показані в Таблиці 3; та (l) та антитіло, яке включає будь-який від (b) до (k). У деяких варіантах полінуклеотид містить один або обидва полінуклеотид(и), наведені в SEQ ID NО:9 та SEQ ID NО:10. В іншому аспекті винахід стосується полінуклеотидів, які кодують будь-яке з описаних тут антитіл (включно з фрагментами антитіл) або поліпептидів, таких як антитіл та поліпептидів, які мають послаблену дію. Полінуклеотиди можуть бути одержані способами, які добре відомі у даній галузі техніки. В іншому аспекті, винаходом пропонуються композиції (такі як фармацевтичні композиції), які включають будь-який з полінуклеотидів винаходу. 96917 40 У деяких варіантах композиція включає вектор експресії, який містить полінуклеотид, що кодує описане тут антитіло 6G. У інших варіантах композиція включає вектор експресії, який містить полінуклеотид, що кодує будь-яке з описаних тут антитіл або поліпептидів. У деяких варіантах композиція включає один або обидва полінуклеотиди, наведені в SEQ ID NО:9 та SEQ ID NО:10. Експресійні вектори та введення полінуклеотидних композицій також описані в цій заявці. В іншому аспекті винахід стосується способу отримання описаних тут полінуклеотидів. Полінуклеотиди, комплементарні до будь-якої з цих послідовностей, також охоплюються даним винаходом. Полінуклеотиди можуть бути одноланцюговими (кодуючими або антисмисловими) або дволанцюговими, або бути молекулою ДНК (геномною, кДНК або синтетичною) або РНК. Молекули РНК включають молекули НnРНК, які включають інтрони та відповідають молекулі ДНК однонаправленим чином, та молекули мРНК, які не містять інтронів. Також кодуючі та некодуючі послідовності можуть, але не потребують, бути представленими в полінуклеотиді даного винаходу, а полінуклеотид може, але не потребує, бути зв'язаним з молекулою та/або супутніми матеріалами. Полінуклеотиди можуть включати природні послідовності (тобто ендогенні послідовності, які кодують антитіла або їх частини) або можуть включати варіанти таких послідовностей. Полінуклеотидні варіанти містять одну або більше заміни, доповнення, видалення та/або вставки, так що імунореактивність кодованого поліпептиду не буде зменшена порівняно із природною імунореактивною молекулою. Вплив на імунореактивність кодованого поліпептиду загалом може бути оцінена як описано у цій заявці. Варіанти переважно мають принаймні приблизно 70 % ідентичності, більш переважно принаймні 80 % ідентичності та найбільш переважно принаймні 90 % ідентичності до полінуклеотидної послідовності, яка кодує природне антитіло або його частину. Два полінуклеотиди або поліпептиди вважаються ідентичними, якщо їх послідовності нуклеотидів або амінокислот в двох послідовностях є однаковими, коли порівнюються для найбільшої відповідності, як описано далі. Порівнювання двох послідовностей звичайно проводиться порівнюванням послідовностей за допомогою порівнювальної рамки на ідентичність та певних областей на подібність послідовностей. "Порівнювальна рамка" як використовується тут, вказує на сегмент, принаймні майже 20 послідовних положень, звичайно від 30 до майже 75, від 40 до майже 50, в якій послідовність може бути порівняна відносно послідовності з такою ж кількістю послідовних положень після оптимального суміщення двох послідовностей. Оптимальне суміщення послідовностей для порівняння може бути проведене за допомогою програми Megalign в пакеті програмного забезпечення з біоінформатики Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, Wis.), при використанні стандартних параметрів. Ця програма має декілька схем суміщування, описаних в наступних джерелах: Dayhoff, 41 Μ.Ο. (1978) A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington D.C. Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, Μ., 1987, МоІ. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, Calif.; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730. Термін "відсоток ідентичності послідовності" визначається порівнянням двох оптимально суміщених послідовностей у рамці для порівняння принаймні майже 20 положень, причому частина полінуклеотидної або поліпептидної послідовності в порівняльній рамці може містити вставки або делеції (тобто пропуски) на 20 процентів або менше, звичайно від 5 до 15 процентів, або від 10 до 12 процентів, порівняно із зразковою послідовністю (яка не має вставок або делецій) для оптимального суміщення двох послідовностей. Відсоток розраховується визначенням кількості позицій в яких ідентичні нуклеїновокислотні основи або залишки амінокислот зустрічаються в обох послідовностях для досягнення максимального співпадіння положень, поділеним на кількість положень, які співпали в зразковій послідовності (тобто, розміром рамки), та помноженням результату на 100 для отримання відсотку ідентичності послідовності. Варіанти також або альтернативно можуть бути значною мірою гомологічними до природного гену або до частини або комплементарними до нього. Такі полінуклеотидні варіанти здатні гібридизуватися за помірно жорстких умов до природної послідовності ДНК, яка кодує природне антитіло (або комплементарну послідовність). Придатні "помірно жорсткі умови" включають попереднє промивання в розчині 5 X SSC, 0,5 % SDS, 1,0 мМ EDTA (рН 8,0); гібридизацію при 50 °C-65 °C., 5 X SSC, протягом ночі; з наступним подвійним промиванням при 65 °C. протягом 20 хвилин кожне 2 X, 0,5 X та 0,2 X SSC із 0,1 % SDS. У контексті цього винаходу "умови високої жорсткості" або "дуже жорсткі умови" є такими як: (1) використання для відмивання низької іонної сили та високої температури, наприклад, 0,0015 M натрій-хлорид/0,0015 M натрій цитрат/0,1 % натрій додецилсульфат при 55 °C; (2) використання при гібридизації денатуруючого агенту, такого як формамід, наприклад, 50 % (об/об) формамід із 0,1 % бичачим сироватковим альбуміном/0,1 % Ficoll, 0,1 % полівінілполіпіролідон, 0,05 Μ натрійфосфатний буфер із рН 6,5 із 0,75 Μ NaCI, 0,075 Μ цитрат натрію при 42 °C; або (3) використання 50 % формаміду, 5 X SSC (0,075 M NaCI, 0,075 Μ цитрат натрію), 50 мМ фосфат натрію (рН 6,8), 0,1 % пірофосфату натрію, 5 X Розчин Denhardt's, 96917 42 УЗ-сонована ДНК сперми лосося (50 мкг/мл), 0,1 % SDS, та 10 % сульфат декстрану при 42 °C, із промиванням при 42 °C в 0,2 X SSC (хлорид натрію/цитрат натрію) та 50 % формамід при 55 °C, наступне промивання "високої жорсткості" полягало в 0,1 X SSC, що містить EDTA при 55 °C. Середній спеціаліст має розуміти, як підібрати температуру, іонну силу, та інше, якщо необхідно пристосувати фактори, такі як довжина зонду та подібне. Середньому спеціалісту буде зрозуміло, що в результаті виродження генетичного коду існує багато нуклеотидних послідовностей, які кодують описаний тут поліпептид. Деякі з цих полінуклеотидів мають малу гомологію з нуклеотидною послідовністю природного гену. Тим не менше, полінуклеотиди, які відрізняються внаслідок використання інших кодонів, також охоплюються даним винаходом. Також алелі генів, які містять наведені тут полінуклеотидні послідовності, є складовими суті даного винаходу. Алелі є ендогенними генами, які змінені внаслідок однієї або більше мутацій, таких як делеції, вставки та/або заміщення нуклеотидів. Одержана мРНК та протеїн може, але не потребує, бути змінена в структурі або функції. Алелі можуть бути визначені за допомогою стандартних методів (таких як гібридизація, ампліфікація та/або порівняння з базою даних послідовностей). Полінуклеотиди даного винаходу можуть бути отримані хімічними методами, рекомбінантними методами або ПЛР. Методи хімічного синтезу полінуклеотидів є добре відомими й не потребують подальшого докладного опису. Досвідчена в даній галузі особа може використати наведені тут послідовності та промисловий синтезатор ДНК для отримання потрібної послідовності ДНК. Для отримання полінуклеотидів методами рекомбінації полінуклеотид, який включає потрібну послідовність, може бути вставлений в придатний вектор, а вектор, в свою чергу, може бути введений в придатну клітину-хазяїна для реплікації та ампліфікації, що описується далі. Полінуклеотиди можуть бути введені в клітину-хазяїна з допомогою методик, добре відомих з рівня техніки. Клітини можуть бути трансформовані введенням екзогенних полінуклеотидів прямим введенням, ендоцитозом, трасфекцією, F-сполученням або електропорацією. Одразу після введення екзогенний полінуклеотид може зберігатися в клітині як неінтегрований вектор (такий як плазміда) або інтегрованим в геном клітини-хазяїна. Полінуклеотиди, ампліфіковані таким чином, можуть бути виділені з клітини-хазяїна методами, які добре відомі у даній галузі техніки. Дивись, наприклад, Sambrook et al. (1989). Також ПЛР дозволяє репродукувати послідовності ДНК. Технологія ПЛР є добре відомою й докладного описана в патенті США 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 та 4,683,202, а також в PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston (1994). РНК може бути отримана за допомогою виділеної ДНК у відповідному векторі та вставлена в придатну клітину-хазяїна. Коли клітина реплікуєть 43 ся й ДНК транскрибується в РНК, РНК може бути виділена за допомогою методів, добре відомих спеціалістам в даній галузі, які наведено, наприклад, в Sambrook et al., (1989). Придатні клонувальні вектори можуть бути сконструйовані за стандартними методиками або можуть обиратися з великої кількості готових векторів. При виборі клонувального вектора можуть робитися зміни відповідно до використовуваної клітини-хазяїна, придатні клонувальні вектори звичайно можуть мати здатність до самореплікації, можуть нести одну мішень для певної рестрикційної ендонуклеази та/або можуть нести гени, які будуть маркерами під час селектування клонів, які містять цей маркер. Придатні приклади включають плазміди та бактеріальні віруси, наприклад, pUC18, pUC19, Bluescript (наприклад, pBS SK+) та їх похідні, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, фагові ДНК, та човникові вектори, такі як pSA3 та рАТ28. Ці та багато інших клонувальних векторів постачаються комерційними виробниками, такими як BioRad, Strategene, та Invitrogen. Експресійні вектори звичайно представляють собою репліковні полінуклеотидні конструкти, які містять полінуклеотид відповідно до даного винаходу. Передбачається, що експресійний вектор повинен реплікуватися в клітині-хазяїні як епісоми або як інтегрована частина хромосомальної ДНК. Придатні експресійні вектори включають, але не обмежуються, плазміди, вірусні вектори, включно з аденовірусами, адено-асоційованими вірусами, ретровірусами, космідами та експресійними векторами, описаними в публікації РСТ WO 87/04462. Векторні компоненти звичайно можуть включати, але не обмежуватися, одне або більше з наступних: сигнальну послідовність; точку початку реплікації; один або більше маркерні гени; придатні керувальні елементи (такі як промотори, енхансери та термінатор). Для експресії (тобто, трансляції) звичайно також потрібен один або більше трансляційний керувальний елемент, такий як сайти зв'язування з рибосомою, сайти ініціації трансляції та стоп кодон. Вектори, які містять потрібні полінуклеотиди, можуть бути введені в клітину-хазяїна будь-яким придатним способом, включно з електропорацією, трансфекцією з використанням хлориду кальцію, хлориду рубідію, фосфату кальцію DEAEдекстрану або інших речовин; мікрочастковим бомбардуванням; ліпофекцією та інфікуванням (наприклад, коли вектором є інфікуючий агент, такий як вірус коров'ячої віспи). Вибір вектора або полінуклеотиду для введення буде залежати від характеристик клітини-хазяїна. Винахід стосується клітин-хазяїнів, які містять будь-який з описаних тут полінуклеотидів. Будь-які клітини-хазяїни, здатні надекспресувати гетерологічні ДНК, можуть бути використані для цілей виділення генів, що кодують потрібні антитіло, поліпептид або протеїн. Не обмежуючі приклади клітинхазяїнів ссавців включають, але не обмежуються цим переліком, клітини COS, HeLa та СНО. Дивись, наприклад, РСТ WO 87/04462. Придантні клітини-хазяїни не ссавців включають прокаріоти (такі як Е. соІі або В. subtillis) та дріжджі (такі як S. 96917 44 cerevisae, S. pombe або К. lactis). Переважно клітини-хазяїни можуть експресувати кДНК на рівні приблизно у 5 разів вищому, більш переважно 10раз$ів вищому, ще більш переважно 20 разів вищому, ніж відповідне потрібне ендогенне антитіло або протеїн, якщо воно є в клітині-хазяїні. Скринінг клітин-хазяїнів на специфічність зв'язування з Αβ1-40 проводиться за допомогою імуноаналізу або FACS. Так можуть бути виявлені клітини, які надекспресують потрібне антитіло або протеїн. Діагностичне застосування антитіл, похідних від 6G та антитіл до -Αβ, які мають погіршене функціонування ефектора Антитіло 6G, яке зв'язується з С-кінцем Αβ, може використовуватися для ідентифікування або визначення присутності або відсутності Αβ. Для спрощення посилання робиться на 6G або антитіла в цілому, виходячи з того, що ці методи стосуються будь-якого варіанта описаного тут зв'язування Αβ (таких як поліпептиди). Детектування зазвичай включає контактування біологічного зразка з описаним тут антитілом, яке зв'язується з Αβ, та утворення комплексу між Αβ та антитілом (наприклад, 6G), яке специфічно зв'язується з Αβ. Утворення такого комплексу може відбуватися in vitro або in vivo. Термін "детектування", як він використовується тут, включає якісне та/або кількісне детектування (визначення рівня) з порівнюванням з контролем або без нього. Будь-які з різноманітних відомих методів можуть бути використані для детектування, включно, але не обмежуючись цим переліком, з такими, як імуноаналіз, застосування антитіла, що зв'язується з поліпептидом, наприклад, ферментний твердофазний імуноаналіз (ELISA), радіоімуноаналіз (RIA) та подібні; та функціональний аналіз для кодованого поліпептиду, наприклад активності зв'язування або ферментативної активності. У деяких варіантах антитіло мітиться з можливістю детектування. Фахівцю відомі інші варіанти описані тут реалізації. Антитіла та поліпептиди даного винаходу також можуть використовуватися для визначення, діагностування та моніторингу захворювань, станів та розладів, пов'язаних із зміненим або ушкодженим Αβ або βΑΡΡ, таких як хвороба Альцгеймера та синдром Дауна. Отже, в деяких варіанта!' реалізації винаходом пропонуються способи, які включають контактування зразка (проби) пацієнта, стосовно якого маються підозри щодо зміни або ушкодження Αβ або експресії з антитілом або поліпептидом даного винаходу та визначення, чи відрізняється рівень Αβ від такого у контрольному або порівняльному зразку. В деяких варіантах реалізації винахід стосується способів, які включають контактування зразка (проби) пацієнта та визначення рівня експресії Αβ. Для діагностичних застосувань антитіло може бути мічене детектованою часткою, включаючи радіоізотопи, флуоресцентні маркери та різні фермент-субстратні мітки. Спеціалістам в даній галузі добре відомі мітки для антитіл. В іншому варіанті реалізації винаходу антитіла даного винаходу не потребують мічення, та їхня присутність визнача 45 ється за допомогою міченого антитіла, яке зв'язується з антитілами даного винаходу. Антитіла даного винаходу можуть бути використані в будь-якому відомому аналітичному методі, такому як аналіз конкурентного зв'язування, прямий та непрямий сендвіч-аналіз та аналіз імунопреципітацією. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987). Антитіла також можуть бути використані для діагностичних аналізів in vivo, таких як in vivo візуалізація. Взагалі, антитіла мічені радіонуклідом 111 14 131 125 3 (такими як, Іn, "Тс, С, І, І, або Н), так що потрібні клітини або тканини можуть бути локалізовані за допомогою імуносцинтіграфії. Антитіла також можуть бути використані як забарвлюючі реагенти за добре відомими з рівня техніки методами. Антитіла до Αβ, які мають погіршене функціонування ефектора, можуть бути використані для визначення амілоїдного навантаження мозку пацієнта при загрозі або діагностуванні ХА, та визначення прогресу будь-якого лікування та стадії захворювання. Було повідомлено, що периферичне введення моноклональних антитіл до Αβ призводить до швидкого підвищення Αβ в плазмі й величина цього підвищення сильно корелює з амілоїдним навантаженням в гіпокампусі та корі головного мозку. DeMattos et al., Science 295:2264-2267 (2002). В деяких варіантах реалізації антитіла до Αβ, які мають погіршене функціонування ефектора, вводяться особі, й визначається рівень Αβ в плазмі, причому підвищення Αβ в плазмі вказує на присутність та/або рівень мозкового амілоїдного навантаження в особи. Ці методи можуть застосовуватися для моніторингу ефективності лікування та стадії захворювання та визначення майбутньої дози та її частоти. Антитіла, які мають погіршене функціонування ефектора, можуть мати кращі показники безпеки та переваги для діагностичного використання. Способи використання антитіла до Αβ для терапевтичних цілей Антитіла (включно з поліпептидами), полінуклеотиди та описані тут фармацевтичні композиції, можуть бути використані в способах попередження, лікування, пригнічування розвитку хвороби Альцгеймера або інших захворювань, пов'язаних із зміненим Αβ або експресією βΑΡΡ, накопичуванням Αβ у пацієнта, таких як синдром Дауна, хвороба Паркінсона, мультиінфаркгна деменція, легкий когнітивний розлад, церебральна амілоїдна ангіопатія, судинні розлади, спричинені відкладаннями в кровоносних судинах пептиду Αβ (такі як інсульт та HCHWA-D), депресія, хвороба КройтцфельдтаЯкоба, а також деменція з тільцями Леві. Такі методи включають введення особі антитіл, поліпептидів або полінуклеотидів або фармацевтичних композицій. В профілактичних застосуваннях, фармацевтичних композиціях або медикаментах, які вводяться пацієнту сприйнятливому або іншими словами з ризиком хвороби Альцгеймера (або інших захворювань пов'язаних із Αβ) в кількості достатній для того, щоб виключити або знизити ризик, зменшити тяжкість або відтермінувати по 96917 46 чаток хвороби, включаючи біохімічні, гістологічні та/або поведінкові симптоми хвороби, її ускладнення та проміжні патологічні фенотипи, представлені під час розвитку хвороби. В терапевтичних застосуваннях, композиціях або медикаментах, які призначаються пацієнту, сприйнятливому або вже страждаючому на таке захворювання в кількості достатній для того, щоб лікувати або принаймні частково затримати симптоми хвороби (біохімічні, гістологічні та/або поведінкові), включно з її ускладненнями та проміжними патологічними фенотипами, представленими під час розвитку хвороби. Винахід також стосується способу затримки розвитку симптому, пов'язаного із хворобою Альцгеймера (або іншими Αβ-пов'язаними захворюваннями) у пацієнта, який включає призначення пацієнту ефективної дози фармацевтичної композиції, яка містить антитіло, поліпептид, полінуклеотид даного винаходу. Симптоми, пов'язані з хворобою Альцгеймера, включають, але не обмежуються цим переліком, розлади пам'яті, розв'язання проблем, мовлення, лічби, візуально-просторового сприйняття, судження та поведінки. Винахід також стосується способів пригнічення або зниження утворення амілоїдних бляшок та/або Αβ накопичень у пацієнта, який включає призначення пацієнту ефективної дози фармацевтичної композиції, яка містить антитіло, поліпептид, полінуклеотид даного винаходу. У деяких варіантах амілоїдні бляшки знаходяться в мозку пацієнта. У деяких варіантах амілоїдні бляшки знаходяться в церебро-васкулярній системі пацієнта. У інших реалізаціях, амілоїдні Αβ накопичення знаходяться в серцево-судинній системі. Винахід також стосується способів зменшення амілоїдних бляшок та/або зменшення або уповільнення Αβ накопичень у пацієнта, який включає призначення пацієнту ефективної дози фармацевтичної композиції, яка містить антитіло, поліпептид, полінуклеотид даного винаходу. У деяких варіантах амілоїдні бляшки знаходяться в мозку пацієнта. У деяких варіантах амілоїдні бляшки знаходяться в церебро-васкулярній системі пацієнта. У інших реалізаціях, амілоїдні Αβ накопичення знаходяться в серцево-судинній системі. Винахід також стосується способів видалення або вичищення амілоїдних бляшок та/або зменшення або уповільнення Αβ накопичень у пацієнта, який включає призначення пацієнту ефективної дози фармацевтичної композиції, яка містить антитіло, поліпептид, полінуклеотид даного винаходу. У деяких варіантах амілоїдні бляшки знаходяться в мозку пацієнта. У деяких варіантах амілоїдні бляшки знаходяться в цереброваскулярній системі пацієнта. У інших реалізаціях, амілоїдні Αβ накопичення знаходяться в серцевосудинній системі. Винахід також стосується способів зменшення пептиду Αβ в тканині (такій як мозок) інгібування та/або зменшення Αβ накопичень в тканині (такій як мозок), інгібування, гальмування та/або зменшення токсичної дії пептиду Αβ в тканині (такій як мозок) у пацієнта, який включає введення ефективної дози фармацевтичної композиції, яка містить антитіло, поліпептид, полінуклеотид даного вина 47 ходу. Поліпептид Αβ може мати розчинну, олігомерну форму та у формі відкладень. Олігомерна форма Αβ може бути утворена 2-50 поліпептидами Αβ, які можуть бути в суміші із пептидами повної довжини 1-40 та 1-42 та/або зрізаними варіантами цих пептидів. Винахід також стосується способів покращення розпізнавання або обернення когнітивних відхилень, пов'язаних із захворюваннями пов'язаними із амілоїдним відкладанням Αβ у пацієнта, такими як хвороба Альцгеймера, які включають застосування ефективної дози фармацевтичної композиції, яка містить антитіло, поліпептид або полінуклеотид даного винаходу. Описані тут методи (включно з профілактикою або терапією) можуть бути виконані однією прямою ін'єкцією за один прийом або декілька прийомів в одне або багато місць. Введення також може бути майже одночасним в декілька сайтів. Частота введення може бути визначена і скоректована під час курсу терапії і залежно від досягнення бажаних результатів. У деяких випадках можуть бути призначені склади з уповільненим вивільненням антитіл (включно з поліпептидамии), полінуклеотидів, та фармацевтичні композиції даного винаходу. На практиці відомі різні склади та пристрої для досягнення уповільненого вивільнення. Пацієнти, особи або індивідууми включають ссавців, таких як, наприклад людина, корова, кінь, собаки, коти, свині та вівці. Переважно суб'єктом є людина, і може або, можливо, яка не уражена хворобою або доки не проявляє симптомів. У випадку хвороби Альцгеймера майже кожен знаходиться під загрозою цієї хвороби, якщо він або вона живе досить довго. Отже, дані методи можуть застосовуватися профілактично для всього населення без потреби будь-якого оцінювання ризику пацієнта. Дані методи є корисними для осіб, які мають певний генетичний ризик виникнення хвороби Альцгеймера. До таких осіб включаються тих, що мають родичів, які стикалися з цією хворобою, та ті, чий ризик визначено аналізом генетичних та біохімічних маркерів. Генетичними маркерами ризику хвороби Альцгеймера є мутації гену АРР, частково мутації в положенні 717 та положеннях 670 та 671 згідно до мутацій Hardy та Шведських мутацій відповідно (дивись, Hardy (1997) Trends Neurosci. 20:154-9). Іншими маркерами ризику є мутації в гені презенеліну, PS1 та PS2, та АроЕ4, сімейна історія ХА, гіперхолістеринемія або атеросклероз. Особи, які вже страждають на хворобу Альцгеймера, можуть бути виявлені за характерним недоумством, а також за присутністю описаних вище факторів ризику.Також існує багато діагностичних тестів для визначення осіб, які мають ХА. Вони включають визначення CSF Таu та рівнів Αβ42. Підвищені або знижені рівні Αβ42 означають наявність ХА. Особи, які страждають на хворобу Альцгеймера, також можуть бути діагностовані за критеріями ADRDA (Асоціації Хвороби Альцгеймера та Пов'язаних Розладів). У асимптоматичних пацієнтів лікування може розпочинатися в будь-якому віці (наприклад, 10, 20, 30). Однак, зазвичай, необов'язково починати лікування, доки пацієнт не досягне віку 40, 50, 60 або 70 років. Лікування зви 96917 48 чайно продовжується багатьма дозами протягом тривалого періоду часу. Лікування може моніторитися весь час різними відомими способами. У випадку потенціального пацієнта з синдромом Дауна лікування може розпочатися внутрішньоутробно введенням терапевтичного агенту матері або одразу після народження. Фармацевтичні композиції, які можуть застосовуватися вказаними вище способами, включають, будь-які описані тут антитіла, поліпептиди та/або полінуклеотиди. У деяких варіантах антитіло є антитілом 6G або його варіантом, наведеним у Таблиці 3. У деяких варіантах антитіло є антитілом, яке специфічно зв'язується пептидом Αβ і містить константний регіон важкого ланцюга, який має погіршене функціонування ефектора. Призначення та дози Антитіло переважно призначається ссавцю на носії, переважно фармацевтично прийнятному носії. Придатні носії та їх композиції описані в Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990; та Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000. Звичайно використовується відповідна кількість фармацевтично прийнятної солі для забезпечення ізотонічності композиції. Приклади носія включають сольовий розчин, розчин Рінгера та розчин декстрози. Значення рН розчину переважно знаходиться в межах від приблизно 5 до 8 та більш переважно від приблизно 7 до приблизно 7,5. Інші носії включають препарати пролонгованого вивільнення, такі як напівпроникні матриці щільних гідрофобних полімерів, які містять антитіла; ці матриці можуть бути у вигляді формованих часток, наприклад, плівок, ліпосом або мікрочасток. Для фахівця в даній галузі є зрозумілими, що певні носії можуть мати певну перевагу перед іншими, наприклад, завдяки способу призначення та концентрації застосовуваних антитіл. Антитіла можуть призначатися ссавцям ін'єкцією (наприклад, системно, внутрішньовенно, підшкірно, інгаляцією, внутрішьомязово, внутрішньосерцево, інтрацеребрально, інтравентрикулярно, інтраназально) або іншими методами, такими як інфузія, які забезпечують їхнє введення в кровотік в ефективній формі. Антитіло може також призначатися методом ізольованої перфузії, такої як ізольованої тканинної перфузії, для посилення місцевого лікувального ефекту. Внутрішньовенне введення є переважним. Ефективне дозування та призначення для застосування антитіла може бути визначено емпірично, а проведення такого визначення є звичайною практикою. Особам, досвідченим в даній галузі, зрозуміло, що доза антитіла, яку потрібно ввести, має відрізнятися, залежно від, наприклад, ссавця, який отримує антитіло, шляху введення, певного типу використовуваного антитіла та інших ліків, які вводяться ссавцю. Інструкція з вибору відповідного дозування антитіла може бути знайдена в літературі з терапевтичного використання антитіл, наприклад, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., 1985, ch. 22 and pp. 303-357; Smith et al., 49 Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York, 1977, pp. 365389. Типова денна доза окремо застосовуваного антитіла може коливатися від приблизно 1 мкг/кг до 100 мг/кг маси тіла або більше на день залежно від перерахованих вище факторів. Звичайно можуть бути застосовані наступні дози: призначається в дозі принаймні майже 50 мкг/кг маси тіла; принаймні майже 10 мкг/кг маси тіла; принаймні майже 3 мкг/кг маси тіла; принаймні майже 1 мкг/кг маси тіла; принаймні майже 750 мкг/кг маси тіла; принаймні майже 500 мкг/кг маси тіла; принаймні майже 250 мкг/кг маси тіла; принаймні майже 100 мкг/кг маси тіла; принаймні майже 50 мкг/кг маси тіла; принаймні майже 10 мкг/кг маси тіла; принаймні майже 1 мкг/кг маси тіла, або більше Антитіла можуть призначатися в нижчих дозах або менш часто на початку лікування для уникнення потенціальних побічних дій, таких як тимчасова церебральна амілоїдна ангіопатія (САА). У деяких варіантах може мати місце більше, ніж одне антитіло. Ці композиції можуть містити принаймні один, принаймні два, принаймні три, принаймні чотири, принаймні п'ять різних антитіл (включно з поліпептидами) даного винаходу. Антитіло може також призначатися ссавцю в комбінації з ефективною кількістю одного або більше іншими терапевтичним агентами. Антитіло може також призначатися послідовно або одночасно з одним або більше іншими терапевтичним агентами. Кількість антитіла та терапевтичного агента залежить, наприклад, від типу використовуваних ліків, патологічного стану, що лікується, та призначеного шляху введення, але звичайно не може бути меншим, якщо кожен призначається окремо. Після введення антитіла ссавцю, фізіологічний стан ссавця може моніторитися способами добре відомими фахівцям в даній галузі. Наведені вище принципи застосування та дозування можуть бути пристосовані для описаних тут поліпептидів. Полінуклеотид, що кодує описане тут антитіло, або поліпептид також може використовуватися для введення та експресування антитіла або поліпептиду в потрібній клітині. Зрозуміло, що експресійний вектор може використовуватися для прямого експресування антитіла. Експресійний вектор може призначатися системно, внутрішньочеревинно, внутрішньовенно, внутрішьомязово, підшкірно, внутрішньооболонково, внутрішньосерцево, орально, ентерально, парентерально, інтраназально, дермально або інгаляцією. Наприклад, введення експресійних векторів включає місцеве або системне введення, включно з ін'єкцією, оральним призначенням, бомбардуванням частками або катетерним введенням, або місцевим введення. Фахівець в даній галузі знайомий із застосуванням експресійних векторів для досягнення експресії протеїну in vivo. Дивись, наприклад, патенти США №6,436,908; 6,413,942 та 6,376,471. Може використовуватися цільова доставка терапевтичних композицій, які включають полінуклеотиди, що кодують антитіло даного винаходу. Методики доставки ДНК, опосередковані 96917 50 рецепторами, описані, наприклад в Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1990) 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338. Терапевтичні композиції, які містять полінуклеотиди, призначаються згідно протоколу генної терапії в кількості від приблизно 100 нг до приблизно 200 нг ДНК для місцевого застосування. Концентрації знаходяться в межах від 500 нг до, приблизно, 50 мг, від, приблизно, 1 мкг до приблизно 2 мг, від приблизно 5 мкг до приблизно 500 мкг та від приблизно 20 мкг до приблизно 100 мкг ДНК також може використовуватися під час генної терапії згідно протоколу. Терапевтичні полінуклеотиди та поліпептиди даного винаходу можуть доставлятися за допомогою засобів доставки генів. Ці засоби доставки генів можуть мати вірусне або невірусне походження (дивись, Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185; and Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148). Експресування цих кодуючих послідовностей може бути проведене за допомогою ендогенних ссавцевих або гетерологічних промоторів. Експресування кодуючої послідовності може бути конститутивним або регульованим. На практиці відоме застосування векторів на основі вірусів, які використовуються для доставки потрібного полінуклеотиду та експресування в потрібній клітині. Приклади векторів на основі вірусів включають, але не обмежуються ними, рекомбінантні ретровіруси (дивись, наприклад, РСТ WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; U.S. 5,219,740; 4,777,127; GB 2,200,651; та ЕР 0345242), вектори на основі альфа-вірусів (наприклад, вірусні вектори Sindbis, лісовий вірус вемлікі (АТСС VR-67; АТСС VR-1247), вірус Ross River (ATCC VR-373; АТСС VR-1246) та Венесуельський вірус кінського енцефаліту (АТСС VR923; АТСС VR-1250; АТСС VR 1249; АТСС VR532)), та адено-асоційовані вірусні вектори (AAV) (дивись, наприклад, РСТ WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 та WO 95/00655). Також можливе застосування ДНК, зв'язаної з інактивованим аденовірусом, описане в Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147. Також можуть використовуватися невірусні носії та способи, включно з, але не обмежуючись цим носієм та способом, окремої полікатіонної конденсованої ДНК, зв'язаної або незв'язаної із інактивованим аденовірусом (дивись, наприклад, Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147); ДНК, зв'язаної з лігандом (дивись, наприклад, Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985); еукаріотичних клітинних засобів доставки (дивись, наприклад, U.S. 5,814,482; РСТ WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; та WO 97/42338) та нейтралізація ядерного заряду або злиття з клітинною мембраною. Також може застосовуватися депротеїнізована ДНК. Приклади введення депротеїнізованої ДНК 51 описані в РСТ WO 90/11092 та U.S. 5,580,859. Ліпосоми, які можуть виступати засобами доставки генів, описані в патенті США 5, 422, 120; РСТ WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; та ЕР 0524968. Інші підходи описані в Philip, МоІ. Cell Biol. (1994) 14:2411, та в Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581. Набори Також винахід стосується виробів та наборів, які містять матеріали, потрібні для лікування патологічних станів, таких як хвороба Альцгеймера або інших захворювань, пов'язаних з Αβ (таких як, синдром Дауна, хвороба Паркінсона, мультиінфарктна деменція, легкий когнітивний розлад та церебральна амілоїдна ангіопатія, судинні розлади спричинені відкладаннями в кровоносних судинах пептиду Αβ (такі як інсульт та HCHWA-D)) або визначення або очищення Αβ або βΑΡΡ. Вироби мають контейнер та маркування. Придатні контейнери включають наприклад, пляшки, склянки та пробірки. Контейнери можуть бути виготовлені з різноманітних матеріалів, таких як скло або пластик. Контейнер містить композицію, яка має активний агент, який є ефективним для лікування патологічного стану або визначення або очищення Αβ або βΑΡΡ. Активний агент в композиції є антитілом та переважно включає моноклональне антитіло, специфічне до Αβ або βΑΡΡ. В деяких реалізаціях активний агент включає антитіло 6G або будь-які антитіла або поліпептиди отримані з антитіла 6G. В деяких реалізаціях активний агент включає антитіло до Αβ або поліпептид, який має погіршене функціонування ефектора. У деяких варіантах антитіло до Αβ або поліпептид містить константний регіон важкого ланцюга, де константний має погіршене функціонування ефектора. Маркування на контейнері вказує, що композиція використовується для лікування патологічних станів таких як хвороба Альцгеймера або визначання або очищення Αβ або βΑΡΡ, та також може мати інструкції для застосування in vivo або in vitro, такі як описані вище. Винаходом пропонуються набори, які містять будь-яке з антитіл (таких як 6G), поліпептидів, полінуклеотидів, описаних тут. У деяких варіантах набір даного винаходу включає описаний вище контейнер. У деяких варіантах набір даного винаходу включає описаний вище контейнер та другий контейнер, який містить буфер. Він також може містити інші матеріали, корисні з комерційної та споживчої точки зору, включно з іншими буферами, розчинниками, фільтрами, голками, шприцами та пакувальними вкладишами з інструкціями для проведення будь-яких описаних тут методів (таких як методи лікування хвороби Альцгеймера та методи пригнічування або зменшення накопичення пептиду Αβ в мозку). В наборах, які використовуються для визначення або очищення Αβ або βΑΡΡ, антитіла зазвичай марковані детектованим маркером, таким як, наприклад, радіоізотоп, флуоресцентна сполука, біолюмінесцентна сполука, хемілюмінесцентна сполука, метал хелатор або фермент. У деяких варіантах винахід стосується композиції (описаної тут) для застосування в будь-якому описаному тут методі, залежно від контексту для 96917 52 застосування в якості медикаменту та/або для виробництва медикаменту. Наступні приклади наведені для ілюстрації, але не обмежують об'єму правової охорони винаходу. ПРИКЛАДИ Приклад 1: Визначення за допомогою афінності зв'язування антитіла 6G та його варіантів А. Загальні методи У цьому прикладі використані наступні загальні методи. Експресійні вектори використані в охарактеризуванні клону Експресія фрагменту Fab антитіл була під контролем індуцибельного IPTG промотора lacZ, подібний до якого описано в Barbas (2001) Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press pg 2.10. Vector рСоmb3Х), хоча додатково включені модифікації та експресія наступних додаткових доменів: константний домен легкого ланцюга Карра людини та константний домен СНІ імуноглобуліну lgG2a людини, регіон С ланцюга Ig gamma-2, протеїн з номером Р01859; легкий ланцюг імуноглобуліну kappa (Homo sapiens), протеїн з номером САА09181. Препарування малих Кількостей Fab Експресія малої кількості Fab у 96 лункових планшетах була проведена наступним чином. Починаючи з трансформованої Е. соІі бібліотекою Fab, колонії були зібрані для інокулювання на основну планшету (агар LB+ампіцилін (50 мкг/мл)+2 % Глюкози) та на робочу планшету (2 мл/лунку, 96 лункова планшета містила 1.5 мл LB + ампіцилін (50 мкг/мл) + 2 % Глюкози). Обидві планшети вирощувалися при 30 °C. протягом 8-12 годин. Основна планшета зберігалася при 4 °C, а клітини з робочої були пелетовані при 5000 об/хв та ресуспендовані в 1 мл of LB+ампіцилін (50 мкг/мл) + 1 мМ IPTG для індукування експресії Fabs. Клітини були зібрані центрифугуванням через 5 г експресування при 30 °C, потім ресуспендовані в 500 мкл буферу HBS-P (10 мМ HEPES буфер рН 7,4, 150 мМ NaCI, 0,005 % Р20). Лізис HBS-P ресуспендованих клітин було проведено одним циклом заморожування (-80 °C.) та розморожування при 37 °C. Клітинні лізати були центрифуговані при 5000 об/хв протягом 30 хв. для відокремлення клітинних залишків від супернатанту який містив Fabs. Супернатанти було нанесено на плазмонний резонансний апарат ВІАсоrе для отримання даних афінності Fab. Клони, які експресували Fabs, були збережені з основної планшети для секвенування ДНК та для великомасштабного продукування Fab, а також докладного охарактеризування як показано далі. Препарування великих кількостей Fab Для отримання детальних кінетичних параметрів Fabs були експресовані й виділені з великої культури. Колби Erlenmeyer, які містили 200 мл LB+ампіциліну (50 мкг/мл)+2 % глюкози, були інокульовані 5 мл з нічної культури з відібраних Fabекспресуючого клону Е. соІі. Клони інкубували при 30 °C до досягнення OD550 нм 1,0 й потім індукова 53 ні заміщенням середовища на 200 мл, з LB+ампіциліну (50 мкг/мл) + 1 мМ IPTG. Через 5 г експресування при 30 °C. клітини були осаджені центрифугуванням, потім ресуспендовані в 10 мл PBS (рН 8). Лізис клітин було проведено двома циклами заморожування/розморожування (при 80 °C та 37 °C, відповідно). Супернатант клітинних лізатів було нанесено на Ni-NTA superflow сефарозні (Qiagen, Valencia. CA) колонки збалансовані PBS, рН 8, потім промиті 5 колоночними об'ємами PBS, рН 8. Окремі Fabs елюйовані з різних фракцій за допомогою PBS (рН 8) + 300 мМ імідазолу. Фракції, які містили Fabs були об'єднані та діалізовані в PBS, потім обчислені за допомогою ELISA перед описуванням афінності. Отримання цілих антитіл Для експресування цілих антитіл варіабельні регіони легкого та важкого ланцюгів були клоновані в експресійні вектори ссавця та трансфіковані за допомогою ліпофектаміну в клітини НЕК 293 для транзиторної експресії. Антитіла були очищені за допомогою протеїну А стандартними методами. Вектор pDb.6G.hFc2a є експресійним вектором який містить важкий ланцюг антитіла 6G, та є придатним для транзиторної або стабільної експресії важкого ланцюга. Вектор pDb.6G.hFc2a має нуклеотидну послідовність, яка відповідає наступним регіонам: регіон мишачого цитомегаловірусного промотора (нуклеотиди 1-612); синтетичний інтрон (нуклеотиди 619-1507); кодуючий регіон DHFR (нуклеотиди 707-1267); сигнальний пептид гормону росту людини (нуклеотиди 1525-1602); варіабельний регіон важкого ланцюга 6G (нуклеотиди 1603-1951); константний регіон важкого ланцюга lgG2a людини, який містить наступні мутації: А330Р331 на S330S331 (нумерація амінокислот за послідовністю дикого типу lgG2a; дивись Eur. J. Immunol.(1999) 29:2613-2624); пізній сигнал поліаденілування SV40 (нуклеотиди 2960-3203); енхансерний регіон SV40; регіон фагу f1 та кодуючий регіон бета-лактамази (AmpR). Вектор pEb.6G.hK є експресійним вектором який містить легкий ланцюг антитіла 6G, та є придатним для транзиторної експресії легкого ланцюга. Вектор pEb.6G.hK має нуклеотидну послідовність, яка відповідає наступним регіонам: регіон мишачого цитомегаловірусного промотора (нуклеотиди 1-612); інтрон EF-1 людини (нуклеотиди 6191142); сигнальний пептид гормону росту людини (нуклеотиди 1173-1150); варіабельний регіон легкого ланцюга антитіла 6G; константний регіон ланцюга kappa людини; пізній сигнал поліаденілування SV40; енхансерний регіон SV40; регіон фагу f1 та кодуючий регіон бета-лактамази (AmpR). Аналіз Віасоrе Афінності моноклональних антитіл 6G було визначено за допомогою ВІАсоrе3000.ТМ. системи поверхневого плазмонного резонансу (SPR) (BIAcore, INC, Piscaway N.J.). Перший метод визначення полягав у імобілізацією 6G на чіпі СМ5 та визначення кінетики зв'язування пептиду Αβ1-40 або іншого пептиду Αβ з антитілом. Чіпи СМ5 були активовані за допомогою N-етил-N'-(3диметиламінопропіл)карбодіімід гіпохлориду (EDC) та N-гідроксисукциніміду (NHS) згідно ін 96917 54 струкцій виробника. Антитіло 6G або його варіанти були розведені в 10 мМ ацетату натрію з рН 4,0 або 5,0 та нанесено на активований чіп в концентрації 0,005 мг/мл. За допомогою змінного часу потоку через кожний окремий канал чіп, було досягнуто щільність антитіл в діапазоні: 1000-2000 або 2000-3000 одиниць (RU). Чіп було блоковано етаноламіном. Дослідження регенерування показало, що розчин містив 2 об'єми елюційного буферу PIERCE та 1 об'єм 4 Μ NaCI ефективно розривав зв'язок пептиду Αβ1-40 тоді як зберігалася активність 6G на чіпі протягом більш ніж 200 ін'єкцій. Буфер HBS-EP (0,01 Μ HEPES, рН 7,4, 0,15 Μ NaCI, 3 мМ EDTA, 0,005 % сурфактанту Р20) було використано в якості проточного буферу для аналізів ВІАсоrе. Послідовні розведення (0,1-10 X KD) зразків очищеного синтетичного пептиду Αβ1-40 були ін'єктовані на 1 хв. при 100 мкл/хв та дано час дисоціації 10 хв. Значення кінетики асоціації (kon) та дисоціації (koff) були отримані одночасно вирівнюванням даних до 1:1 моделі зв'язування за Langmuir (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6.99-110) за допомогою програми BIAevaluation. Значення рівноваги константи дисоціації (KD) були обчислені як koff/kon. Іншим методом, афінність була визначена імобілізацією пептиду Αβ1-40 на чіпі SA та визначення кінетики зв'язування 6G Fab та Fab варіантів 6G з імобілізованим пептидом Αβ1-40. Афінності фрагментів Fab 6G та його варіантів були визначені за допомогою системи поверхневого плазмонного резонансу (SPR) (ВІАсоrе3000.ТМ., ВІАсоrе, INC, Piscaway N.J.). Чіпи SA (стрептавідин) були використані згідно інструкцій виробника. Біотинильваний пептид Αβ був розведений в HBS-EP (10 мМ HEPES рН 7,4, 150 мМ NaCI, 3 мМ EDTA, 0,005 % Р20) та нанесено на чіп в концентрації 0,005 мг/мл. За допомогою змінного часу потоку через кожний окремий канал чіп, було досягнуто щільність антитіл в двох діапазонах: 100-400 одиниць для детального дослідження кінетики та 5002000 одиниць (RU) для дослідження концентрації та скринінгу. Дослідження регенерування показало, що 100 мМ фосфорної кислоти (також можна буро провести за допомогою розчину, який містив 2 об'єми 50 мМ NaOH та 1 об'єм 70 % етанолу) ефективно розривав зв'язок пептиду Fab тоді як зберігалася активність Αβ на чіпі протягом більш ніж 200 ін'єкцій. Буфер HBS-EP було використано в якості проточного буферу для аналізів ВІАсоrе. Послідовні розведення (0,1-10 X KD) зразків очищеного Fab були ін'єктовані на 2 хв. при 100 мкл/хв та дано час дисоціації 10 хв. Концентрації протеїнів Fab було визначено за допомогою ELISA та/або електрофорезу SDS-PAGE з використанням стандарту Fab відомої концентрації (визначеного амінокислотним аналізом). Значення кінетики асоціації (kоn) та дисоціації (koff) були отримані одночасно вирівнюванням даних до 1:1 моделі зв'язування за Langmuir (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6.99-110) за допомогою програми BIAevaluation. Значення рівноваги константи дисоціації (KD) були обчислені як koff/kon. 55 96917 Твердофазний імуноферментний аналіз ELISA Аналіз ELISA застосовували для визначення зв'язування антитіла 6G і варіантів з небіотинільованими Αβ пептидами. Планшети NUNC maxisorp покривали 2,5 мкг/мл Αβ пептидів в сольовому буферному розчині з рН 7,4 протягом 1 години при температурі 4 °C. Планшети блокували 1 % бичачим сироватковим альбуміном в сольовому буферному розчині з рН 7,4. Первинне антитіло (отримане з клітинних супернатантів, сироватки, що містить антитіла до Αβ, або з очищеного повного антитіла або Fabs при бажаних розведеннях) інкубували з імобілізованими Αβ пептидами протягом 1 години при кімнатній температурі. Після промивання планшети інкубували із козиним антилюдським каппа HRP-кон'югованим вторинним антитілом (МР Biomedicals, 55233) при розведенні 1:5000. Після промивання зв'язане вторинне антитіло чисельно характеризували додаванням ТМВ субстрату (KPL, 50-76-02, 50-65-02). Реакцію з пероксидазою хріну зупиняли додаванням ІМ фосфорної кислоти, і при 450 нм визначали абсорбцію. Аналіз ELISA використовували для визначення зв'язування антитіла 6G і варіантів з біотинільованими Αβ пептидами. Планшети NUNC maxisorp покривали 6 мкг/мл стрептавідину (Pierce, 21122) в сольовому буферному розчині з рН 7,4 протягом 1 56 години при температурі 4 °C. Планшети блокували 1 % бичачим сироватковим альбуміном в сольовому буферному розчині з рН 7,4. Після промивання біотинільовані Αβ пептиди в сольовому буферному розчині при рН 7,4 інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. Первинне антитіло (отримане з клітинних супернатантів, сироватки, що містить антитіла до Αβ, або з очищеного повного антитіла або Fabs при бажаних розведеннях) інкубували з імобілізованими Αβ пептидами протягом 1 години при кімнатній температурі. Після промивання планшети інкубували із козиним анти-людським каппа HRP-кон'югованим вторинним антитілом (МР Biomedicals, 55233) при розведенні 1:5000. Після промивання зв'язане вторинне антитіло чисельно характеризували додаванням ТМВ субстрату (KPL, 50-76-02, 50-65-02). Реакцію з пероксидазою хріну зупиняли додаванням ІМ фосфорної кислоти, і при 450 нм визначали абсорбцію. В. Афінність Зв'язування Антитіла 6G та його варіантів з Αβ1-40, Αβ1-42 та іншими Αβ пептидами Амінокислотні послідовності варіабельних регіонів важкого та легкого ланцюгів антитіла 6G показано на Фіг.1. Афінність зв'язування антитіла 6G з Αβ1-40, Αβ1-42 та Αβ22-37, визначена за допомогою методів Віасоrе описаних вище, показана в нижченаведеній Таблиці 2. Таблиця 2 Афінність зв'язування антитіла 6G та фрагменту Fab kon (1/Ms) Біотинільований Αβ1-40, імобілізований на стрептавідиновому чіпі, 6G Fab пропускали через нього Біотинільований Αβ1-42, імобілізований на стрептавідиновому чіпі, 6G Fab пропускали через нього Біотинільований Αβ22-37, імобілізований на стрептавідиновому чіпі, 6G Fab пропускали через нього Амінокислотну послідовність варіантів 6G наведено далі в Таблиці 3. Усі амінокислотні заміни варіантів, показані в Таблиці 3, описані відносно послідовності 6G. Відносне зв'язування варіантів 6G також показано в Таблиці 3. Зв'язування ви koff (1/s) 5 7,0×10 4 1,6×10 5 3,9×10 3,0×10 1,8×10 3,6×10 KD (nM) -4 2 -3 80 -3 11 значали з допомогою аналізу ELISA, описаного вище для небіотинільованого Αβ1-40 або Αβ1-42, імобілізованого на поверхні планшета для аналізу ELISA. 57 96917 58 Таблиця 3 Амінокислотні послідовності і дані щодо зв'язування для варіантів антитіла 6G Дані зв'язування мутованих варіантів гою аналізу ELISA Номер клону мутації 6G F99 D100 1А Y 1B Μ 1G L 2G Ρ 3Е С 4G S 5D Ν 6А Τ 7В 7D 8Н 9Е 10А 10Е 10G 11D 2F 3А 3В 3С 4А 4В 4D 6F важкого ланцюга 6G, отримані з допомо N101 Y102 D103 R104 S с Η R F L I Μ Ρ A R G G F Q s A450 ELISA Αβ1-40 2,55 1,60 0,37 0,51 0,30 0,26 1,41 1,52 0,86 0,44 0,23 0,21 0,22 1,85 0,41 0,63 0,29 1,89 1,16 1,43 2,30 2,17 2,48 2,45 2,28 Αβ1-42 0,95 0,26 0,22 0,21 0,50 0,40 0,30 0,39 0,31 0,27 0,31 0,19 0,26 0,34 0,24 0,22 0,24 0,38 0,28 0,43 0,76 0,40 0,71 1,00 0,62 Дані зв'язування мутованих варіантів легкого ланцюга 6G, отримані з допомогою аналізу А450 ELISA ELISA Номер кломутації Αβ1-40 Αβ1-42 ну 6G Q93 Q94 S95 K96 E97 F98 P99 W100 S101 2,49 0,61 2Н К 0,07 0,13 3А Ρ 0,08 0,13 4F S 2,00 0,30 5В G 0,09 0,14 7Е R 0,09 0,18 7F К 0,12 0,19 10Е L 0,08 0,12 1А N 2,02 0,32 1С F 0,05 0,05 4А A 2,09 0,28 4G F 1,07 0,28 5Н R 2,60 0,85 6С G 0,05 0,05 6D Τ 2,41 1,34 6Е Ρ 0,12 0,20 8G V 2,60 0,90 Приклад 2 Характеризування епітопу на пептиді A3, який зв'язується з антитілом 6G Для визначення епітопу на поліпептиді Αβ, який розпізнається антитілом 6G, було застосовано аналіз зв'язування ELISA. Різні поліпептиди Αβ (Global Peptide Services, CO) були імобілізо вані на планшеті ELISA. Зв'язування повного антитіла 6G (при 20 нМ) з імобілізованим Αβ визначали з допомогою ELISA як описано вище. Амінокислотні послідовності Αβ1-40, Αβ1-42 та Αβ1-43 показані далі в Таблиці 5. Як показано на Фіг.2, антитіло 6G зв'язується з Αβ пептидами 17-40, 17-42, 22-35, 28-40, 1-38, 1-40, 1-42, 1-43 і 28-42, 59 96917 при цьому зв'язування з пептидами 28-42 є значно слабшим порівняно з іншими пептидами. Антитіло 6G не зв'язувалося з пептидами Αβ 1-16, 128 і 33-40. Таким чином, антитіло 6G зв'язується з С-кінцем різних усічених Αβ пептидів, наприклад 22-35, 1-38, 1-40, 1-42 і 1-43. У Таблиці 4 наведене порівняння афінності 6G до Αβ1-40 з афінністю до іншого Αβ пептиду, визначену як koff (1/s) з допомогою аналізу Віасоге. Антитіло 6G зв'язується з Αβ1-40 з найвищою афінністю порівняно з іншими пептидами, із значно нижчою афінністю - з усіченими пептидами Αβ1-40 (такими як 1-36, 1-37, 1-38 і 1-39), Αβ1-42 і Αβ1-43. Це вказує на те, що бічний ланцюг або каркас амінокислоти 40 (валіну) Αβ включено у зв'язування 6G до Αβ1-40 та зв'язування значно знижується (наприклад, від 10 до приблизно 50 60 250 разів) при відсутності цієї амінокислоти. Зв'язування з нижчою афінністю з карбокситермінальними амідованими Αβ1-40 вказує на те, що у зв'язуванні 6G до Αβ1-40 бере участь вільний С-кінець пептиду Αβ1-40, але воно не залежить від нього. Більш низька афінність зв'язування до Αβ142 і Αβ1-43 може бути зумовлена конфронтаційними відмінностями між пономерною формою Αβ1-40 і Αβ1-42 або Αβ1-43. Було доведено, що мономер Αβ1-42 має конформацію у розчині, відмінну від Αβ1-40.·Див. структурні координати мономера для Αβ1-42, наведені в Protein Data Bank (файли pdb) з номером доступу HYT; і структурні координати мономера для Αβ1-40, наведені в Protein Data Bank (файли pdb) з номером доступу 1ВА6 і 1ВА4. Таблиця 4 Фрагмент пептиду Αβ 1-28 1-43 22-35 1-36 1-37 1-38 1-39 17-42 1-42 28-42 28-40-ΝΗ2# 28-40 17-40 1-40 koff (1/s) Koff Αβ пептид/koff Αβ1-40 (кратність зниження афінності) Дуже низьке зв'язування 0,0285 0,0205 0,0149 -3 9,3×10 -3 7,92×10 0,0465 -3 1,9×10 -3 3,37×10 -3 3,62×10 -4 6,4×10 -4 2,15×10 -4 1,32×10 215,9 155,3 112,8 70,4 60,0 352,2 14,4 25,5 27,4 4,8 1,6 1 Пептид пропускали у вигляді аналіту на чіп СМ5 з моноклональним антитілом 6G (лігандом), імобілізованим аміохімією #пептид з імітованим карбокси-кінцем Епітопне картування антитіла 6G було виконане аналізом ELISA. Біотинильовані 15-mer або 10-mer різних пептидів Αβ (ці пептиди мають приєднаний до С-кінця гліцин) були імобілізовані на планшетах, вкритих стрептавідином. Антитіло 6G (від 2.5 мкг/мл до 10 мкг/мл) були інкубовані з імобілізованими пептидами і визначали зв'язування як описано вище. Як показано на Фіг.3, антитіло 6G зв'язується з пептидами Αβ з амінокислотами 20-34, 21-35, 22-36, 23-37, 24-38, 25-39 та 25-34 з глінцином на С-кінці; але не зв'язується з пептидами Αβ з амінокислотами 19-33, 26-40, 27-41, 24-33 та 26-35 з глінцином на С-кінці цих пептидів. Це вказує на те, що епітоп антитіла 6G зв'язується з амінокислотами від 25 до 34. Враховуючи вищенаведені дані, епітоп, з яким зв'язується антитіло 6G включає амінокислоти 25-34 і 40. Фіг.4 є схематичною діаграмою, на якій показаний епітоп антитіла 6G. Таблиця 5 Амінокислотні послідовності β-амілоїдного пептиду 1-40 (WT) 1-42 (WT) 1-43 (WT) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL MVGGW (SEQ ID NO:15) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL MVGGWIA (SEQ ID NO:16) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL MVGGWIAT (SEQ ID NO:17) В. Антитіло 6G не зв'язується з APP Для визначення, чи зв'язується 6G з попередником амілоїдного протеїну (АРР), було визна чено зв'язування 6G з клітинами, трансфікованими диким типом АРР. НЕК293 клітини були трансфіковані кДНК, яка кодує попередник амілоїдно