Спосіб високопродуктивної перевірки біологічного зразка на наявність мікроорганізмів

Реферат: Винахід належить до способів та обладнання для високопродуктивного тестування біологічних зразків, що містять або не містять мікроорганізми. Способи включають використання діагностичної мультиплексорної панелі (ДМП), яка спеціально розроблена для одночасної UA 100495 C2 (12) UA 100495 C2 ідентифікації багатьох потенційних мікроорганізмів, які можуть бути наявні в біологічному зразку за допомогою реакції подовження праймерів під дією високо консервативних послідовностей нуклеїнових кислот у мікроорганізмах під час проведення тесту. Біологічний зразок зазвичай фіксують на твердому субстраті за допомогою ДМП в одному пункті перед передачею до пункту проведення аналізу. Способи і обладнання винаходу використовуються для визначення наявності інфекційних патогенних мікроорганізмі у біологічному зразку, наприклад для діагностики інфекцій, що передаються статевим шляхом. UA 100495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь техніки, до якої відноситься винахід Винахід пов'язаний із складними дослідженнями високої продуктивності для виявлення мікроорганізмів, що можуть бути наявні у біологічному зразку за допомогою ферментативного аналізу нуклеїнових кислот. Більш точно, винахід спрямований на ідентифікацію патогенних організмів. Рівень техніки Починаючи з дев'ятнадцятого століття з початку ідентифікації мікроорганізмів, як одних із основних причин захворюваності і смертності, продовжилися зусилля щодо проведення моніторингу та контролю поширення інфекційних хвороб. Найперші зусилля були зроблені молодими вченими у науці епідеміології, зокрема, Д-ром Джоном Сноу, котрий став відомий як знищувач осередку епідемії на вулицях Лондона після того, як він ідентифікував її як джерело широко розповсюдженого спалаху холери у районі Сіті. У двадцятому сторіччі виникнення антибіотиків, масової вакцинації та противірусного лікування стали причиною значного рівня контролю за розповсюдженням таких хвороб, принаймні у розвинутих країнах світу. Проте, інфекційні хвороби все ще залишаються однією із головних причин смерті у всьому світі, з безжальною спадковістю «нового» мікробного вбивці, що з'являється кожного року. MRSA; SARS; пташиний грип; ВІЛ та малярія являються лише кількома представниками багатьох інфекційних хвороб, збудники яких спричиняють тривогу та роздуми у всьому світі. Міжнародні організації з охорони здоров'я, такі як ООН та СОТ також виражають хвилювання щодо нестримного використання сполук антибіотиків, що призводять до підвищення рівнів стійкості багатьох різновидів мікроб до антибіотиків. Крім того інфекції, що передаються статевим шляхом (ІПСШ), на сьогодні представляють одну з найбільших проблем інфекційних хвороб у всьому світі в декількох регіонах, особливо в Африці та в країнах бувшого Радянський Союз, та знаходяться на рівні епідемії. Згідно однієї наукової роботи (Adler, M., 2005, Why sexually transmitted infections are important. In: ABC of Sexually Transmitted Infections. th 5 ed. BMJ Books) відомо, що кількість інфікованих людей в Західній Європі дорівнює 17 мільйонам, в США 15 мільйонам, в Африці 70 мільйонам, та у всьому світі близько приблизно 400 мільйонів. Боротьба із захворювання, що передаються статевим шляхом та ВІЛ/СНІД залишається найважливішим питанням порядку денного на всесвітніх урядових конференція по питаннях здоров'я. Очевидна потреба у поліпшенні доступу до лікарських послуг плюс створення та забезпечення діагностичних послуг, доступних для всіх людей, котрі потребують лікування. Багато ІПСШ не мають симптом, проте їх можна ідентифікувати шляхом проведення тестів. Однак стандартні скринінг-програми надзвичайно рідкісні, являються соціальною ганьбою, неадекватно фінансуються та обмежують інформативність суспільства. Інфекційні хвороби не лише впливають на людське населенням, спалахи хвороб серед худоби та зараження рослинних культур також завдають значної шкоди економіці. Спалахи лихоманки у свиней, хвороби ротової порожнини і кінцівок худоби та пташиний грип можуть швидко поширюватися і спустошувати сільськогосподарську продукцію та економіку країни. У Великобританії у 2001 році, спалах хвороби ротової порожнини і кінцівок худоби призвів до відбракування більш ніж семи мільйонів рогатої худоби та овець, що призвело до ефективного «закриття» сільських областей. На сьогоднішній день доступні скринінг-системи для ідентифікації мікроорганізмів у зразку, відібрано у власника (наприклад у пацієнта, тварини або джерела рослинного походження), мають низьку продуктивність. У клінічних умовах зазвичай проводять дослідження зразка тільки на наявність одного мікроорганізму, так як відсутні медичні вказівки на те, що пацієнт може страждати від декількох мікробних хвороб. Це означає, що зазвичай можливо виявити лише одну інфекцію за тестом, що значно впливає на вартість та час проведення тесту. Крім того, у реципієнта без ознак хвороби часто важко вирішити, на наявність якого мікроорганізму потрібно перевірити пацієнта. Негативні результати для двох або трьох інфекційних організмів можуть створити помилкове відчуття захищеності та безпеки. Сучасні системи виявлень, що використовуються в клінічній практиці, застосовують хімічні аналізи на основі дослідження ДНК для виявлення інфекції мікроорганізмів. Найбільш загальні методики основуються на Полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР), Лігазній Ланцюговій Реакції, Ампліфікації заміщення ланцюгу, Ампліфікації за допомогою транскрпції, Ампліфікації яка залежить від нуклеотидної послідовності та декілька інших. Ці підходи також мають низьку продуктивність, потребують багато часу, вимагають багато практичної роботи та важкі для процесу автоматизації. Окрім цього, відсутній будь-який надійний підхід для виявлення багатьох 1 UA 100495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 патогенних збудників в одному дослідженні з використанням єдиного зразка, відібраного у власника організму. Отже, бажано б мати засоби для надійного та недорого тестування для виявлення багатьох мікроорганізмів одночасно, які можуть бути наявні у біологічному зразку. Зокрема, краще мати засоби для проведення досліджень, які б дозволили правильно проводити відбір біологічного зразка у домашніх умовах або на полі. Розкриття винаходу У широкому значенні, даний винахід вирішує вищевказані проблеми, створюючи способи і обладнання для високопродуктивних досліджень біологічних зразків, що можуть містити або не містити мікроорганізми. Способи включають використання Діагностичної Мультиплексорної Панелі (ДМП), спеціально розробленої для одночасної ідентифікації багатьох різновидів потенційних мікроорганізмів, які можуть бути наявні або відсутні у біологічному зразку. У першому аспекті, винахід передбачає використання способу визначення наявності одного або більше вказаних мікроорганізмів у біологічному зразку, який потенційно містить мікроорганізми, включаючи: (a) фіксацію біологічного зразка на та/або в твердому субстраті у першому пункті місцезнаходження; (b) переміщення фіксованого біологічного зразка принаймні у наступний пункт місцезнаходження і виконання етапу екстракції на твердому субстраті з метою екстракції будьякої ДНК мікроорганізму, фіксованого на та/або в твердому субстраті; (c) виконання етапу ампліфікації нуклеїнових кислот на ДНК мікроорганізму, екстрагованого на етапі (b), зокрема, етап ампліфікації направлено на ампліфікацію принаймні однієї висококонсервативної послідовності, від одного або більше вказаних мікроорганізмів, де ампліфіковані послідовності визначаються як цільовими послідовностями; (d) комбінування цільових послідовностей з багатьма праймер послідовностями, що містяться в Діагностичній Мультиплексорній Панелі (ДМП), де кожна праймер послідовність полегшує процес генотипування цільової послідовності; (e) проведення реакції подовження праймерів у комбінації цільових послідовностей та наявної ДМП у пункті (d) , таким чином утворюючи продукт реакції ДМП; та (f) аналізу продукту реакції для визначення генотипу будь-яких цільових послідовностей, які наявні у зразку та співвідносять генотип цільових послідовностей в продукті реакції з ідентифікацією вказаних мікроорганізмів, присутніх у біологічному зразку. У другому аспекті, винахід передбачає використання ДМП, яку можна застосовувати у генотипуванні патогенних мікроорганізми, які, як відомо, викликають принаймні одну інфекційну хворобу, наявну у біологічному зразку. ДМП містить велику кількість праймер послідовностей для ідентифікації хоча б двох або більше SNPs, наявних у високо-консервативній алелі як мінімум одного відомого мікроорганізму, що може спровокувати інфекційну хворобу при використанні реакції подовження праймера. У третьому аспекті, винахід створює тестовий набір для визначення наявності мікроорганізмів, котрий споживач може використовувати особисто в одному місцезнаходженні. Набір складається з тестової поверхні, що розміщена у герметичній камері; тестова поверхня містить твердий субстрат, що здатний фіксувати біологічний зразок в собі або на поверхні, а такожбіологічний зразок, який вносять на тестову поверхню; після цього камера запечатується навколо тестової поверхні так, щоб тестовий набір можна передати або надіслати до іншого місця розташування для проведення аналізу на визначення наявності одного або більше мікроорганізмів у біологічному зразку. У четвертому аспекті, винахід пропонує спосіб лікування тварини, включаючи людини, яку підозрюють у перенесенні одного або більше інфекційних мікроорганізмів в результаті відбору біологічного зразка у тварини, дослідження біологічного зразка згідно з описаними вище методиками. За допомогою такого способу можна встановити, чи тварина заражена один або більше інфекційними мікроорганізмами, та провести курс лікування тварини відповідно до наявної інформації про вид(и) інфекційних мікроорганізмів у біологічному зразок. Також курс лікування формується відповідно до інформації про стійкість до антибіотиків одного або більше інфекційні мікроорганізми, наявних у біологічному зразку. Ця та інша користь, особливості та переваги винаходу стають очевидними для кваліфікованих спеціалістів після ознайомленнями з ідеями винаходу. Фігури На Фіг. 1 представлено схематичне зображення типових високо-консервативних ДНК послідовностей - в результаті порівняння декількох штамів однакових різновидів було отримано типові послідовності - положення, при яких праймери для ампліфікації або реакції подовження 2 UA 100495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 праймерів відбираються з метою використання у ДМП винаході. Для кожного праймера, перші дві літери ідентифікують організм, наступна літера ідентифікує цільову послідовність для різновидів (1-3); 1stPCRP означає перший праймер ПЛР; 2ndPCRP означає другий праймер ПЛР; Е1 або Е2 означає праймер подовження; для Ureaplasma є два сайти, для яких будуються праймери (UU1 і UU2). Ідентичність праймерів наведена у Таблиці 1. Організми - (a) Candida albicans; (b) Chlamydia trachomatis; (с) Gardnerella vaginalis; (d) Mycoplasma genitalium; (e) Mycoplasma hominis; (f) Neisseria gonorrhoea; (g) Treponema pallidum; (h) Trichomonas vaginalis; (i) Ureaplasma urealyticum. Детальний опис Для пояснення винаходу, використовується декілька кількість визначень, які допоможуть у розумінні суті винаходу. Для уникнення сумнівів усі посилання, які зустрічаються в даному документі, об'єднуються посиланням в цілому. Якщо інше не вказане, усі технічні та специфічні терміни, використані в даному документі, мають те ж саме значення що і для загального розуміння будь-якою пересічною людиною, що має деякі знання щодо сфери винахід. Очікується, що під час ознайомлення із загальними біологічними методиками, кваліфікована в цій сфері особа вже матиме знання про такі методики, наприклад, стандартні тексти, такі як Sambrook J. et al, (2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY. Термін «вказані мікроорганізми» в даному випадку використовується як вказівка на один або більше вказаних видів мікроорганізмів, що можуть бути наявні або відсутні у біологічному зразку. Вказані мікроорганізми зазвичай мають вірусне, мікробне, грибкове (включаючи одноклітинні дрожеві грибки) та/або протозойне (включаючи плазмодіум) походження. Типовим є те, що вказані мікроорганізми будуть патогенними для реципієнта - тварини в однаковий момент циклу їх існування. Проте, даний винахід є адекватним для тих видів мікроорганізмів, що виявляють стан спокою, симбіотичну або субклінічну інфекції. Термін «біологічний зразок» в даному випадку використовується для зразків, що можуть містити один або більше вказаних мікроорганізмів, над якими проводять дослідження відповідно до даного винаходу. Залежно від цілі ДМП біологічний зразок можна взяти у людини-пацієнта, тварини, рослини або харчового продукту. В останньому випадку використовують ДМП для визначення контамінації харчових продуктів харчовими патогенами. Зазвичай у вигляді проб може бути сеча, кал; вагінальні, носові, ректальні або ушні мазки; кров, слина; та/або мокротиння; сперма; вагінальні або сечові виділення та їх мазки; сльози (а саме сльозовиділення); зразки тканин біопсії; і мазки поверхонь, на яких може знаходитися будь-який з вищезазначених виділень або субстанції. Якщо біологічний зразок даного винаходу містить клітини, тканину та/або ДНК організму власника, наприклад людини-пацієнта, ціль винаходу перевірити на присутність мікроорганізмів, наявних всередині носія інфекції - не тестувати власну ДНК носія. Твердий субстрат винаходу складається з поглинаючого волокнистого матеріалу, що просочений одним або більше реактивами, які фіксують та роблять неактивними будь-які мікроорганізми,наявні у біологічному зразку або навіть більш простіше викликають фіксацію нуклеїнової кислоти, в якій знаходься мікроорганізми. Такі реактиви можуть містити миючі сполуки: аніонний або катіонний миючі засоби, хелатоутворюючі реагенти (наприклад, EDTA), сечовина та/або сечова кислота. Твердий субстрат безпосередньо складається з абсорбенту, тобто матеріалу з паперу на целюлозній основі (наприклад, промокальний папір); мембрани з мікрофібри; матеріалу із скляного волокна; матеріал з полімерного волокна (наприклад, мембрана нейлонового фільтру); текстильної тканини; та синтетичної тканини. Описані відповідні тверді субстрати у, наприклад, Патенті США № 5496562, 5756126, 5807527, 5939259, 5972386, 5985327, 6168922, 6746841 і 6750059. У специфічних модифікаціях даного винаходу твердий субстрат також містить фільтр-папір, оброблений реагентом Whatman FTA® або Whatman FTA Elute®, такий як папір Whatman FTA® або папір Whatman FTA® Elute. Істотна перевага способу даного винаходу полягає у тому, що твердий субстрат оброблений реагентом, таким як реагент Whatman FTA Elute®. Тому людина може використовувати цей тестовий набір у домашніх умовах. Відповідно до винаходу людина може провести початкову фазу відбору проби, придбавши набір та лише змочивши твердий субстрат у зразку сечі або слини. Твердий субстрат фіксує будь-які мікроорганізми, наявні в сечі або слині, тому інфекційні патогени безпечно захищені і не є інфекційними, а зразок можна передати до місця проведення тестів, не потребуючи дорогої обробки (а саме охолоджування, або додаткової хімічної установки), наприклад, скориставшись звичайними поштовими послугами. ДНК фіксованого мікроорганізму можна легко екстрагувати від твердого субстрату в місці проведення аналізу, зазвичай використовуючи просте нагрівання та вимивання водою. Таким чином, винахід 3 UA 100495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 створює систему, при якій відбір біологічного зразку можна з легкістю виконувати в домашніх умовах або на полі, зразки можуть зберігатися необмежено за часом та їх можна протестувати пізніше. Зручний тест-набір, що можна використовувати у домашніх умовах згідно з даним винаходом, містить герметичну камеру, що оточує тест-поверхню. До набору також додається інструкція, в якій описується, як користувач може розмістити біологічний зразок - наприклад, краплю сечі - на тест-поверхню. Тест-поверхня містить твердий субстрат, тип якого описано вище. Після того, як зразок розміщують на тест-поверхню, запечатану камеру закривають, щоб герметизувати та захистити тест-поверхню від стороннього пошкодження. У герметичному вигляді набір захищений від пошкоджень або контамінації та його можна надіслати до тестлабораторії, яка розміщена далеко від місцезнаходження користувача. У тест лабораторії камеру можна відкрити (при необхідності зламати камеру), щоб отримати доступ до тестповерхні для аналітичних цілей відповідно до винаходу. "Послідовність нуклеїнової кислоти" - це одно або двониткова ковалентно-зв'язана послідовність нуклеотидів, в якій 3'-їй та 5'-ий кінці на кожному нуклеотиді з'єднані фосфодиефірними зв'язками. Послідовності нуклеїнової кислоти - це зазвичай полінуклеотиди, що виникають на основі діоксирибонуклеотидів або рибонуклеотидів. Полінуклеотиди містять ДНК та РНК та їх можна синтетично виробляти in vitro або ізолювати від природних джерел. Розміри послідовностей нуклеїнових кислот зазвичай визначаються числом базових пар (бп) для двониткових полінуклеотидів, або у випадку однониткових полінуклеотидів визначається кількістю нуклеотидів (кн). Одна тисяча бп або кн дорівнює кілобазі (КБ). Полінуклеотиди, що мають у довжину менше 40 нуклеотидів, зазвичай називаються «олігонуклеотиди». Праймер послідовність, що використовуються у даному винаході для ампліфікації нуклеїнової кислоти та подовження праймерів, є однонитковими олігонуклеотидами. Термін "реакція ампліфікації нуклеїнової кислоти" означає будь-яку кількість пов'язаних ферментних методик, що використовують теплостійку ДНК полімеразу для ампліфікації специфічної послідовності ДНК, використовуючи серійні цикли подовження праймерів, денатурацію та гібридизацію. Зазвичай, ПЛР - це реакція ампліфікації нуклеїнових кислот, що використовується у даному винаході. Термін "реакція подовження праймера" означає реакцію, в якій праймери нуклеїнових кислот конструюються так, щоб гібридизувати з цільовою послідовністю і розширитись ферментами, додаючи один або більше нуклиотидів до 3'-кінця праймера. Цикл гібридизації праймерів відбувається в даній цільовій послідовності, що швидко гібридизується в 5' або декількох основ, розташованих вище в положенні поліморфізму, наприклад, поліморфізм одного нуклеотиду. У винаході, де праймер гібридизується на основі розташованого вище відомого SNP сайту, одноосновний праймер подовження діє на гібриди цільової праймер послідовності, щоб додати єдиний термінуючий нуклеотид, часто дідезоксинуклеотид. Лише один з чотирьох нуклеотидів, що приєднує праймер, являється комплементарним до послідовності на цільовій нитці. Ідентичність доданого нуклеотиду визначається під час фази аналізу за допомогою способу винаходу, детальний опис якого представлено далі за текстом. Термін "поліморфний алель" використовується для означення будь-яких двох або більше альтернативних форм генетичної послідовності, що займає таке ж хромосомне положення та контролює ту ж саму спадкову характеристику. Зміни алель виникають природно у зв'язку з мутацією, це може призвести до фенотипного поліморфізму серед населення або, може призвести до консервативного (не фенотипного) поліморфізму. Мутації генів зазвичай приводять до змін у послідовності нуклеїнових кислот. У даному винаході використовується явище поліморфізму алель стосовно поліморфізмів одного нуклеотиду (SNPs), вставок, викреслювань, інверсій та замін, все що може відбуватися в генах, які мають гарну здатність зберігатися у відповідному різновиді. SNPs - поліморфізми, в яких алелі відрізняються заміною / заміщенням єдиного нуклеотиду в ДНК послідовності у визначеному місці в геномі. У висококонсервативних генах, як наприклад, 16S rRNA в бактеріях, SNPs - являються надзвичайними різновидами та специфічними штамами, і це дозволяє отримати точну інформацію генотипування. Інші високо-консервативні області в мікроорганізмах містять ген бактерії 32S rRNA, дріжджі 16S та гени 18S rRNA, а також вірусні гени полімерази. Проте, кваліфікованому спеціалісту дозволяють використовувати біоінформативні методики для ідентифікації SNPs в іншому альтернативно консервативному регіоні генома для конкретного мікроорганізму. Поліморфізми, як описано вище, можуть приєднуватися до специфічних особливостей в організмі під час випробуванням. Наприклад, стійкість до антибіотиків пов'язують з мутацією а, отже, поліморфізмом. Проте, спосіб даного винаходу не обмежується ідентифікацією лише поліморфних положень в геномах мікроорганізмів під час тесту. Якщо послідовності конкурентів 4 UA 100495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 контролю використовуються для даної консервативної цільової послідовності, термін "поліморфний алель" застосовують дише для позначення зміни в даній частині послідовності між послідовністю незнайомого типу (яку будуть тестувати) та послідовності штучного конкурента. У даному прикладі приймається до уваги те, що так званий поліморфізм лише допомагає вставити відмінність продуктів реакції подовження праймера конкурентного зразка від зразка незнайомого типу, оскільки відповідні продукти реакції матимуть різну відносну молекулярну масу. Даний винахід основується частково на методі для надійного та високопродуктивного дослідження одного або більше біологічних зразків на наявність мікроорганізмів у даному зразку. Аналіз з високою продуктивністю можливий лише завдяки використання Діагностичної Мультиплексорної Панелі (ДМП), яка направлена на генотипування великої кількості мікроорганізмів, потенційно наявних у біологічному зразку. ДМП створює комбінацію праймерів, що кожен специфічно гібридизує з високо-консервативною послідовністю в ДНК, яка ізольована від мікроорганізмів, що можливо наявні у біологічному зразку. ДМП дозволяє відбуватися одночасно реакції подовження праймерів для ідентифікації одного або більше організмів, потенційно наявних у єдиному зразку. ДМПі даного винаходу можна також використовувати у терапевтичних цілях та діагностиці, а саме там, де мікроорганізми перевіряють на ослаблення (спад), поширеного в зоні хвороби або типу. У прикладі винаходу, застосування кого описано більш детально далі по тексту, ДМП використовується безпосередньо з метою діагностики наявності інфекції, що передається статевим шляхом у біологічних зразках, відібраних у пацієнтів-людей. Дана форма ДМП може легко протестувати на наявність фотогенів бактерій, таких як Mycoplasma spp.; Chlamydia spp.; Ureaplasma spp.; Neisseria spp.; Gardnerella spp.; Trichomonas spp.; Treponema spp.; грибок Candida albicans або вірусні патогени, такі як цитомегаловірус (CMV); віруси гепатитів (зокрема, HAV, HBV, HCV та інші), віруси імунодефіциту людини (HIV); віруси папіломи людини (HPV); віруси простого герпесу (HSV); вірус Molluscum contagiosum (MCV); вірус грипу; вірус Епштейна -Барра (EBV) та вірус вітряної віспи (VZV). Інші зони хвороб, для яких також можна застосовувати ДМП, містять: харчове отруєння, туберкульоз, рак в результаті вірусу, енцефаліт; малярія; гепатит; менінгіт; лейшманіоз; Африканський трипаносомоз; пневмонія; чума; SARS; MRSA; сказ; сибірська виразка; Лихоманка долини Ріфт; туляремія; вірус шигелла; ботулізм; жовта лихоманка; Лихоманка Q; геморагічна лихоманка Ебола; лихоманка вірусу Денге; лихоманка Західного Нілу; дизентерія; грип; кір; та висипний тиф. Далі за допомогою винаходу можна визначити послідовність, що створює стійкість до антибіотиків у бактеріальних патогенах, зокрема, такі послідовності до схеми ДМП тестування. Це дозволяє пришвидшити початок лікування індивідуумів, в організмах яких знаходяться такі патогени, за допомогою видалення додаткового окремого етапу мікробіологічної ідентифікації на чутливість до антибіотиків. До того ж, винахід може надати інформацію про прогресивний стан декількох хвороб, визначаючи концентрацію виявлених патогенів, яка у більшості випадків відображає прогресивний стан хвороби. Наприклад, концентрація може містити оцінку навантаження вірусу. Кількісну інформацію можна отримати від фази реакції подовження праймерів, наприклад, включенням послідовності конкурента до даної цільової послідовності. Послідовність конкурента містить поліморфізм у специфічному положенні в цій послідовності, порівняно з цільовою послідовністю. Послідовність конкурента може відповідно включати альтернативний нуклеотид у положенні відомого SNP, але який не є ідентичним. Якщо конкурент додають під час етапу ампліфікації нуклеїнової кислоти у заданій концентрації (або номер копії), у такому разі конкурент виконує функцію еталонним тестом для визначення кількості концентрації поліморфізму, що містить цільову послідовність необхідного мікроорганізму. З точки зору специфіки винаходу, можна отримати додаткові послідовності конкурента з різними концентраціями (наприклад, низької, середньої та високої концентрації), усі з варіативністю наявної послідовності, направленої на специфічний сайт у цільовій послідовності, щоб точно визначити кількість концентрації мікроорганізму в оригінальному біологічному зразку. Визначення кількості убік, включення послідовностей конкурентів також забезпечує внутрішній контроль для всіх ферментних етапів в діагностичному методі винаходу. ДМП винаходу представлений як множинність відповідно зв'язаних праймерів у розчині. Проте, ДМП може також містити праймери, які фіксуються на твердій поверхні, наприклад, у формі мікрочіпа. Тверда поверхня може відповідно бути у формі субстрату з силікону або скляного субстрату. Розщеплення ДМП продуктів реакції після подовження праймерів можна досягнути за допомогою різних технологій, включаючи мас-спектрометрію (наприклад, MALDI-TOF), 5 UA 100495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 електрофорез (наприклад, капілярний електрофорез), ДНК біочіп (наприклад, Affymetrix GeneChip™ або друкованих ДНК матриць) через об'єднання флуоресцентно позначених нуклеотидів (наприклад, Beckman Coulter's SNPstream® або Applied Boisystems' SNPlex®), або інші ярлики (наприклад, антиген, біотин, або радіоярлик). Найкращий спосіб для розщеплення продуктів подовження праймерів включає визначення відповідно до відносної молекулярної маси, а також важливими являються мас-спектрометрія та капілярний електрофорез. У одному специфічному розумінні даного винаходу, кожний праймер, охопленого в межах ДМП, відрізняється загальною довжиною неклеотида, щоб навіть два праймери не були однокової відносної молекулярної маси до або після реакції подовження праймерів. Продукти реакції очищають, щоб оптимізувати процес проведення мас-спектрального аналізу. Після очищення продукти наносять на відповідний елемент, зазвичай це силіконовий чіп, що об'єднує сайти (наприклад, SpectroCHIP®) фото-стійкої матриці високої щільності мас-спектральних аналізів, та аналізують на матриці за допомогою лазерної десорбції/іонізації час-прогінний (MALDI-TOF) мас-спектрометра (наприклад, Sequenom MassArray® Мас-спектрометр як описано в Патенті США № 6500621, 6300076, 6258538, 5869242, 6238871, 6440705, і 6994969). Результати мас-спектрального аналізу обробляються за допомогою відповідного пакету програм, що дають можливість отримати інформацію про наявність або відсутності продуктів подовження праймера, що співвідноситься з наявністю або відсутністю особливих вказаних мікроорганізмів у біологічному зразку. Також представлений наступний приклад використання винаходу. Приклад Сучасні винахідники розробили недорогий, надійний тест з високою точністю результатів, що дає можливість визначити будь-яку кількість інфекцій в єдиному зразку. Тест складається з двох частин - набору для відбору зразка, який є легким у використанні та можна застосовувати у домашніх умовах (використовуючи папір Whatman FTA Elute®, як зразок, що містить субстрат) та новітньої Мультиплексорної панелі, що визначає інфекції, які передається статевим шляхом (МПІПСШ) як Діагностична Мультиплексорна Панель (ДМП), яка може визначити за допомогою ДНК технології, чи заражена жива істота одним або декілька патогенами, що передаються статевим шляхом, а також бактеріального, вірусного, протозойного та/або грибкового походження. Даний приклад показує, що: - папір Whatman FTA Elute® - є адекватнім засобом для збору і зберігання патогенів бактерій, грибків та протозоа, що містяться у зразку сечі людини. - сполуки, присутні в папері Whatman FTA Elute® або сечі, не заважають протіканню ферментним тест-процесам. - новітня МПІПСШ функціонує як ДМП і може визначити патогени особи у патогенній суміші. Матеріали та способи Клінічні зразки Загалом було відібрано 44 зразки у пацієнтів, що відвідували приватну урологічну клініку в Україні. Пацієнтам в експериментальній групі потрібно було здати перший зразок сечі (приблизно 30мл-50мл) в стерильний посуд під час консультації. Усі пацієнти дали свою згоду на забір зразків. Були дотримані етичні вимоги та положення (включаючи спосіб відбору зразка) Українського Департаменту охорони здоров'я. Кожен зразок сечі переносили на картку Whatman FTA Elute® (Whatman pic, Brentford, UK), за допомогою стерильного аплікатора з наконечником із спеціальної губки (Puritan®, Maine, США). Аплікатор погружали в ємкість з сечею а потім промокаючи чотири рази в чотирьох окремих місцях на карті. Після додавання зразка кожна окрема карта Whatman FTA Elute® просушувалася при кімнатній температурі, поки не станала повністю сухою. Щоб запобігти контамінації, сухі карти розміщують окремо у поліетиленових пакетах, які автоматично запечатуються і потім зберігаються при кімнатній температурі. Пачка зразків 1 і 2 (31 і 13 окремі зразки відповідно) були складені у два вантажні ящики та відправлені (через кур'єрську службу Federal Express®) до тест лабораторії у Німеччині. Зразки у пачці 1 відібрали протягом 12 грудня - 26 грудня 2006 року включно. Зразки пачки 2 відібрали протягом 5 січня - 12 січня 2007р. включно. Всі зразки паралельно проаналізували у незалежні місцевій лабораторії (Київ, Україна), яка спеціалізується на тест-дослідженнях інфекцій, що передаються статевим шляхом, використовуючи стандартну ДНК на основі методик детекції, як рекомендовано Українським Департаментом Охорони здоров'я. Всі зразки були перевірені на наявність наступних мікроорганізмів: 6 UA 100495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Candida albicans Chlamydia trachomatis Gardnerella vaginalis Mycoplasma genitalium Mycoplasma hominis Neisseria gonorrhoeae Trichomonas vaginalis Treponema pallidum Ureaplasma urealyticum Отримані результати з місцевої тест лабораторії (позначено як «клініка») порівняли з результатами, отриманими в результаті використання способу МПІПСШ / ДМП (позначена як «лабораторія»). - Експериментальні процедури ДНК екстракція Щоб прийняти до уваги різницю в ДНК концентрації між зразками, з кожної картки Whatman FTA Elute® зі зразком було відібрано шість дисків по 6 мм в діаметрі за допомогою ручного пристрою з можливістю перфорування отворів у наступній послідовності -1-ого диск на 2 мл пробірку, 2 диска на 2 мл пробірку і 3 диска на 2 мл пробірку. Пристрій для перфорованих отворів після виконання отворів у кожній картці зразка прочищався за допомогою триразового перфорування чистого фільтр-паперу а потім триразового перфорування пар пру насиченого 70% етиловим спиртом. Для перевірки на перехресну контамінацію чисту карту FTA Elute® перфорувати один раз і виконували ДНК екстракцію як описано нижче (пробірка номер 4). ДНК екстракцію було виконано за допомогою Whatman FTA Elute card® протоколу ДНК екстракції у нашій модифікації для перфорованого диска з діаметром бмм. Один, два і три бмм диска з зразками (Перфоровані Фрагменті Паперу - ПФП) розмістили в окремі 2 мл пробірки Еппендорф з округлим дном, в які додали відповідно 0,7 мл, 1,4 мл та 2,1 мл ddH2O. Кожен зразок мішали у шейкері протягом 5 секунд тричі, а потім диски із зразками перенесли в окремі чисті 0,5 мл пробірки Еппендорф. До кожної пробірки з одним, двома, трьома дисками відповідно додали 50μ1, 80μ1, та 100μ1 ddН2O, після чого пробірки поставили в термостат на 95° С на 30 хвилин. Після інкубації зразки прокрутили в 12000g протягом 2 хвилин і зберігали при температурі +4°С. Для ПЛР використовували 1μ1 кожного зразка або як 1:1 розчину з ddH2U. Зразки для позитивного контролю Наступні колонії клітин, отримані від британської Національної Колекції типових Культур (NCTC), використовувалися як зразки для позитивного контролю. № Колонії клітин за каталогом Види NC127 00 N. gonorrhoeae NC11148 N. gonorrhoeae NC08448 N. gonorrhoeae NC10177 U. urealyticum NC10111 M.hominis NC10915 G.vaginalis NCPF3179 C.albicans NC10195 M.genitalium Клітини розчинили у 500 μ1 свіжої сечі, а потім взяли 50 μ1 кожного зразка для проведення позитивних контрольних досліджень як вказано нижче. Позитивний контроль № 1 NC12700 N. gonorrhoeae NC10177 U. urealyticum NC10111 M.hominis NC10915 G.vaginalis NCPF3179 C.albicans NC10195 M.genitalium Позитивний контроль № 2 NC11148 N. gonorrhoeae NC10177 U. urealyticum NC10111 M.hominis NC10915 G.vaginalis NCPF3179 C.albicans NC10195 M. genitalium 7 UA 100495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Позитивний контроль № 3 NC08448 N. gonorrhoeae NC10177 U. urealyticum NC10111 M.hominis NC10915 G. vaginalis NCPF3179 C.albicans NC10195 M. genitalium Позитивні контролі і свіжий зразок сечі, що використовувалися для розчинення клітин, відібрали піпеткою на індивідуальні картки FTA Elute® за рекомендаціями Whatman (50μ1 на 2 1см ) . Після додавання зразків карти просушували при 60 °С одну годину та відбувалася екстракція ДНК, як описано вище. Крім того, аліквота кожного позитивного контролю і свіжого зразка сечі (використані для розчинення клітин) використовувалися безпосередньо, так як в 1:5 розчині ddН2О для ампліфікації ПЛР. Під час експерименту ми не змогли отримати позитивні контролі для С. trachomatis, Т. vaginalis або Т. pallidum. Розробка аналізу Розробка ДМП для аналізу базується на послідовності ДНК, які гарно зберігаються між різними штамами кожного різновиду, що нас цікавить. Щоб визначити високу варіабельність, використовували три різні місця у зонах збереження для розробки трьох аналізів для кожного патогенна. Для всіх патогенів консервована обрана область була 16S rRNA ген, за винятком С. albicans, де консервована обрана область - це 18S rRNA ген (дивись Фіг. 1) . Для U. urealyticum використовували дві різні консервовані області для проведення шести аналізів. Точні послідовності для ПЛР та праймери подовження праймерів (ВП) наведені у Таблиці 1. За допомогою аналізу можна визначити наявність різновидів бактерій, грибків та протозоа у зразку. С. albicans С. trachomatis G. vaginalis Μ. genitalium Μ. hominis N. gonorrhoeae Τ. vaginalis Т. pallidum U. urealyticum Було виконано два типи випробувань. Перший тип містив послідовності штучного контрольного конкурента для кожної цілі, другий не містив ніяких конкурентів. Роль конкурента виконувати функцію внутрішнього позитивного контролю для ПЛР, РЕ та інших ферментних реакцій, так само як місце нанесення чіпа. У зразку з конкурентом очікували побачити принаймні сигнал для конкурента, навіть якщо зразок не містив відповідної ДНК цілі патогена. Конкуренти проектувалися так, щоб бути ідентичними до цільової ДНК послідовності з відомою відмінністю єдиної нуклеотиди в SNP сайті, послідовності конкурентів наведено в Таблиці 1. Конкурентів додали приблизно 30 копій для цілі для ампліфікації ПЛР. У проаналізованих зразках без конкурентів очікувався сигнал тільки тоді, коли цільова ДНК патогена була наявна в зразку. Цілі однакового мультиплекса виконували роль внутрішніх позитивних контролів один для одного. Проте у випадку відсутності сигналу для всіх цілей, що разом ампліфіковані, неможливо вирішити, чи зразок не містить будь-яку цільову патогенну ДНК або що один або декілька ферментних реакцій не відбулися. ПЛР ампліфікації ПЛР ампліфікацію виконували в 5μ1 об'єму реакції, що містила 1,25х HotStar® ПЛР буферного розчину 1,625mM MgCI2, 0,04mМ кожного dNTP, 0,1 μΜ кожного праймера і 0,1 U HotStarTaq®. Параметри ампліфікації були наступними: 95°С 15 хв. 1 цикл ─ 94°С 20 сек 56°С 30 сек 45 циклів 72°C 1 хв. ─ 72°C 3 хв. 8 UA 100495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4°С 5 хв. 15°С Необмежено в часі Ампліфікацію виконували на MJR Tetrad Thermo Cycler. Обробка креветковою лужною фосфотазою (КЛФ) Після проведення ПЛР додали наступні реактиви в кожну пробірку: 1,53μ1 Η2О, 0,17μ1 TS буферного розчину та 0,30μ1 КЛФ. Реакція відбулася за наступними параметрами: 37°С 20 хв. 85°С 5 хв. 4°С Необмежено в часі Реакцію виконували на MJR Tetrad Thermo Cycler. Реакція подовження праймерів Реакція подовження праймерів було проведено згідно iPLEX™ протоколу (Sequenom, Inc., San Diego, CA, USA). Після інкубації до кожної пробірки додали 2μ1 суміші праймерів, до складу якої входять 1х iPLEX буферного розчину, 1х iPLEX термінуючої суміші, 0,625μМ кожного розширеного праймера та 1х iPLEX фермент. Реакція iPLEX відбулася за наступними параметрами: 94°С 30 сек. 94°С 5 сек. 52°С 5 сек. 80°С 5 сек. Переходить до стадії 3-5 рази Переходить до стадії 2-40 рази 72°С 3 хв. 4°С Необмежено в часі Реакцію виконували на MJR Tetrad Thermo Cycler. Опріснення 16μ1 Н2О і 6мг смоли SpectroCLEAN® додали у вищезазначену суміш та обертали на круговому шейкері 30 хвилин, після чого центрифугували протягом 5 хв. на 3,000g , щоб смола випала в осад. Нанесення проб 9 нанолітрів кожного зразку нанесли на 384 SpectroCHIP®, використовуючи робот MassARRAY® Nanospotter згідно з інструкціями виробників. Кожен чіп потім зчитували на MALDI-TOF мас-спектрометрі компактному аналізатору MassARRAY®, та дані збирали за допомогою програми Typer v3.З (або вище) та зберігали у базі даних. Визначення генотипу та стану інфекції у зразку Для кожної послідовності ДНК (ДНК ціль) яку брали для аналізу був розроблений специфічний конкурент, таким чином щоб він відрізнявся від ДНК цілі за штучно введеним поліморфізмом одного нуклеотиду (SNP). Останнє було позначене як генотип MUT (Мутант) програмою, яку використовували для генотипування. Патогенний SNP був позначений як генотип С (Контроль). Коли обоє конкурентна молекула ДНК і ДНК ціль, були присутні у реакції, програма вказувала на присутність гетерозиготного генотипу, і позначала його як C.MUT або MUT.C. Порядок аллеля в гетерозиготному генотипі відображає відносну пропорцію відповідної ДНК у реакції. Вважається, що у зразку присутні інфекційні патогени, коли як мінімум два з трьох аналізів вказували на присутність хвороботворної ДНК в єдиному зразку ДНК. Оскільки три різні зразки ДНК були отримані від кожного пацієнта, очікується, що всі три зразки повинні показати ідентичні результати (Примітка: оскільки кожен зразок містив різну кількість копій патогенів, очікувалось, що зразки ДНК, отримані від двох і трьох дисків із зразками, дадуть більш достовірні результати завдяки збільшенню кількості патогенних ДНК, порівняно із зразком ДНК, екстрагованого з єдиного типового диска). Іноді тільки один або два випробування вказали на присутність патогенної ДНК у зразку пацієнтів, в той час як більшість аналізів на цей патоген у всіх ДНК зразках були негативні. Вважали, що ці результати є хибними (ймовірно завдяки перехресній контамінації), проте зразки визначили як позитивними та позначені наявністю «х» хрестиком поряд з результатом у звітній таблиці результатів (Таблиця 2). Результати та обговорення Папір Whatman FTA Elute® Для дослідження впливу сполук, наявних у папері Whatman FTA Elute® або сечі, на протікання ферментних процесів, було проведено серію підроблених зразків, що містять певну кількість відомих якісних ДНК, а саме розбавлено 1:1 елюантом, отриманим в результаті екстракції одного, двох, трьох дисків зразків або із свіжої сечі. Потім зразки використовували 9 UA 100495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 для ПЛР-та інших ферментних реакціях. Для зразків були отримані ПЛР продукти високої якості та мас-спектрометр (дані не приведені). Це вказує, що вибраний спосіб екстракції та протокол промивання є адекватними для аналізу MALDI-TOF, а також показують, що субстанції в сечі людини не мають значного впливу на достовірність аналізу ДМП. Щоб визначити чи папір Whatman FTA Elute® може захопити і зберегти патогенну ДНК, отриману від зразка сечі, зразки ДНК (екстраговані з карток), що належать пацієнтам та визначені як позитивні за допомогою місцевих лабораторних аналізів (клініка) були ампліфіксвані в 50μ1 реакції, використавши праймери МПІПСШ/ДМП і продукція, сепарована на 2% агароз гелі в 1хТВЕ буферному розчині (дивись Фіг. 1). У всіх випадках спостерігали хороший сигнал для правильного розміру ампліконів, що вказує на наявність патогенної ДНК на папері Whatman FTA Elute® в кількості, достатній для достовірної ПЛР ампліфікації. Той же експеримент був проведений з використання позитивних контрольних зразків сечі і спостерігалися подібні результати (дані відсутні). Ці результати підтверджують, що продукти на основі целюлози, наприклад папір Whatman FTA Elute®, можна використовуватися як відповідний твердий субстрат для відбору та транспортування зразків пацієнтів і не виявляють ніякого візуального погіршення з часом. Проте, стало зрозуміло, що зразки сирої сечі так само як і біологічні зразки, фіксовані на інших типах субстрату, можна також використовувати для проведення тестів за допомогою даного способу МПІПСШ/ДМП. Методологія МПІПСШ/ДМП Всі зразки були проаналізовані у реакціях з або без послідовностей ДНК конкурента. В експериментах з використання конкурентів у більшості випадків були отримані сигнали специфічні для ДНК конкурента, в тому числі при аналізі зразків з позитивнім контролем. У даному розділі обговорюються результати аналізів в яких ДНК конкуренти не використовувались. Результати експериментів представлені у Таблицях. Позитивні контролі Для підтвердження можливого використання способу МПІПСШ/ДМП для виявлення індивідуальних патогенів серед патогенної суміші були створені три позитивних контролі з використанням сечі як середовища (дивись вище), отриманих в результаті змішування патогенів, що передаються статевим шляхом, отриманий від NCTC. Позитивні контрольні зразки були проаналізовані як зразки сечі, так і зразки паперу Whatman FTA Elute® (Таблиця 3). У всіх випадках була виявлена присутність кожного патогенна у зразку незалежно від його походження. Позитивні контролі, що відрізняються штамом N. gonorrhoeae також присутні у зразках. У всіх випробуваннях для цього виду за допомогою способу МПІПСШ/ДМП можна виявити наявність N. gonorrhoeae незалежно від типу штаму. Це показує, що області ДНК, вибраної для проведення дослідження N. Gonorrhoeae, не показують специфічну залежність від штаму і можна використовувати для визначення наявності будь-якого відомого виду N. gonorrhoeae у зразку. Клінічні зразки Аналізуючи клінічні зразки, у всіх випадках результати лабораторії МПІПСШ/ДМП підтвердили результати, отримані і проаналізовані незалежно від клініки (Таблиця 2). Декілька зразків було також ідентифіковано як позитивними для інфекцій, які не виявлені в тестлабораторії. Проте, через те, що не у всіх випробуваннях виявили даний патоген і тому що тільки один (рідко два) зразки ДНК мали позитивний сигнал, ці результати потрібно розглядати як хибними для даного експериментального вивчення. У більшості випадків таке трапляється з пацієнтом, чий зразок знаходився на попередньо перфорованій картці зразка, що показала позитивний результат для специфічної інфекції (наприклад, пацієнт 2 та 3 - U. urealyticum, пацієнти 11 та 12 - М. genitalium, і т.п.). Ймовірно пояснення для цих хибних результатів це контамінація ДНК від попереднього зразка. Це підтверджує той факт, що контрольні зразки контамінації (чиста карта Whatman FTA Elute®), використані між зразками пацієнтів, також є позитивними для тих же інфекцій. Тому слід оптимізувати високу чутливість ДМП винаходу та майбутніх експериментальних процедур, щоб уникати перехресної контамінації. Три різні зразки ДНК були відібрані з кожної карти зразка пацієнта. Зразки містили різну кількість копій патогенної ДНК (за наявності) . У більшості випадків можливо ідентифікувати інфекцію в зразках ДНК від позитивних пацієнтів, що екстрагують від двох або більше дисків зразків. Для більшості зразків ДНК від позитивних пацієнтів усі три випробування ідентифікували інфекцію. Лише у невеликій кількості випадків один з трьох випробувань не показало гарного сигналу, проте на нього вказало програмне забезпечення генотипування. 10 UA 100495 C2 5 10 Також можна визначити кількість копії ДНК об'єкту у реакції за допомогою титрування кількості конкурента або включення трьох різних конкурентів у відомих початкових концентраціях у ту ж саму реакцію. Останній підхід рекомендується для патогенів, рівень спалахів яких важливий від клінічної перспективи, наприклад, серед індивідуумів, інфікованих ВІЛ або G. vaginalis. Хоча специфічні особливості та застосування винаходу описані у всіх деталях, це можливо було виконати лише за допомогою прикладу і лише з метою ілюстрації. Вищезазначені втілення не мають намір обмежувати контекст заяв у додатку, які слідують далі за текстом. На думку винахідників до винаходу можна застосувати різні заміни, зміни, і модифікації, проте не потрібно далеко відступати від значення та сфери винаходу, як зазначено у заявах. 11 UA 100495 C2 12 UA 100495 C2 13 UA 100495 C2 14 UA 100495 C2 15 UA 100495 C2 16 UA 100495 C2 17 UA 100495 C2 18 UA 100495 C2 19 UA 100495 C2 20 UA 100495 C2 21 UA 100495 C2 22 UA 100495 C2 23 UA 100495 C2 24 UA 100495 C2 25 UA 100495 C2 26 UA 100495 C2 27 UA 100495 C2 28