Антиген gp41

Реферат: Винахід належить до модифікованого поліпептиду, який включає три суміжні сегменти N, L і С, представлений формулою NLC і включає: N-спіральну ділянку gp41 (N), С-спіральну ділянку gp41 (C) і сполучну петлю, яка включає синтетичний лінкер (L) між N- i С-спіралями, де лінкер замінює амінокислоти 593-617 gр41, де порядок нумерації відповідає прототипу - ізоляту штаму ВІЛ-1 НхВ2 монофілетичної групи В, і вказаний поліпептид включає кальвеолін-1нейтралізуючий епітоп і епітоп 98.6 D, але не включає епітопів 2F5 і 4Е10, не є пептидом злиття і має мінімальну перехресну імуногенну реактивність з інтерлейкіном людини - 2 (ІЛ2); до водної композиції, кон’югата, тримеру, фармацевтичного препарату та застосуванню вказаного поліпептиду для лікування і/або профілактики ВІЛ. UA 108469 C2 (12) UA 108469 C2 UA 108469 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Попередній рівень техніки Даний винахід відноситься до розчинної і стабілізованої у водному середовищі форми глікопротеїну оболонки ВІЛ-1 gp41, придатної для індукції імунної відповіді проти вірусу імунодефіциту людини типу 1 (ВІЛ-1), фармацевтичниї композицій, що містять вказаний gp41, способу лікування, спрямованого проти вірусу імунодефіциту людини і захворювань або розладів, що асоціюються з ВІЛ. ВІЛ-1 кодує попередник глікопротеїну оболонки масою 160 кДа (gp160), який протеолітично розщеплюється на зовнішній (gp120) і трансмембранний (gp41) глікопротеїни. У зрілій глікопротеїновій оболонці глікопротеїн gp120 знаходиться у формі, що асоціюється з ектодоменом gp41 за допомогою нековалентної взаємодії. Нативні глікопротеїни оболонки ВІЛ-1 існують, переважно, у вигляді тримерів на поверхні вірусної мембрани, що складаються з трьох gp120 і трьох gp41 субодиниць, і заякорені в мембрані вірусу або інфікованої клітини за допомогою трансмембранної ділянки gp41. Показано, що зв'язування gp120 з рецептором CD4 викликає конформаційні зміни, сприяючі наступній взаємодії з одним з ряду хемокинових рецепторів (CXCR4, CCR5.). Ці зв'язування запускають конформаційні зміни в gp41. Зокрема, дослідження за допомогою рентгенокристаллографії і ядерного магнітного резонансу показують, що глікопротеїн оболонки вірусу gp41 існує щонайменше в трьох конформаціях: нативній конформації (шпилька), префузогеній метастабільній конформації, яка переходить в термостабільну фузогенну конформацію ("три шпильки") внаслідок ініційованих події, такиз як зв'язування частки вірусу ВІЛ-1 з мембраною клітини-мішені. Так, зв'язування gp120 з клітинними корецепторами викликає перехід gp41 з префузогенної форми у фузогенну. Лінійна організація gp41 включає пептид злиття, ектодомен (N-кінцеву суперспіраль, дисульфід-звязана ділянка петлі і С-кінцевої α-спіральний відрізок) і трансмембранний домен. У фузогенному шестиспіральному пучку gp41 три N-кінцеві спіралі формують тривимірну суперспіраль, і три С-кінцеві спіралі упаковані у зворотному напрямі в три гідрофобні борозенки на поверхні суперспіралі. Така спірально-шпилькова структура відповідає конформації gp41 з фузогенною активністю. Оскільки трансмембранний якір і пептид злиття ектодомену gp41 занурені, відповідно, в мембрани вірусу і клітини-мішені, утворення фузогенної шпилькової структури призводить до колокалізації двох мембран і, таким чином, дозволяє долати енергетичний бар'єр злиття мембран. Глікопротеїни оболонки ВІЛ-1 є єдиною реалістичною мішенню для індукованої вакциною відповіді нейтралізуючих антитіл, оскільки вони сприяють злиттю вірусної мембрани за допомогою рецептор-опосредованних конформаційних змін і експрессуються на поверхні як віріонів, так і інфікованих клітин. Спочатку в якості основних кандидатів для вакцини розглядалися мономірний gp120 ВІЛ-1 і його похідні. Проте gp120 ВІЛ-1 є високоваріабельним і, як було неодноразово показано, імуногенно неефективним при індукції нейтралізуючих антитіл проти клінічних ізолятів ВІЛ-1. Деякі з антитіл, що індукуються мономерами gp120, ефективно зв'язують зібрані тримери поверхневих глікопротеїнів ВІЛ-1. Навпаки, gp41 є надзВІЛайно іммунногенним глікопротеїном, що індукує утворення антитіл практично у усіх ВІЛ-інфікованих індивідуумів. Ектодомен gp41 є найбільш консервативною ділянкою поверхневого мембранного білку ВІЛ1, який в інших областях проявляє істотну генетичну різноманітність навіть серед близькоспоріднених ізолятів. Крім того, gp41 грає критичну роль в підтримці структури і інфекційності віріонів ВІЛ-1. Антитіла, спрямовані проти структур шестиспірального пучка (фузогенна форма) і прешпильки (префузогенна форма) перешкоджають злиттю за певних умов. Антитіла, що мають доступ до конформацій пре-шпильки і шестиспірального пучка gp41, будуть здатні інгібірувати опосередковане gp41 злиття. Крім того, шестиспіральний пучок є надзВІЛайно стабільною структурою. Ці спостереження дозволяють розглядати gp41, в модифікованій або немодифікованій формі, в якості прийнятної мішені для розробки лікарських засобів і вакцин. У US 6,455,265 показано, що деякі похідні gp41 можуть бути особливо ефективними для одержання вакцин для запобігання патогенним ефектам, пов'язаним з ретровірусною ВІЛ інфекцією, за умови, що відповідні поліпептиди мають епітопи, що мають модифіковану антигенність, так щоб одержувати відмінну імунну відповідь по відношенню до вірусної оболонки і деяких власних білків. Конкретніше, виявлено, що консервативні і іммуннодомінантні ділянки ретровірусної оболонки можуть бути відповідальні за шкідливий аутоіммунний процес, особливо у разі 1 UA 108469 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ретровірусної оболонки gp41. Було встановлено, що певні іммуннодомінантні ділянки gp41 демонструють тривимірні структурні аналогії і перехресну реактивність з певними ділянками деяких білків імунної системи людини і, зокрема, з інтерлейкіном 2 (ІЛ-2). Таким чином, в US 6,455,265 були запропоновані модифіковані поліпептиди, одержані за допомогою модифікування антигенності епітопу відповідного білка оболонки, для одержання різної імунної відповіді по відношенню до білка вірусної оболонки і до даних білків імунної системи людини, зокрема ІЛ-2. У WO 2005/01033 розкриті такі модифіковані поліпептиди щонайменше з однією антигенною ділянкою нативного білка ВІЛ gp41. Зазвичай, синтетичний gp41 може бути одержаний в трансфеційованном бакуловірусі або клітинах ссавця, але в меншій кількості, ніж в E. сoli. Крім того, глікозовані у бакуловірусі або клітинах ссавця відрізняється від глікозування в клітинах людини і не є необхідною умовою імуногенності білка. Фактично, gp41 є сильно іммунногенним без глікозування. Проте повнорозмірний або укорочений рекомбінантний ектодомен gp41 ВІЛ-1, продукований в E. coli, зазвичай утворює нерозчинні осади (агрегати тримірної форми gp41) у водному середовищі при нейтральному рН. Все ще існує необхідність одержання високих рівнів білків gp41, які можуть бути позбавлені іммуннодомінантної ділянки, що запускає антитіла без нейтралізуючої активності, але зберігають при цьому ділянки gp41, важливі для напряму імунної відповіді на відповідні епітопи, що в цілому зберігають іммунногенну активність. Проте все ще залишається потреба у вакцині, що дозволяє індукувати універсальну імунну відповідь проти Віл-інфекції і, зокрема, інфекції ВІЛ-1. Також існує необхідність створення вакцин до вірусів, що не відносяться до кладу В, наприклад, до штамів кладу С. Також існує необхідність створення вакцини з широким спектром інгібування, що дає можливість перехрестно-кладного інгібування. Існує потреба у вакцині, що дозволяє індукувати природжену і гуморальну і клітинну імунну відповідь проти інфекції ВІЛ-1. Існує потреба у вакцині, що дозволяє індукувати імунну відповідь проти інфекції ВІЛ на рівні слизових оболонок і в крові. Існує потреба у вакцині, що дозволяє індукувати IgA і антитіла слизової оболонки, і системні IgA- і IgG-антитіла, здатних перешкоджати проникненню ВІЛ через слизову оболонку і ранньої клітинної інфекції під слизовою оболонкою. Існує потреба у вакцині, прийнятній для інгібування або зниження проникнення ВІЛ через слизові тканини, наприклад, вагінальні слизові тканини, за допомогою різних механізмів, таких, як трансцитоз і АЗКЦ (антитілозалежна клітинна цитотоксичність). Метою винаходу є забезпечення усіх вищезгаданих потреб. Короткий опис винаходу Конкретніше, даний винахід відноситься до стабілізованих водорозчинних форм білка gp41. Автори даного винаходу несподівано виявили, що можливо значно понизити будь-яку іммуннодомінантну перехресну реакцію з деякими білками імунної системи людини, гідрофобність петлі, за рахунок підвищення розчинності і стабільності похідних gp41, що дає тримірну розчинну форму gp41 без зміни його іммунногенної реактивності. Крім того, згідно з переважним, але не єдиним, втіленням, вказані поліпептиди легко очищають і прикріплюють до носія, прийнятного для індукції імунної відповіді проти вірусу імунодефіциту людини, наприклад, віросомі. Детальний опис винаходу Однією з основних цілей даного винаходу є розробка інших модифікованих поліпептидів, що мають поліпшену стабільність, в мономірній або олігомірній формі, при збереженні їх розчинності уводному середовищі, зокрема, коли вони прикріплені або пов'язані з вищезгаданою віросомною часткою. Іншою метою даного винаходу є розробка інших модифікованих пептидів, які, будучи коньюгованими з віросомоподібною часткою, мімікрують орієнтацію і презентування білка gp41 на нативній вірусній мембрані ВІЛ і на будь-якій мембрані клітини, інфікованої ВІЛ. Іншою метою даного винаходу є розробка інших модифікованих пептидів, що мають ефективні антигенні, можливо іммунногенні властивості, які роблять їх можливими кандидатами для профілактичного лікування, спрямованого проти ВІЛ. Відповідно, одним об'єктом даного винаходу є будь-яка антигенна і іммунногенна сполука або композиція, що містять ці або інші модифіковані пептиди. Іншою метою даного винаходу є розробка інших модифікованих поліпептидів, що ефективно індукують системний IgG (кров) і можливий комплементарний IgA слизової оболонки, 2 UA 108469 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 спрямованих на відповідні консервативні ділянки білкау gp41, зокрема проти варіантів ВІЛ різних кладів, наприклад проти кладів В і З ВІЛ-1 і різних підтипів серед них. Іншою метою даного винаходу є розробка інших модифікованих пептидів, що ефективно індукують протективні антитіла і генерують в невеликій кількості, або що не генерують взагалі, ненейтралізуючі антитіла проти ВІЛ, або що мають кращу або оптимально спрямовану гуморальну відповідь проти консервативних ділянок gp41. Іншою метою даного винаходу є розробка інших модифікованих пептидів, здатних блокувати транслокацію вірусу через слизовий бар'єр і інгібувати клітинну інфекцію, таким чином запобігаючи інфекції ВІЛ-1. Інша мета даного винаходу передбачає поліпептиди подібні gp41, які можна піддавати ліпідізації, тобто безпосередньо або не безпосередньо комбінувати своїм С-термінальний кінець з прийнятним ліпідом, в кількості, сумісній з індустріалізацією/продукцією будь-кого віросомного коньюгату вказаного пептиду. Інша мета даного винаходу передбачає поліпептиди, подібні gp41, що можуть пов'язуватися, тобто прикріпленими із зовнішнього боку до віросомо-подібної частки, в кількості, сумісній з індустріалізацією/продукцією будь-якого коньюгату вказаного пептиду. У рамках одного аспекту винаходу запропонований модифікований поліпептид, що містить три суміжні сегменти N, L і З, представлений формулою N-L - C і що містить: N-спіральну ділянку gp41 (N), С-спіральну ділянку gp41 (C) і сполучну петлю, що містить синтетичний лінкер (L) між N, - і С-спіралями, де лінкер замінює амінокислоти 593-617 gp41, де порядок нумерації відповідає прототипу - ізоляту штаму ВІЛ-1 НхВ2 кладу В, і де вказаний пептид містить кальвеолін-1-нейтралізуючий епітоп і епітоп 98.6 D, але не містить епітопів 2F5 і 4Е10, не є пептидом злиття і має мінімальну перехресну іммунногенній реактивність з інтерлейкіном-2 (ІЛ2). Поліпептид згідно винаходу далі в цьому документі взаємозамінний називається "Антиген, похідний від gp41" або "gp 41 згідно винаходу" або "rgp41". Поліпептид згідно даного винаходу фактично зберігає нативну конформацію в результаті взаємодії між N - і С-спіралями і має гідрофобність, що забезпечує розчинну і стабільну тримірну форму вказаного модифікованого поліпептиду без значної зміни його іммунногенної реактивності. У контексті даного винаходу епітоп 2F5 відповідає специфічній ділянці gp41, розпізнаваного антитілом 2F5 людини, що має широку нейтралізуючу активність відносно різних первинних ізолятів ВІЛ-1 (Trkola A. et.al., 1995, J. Virol., 69, pp6609-6617, см Фіг. 1). Це моноклональне антитіло розпізнає кіровий епітоп з шести амінокислот в межах відносно консервативної лінійної послідовності з 16 амінокислот (NEQELLELDKWASLWN, SEQ ID No.7) в ектодомені gp41 біля трансмембранної ділянки молекули (Parker et.al., 2001, J. Virol., 75, pp10906-10911). Моноклональне антитіло людини 4Е10 є специфічним для трансмембранної проксимальної ділянки gp41, розташованої у безпосередній близькості від карбокситермінального кінця по відношенню до епітопу 2F5, і також має широку нейтралізуючу активність (Zwick et.al., 2001, J. Virol., 75, pp10892-10905, см Фіг. 1). Епітоп 98.6 D розташований в ділянці gp41 кластеру II і розпізнається моноклональним антитілом людини 98.6 D, як описано в Gorny M.K. et.al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., 86, pp16241628 і Xu J.-Y. et.al., 1991, J. Virol., 65, pp4832-4838. Домен, зв'язуючий кальвеолін-1, відповідає пептиду CBD1 (SLEQIWNNMTWMQWDK, SEQ ID No. 8) в gp41 (Benferhat et.al., 2009, Mol. Immunol. 46(4), pp705-712). Пептид злиття відповідає амінотермінальній ділянці gp41, що доступна після утворення суперспіральної форми. Ця ділянка вбудовується в мембрану клітини-мішені, що призводить до злиття вірусної і клітинної мембран; він відповідає ділянці 512-539 позаклітинній частині gp41 (Quintana et.al., 2005, JCI; см Фіг. 1). Поліпептид згідно даного винаходу дає можливість утворення тримерів, зберігає антигенність нативного gp41 і проявляє мінімальну перехресну реактивність з ІЛ-2. Така перехресна реактивність визначається способами, добре відомими фахівцям в області техніки, такими як gp41-ИСФА і gp41-дот-блот. Приклад такого визначення наведений нижче (див. Приклад 3, Фіг. 2). Згідно даного винаходом вираження "зберігає антигенність нативного gp41" або "без зміни його іммунногенної активності" означає, що поліпептид згідно винаходу має практично такий же рівень антигенної і іммунногенної активності, як дикий тип gp41. Ділянки N і З, що становлять поліпептид згідно винаходу, можуть бути одержані з будь-якого білка gp41 ВІЛ, включаючи штами ВІЛ-1 і ВІЛ-2, у тому числі лабораторні штами і первинні 3 UA 108469 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ізоляти. Переважно ці ділянки одержують з штаму ВІЛ-1 і, зокрема, з штаму НхВ2 ВІЛ-1, як представлено на SEQ ID No.1. Нуклеотидні і пептидні послідовності великого числа білків gp41 відомі і доступні, наприклад, в інтернеті на сайті http://www.hiv.lanl.gov/, а також у відповідній короткій настанові Los Alamos (HIV Sequence Compendium 2005 Leitner T, Foley B, Hahn B, Marx P, McCutchan F, Mellors J, Wolinsky S and Korber B, Eds., опублікованій в Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, NM, LA-UR 06-0680). Будь-яка послідовність, приведена вище і у формулі винаходу, в яку внесені одна або більш ніж одна консервативна мутацій (що трохи модифікують імуногенність) також включена у вищезгадане визначення. Амінокислоти пронумеровані шляхом посилання на послідовність білка gp41, представленого на Фіг. 1 (амінокислотна послідовність якого представлена на SEQ ID No. 1). У переважному втіленні поліпептид згідно винаходу є послідовністю, представленою на SEQ ID No. 17 або SEQ ID No.18. У ще одному аспекті винаходу поліпептид також містить щонайменше один спейсерний пептид на ділянку S. У ще одному аспекті поліпептид згідно винаходу представлений SEQ ID No.19 або SEQ ID No.20 і відповідно названий Mo або M1. Вказана спейсерна послідовність може забезпечувати кращу коньюгацію, наприклад, зв'язок поліпептиду з носієм, наприклад, віросомою, шляхом створення реактивних амінокислот, за рахунок яких вказана прищеплена сополімеризація відбувається успішніше. Зокрема, це може дозволити додатково віддаляти амінокислоту(и), на якій відбувається вказана прищеплена сополімеризація, від мембрани віросоми. Композиція вказаної спейсерного ділянки, наприклад, амінокислотна послідовність, також може бути розроблена так, щоб полегшити спосіб одержання поліпептиду по винаходу. У конкретному втіленні винаходу вказана спейсерний ділянка може містити залишки гістидину, які можуть брати участь в етапі очищення цілого поліпептиду (див. Приклад 1 нижче). Вказаний спейсерний пептид містить щонайменше амінокислотну послідовність, представлену на SEQ ID No.9, SEQ ID No.10, SEQ ID No.11 або SEQ ID No.12, в С-термінальної частини поліпептиду згідно винаходу. Вказана спейсерна послідовність також може вносити вклад в імуногенність поліпептиду згідно винаходу. У переважних втіленнях N сегмент представлений амінокислотами 540-592 gp41, порядок нумерації згідно з прототипом - ізолятом НхВ2 ВІЛ-1, і З ділянка представлена амінокислотами 618-664 gp41, порядок нумерації згідно з прототипом - ізолятом НхВ2 ВІЛ-1. Згідно з переважним втіленням, N ділянка є послідовністю, приведеною на SEQ ID No.13 або SEQ ID No.14 і З ділянка є послідовністю, приведеною на SEQ ID No.15. У ще одному аспекті винаходу вказаний фрагмент L є послідовністю, приведеною на SEQ ID No.16. Поліпептиди згідно винаходу доступні у формі тримерів. У іншому аспекті даного винаходу запропонована водна композиція, що містить поліпептид згідно винаходу, де вказаний поліпептид формує стабільні тримери у водному середовищі. Даний винахід, зокрема як визначено у формулі винаходу, що додається, включає поліпептиди, еквівалентні раніше визначеним або описаним, зокрема, їх аналоги, як визначено в цьому документі нижче за допомогою посилання на інші додаткові антигени, придатні для здійснення даного винаходу. Як його застосовують у даному винаході, вираження "його аналог" відносно gp41 –похідного антигена відноситься до пептиду, що має значну (щонайменше 85 %, зокрема щонайменше 90 %, і зокрема щонайменше 95 %) ідентичність або гомологію амінокислотної послідовності (тобто амінокислотний залишок заміщений амінокислотним залишком того ж сімейства, наприклад, однакової полярності або заряду) з амінокислотною послідовністю вказаного gp41производного антигена, і який має схожі або збережені біологічні властивості, зокрема відносно антиген-звязуючий частини іммунноглобіну, спрямованими проти білка gp41. Згідно з вищеописаними характеристиками, поліпептид згідно даного винаходу утворює при розчиненні розчинні тримери. По суті, в ще одному аспекті, згідно з винаходом запропонована водна композиція, що містить поліпептид згідно винаходу, де вказаний поліпептид утворює тример у водному середовищі. Вказаний тример є стабільним у вказаній водній композиції. Олігомірне, наприклад, тримірне, стан поліпептиду згідно винаходу може бути визначений способами, добре відомими фахівцям в області техніки, такими як гель-фільтрація, наприклад, FPLC, з розподілом між 3000 і 600000 Дальтон. 4 UA 108469 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Стабільність тримерів, утворених пептидом згідно винаходу, може бути визначена способами, добре відомими в області техніки, такими як декілька циклів заморожування і відтавання водної композиції, що містить поліпептид згідно винаходу. Поліпептиди згідно винаходу одержують за допомогою зВІЛайних або стандартних способів хімічного синтезу або генетичної інженерії, добре відомих фахівцям в області техніки. Згідно з одним варіантом поліпептиди одержують за допомогою хімічного синтезу: вони можуть бути синтезовані у вигляді окремої послідовності або у вигляді декількох субпослідовностей, які потім зв'язують один з одним. Хімічний синтез може бути здійснений в твердій фазі або в розчині, ці два способи синтезу добре відомі фахівцям в області техніки. Ці способи, зокрема, описані Atherton і Shepard в "Solid phase peptide synthesis" (IRL press Oxford, 1989) і Houbenweyl в "Methoden der organischen Chemie" (Methods in organic chemistry), опублікованою в E. Wunsch Vol. 15-1 і 11, Stuttgart, 1974, і також в наступних статтях, включених в цей документ за допомогою посилання: P.E. Dawson et.al. (Sience 1994; 266(5186), pp776-779); G G Kochendoerfer et.al. (1999; 3(6), pp665-671); P.E. Dawson et.al. (2000, 69, Annu. Rev. Biochem., pp.923-960). Згідно з іншим варіантом поліпептиди згідно винаходу одержують за допомогою способів генетичної інженерії, добре відомих фахівцям в області техніки. Якщо вказані поліпептиди згідно винаходу одержують за допомогою генетичної інженерії, вони можуть утримувати на NH2термінальному кінці додатковий залишок метіоніну, що відповідає трансляції першого стартового кодону. Детальніше ці способи описані в Molecular Cloning: молекулярне настанова Maniatis et.al., Cold Spring Harbor, 1989. Зазвичай застосовують спосіб ПЦР для одержання послідовності ДНК, кодуючої поліпептиди згідно винаходу, у формі, яка може бути вбудована в експрессійний вектор. Потім експрессійний вектор, що містить відповідну послідовність, застосовують для трансформації клітини-хазяїна, яка дозволяє експрессувати відповідну послідовність. Після цього одержані поліпептиди ізолюють з культурального середовища за допомогою стандартних способів хроматографії, добре відомих фахівцям в області техніки. На етапі очищення переважно застосовують високоефективну рідинну хроматогафию (ВЕРХ). Зазвичай клітини збирають за допомогою центрифугування у кінці культивування і поміщають в нейтральний буфер для того, щоб зруйнувати за допомогою будь-якого прийнятного засобу. Після цього клітинний лізат центрифугуют з метою відділення розчинного матеріалу від нерозчинного. SDSPAGE аналіз супернатанту і осідання після центрифугування виявляє, чи є поліпептид розчинним, чи ні. Якщо пептид нерозчинний, то підвищення розчинності досягають за допомогою буфера, що містить сечовину, гуанідин або будь-який інший розчинник. Центрифугування на цьому етапі дає можливість видалити залишки органічних речовин і інші нерозчинні продукти, які перешкоджатимуть хроматографії. Наступний етап полягає в нанесенні розчинених молекул на колонку для аффінної хроматографії, що може бути металло-хелатного типу, якщо кількість гістидинових залишків така ж, як в лінкерній ділянці L, яка може бути інтегрована у відповідний поліпептид. Система, що дає можливість аффінної очищення, може бути різною за своєю природою, наприклад, іммунноафінна, аффинна до цибакрону синьому і так далі. На цьому етапі поліпептид демонструє міру очищення, близьку до або більше 80 %, зокрема, щонайменше 90 %, як може бути визначено за допомогою колориметрії при SDSPAGE електрофорезі з наступною витримкою в Кумассі блакитному. Денситометричний вимір смуг дає можливість ВІЛислити міру очищення. Міра очищення також може бути виміряна за допомогою зворотньо-фазової ВЕРХ, за допомогою виміру області різних піків. Може бути доданий додатковий етап хроматографії з метою подальшого очищення поліпептиду, наприклад, за допомогою описаної гель-фільтрації або зворотньо-фазовоїхроматографії. У ще одному втіленні винахід описує полінуклеотид, кодуючий поліпептиди, визначені вище. Полінуклеотиди згідно даного винаходу містять як одноланцюгові, так і двуланцюгові молекули ДНК/РНК. У ще одному аспекті даного винаходу полінуклеотид, кодуючий rgp41 згідно даного винаходу, має послідовність SEQ ID No.21 або SEQ ID No.28. Додаткові послідовності ДНК, кодуючі модифіковані поліпептиди, що потрапляють в об'єм даного винаходу, може бути легко одержана фахівцями в області техніки на підставі генетичного коду і поліпептидних послідовностей, приведених в даному описі. З іншого боку, будь-якому фахівцеві в області техніки очевидно, що серед молекул поліпептидів, що кодуються молекулами полінуклеотидів згідно даного винаходу, зокрема, полінуклеотидними послідовностями, приведеними в даному описі, можливі варіації послідовності з урахуванням вирожденності генетичного коду. 5 UA 108469 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Усі ці варіації включені визначенням(ями) винаходу і формулою винаходу, що додається, якщо ці варіації не змінюють значно структуру/конформацію і функцію(ї) і властивості одержуваного поліпептиду по відношенню до описаних раніше окремо і нижче в цьому документі. Згідно з одним втіленням винаходу полінуклеотидну послідовність згідно винаходу безпосередньо хімічно синтезують (Young L. and Dong Q., 2004, - Nucleic Acids Res., Apr 15;32(7), Hoover D.M. and Lubkowski J., 2002, Nucleic Acids Res., 30, Villalobos A, et.al., 2006. BMC Bioinformatics, Jun 6;7:285). Полінуклеотидні послідовності згідно винаходу, одержані таким чином, можуть бути вбудовані відомим способом у будь-який відповідний вектор, що дає можливість експрессувати вказаний поліпептид, якщо необхідно, в модифікованій формі, у відповідних клітинних системах. Полінуклеотидні послідовності, одержані таким чином, можуть бути введені в господарську клітину для трансформації хазяїна і забезпечення експресії (наприклад, транскрипції і трансляції) введеної послідовності. Вектори включають плазміди, фаги і так далі. Переважно застосовують вектори, в яких послідовність ДНК, що кодує поліпептид згідно винаходу, знаходиться під контролем сильного промотора, який може бути індуцибельним або неіндуцибельним. В якості прикладу промотора, який може бути застосований, можна згадати промотор РНК полімерази Т7. Експрессійні вектори можуть включати селекційний маркер, такий як гени стійкості до ампіциліну, тетрацикліну або інших антибіотиків для застосування людьми. З іншого боку, трансформовані клітини можуть бути відібрані за допомогою маркера ауксотрофності або способу селекції будь-якого типу, не заснованого на антибіотиках (комплементація життєво необхідного гену, що заздалегідь нокаутує, в геномі хазяїна). Приклади експрессійних векторів, які можуть застосовуватися, включають плазміди pET21b, pET30 (Novagen), вектори дріжджів, бактерій, вірусів, таких як бакуловіруси і поксвіруси. Для забезпечення експресії і очищення поліпептиду згідно винаходу останній може бути експрессований в модифікованій формі, такій як гібридний білок, і може включати не лише сигнали секрецій, але також додаткові гетерологічні функціональні ділянки. Наприклад, для поліпшення його стабільності і збереження поліпептиду в господарській клітині на N-кінці може бути додана ділянка додаткових амінокислот, у тому числі заряджених амінокислот. Метою винаходу також є експрессійний вектор, що містить полінуклеотид, як описано вище. Вказаний вектор може застосовуватися для трансформації організму хазяїна, де вказаний організм хазяїна є іншою метою даного винаходу. Згідно з винаходом також запропонована господарська клітина, трансформована за допомогою вказаного вектору. Може бути використана будь-яка господарська клітина, зазвичай застосовувана у поєднанні з експрессійними векторами, описаними раніше, наприклад, E. coli, BL21 (DE3), BLR (DE3), origami 2(DE3), Bacillus або інші грам-позитивні хазяї, такі як Lactococcus lactis, дріжджі, бакуловірус і еукаріотичніе клітини, такі як CHO (клітини яєчника китайського хом'яка) або Vero. Переважні клітинні експрессійної системи включають E. coli, таку як BL21 (DE3). У іншому аспекті даного винаходу запропонований коньюгат, що містить поліпептид згідно даного винаходу. У ще одному аспекті поліпептид згідно винаходу коньюгований з віросомоподібної везикулою. Віросомоподібна везикула Віросомоподібна везикула, прийнятна для даного винаходу, містить щонайменше віросомальні ліпіди і переважно проявляє властивості мембран злиття. Згідно з одним втіленням, віросомоподібна везикула згідно винаходу може містити моноламеллярний ліпідний біслой. Згідно з ще одним втіленням віросомоподібна везикула згідно винаходу може бути бі- або мультиламеллярною везикулою. Згідно з ще одним втіленням віросомоподібна везикула може мати діаметр, як правило, в межах від 50 до 600 нм, і зокрема, діаметр від 100 до 300 нм, і зокрема від 300 до 400 нм. Віросомоподібні везикули згідно винаходу можуть бути сферичними одношаровими везикулами з середнім діаметром приблизно 150 нм. Віросомоподібніе везикули містять інкорпоровані в ліпідний бішар білки вірусної мембрани, злиття, що мають або не мають властивості, або їх фрагменти. Вираження "білки злиття або їх фрагменти" відноситься до білок або їх фрагментів, здатних індукувати і забезпечувати реакцію злиття між мембраною віросомоподібної везикули і біологічною мембраною клітини-мішені. 6 UA 108469 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Наприклад, білки злиття можуть бути мембранними глікопротеїнами вірусу грипу, такі як гемаглютинін (ГА). Згідно з одним втіленням, можуть використовувати щонайменше два різні білки злиття або їх фрагменти, які можуть проявляти різні характеристики злиття. Згідно з іншим втіленням різні характеристики злиття можуть бути, наприклад, різною чутливістю до температури, до концентрації іонів, до кислотності, до типу клітинної або тканинної специфічності. Згідно з одним втіленням віросомоподібна везикула може містити білки злиття, опосредковане злиття при двох різних температурах. Згідно з іншим втіленням, для побудови віросомоподібної везикули з різних штамів вірусів може бути використаний гемаглютинін (ГА). Наприклад, молекули ГА з віріонів Х-31 і PR8/34 можуть бути здатними каталізувати дві різні реакції злиття при різних температурах. Білки злиття з різними характеристиками злиття можуть бути одержані з різних штамів вірусу грипу, або білки злиття можуть бути одержані з різних вірусів, таких як білок EI вірусу стоматиту (ВПС) везикули, поверхневий білковий комплекс вірусу лісу Семліки (ВЛС) або білок F вірусу Сендай. Антиген, сполучений з мембраною віросомоподібної везикули, може бути деградований за допомогою ендосоми і може бути презентованим імунній системі за допомогою рецепторів МНС класу II. Антиген, що міститься усередині порожнини віросоми, може бути доставлений в цитозоль антиген-презентуючої клітини за допомогою злиття мембран і деградований в цитозолі, після чого він може бути презентований як антиген молекулами МНС класу I. Також може відбуватися перехресна презентація антигенів, що доставляються віросомами. Таким чином, віросомоподібна везикула може індукувати гуморальну і клітинну імунну відповідь. Зокрема, віросомоподібна везикула може індукувати продукцію IgA-антител, таких як секреторний IgA, а також IgG або IgM. Протоколи приготування добре відомі фахівцям в області техніки. Прийнятні протоколи приготування віросом описані, наприклад, в WO 2004/045582 або ЕР 0 538 437, ЕР 1 633 395, ЕР 1594466, включених в цей документ за допомогою посилання. Згідно з одним втіленням, віросомоподібні везикули згідно винаходу можуть бути одержані або з віросомних везикул як таких, або з везикул, що утворюються в результаті злиття віросомной везикули з ліпосомною везикулою. Приготування віросомних везикул здійснюють за допомогою будь-якого способу, відомого фахівцям в області техніки, такого, як описаний в Stegmann et.al., EMBO J. 6, 1987, no. 9, 2651-9, або de Jonge et.al., Biochim. Biophys. Acta, 1758, 2006, 527-539, включених в цей документ за допомогою посилання. Віросомні везикули можуть бути відновлені, наприклад, з ліпідів оригінальної вірусної мембрани або глікопротеїнів вірусної мембрани після розчинення, наприклад, інтактного вірусу грипу, при допомозі моно- N-додецилового ефіру октаетиленгліколя (OEG), осадження нуклеокапсиду (вірусні глікопротеїни і ліпіди залишаються в супернтатнте) і видалення детергента з супернатанту за допомогою гідрофобної смоли(Stegmann T., et.al., EMBO J. 6, 1987, 2651-9). Віросоми також можуть бути відновлені з оригінальних вірусних мембран за допомогою розчинення вірусних мембран за допомогою коротколанцюгового фосфоліпіду, осадження нуклеокапсиду (тільки глікопротеїни вірусних мембран і ліпіди залишаються в супернатанті) і видалення коротколанцюгового ліпіду з супернатанту за допомогою діалізу. Після розчинення вірусу за допомогою детергенту або коротколанцюгового фосфоліпіду і видалення нуклеокапсиду, як описано раніше, в супернатант перед видаленням детергенту або короткоцепочного ліпіду додають антигени або ад'юванти, розчинні в детергенті або коротколанцюговому фосфоліпіді, що призводить до інкорпорації антигену або ад'юванту у формовану таким чином віросому. Аналогічно, в супернатант можуть бути додані ліпіди, розчинні в детергенті або коротколанцюговому фосфоліпіді, для включення у вірусну мембрану. Приготування віросомних везикул, що містять білки злиття з різних вірусів здійснюють за допомогою змішування супернатантів, що містять розчинені вірусні мембрани, як описано раніше, або за допомогою додавання очищених білків злиття в такий супернатант, до вказаного видалення детергенту або коротколанцюгового ліпіду. Згідно з одним втіленням, віросомоподібна везикула згідно винаходу одержується в результаті злиття віросомної везикули з ліпосомною везикулою. Таким чином, згідно з одним втіленням віросомоподібна везикула згідно винаходу може містити віросомальні і ліпосомальні ліпіди. Згідно з одним втіленням віросомоподібна везикула згідно винаходу може містити ліпідний бішар, що включає ліпіди, вибрані з катіонних ліпідів, синтетичних ліпідів, гліколіпідів, фосфоліпідів, гліцерофосфоліпідів, глікосфінголіпідів, подібних галактозілцераміду, сфінголіпиди, холестерол і похідні. 7 UA 108469 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фосфоліпіди можуть містити, зокрема, фосфатиділхолін, сфінгоміелин, фосфатидилетаноламін, фосфатидилсерін, фосфатидилгліцерол, фосфатидну кислоту, кардіоліпін і фосфатидилінозитол з різним жирнокислотним складом. Катіонні ліпіди можуть бути вибрані з DOTMA (N-(I-(2,3-діолеілакси) пропіл)-N, N, N-триметил амоній хлорид), DOTAP (N-(I-(2,3-діолеоілокси) пропіл)-N, N, N-триметиламмоний хлорид, DODAC (N, N-діолеіл-N, N-диметиламмоний хлорид), DDAB (дідодецилдіметиламмоний бромід) і стеариламіну або інших аліфатичних амінів та ін. Ліпіди, що застосовуються у винаході представляються у вигляді невеликих одношарових ліпосом в суміші з DOPE (діолеоілфосфатиділ-етаноламін), який широко застосовують в якості допоміжного ліпіду, що сприяє руйнуванню ендосомальної мембрани. Згідно з іншим втіленням, для поліпшення стійкості і ізоляції везикул також застосовують коемульгуючий агент. Наприклад, вказаний коемульгируючий агент готують з холестеролу і похідних, таких як, наприклад, заряджений холестероловий ефір або нейтральний холестеринсульфат; похідних із стероловою основою, наприклад, похідні з рослин, такі як фітостероли (ситостерол, сигмастерол), цераміди і їх суміші. Віросоми або їх вміст можуть піддавати гідролізу і фізичній деградації при зберіганні. Згідно з одним втіленням, віросоми зберігають для тривалого зберігання за допомогою ліофілізації і відновлені перед застосуванням за допомогою водного розчину. Ліопротектанти, такі як інулін, додають безпосередньо перед ліофілізацією, щоб забезпечити збереження цілісності віросоми впродовж ліофілізації і при відновленні (Wilschut J. et.al., J. Liposome Res. 17, 2007, 173-182). Переважно застосовують ліофільну сушку (Amorij J.P. et.al., Vaccine 17, 2007, 8707-17). Віросомоподібна везикула згідно винаходу може додатково містити угрупування таргетингу, що націлює вказану везикулу на специфічну клітину або тканину. Згідно з одним втіленням, віросомоподібна везикула згідно винаходу додатково може містити угрупування таргетингу, що націлює вказану везикулу на специфічну клітину або тканину. Прийнятне угрупування таргетингу може бути вибране з рецептора клітинної поверхні, хемокіну, цитокіну, чинника росту, антитіла або фрагмента антитіла, пептидній послідовності із специфічністю або питомим зарядом, комплементарною молекулятрою адгезією такою як інтегрин. Угрупування таргетингу інкорпорують в або прикріплена до ліпідного бішару вказаної везикули за допомогою будь-яких способів, відомих фахівцям в області техніки. Згідно з одним втіленням, антиген, локалізований на зовнішній поверхні віросомоподібної везикули згідно винаходу, можливо: - ковалентний пов'язаний з ліпідом вказаної вірсомоподібної везикули, або - включений в ліпідний бішар вказаної віросомоподібної везикули за допомогою трансмембранного пептидного домена. Згідно з одним втіленням антиген міститься усередині віросоми. Модифікації антигена згідно винаходу і способи перехресного зв'язування вказаного модифікованого антигена із зовнішньою поверхнею віросомоподібної везикули можуть бути такими, як описані в WO 2004/078099. Згідно з одним втіленням, антиген може бути ковалентний приєднаний до зовнішньої поверхні віросомоподібної везикули за допомогою перехресного зв'язування з ліпідом або фосфоліпідом. Згідно з іншим втіленням, антиген може бути приєднаний до зовнішньої поверхні віросомоподібної везикули за допомогою перехресного зв'язування з карбогідратом. Згідно з одним втіленням, ковалентнозв'язаний антиген може містити щонайменше один С-термінально розташований перехресно-зв'язуючий залишок. Наприклад, перехресно-зв'язуючий залишок може бути вибраний з цистеїну (Cys) або лізину (Lys). Згідно з іншим втіленням ковалентнозв'язаний антиген може додатково містити щонайменше один спейсерний залишок між вказаними С-термінально розташованими перехресно-зв'язуючими залишками і що відповідає З-кінцем антигену. Прийнятний спейсерний залишок може бути вибраний, наприклад, із залишків Gly (гліцину), Ala (аланина), Ser (серину), Asp (аспартату), Lys (лізину), Gln (глутаміну), His (гістидину), Ile (ізолейцину) і Leu (лейцину). Спейсерні залишки з 2 по 12, зокрема з 3 по 10 і особливо з 4 по 8, пов'язують для утворення спейсерних послідовностей. Прийнятні спейсерні послідовності можуть бути вибрані, наприклад, з Gly-Gly або Lys-Gly. Поперечне зв'язування антигену з поверхнею віросомоподібної везикули здійснюють за допомогою амфіфільних похідних ПЕГ, фосфатиділетаноламіну (ФЕ), фосфатиділхоліну (ФХ), фосфатиділсерину, холестеролу або їх суміші, що легко включаються в ліпідний бішар. Поперечне зв'язування антигена з ліпідом віросомоподібної везикули згідно винаходу може бути здійснене за допомогою будь-якого способу, відомого фахівцям в області техніки. 8 UA 108469 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Поперечне зв'язування може бути проведене в ліпідному розчині і ліпід-пептидному коньюгаті, який може бути згодом включений у віросомоподібну везикулу. Згідно з втіленням винаходу, антиген пов'язують з ліпідом везикули згідно винаходу, наприклад, за допомогою біфункціонального сукцинатного лінкера, зокрема, Nгідроксисукцинімідного ефіру (гама)-малеінидобутанової кислоти або-(гама)малеімідобутирилокси-сукцинімід-ефіра. Антигени, ліпідзвязані антигени, фосфоліпіди і ад'юванти можуть бути додані до супернатанту, що утворюється після розчинення вірусу за допомогою детергента або коротколанцюгового фосфоліпіду і видалення нуклеокапсиду, як описано вище. Потім можуть бути сформовані віросоми, як описано раніше, за допомогою видалення детергенту, наприклад за допомогою Bio-Beads SM-2 (Biorad), Amberlyte XM, або коротколанцюговий фосфоліпід видаляють за допомогою діалізу. Несподівано виявилось, що жоден коньюгат, одержаний, як описано вище, не робить істотного влияения ні на структуру/конформацію, ні на властивості, ні на функцію(ї) поліпептиду згідно винаходу, зокрема на його здатність до тримеризації. Несподівано виявилось, при розчиненні у водному середовищі вказані коньюгати і, отже, вказані поліпептиди залишаються в розчиненому стані і є стабільними. Таким чином, водні композиції, що містять вказані коньюгати, що підлягають розчиненню у водному середовищі, безпосередньо включені в Даний винахід. Згідно з іншими його аспектами, Даний винахід відноситься до фармацевтичного препарату, що зазвичай містить будь-який поліпептид gp41 згыдно винаходу, яку-небудь його хімічну/фізичну форму, і які-небудь фармацевтичні ад'юванти або ексципієнти. У ще одному втіленні фармацевтичний препарат в якості активної речовини містить щонайменше поліпептид згідно винаходу, або коньюгат, як описано вище, або експрессійний вектор, що дозволяє здійснювати експресію поліпептиду згідно винаходу. Такі фармацевтичні препарати по можливості містять водну композицію згідно винаходу. Для фармацевтичних цілей згідно винаходу може бути застосований ряд водних середовищ, наприклад, вода, буферна вода, 0,4 % сольовий розчин, 0,3 % гліцин, гіалуронова кислота та ін. Фармацевтичний препарат стерилізують за допомогою зВІЛайних добре відомих способів стерилізації або за допомогою стерильного фільтрування. Фармацевтичні препарати згідно винаходу можуть бути упаковані для застосування як є, або в ліофілізованій формі, при цьому ліофілізований препарат перед введенням комбінують із стерильним розчином. Фармацевтичний препарат згідно винаходу, при необхідності, може містити фармацевтично прийнятні допоміжні речовини для забезпечення фізіологічних умов, такі як агенти для підведення рН і буферні агенти, агенти, регулюючі тонічність, зволожуючі агенти та ін., наприклад, ацетат натрію, лактат натрію, хлорид натрію, хлорид калію, хлорид кальцію, сорбітанмонолаурат, триетаноламінолеат, та ін. Фармацевтичний препарат згідно винаходу може містити поліпептид або його тример або його коньюгат або додатковий антиген, що являється похідною gp41, в кількості, ефективній для лікування пацієнта, що потребує цього. Вказаний додатковий антиген gp41 відмінний від поліпептиду згідно винаходу. У конкретнішому втіленні вказаний додатковий антиген існує у вигляді коньюгату, і конкретніше пов'язаний з віросомою. Ефективна кількість є такою кількістю поліпептиду або коньюгату згідно винаходу, який окремо, або разом з додатковими дозами, може стимулювати бажану відповідь. Ефективна кількість залежить від різних чинників, таких як шлях введення, одноразове або багатократне введення, і індивідуальних параметрів пацієнта, таких як вік, фізичний стан, розмір, маса, і стадія захворювання. Ці чинники добре відомі фахівцям в області техніки і можуть бути розглянуті в ході стандартного дослідження. Таким чином, згідно з одним втіленням препарат може містити поліпептиди або їх тримери або їх коньюгати згідно винаходу самі по собі або у поєднанні з щонайменше одним ад'ювантом, як описано раніше. Вказаний антиген є відмінним від такого або таких rgp41 згідно винаходу. Вказаний антиген також відмінний від такого або таких, зокрема ГА, що міститься у вказаних віросомах. Додатковий антиген є, наприклад, будь-якою частиною білка gp41, а також білками gp41, відмінний від ділянок 540-592 і 618-664, де порядок нумерації заснований на прототипі - ізоляті кладу У ВІЛ-1 НхВ2 в його цілісності, і їх аналоги. Вказаний додатковий антиген може походити з ВІЛ-1 будь-якого кладу, в переважному втіленні вказаний додатковий антиген походить з gp41 кладу В або кладу С. Згідно з одним втіленням антиген, похідний від gp41, прийнятний в якості додаткового антигену для винаходу, позбавлений властивості злиття згідно відношення до клітинної мембрани клітини-мішені. 9 UA 108469 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Згідно з одним втіленням, вказаний антиген, похідна від gp41, ковалентна пов'язана із зовнішньою поверхнею віросомоподібної везикули, як описано раніше для коньюгатів згідно даного винаходу, що містять віросоми і віросомоподібні частки. Згідно з одним втіленням, вказаний антиген, похідна від gp41, є пептидом, званий Р1. Пептид Р1 відповідає амінокислотній послідовності, присутній в ектодомені поверхневого білку gp41 ВІЛ, локалізованого на поверхні вірусних часток до взаємодії вірусу з клітинами-мішенями. Наприклад, в штамі НхВ2 ВІЛ-1 ця послідовність складається з амінокислот з 649 по 683, де порядок нумерації заснований на прототипі - ізоляті штаму з кладу В НхВ2 ВІЛ-1. У переважному втіленні вказаний пептид Р1 описаний повністю або частково за допомогою послідовності, вибраної з SEQ ID NO 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 6 або їх аналога, як описано в WO 2007/099446, зміст якого включений в цей документ за допомогою посилання. В якості прикладу антигена Р1, прийнятного для винаходу, може бути приведена пептидна послідовність Р1, що додатково містить трьохамінокислотний спейсер L-G-C або L-S-C в Стермінальному положенні, як, наприклад, описана на SEQ ID NO 4 або SEQ ID No. 5. У конкретному втіленні фармацевтичний препарат згідно даного винаходу застосовують при імунотерапії, зокрема профілактичній імунотерапії. Фармацевтичний препарат згідно винаходу містить поліпептид або коньюгат згідно винаходу в кількості, ефективній для лікування пацієнта, що потребує цього. У подальшому втіленні фармацевтичний препарат, як визначено раніше, може застосовуватися при імунотерапії, зокрема профілактичній імунотерапії. Згідно з іншим втіленням фармацевтичний препарат згідно винаходу може містити додатковий антиген, відмінний від вказаного поліпептиду або вказаного коньюгату згідно винаходу, в якості комбінованого препарату для одноразового, окремого або послідовного застосування при імунотерапії. Згідно з іншими його аспектами, Даний винахід також відноситься до застосування щонайменше одного поліпептиду gp41, коньюгату або експрессійного вектору відповідно до даного винаходу, для виробництва лікарського засобу, призначеного для індукції адаптивної імунної відповіді і природженої імунної відповіді, спрямованої проти білка gp41 вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ). У переважному втіленні поліпептид gp41, що застосовується представлений на SEQ ID No.19 або SEQ ID No. 20 в пов'язаній з віросомою формі. У ще одному втіленні винаходу описано застосування одного поліпептиду, тримеру, експрессійного вектору або коньюгату згідно винаходу і додаткового антигену у вигляді коньюгату, де вказаний коньюгат найприйнятніше є віросомою, для виготовлення лікарського засобу, призначеного для індукції адаптивної імунної відповіді і природженої імунної відповіді, спрямованої проти білка gp41 вірусу імунодефіциту людини, де вказаний додатковий антиген найприйнятніше представлений на SEQ ID No. 2, SEQ ID No.3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 або SEQ ID No. 6. Такі фармацевтичні препарати зазвичай можуть містити фармацевтично прийнятні концентрації солей, буферних агентів, антиоксидантів, консервантів, сумісних носіїв, ад'ювантів, як описано нижче, і додатково інші терапевтичні агенти. Ад'юванти Згідно з одним втіленням, імуностимулюючий ефект поліпептиду або коньюгату згідно винаходу по можливості підвищують за допомогою асоціації цих поліпептиду і коньюгату щонайменше з одним ад'ювантом. Згідно з одним втіленням, імуностимулюючий ефект віросомоподібніх везикул згідно винаходу може бути додатково підвищений за рахунок асоціації цих віросомоподібніх везикул щонайменше з одним ад'ювантом. Вказаний ад'ювант може бути інкапсульований усередині і інкорпорований в ліпідний бішар і вільно комбінований з вказаною везикулою. Згідно з одним втіленням, віросомоподібна везикула може додатково містити щонайменше один ад'ювант, що посилює і опосредуюча імунна відповідь, вибрана з природженої імунної відповіді і адаптивної імунної відповіді. Вживані ад'юванти можуть посилювати імунну відповідь за допомогою активування антиген-презентуючих клітин (АПК), макрофагів і стимуляції специфічних типів лімфоцитів. Ад'ювант, який може використовуватися в даному винаході, може бути будь-який лігнад, прийнятний для активації рецептора, що розпізнає патоген (PRR), експрессуючого в або на дендритних клітинах (ДК), Т-клітинах, В-клітинах або інших антигенпрезентуючих клітинах. Для досягненя мети винаходу можуть бути придатні ліганди, що активують шлях рецептора нуклеотидхв'язуючого Олігомеризаційного домена (NOD). Ад'юванти, прийнятні для цих 10 UA 108469 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лігандів, можуть бути мураміл-дипептидні похідні. Ліганди, активуючі Toll-подібніе рецептори (TLR) також можуть використовуватися для досягнення мети винаходу. Ці рецептори є членами сімейства PRR і широко експрессуються на різних природжених імунних клітинах, включаючи ДК, макрофаги, огрядні клітини і нейтрофіли. В якості прикладу лігандів, активуючих TLR, можуть бути вказані: для TLR4-монофосфорил ліпід А, 3-О-деацитильований монофосфорил ліпід А, ЛПС з E.coli, таксол, RSV білок злиття, і господарські білки теплового шоку 60 і 70, для TLR2-ліпопептиди, такі як N-пальметоил-S2,3(біспальметоилокси)-пропіл-цистеінил-серил-№013-лізин, пептидоглікан Staphylococcus aureus, ліпопротеини M. tuberculosis, зимозан Sacharomyces cerevisiae і високоочищений ЛПС P. gingivalis, для TLR3-дцРНК, для TLR5-флагеллин, для TLR7-синтетичні сполуки, такі як імідазохіноліни і для TLR9 - певні типи СрG-багатої ДНК. Інші корисні для винаходу ад'юванти можуть бути епітопами Т-хелперів. Т-хелперний епітоп є пептидом, що зазвичай одержується з екзогенних білків, які пройшли протеолітичну деградацію і процесінг по ендоцитарному шляху антигенпрезентирующих клітин (АПК). У таких клітинах головний комплекс гістосумісності класу II (МНС II) асоційований з цими пептидами в ендосомах. Цей комплекс, що транспортується до поверхні АПК, може взаємодіяти із специфічним Т-клітинним рецептором Т-лімфоцитів CD4, що призводить до їх активації. Відповідно до типу хелперного епітопа, Т-клітинна відповідь може бути типу Тх1 і Тх2, як відомо в області техніки. В якості прикладу епітопа орієнтованої для Т-хелперу відповіді можна згадати один пан-DRхелперний Т-клітинний епітоп (PADRE). Цей епітоп сконструйований так, що він зв'язує найбільш поширені молекули HLA-DR з високою аффінністью і діє як сильний імуноген. Показано, що епітоп PADRE HTL збільшує ефективність вакцин, розроблених для стимуляції клітинної імунної відповіді (Alexander J. et.al., Immunol. Res. 18, 1998, 79-92). Згідно з одним втіленням, ад'ювант, який може бути використаний з віросомоподібніми везикулами згідно даного винаходу, може бути вибраний з солей алюмінію, фосфатних гелів алюмінію, мікобактерій, таких як BCG, M. vaccae або Corynebacterium parvum, пептидів, гемоціаніну лімфи равлика, інтерлейкіну-2 (ІЛ-2), ІЛ-12, GM-CSF (колоностимулюючого чинника гранулоцитів-макрофагів), лігандів хемокинового сімейства, таких як RANTES (хемокин, експрессуючий і що секретується нормальними T-клітинами при активації), ліпопротеїну грамбактерій, компоненту клітинної стінки дріжджів, дволанцюгової РНК, ліпополісахариду грам