Мікроорганізм, який експресує ксилозоізомеразу

Реферат: Винахід належить до трансформованих Saccharomyces, що містять екзогенну ксилозоізомеразу, виділену від Lactococcus, які здатні до (а) більш високої активності ксилозоізомерази, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією; і/або (b) більш високої швидкості зростання в середовищі для зростання або на середовищі для зростання, яке містить ксилозу, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією; і/або (с) більш швидкого метаболізму ксилози, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією; і/або (d) більш швидкої продукції етанолу при вирощуванні в анаеробних умовах на ксилозі як джерелі вуглецю, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією. UA 108468 C2 (12) UA 108468 C2 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Даний винахід належить до мікроорганізму. Зокрема, даний винахід належить до трансформованого мікроорганізму, здатного до: більш високої активності ксилозоізомерази, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією, і/або до більш високої швидкості зростання в середовищі для зростання або на середовищі для зростання, яке містить ксилозу, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією; і/або більш швидкого метаболізму ксилози, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією; і/або до більш високої продукції етанолу при вирощуванні в анаеробних умовах на ксилозі як джерелі вуглецю, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією. Крім того, даний винахід належить до способу отримання трансформованих мікроорганізмів, здатних до: більш високої активності ксилозоізомерази, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією, і/або до більш високої швидкості зростання в середовищі для зростання або на середовищі для зростання, яке містить ксилозу, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією; і/або більш швидкого метаболізму ксилози, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією; і/або до більш високої продукції етанолу при вирощуванні в анаеробних умовах на ксилозі як джерелі вуглецю, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією. Крім того, даний винахід належить до інокулята і культурального середовища, що містить мікроорганізм відповідно до даного винаходу або мікроорганізм, отриманий способом відповідно до даного винаходу. У іншому аспекті даний винахід належить до способу ферментації, що включає культивування в культуральному середовищі мікроорганізму відповідно до даного винаходу або мікроорганізму, отриманого способом за даним винаходом. Крім того, даний винахід належить до способів отримання біопалива і/або продукту, який походить з ксилози, що включає культивування в культуральному середовищі мікроорганізму за даним винаходом або мікроорганізму, отриманого способом за даним винаходом. Крім того, даний винахід належить до біопалива і/або продукту, який походить з ксилози, отриманому способом за даним винаходом. Крім того, даний винахід належить до застосування мікроорганізму відповідно до даного винаходу або мікроорганізму, отриманого способом за даним винаходом, для отримання продукту, який походить з ксилози, і/або біопалива. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Етанол вважається привабливою альтернативою транспортному паливу, який можна використовувати як домішку, доповнення або часткову заміну бензину з викопного палива, яке є обмеженим в кінцевому результаті джерелом. Етанол можна використовувати в менших концентраціях замість метил-трет-бутилового ефіру (MTBE) як більш чисту домішку, що підвищує октанове число, або оксигенуючу домішку в бензин, або його можна використовувати для домішування в бензин в більш високих кількостях, що складають від 10 до 85 %, причому ці суміші можна використовувати в тільки дещо модифікованих автомобільних двигунах в порівнянні з відомими в цей час двигунами. Таким чином, він має величезну перевагу відносно інших альтернативних транспортних палив. Можна проводити будь-яку часткову заміну з максимальною гнучкістю, і без значних змін технології транспортних двигунів, відомої на сьогоднішній день. Етанол має перевагу, яка полягає в тому, що він є відновлюваним джерелом, оскільки його можна отримувати в дуже великих кількостях з рослинного матеріалу. З цього також виходить перевага наявності низького сумарного внеску у викид діоксиду вуглецю в атмосферу, оскільки діоксид вуглецю, який вивільняється при використанні етанолу, повторно абсорбується внаслідок необхідності продукції рослинного матеріалу для регенерації використаного етанолу. При традиційній продукції етанолу за допомогою ферментації використовуваним рослинним матеріалом є цукор з 6 атомами вуглецю, або прямо екстрагований з рослин, що містять вільні моносахариди або дисахариди, або утворений шляхом гідролізу крохмалю з крохмалевмісних частин рослин. Ці цукри отримують з частин рослин, які також використовуються для вживання людиною або тваринами. Таким чином, традиційна продукція етанолу прямо конкурує за рослинний матеріал, який в іншому випадку використовувався б для продуктів харчування або кормів. Конверсія їжі в паливо приводить до етичних проблем в світі, де мільйони людей голодують; обчислення показують, що кількість кукурудзи, необхідна для продукції бака палива для одного звичайного всюдихідного автомобіля в США, приблизно дорівнює кількості, необхідній для того, щоб годувати одну голодуючу людину протягом одного повного року. 1 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Альтернативним рішенням є застосування для отримання енергії і палива лігноцелюлозного рослинного матеріалу, який в іншому випадку вважається відходами. Це, загалом, сприймається високо позитивно, і, таким чином, розробка шляхів застосування лігноцелюлозного рослинного матеріалу для продукції етанолу отримала в багатьох країнах рішучу підтримку, як політично, так і в суспільстві. Іншою перевагою є велика кількість лігноцелюлозного матеріалу, що насправді робить теоретично можливою заміну 50 % або більш сучасного використовуваного бензину етанолом. Існують численні джерела лігноцелюлозного матеріалу, який можна використовувати для продукції етанолу, при умові що може бути досягнутий ефективний і економічний процес збору і конверсії. Декілька прикладів, де збір вже проводиться в цей час, включає макуху цукрової тростини, деревну стружку, кукурудзяну солому і пшеничну солому. Двома головними технічними проблемами, з якими стикаються при застосуванні лігноцелюлозного матеріалу для продукції етанолу за допомогою ферментації, є: 1. трудність гідролізу целюлози, що містить цукор з 6 атомами вуглецю, до глюкози без утворення побічних продуктів, які заважають або перешкоджають подальшій мікробній конверсії глюкози в етанол; і 2. відсутність організму, який здатний ефективно здійснювати конверсію цукрів з 5 атомами вуглецю (наприклад, ксилози і арабінози), присутніх в геміцелюлозній частині лігноцелюлозного матеріалу, в етанол. Saccharomyces cerevisiae протягом більше ніж 6000 років є переважним мікроорганізмом для конверсії цукрів з 6 атомами вуглецю, які походять з рослинного матеріалу, в етанол. Це є наслідком сприятливої комбінації високого виходу етанолу, високої питомої продуктивності і високої толерантності до етанолу разом зі здатністю рости і здійснювати ферментацію при низьких pH, де іншим конкуруючим мікроорганізмам важко просто вижити. Коли труднощі в гідролізі целюлозу будуть подолані, S. cerevisiae, найбільш ймовірно, продовжать бути переважним організмом для отримання етанолу ферментацією вивільненого мономерів цукрів з 6 атомами вуглецю. Однак, на жаль, S. cerevisiae не здатні метаболізувати цукри з 5 атомами вуглецю, які складають аж до однієї третини лігноцелюлозного цукрового матеріалу. Отже, в останні два десятиріччя проводиться робота по пошуку шляхів для модифікації способами генетичної інженерії S. cerevisiae для внесення в них здатності ферментувати цукор з 5 атомів вуглецю. Ця робота, головним чином, сфокусована на ферментації ксилози, оскільки ксилоза становить переважаючу частину цукрів з 5 атомами вуглецю в лігноцелюлозі. Хоча S. cerevisiae не можуть метаболізувати ксилозу, вони здатні метаболізувати її ізомер ксилулозу (Wang and Schneider, 1980), яка являє собою метаболіт, що є точкою входження в пентозофосфатний шлях. Таким чином, в принципі, проблема може бути вирішена наданням S. cerevisiae, здатних конвертувати ксилозу в ксилулозу. Для спрямування ксилози на пентозофосфатний шлях через ксилулозу в S. cerevisiae були внесені два різних існуючих біохімічних каскади. У природних метаболізуючих ксилозу грибах ксилоза конвертується в ксилулозу в двостадійному процесі (див. фігуру 1). Спочатку ксилоза відновлюється до ксиліту ксилозоредуктазою (XR-EC 1.1.1.21). Потім ксиліт дегідрогенізується до ксилулози ксилітдегідрогеназою (XDH-EC 1.1.1.9). Редуктаза і дегідрогеназа не присутні в S. cerevisiae, однак можливо перенести і експресувати гени, що кодують ці два ферменти, з Pichia stipitis в S. cerevisiae, і отриманий модифікований штам S. cerevisiae буде здатний метаболізувати ксилозу. Активність цих двох ферментів вимагає NADPH і NAD+,і в результаті неї утворюються NADP+ і NADH, так що необхідно, щоб організм регенерував баланс NAD+ - NADH і NADP+ NADPH за допомогою окисно-відновних процесів де-небудь в іншій частині метаболізму, інакше метаболізм ксилози буде припиняти функціонувати при виснаженні NADPH і NAD+. Досить низьку швидкість метаболізму ксилози і утворення значних кількостей ксиліту в штамах S. cerevisiae, модифікованих подібним чином, зв'язують з цією властивою їм проблемою каскаду ксилозоредуктази-ксилітдегідрогенази. У метаболізуючих ксилозу бактеріях конверсія ксилози в ксилулозу відрізняється тим, що один фермент, ксилозоізомераза (EC 5.3.1.5), конвертує ксилозу безпосередньо в ксилулозу (див. фігуру 1). Цей шлях очевидно є більш простим і не створює дисбалансу NAD+ - NADPH, згаданого вище. Таким чином, це також було первинною стратегією, запропонованою для забезпечення здатності S. cerevisiae метаболізувати ксилозу. Однак було показано, що здійснення цієї стратегії є важким. Експресія більшості генів ксилозоізомерази з бактерій не приводить до присутності активної ксилозоізомерази в S. cerevisiae, і точна причина цього досі невідома. У різних дослідженнях було виявлено, що часто білок, який продукується при 2 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 експресії бактерійного гена, може бути виявлений, однак експресований білок, мабуть, не зсідається в S. cerevisiae в активний фермент. Термостабільні ферменти часто є більш стабільними в інших типах екстремальних умов, таких як високий вміст солі і граничні значення pH. Це може вказувати на те, що термостабільні ферменти з більшою імовірністю зберігають (і, можливо, також піддаються) правильне зсідання. Крім того, дійсно можна знайти приклади бактерійних генів ксилозоізомерази, виділених з термофільних організмів, які експресують активні ксилозоізомерази в S. cerevisiae (див.: Walfridsson et al., 1996; і Bao et al., 1999). Було показано, що ці гени забезпечує метаболізм ксилози в S. cerevisiae, але з дуже низькою швидкістю. Низьку швидкість приписують тому факту, що термостабільні ксилозоізомерази мають оптимальну активність при 80-90 °C, але температури, які підтримують виживання більшості штамів S. cerevisiae, становлять 30-35 °C. СУТЬ ВИНАХОДУ Даний винахід належить до трансформованого мікроорганізму, здатного до: (a) більш високої активності ксилозоізомерази, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією; і/або (b) більш високої швидкості зростання в середовищі для зростання або на середовищі для зростання, яке містить ксилозу, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією; і/або (с) більш швидкого метаболізму ксилози, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією; і/або (d) більш швидкої продукції етанолу при вирощуванні в анаеробних умовах на ксилозі як джерелі вуглецю, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією. У іншому аспекті даний винахід належить до інокуляту, що містить мікроорганізм відповідно до даного винаходу. У іншому аспекті даний винахід належить до культурального середовища, що містить мікроорганізм відповідно до даного винаходу. У наступному аспекті даний винахід належить до способу отримання трансформованого мікроорганізму, причому вказаний спосіб включає стадію трансформації мікроорганізму, так щоб вказаний трансформований мікроорганізм був здатний до: (a) більш високої активності ксилозоізомерази, ніж у мікроорганізму перед трансформацією; і/або (b) більш високої швидкості зростання в середовищі для зростання або на середовищі для зростання, ніж у мікроорганізму перед трансформацією; і/або (с) більш швидкого метаболізму ксилози, ніж у мікроорганізму перед трансформацією; і/або (d) більш швидкої продукції етанолу при вирощуванні в анаеробних умовах на ксилозі як джерелі вуглецю, ніж у мікроорганізму перед трансформацією. У іншому аспекті даний винахід належить до способу ферментації, що включає культивування в культуральному середовищі мікроорганізму відповідно до даного винаходу або мікроорганізму, отриманого способом за даним винаходом. У наступному аспекті даний винахід належить до способу отримання продукту, який походить з ксилози, що включає культивування в культуральному середовищі мікроорганізму відповідно до даного винаходу або мікроорганізму, отриманого способом за даним винаходом. У іншому аспекті даний винахід належить до способу отримання біопалива, де вказаний спосіб включає стадію культивування в культуральному середовищі мікроорганізму за даним винаходом або мікроорганізму, отриманого способом за даним винаходом. У іншому аспекті даного винаходу передбачене біопаливо, отримане способом за даним винаходом. У наступному аспекті даного винаходу передбачений продукт, який походить з ксилози, отриманий способом за даним винаходом. У наступному аспекті даного винаходу передбачене застосування мікроорганізму відповідно до даного винаходу або мікроорганізму, отриманого способом за даним винаходом, для продукції продукту, який походить з ксилози. Крім того, даний винахід належить до застосування мікроорганізму відповідно до даного винаходу або мікроорганізму, отриманого способом за даним винаходом, для продукції біопалива. У іншому аспекті даний винахід належить до трансформованого мікроорганізму, де вказаний трансформований мікроорганізм містить екзогенну нуклеотидну послідовність, яка кодує ксилозоізомеразу. ОБГОВОРЕННЯ 3 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Попередні спроби знайти гени бактерійної ксилозоізомерази мезофільного походження з високою активністю при експресії, наприклад, в Saccharomyces cerevisiae, виявилися безуспішними. Несподівано, як описано в цьому документі, автори винаходу успішно ідентифікували бактерії, зокрема, мезофільні бактерії, які містять нуклеотидні послідовності, що кодують ксилозоізомеразу, яка при експресії, наприклад, в S. cerevisiae, приводить до високої внутрішньоклітинної активності ксилозоізомерази в організмі. Такі послідовності можна використовувати, наприклад, для конструювання штамів сімейства Saccharomyces, забезпечуючи конверсію дріжджами ксилози в ксилулозу і, тим самим сприяючи ефективній продукції і/або метаболізму ксилози в етанол. На фігурі 4 детально показаний метаболізм ксилози в етанол; ксилулоза-5-фосфат - проміжна сполука, яка може утворюватися з D-ксилози - входить в пентозофосфатний шлях і далі метаболізується в етанол в анаеробних умовах. Однак в доповнення до цього, такі послідовності також можна використовувати для конструювання штамів, наприклад, S. cerevisiae, які є ефективними продуцентами інших сполук, які походять з ксилози, через пенозофосфатний шлях. Приклади таких сполук включають, але не обмежуються ними, ароматичні амінокислоти, молочну кислоту, янтарну кислоту, оцтову кислоту, ацетальдегід, фурфураль, ітаконову кислоту, глутамінову кислоту, лимонну кислоту, крезол, лізин, 3-гідроксипропіонову кислоту, полі-3-гідроксіалканоати, протокатехову кислоту, пірокатехол, гваякол, вератрол, резвератрол, ванілін, ванілінову кислоту, ваніліновий спирт, муконову кислоту, адипінову кислоту, 4-гідроксибензойну кислоту, 4-гідроксибензальдегід, 4метоксибензойну кислоту, 4-амінобензоат, 4-гідроксіанілін, 4-метоксіанілін, хінол, анізол, фенол, антранілову кислоту, 3-гідроксіантранілат, 2,3-дигідроксибензойну кислоту, 2-амінофенол, 1,4циклогександіон, ізопрен і стирол. ДЕЯКІ ПЕРЕВАГИ Переважно, даний винахід належить до трансформації (інженерії) мікроорганізмів, таких як мікроорганізми сімейства Saccharomyces, для забезпечення метаболізму мікроорганізмами ксилози. Це, в свою чергу, переважно збільшує ефективність мікроорганізмів, зокрема, штамів Saccharomyces, відносно продукції етанолу з сировини, яка містить ксилозу (такої як лігноцелюлозний матеріал). Крім того, це переважно збільшує ефективність мікроорганізмів відносно продукції інших природних або отриманих способами інженерії метаболітів, які походять з проміжних сполук в пентозофосфатному шляху, таких як ароматичні амінокислоти, молочна кислота, янтарна кислота, оцтова кислота, ацетальдегід, фурфураль, ітаконова кислота, глутамінова кислота, лимонна кислота, крезол, лізин, 3-гідроксипропіонова кислота, полі-3-гідроксиалканоати, протокатехова кислота, пірокатехол, гваякол, вератрол, резвератрол, ванілін, ванілінова кислота, ваніліновий спирт, муконова кислота, адипінова кислота, 4гідроксибензойна кислота, 4-гідроксибензальдегід, 4-метоксибензойна кислота, 4-амінобензоат, 4-гідроксіанілін, 4-метоксіанілін, хінол, анізол, фенол, антранілова кислота, 3-гідроксіантранілат, 2,3-дигідроксибензойна кислота, 2-амінофенол, 1,4-циклогександіон, ізопрен і стирол. Крім того, це сприяє загальному застосуванню матеріалу, який містить ксилолу, як сировини для вирощування штамів сімейства Saccharomyces для промислових цілей. Наступна перевага полягає в тому, що нуклеотидна послідовність, яка кодує ксилозоізомеразу, походить з мезофільного організму і/або здатна до високої активності при мезофільних температурах. Інша перевага полягає в тому, що мікроорганізми відповідно до даного винаходу продукують активну ксилозоізомеразу. Переважно, з використанням мікроорганізмів відповідно до даного винаходу, можна отримувати біопалива (такі як етанол). Більш переважно, з використанням мікроорганізмів відповідно до даного винаходу, можна отримувати біопалива з відходів, таких як сільськогосподарські відходи (включаючи солому злакових, таких як пшенична солома; бурякову пульпу; макуху цукрової тростини; таку солому, як солома сорго, соєвих бобів маїсу або кукурудзи; і деревну стружку). За допомогою даного винаходу відсутня необхідність (або знижується необхідність) в застосуванні матеріалів (таких як екстракт цукрової тростини, екстракт цукрового буряка, крохмаль сорго, маїсовий крохмаль, пшеничний крохмаль або кукурудзяний крохмаль), які в іншому випадку можна використовувати як джерело їжі для людей і/або як корм для тварин. Переважно, мікроорганізми відповідно до даного винаходу забезпечують оптимальне використання цукрів, які вивільняються при гідролізі лігноцелюлозного матеріалу за допомогою ферментації пентозних цукрів, ксилози. Даний винахід забезпечує продукцію біопалива, яке є більш CO 2-нейтральним в порівнянні з транспортним паливом на основі нафти. За допомогою даного винаходу викид CO2 є низьким 4 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (ще більш низьким) при отриманні біопалива згідно з даним винаходом, в порівнянні з отриманням типового транспортного палива на основі нафти (викопні палива). ФІГУРИ Фігура 1. Схематичне представлення метаболічних каскадів, на якому детально показаний метаболізм двох альдопентоз, D-ксилози і L-арабінози. Обидві альдопентози конвертуються в кетопентозу, і далі в D-ксилулоза-5-фосфат. Без зв'язку з теорією, як показано на фігурі, один тип каскаду (альдозоредуктазний тип) зустрічається у грибів, в той час як інший тип каскаду (ізомеразний тип) зустрічається у бактерій. У каскаді грибного типу, перші ферменти можуть бути названі "D-ксилозоредуктаза" і "L-арабінозоредуктаза", однак часто один і той же фермент може відновлювати як D-ксилозу, так і L-арабінозу, а потім може брати участь в обох каскадах, і він може бути позначений менш специфічною назвою "альдозоредуктаза". Фігура 2. Без зв'язку з теорією, на фігурі 2 показане схематичне представлення грибного і бактерійного типів метаболічних каскадів для деяких менш поширених пентоз (D- і L-ліксоза, Dрибоза), що деталізує початковий метаболізм до входження в пентозофосфтний шлях. Фігура 3. Схематичне представлення неокислювальної частини пентозофосфатного шляху (PPP). Фігура 4. Схематичне представлення метаболічної конверсії ксилози в етанол. Тут, кетопентоза ксилулоза-5-фосфат, яка може походити з D-ксилози, далі метаболізується в етанол в анаеробних умовах. XI являє собою ксилозоізомеразу, і XK являє собою ксилулокіназу. Показане сумарне входження ксилози в процес і сумарний вихід етанолу з процесу (підсумок процесу). Фігура 5. Активність ксилозоізомерази (XI) в Saccharomyces cerevisiae, трансформованої нуклеотидною послідовністю, що кодує бактерійну ксилозоізомеразу. Бактерійна ксилозоізомераза походить з (i) Pseudomonas syringae, (ii) Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus, (iii) Thermoanaerobacter thermohydrosulfurigenes або (iv) Lactococcus lactis subsp. lactis (Lactobacillus xylosus). Фігура 6. Зростання на ксилозі Saccharomyces cerevisiae, трансформованих нуклеотидними послідовностями, які кодують і експресують бактерійну ксилозоізомеразу і нуклеотидну послідовність, яка кодує і експресує кілулозокіназу, клоновану з Pichia stipitis. Фігура 7. Питома активність ксилозоізомерази Saccharomyces cerevisiae, трансформованих нуклеотидною послідовністю, що кодує і експресує варіант ксилозоізомерази Lactococcus. Варіант ксилозоізомерази (XI) Lactococcus має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 або SEQ ID NO: 20. ОПИС ВИНАХОДУ Як використовують в цьому документі, вирази "більш висока активність ксилозоізомерази, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією" і "більш висока активність ксилозоізомерази, ніж у мікроорганізму перед трансформацією" належать до трансформованого мікроорганізму, який має активність ксилозоізомерази щонайменше 0,16, 0,2, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 або 1,0 одиниць ксилозоізомерази на мг білка мікроорганізму при культивуванні в придатних умовах культивування, що дозволяють щонайменше підтримку вказаного мікроорганізму; наприклад, вказане культуральне середовище може містити один або декілька субстратів (наприклад, ксилозу), здатних активувати експресію нуклеотидної послідовності, яка кодує ксилозоізомеразу, однак вказане культуральне середовище не містить якого-небудь субстрату, який здатний інгібувати експресію нуклеотидної послідовності, яка кодує ксилозоізомеразу. Один приклад придатних умов культивування описаний в прикладі 5. Вказану активність ксилозоізомерази вимірюють з використанням аналізу з цистеїн-карбазолом, описаного Dische and Borenfreund (1951). Активність ксилозоізомерази у трансформованого мікроорганізму перевищує активність ксилозоізомерази у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією, або мікроорганізму перед трансформацією, при культивуванні в тих же умови культивування, що і для трансформованого мікроорганізму. Як використовують в цьому документі, вирази "більш висока швидкість зростання в середовищі для зростання або на середовищі для зростання, яке містить ксилозу, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією" і "більш висока швидкість зростання в середовищі для зростання або на середовищі для зростання, ніж у мікроорганізму перед трансформацією" належать до трансформованого мікроорганізму, здатного до збільшення швидкості зростання, так щоб час, необхідний для подвоєння числа мікроорганізмів, був щонайменше на 10 %, 15 %, 20 % або 25 % нижчий, ніж час, необхідний для подвоєння числа еквівалентних мікроорганізмів перед трансформацією, або мікроорганізмів перед трансформацією, при культивуванні в однакових умовах. 5 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вирази "більш швидкий метаболізм ксилози, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією" і "більш швидкий метаболізм ксилози, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією", як використовують в цьому документі, належать до трансформованого мікроорганізму, який здатний метаболізувати ксилозу, так щоб використана кількість ксилози на клітину в культуральному середовищі була щонайменше на 10 %, 20 %, 25 %, 30 % або 35 % вища, ніж використана кількість ксилози для еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією, або мікроорганізму перед трансформацією, при культивуванні в однакових умовах протягом даного періоду часу в експонентній фазі зростання. Вказаний трансформований мікроорганізм культивують в придатних умовах культивування, що дозволяють щонайменше підтримку вказаного мікроорганізму; наприклад, вказане культуральне середовище може містити одну або декілька речовин (наприклад, ксилозу), здатних активувати експресію нуклеотидної послідовності, яка кодує ксилозоізомеразу, однак вказане культуральне середовище не містить який-небудь субстрат, який здатний інгібувати експресію нуклеотидної послідовності, яка кодує ксилозоізомеразу. Як використовують в цьому документі, вирази "більш швидка продукція етанолу при вирощуванні в анаеробних умовах на ксилозі як джерелі вуглецю, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією" і "більш швидка продукція етанолу при вирощуванні в анаеробних умовах на ксилозі як джерелі вуглецю, ніж у мікроорганізму перед трансформацією" належать до трансформованого мікроорганізму, який здатний продукувати щонайменше на 10 %, 20 % або 30 % більше етанолу на клітину, ніж еквівалентний мікроорганізм перед трансформацією при культивуванні в анаеробних умовах з ксилозою як джерелом вуглецю протягом даного періоду часу. Термін "еквівалентний мікроорганізм перед трансформацією", як використовують в цьому документі, включає вказування на мікроорганізм перед трансформацією нуклеотидною послідовністю, яка кодує ксилозоізомеразу, або перед трансформацією нуклеотидною послідовністю, яка викликає підвищену регуляцію (наприклад, надекспресію) ксилозоізомерази. У одному варіанті здійснення мікроорганізм відповідно до даного винаходу трансформований нуклеотидною послідовністю, яка приводить до надекспресії мікроорганізмом ксилозоізомерази. Наприклад, в геном мікроорганізму вбудовують промотор, який забезпечує надекспресію в мікроорганізмі ендогенної нуклеотидної послідовності, яка кодує ксилозоізомеразу. У іншому варіанті здійснення мікроорганізм відповідно до даного винаходу трансформований нуклеотидною послідовністю, що кодує ксилозоізомеразу. Наприклад, мікроорганізм трансформований експресуючим вектором, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує ксилозоізомеразу, функціонально пов'язану з регуляторною послідовністю. Переважно, мікроорганізм відповідно до даного винаходу трансформований нуклеотидною послідовністю, що кодує ксилозоізомеразу. Переважно, мікроорганізм відповідно до даного винаходу трансформований нуклеотидною послідовністю, що кодує екзогенну ксилозоізомеразу. Переважно, мікроорганізм відповідно до даного винаходу трансформований нуклеотидною послідовністю, що кодує екзогенну ксилозоізомеразу, який походить з видів Lactococcus. У переважному варіанті здійснення мікроорганізм відповідно до даного винаходу трансформований нуклеотидною послідовністю, що кодує амінокислотну послідовність, представлену як SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 або SEQ ID NO: 20, або її варіант, гомолог або похідне. У більш переважному варіанті здійснення мікроорганізм відповідно до даного винаходу трансформований нуклеотидною послідовністю, що кодує амінокислотну послідовність, представлену як SEQ ID NO: 19 або SEQ ID NO: 20, або її варіант, гомолог або похідне. У переважному варіанті здійснення мікроорганізм відповідно до даного винаходу трансформований нуклеотидною послідовністю, представленою як SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 27 або SEQ ID NO: 28, або її варіантом, гомологом або похідним. У більш переважному варіанті здійснення мікроорганізм відповідно до даного винаходу трансформований нуклеотидною послідовністю, представленою як SEQ ID NO: 27 або SEQ ID NO: 28, або її варіантом, гомологом або похідним. У одному аспекті мікроорганізм відповідно до даного винаходу трансформований двома або більше нуклеотидними послідовностями, що кодують ксилозоізомеразу. Переважно, нуклеотидна послідовність, яка кодує ксилозоізомеразу, згадану в цьому документі, являє собою кодуючий її експресуючий вектор. 6 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Переважно, експресуючий вектор, згаданий в цьому документі, містить промотор, здатний надекспресувати нуклеотидну послідовність, яка кодує ксилозоізомеразу. Приклади таких промоторів включають промотор GPD, промотор TEF і промотор ADP. Переважні промотори, які можна використовувати для надекспресії ксилозоізомерази, можуть являти собою будь-який з регуляторних елементів, які контролюють експресію нуклеотидних послідовностей, що кодують білки, залучені в гліколіз і ферментацію глюкози. У одному варіанті здійснення в способі відповідно до даного винаходу мікроорганізм трансформують нуклеотидною послідовністю, яка забезпечує надекспресію мікроорганізмом ксилозоізомерази. Наприклад, в геном мікроорганізму вбудовують промотор, який забезпечує надекспресію мікроорганізмом ендогенної нуклеотидної послідовності, яка кодує ксилозоізомеразу. У наступному прикладі в геном мікроорганізму вбудовують промотор, який забезпечує конститутивну експресію мікроорганізмом ендогенної нуклеотидної послідовності, яка кодує ксилозоізомеразу. У іншому варіанті здійснення в способі відповідно до даного винаходу мікроорганізм трансформують нуклеотидною послідовністю, що кодує ксилозоізомеразу. Наприклад, мікроорганізм трансформують експресуючим вектором, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує ксилозоізомеразу, функціонально пов'язану з регуляторною послідовністю. У наступному прикладі мікроорганізм трансформують експресуючим вектором, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує ксилозоізомеразу, функціонально пов'язану з регуляторною послідовністю, де вказана регуляторна послідовність забезпечує конститутивну експресію нуклеотидної послідовності, яка кодує ксилозоізомеразу. Переважно, в способі відповідно до даного винаходу, мікроорганізм трансформують нуклеотидною послідовністю, що кодує ксилозоізомеразу. Переважно, в способі відповідно до даного винаходу, мікроорганізм трансформують нуклеотидною послідовністю, що кодує екзогенну ксилозоізомеразу. У переважному варіанті здійснення в способі відповідно до даного винаходу мікроорганізм трансформують нуклеотидною послідовністю, що кодує ксилозоізомеразу, що містить нуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 27 або SEQ ID NO: 28, або її варіант, гомолог або похідне. У переважному варіанті здійснення в способі відповідно до даного винаходу мікроорганізм трансформують нуклеотидною послідовністю, що кодує ксилозоізомеразу, що містить амінокислотну послідовність, представлену як SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 або SEQ ID NO: 20, або її варіант, гомолог або похідне. У одному аспекті в способі відповідно до даного винаходу мікроорганізм трансформують двома або більше нуклеотидними послідовностями, що кодують ксилозоізомеразу. У способі відповідно до даного винаходу переважно нуклеотидна послідовність, яка кодує ксилозоізомеразу, являє собою кодуючий її експресуючий вектор. Як використовують в цьому документі термін "спосіб ферментації" належить до культивування мікроорганізму або мікроорганізмів в аеробних і анаеробних умовах. У одному варіанті здійснення культуральне середовище містить ксилозу і/або джерело ксилози. У одному варіанті здійснення культуральне середовище містить пентозний цукор і/або джерело пентозного цукру. Переважно, пентозний цукор являє собою ксилозу. У одному варіанті здійснення пентозний цукор походить і/або є таким, що отримується з лігноцелюлозного матеріалу. Альтернативно або додатково, культуральне середовище містить матеріал, який походить з лігноцелюлозного матеріалу. Переважно, спосіб відповідно до даного винаходу, крім того, включає стадію отримання біопалива з культурального середовища. У одному варіанті здійснення продукт, який походить з ксилози, вибраний з групи, яка складається з ксилулози, ксилулозо-5-фосфату, етанолу, ароматичних амінокислот, молочної кислоти, янтарної кислоти, оцтової кислоти, ацетальдегіду, фурфуралю, ітаконової кислоти, глутамінової кислоти, лимонної кислоти, крезолу, лізину, 3-гідроксипропіонової кислоти, полі-3гідроксіалканоатів, протокатехової кислоти, пірокатехолу, гваяколу, вератролу, резвератролу, ваніліну, ванілінової кислоти, ванілінового спирту, муконової кислоти, адипінової кислоти, 4гідроксибензойної кислоти, 4-гідроксибензальдегіду, 4-метоксибензойної кислоти, 4амінобензоату, 4-гідроксіаніліну, 4-метоксіаніліну, хінолу, анізолу, фенолу, антранілової кислоти, 3-гідроксіантранілату, 2,3-дигідроксибензойної кислоти, 2-амінофенолу, 1,4-циклогександіону, ізопрену і стиролу. 7 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Переважно, продукт, утворений з ксилози, вибраний з групи, яка складається з ксилулози, ксилулоза-5-фосфату, етанолу, ароматичних амінокислот, молочної кислоти, янтарної кислоти, оцтової кислоти, ацетальдегіду, фурфуралю, ітаконової кислоти, глутамінової кислоти, лимонної кислоти, крезолу, лізину, 3-гідроксипропіонової кислоти і полі-3-гідроксіалканоатів. У найбільш переважному варіанті здійснення продукт, утворений з ксилози, являє собою етанол. Як використовують в цьому документі, термін "надекспресує" у виразі "нуклеотидна послідовність, яка забезпечує надекспресію мікроорганізмом ксилозоізомерази" і "промотор, здатний надекспресувати нуклеотидну послідовність, яка кодує ксилозоізомеразу" належить до підвищення експресії від нульового рівня до деякого рівня експресії або починаючи з низького рівня експресії до більш високого рівня експресії (наприклад, підвищення регуляції), коли трансформований мікроорганізм порівнюють з еквівалентним мікроорганізмом перед трансформацією. Мікроорганізми, які надекспресують ксилозоізомеразу, мають збільшену здатність каталізувати конверсію ксилози в ксилулозу. Здатність конвертувати ксилозу в ксилулозу можна підтверджувати шляхом визначення здатності клітинного лізату продукувати ксилулозу з ксилози шляхом оцінки продукованої ксилоулози з використанням, наприклад, аналізу кетопентоз, як описано Dische and Borenfreund (Dische and Borenfreund, 1951), також описаного в розділі "Приклади" цього документа. Переважно, трансформований мікроорганізм, який надекспресує ксилозоізомеразу, здатний до: (a) більш високої активності ксилозоізомерази, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією; і/або (b) більш високої швидкості зростання в середовищі для зростання або на середовищі для зростання, яке містить ксилозу, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією; і/або (с) більш швидкого метаболізму ксилози, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією; і/або (d) більш швидкої продукції етанолу при вирощуванні в анаеробних умовах на ксилозі як джерелі вуглецю, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією. Приклади мікроорганізмів, які надекспресують ксилозоізомеразу, включають: (i) мікроорганізми, трансформовані експресуючим вектором, що кодує ксилозоізомеразу (перед трансформацією вказаний мікроорганізм не був здатний експресувати ксилозоізомеразу); і (ii) мікроорганізми, трансформовані для підвищеної регуляції експресії ендогенної ксилозоізомерази (перед трансформацією вказаний мікроорганізм був здатний експресувати вказану ксилозоізомеразу в даному наборі умов культивування в ході експонентного зростання, однак після трансформації вказаний мікроорганізм здатний експресувати вказану ксилозоізомеразу на більш високому рівні, в тих же умовах культивування в ході експонентного зростання). Термін "нуклеотидна послідовність, яка кодує ксилозоізомеразу", як використовують в цьому документі, охоплює нуклеотидні послідовності, що містять регуляторні послідовності, які забезпечують експресію нуклеотидної послідовності, яка кодує ксилозоізомеразу, такі як промотори і енхансери, які можуть бути природним чином або неприродним чином асоційовані з нуклеотидною послідовністю, що кодує ксилозоізомеразу. У одному аспекті даний винахід належить до генетично модифікованої дріжджової клітини, що має функціональний екзогенний ген ксилозоізомерази, який походить з мікроорганізму сімейства Lactococcus, де екзогенний генів ксилозоізомерази функціонально пов'язаний з промоторними і термінаторними послідовностями, які функціональні в дріжджах. У іншому аспекті даний винахід належить процесу ферментації, в якому мікроорганізм, як описано в цьому документі, культивують в умовах ферментації в ферментаційному бульйоні, який включає матеріал, який походить з лігноцелюлозного матеріалу. У іншому аспекті, даний винахід належить до процесу ферментації з використанням мікроорганізму відповідно до даного винаходу, де ферментаційний бульйон (тобто культуральне середовище) містить пентозний цукор. Трансформований мікроорганізм Як згадується в цьому документі, термін "трансформований мікроорганізм" належить до мікроорганізму, який генетично змінений технологією рекомбінантних ДНК. Термін "трансформований", як використовують в цьому документі, є синонімом таких термінів, як "трансфікований", "рекомбінантний", "модифікований способами генетичної інженерії" і "генетично модифікований". 8 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Термін "трансформований мікроорганізм" застосовно до даного винаходу включає будь-який мікроорганізм, який містить експресуючий вектор(и), що містить нуклеотидну послідовність(і), згадану в цьому документі, і/або промотор(и), який здатний забезпечувати експресію (зокрема, надекспресію, тобто підвищену регуляцію) нуклеотидної послідовності(ей), згаданої в цьому документі. У одному варіанті здійснення нуклеотидна послідовність(і) включена в геном мікроорганізму. У іншому варіанті здійснення промотор включений в геном мікроорганізму. Ці ознаки забезпечують наявність у трансформованого мікроорганізму (в порівнянні з еквівалентним мікроорганізмом перед трансформацією) (a) більш високої активності ксилозоізомерази; і/або (b) більш високої швидкості зростання в середовищі для зростання або на середовищі для зростання, яке містить ксилозу; і/або (с) більш швидкого метаболізму ксилози; і/або (d) більш швидкої продукції етанолу при вирощуванні в анаеробних умовах на ксилозі як джерелі вуглецю. Термін "трансформований мікроорганізм" не охоплює кодуючі нативний нуклеотид послідовності в їх природному оточенні, коли вони знаходяться під контролем їх нативного промотору, який також знаходиться в його природному оточенні. Таким чином, трансформований мікроорганізм за даним винаходом належить до мікроорганізму, що містить будь-яку з нуклеотидних послідовностей, що кодують ферменти, згадані в цьому документі, конструкцій, що містять вказані нуклеотидні послідовності, векторів, що містять вказані нуклеотидні послідовності, плазмід, що містять вказані нуклеотидні послідовності і експресуючих векторів, що містять вказані нуклеотидні послідовності, або їх комбінації. Таким чином, наступний варіант здійснення даного винаходу належить до мікроорганізмів, трансформованих або трансфікованих нуклеотидною послідовністю(ями), яка експресує фермент(и), згаданий в цьому документі. Мікроорганізм вибирають, щоб він був сумісний з вектором, і він може являти собою, наприклад, клітини бактерій, грибів або дріжджів. Прикладами придатних бактерійних організмів-хазяїв є грампозитивні або грамнегативні види бактерій. У залежності від природи нуклеотидної послідовності(ей), що кодує фермент(и), згаданий в цьому документі, можуть бути переважними еукаріотичні хазяї, такі як дріжджі або інші гриби. Як правило, дріжджові клітини є переважними відносно клітин грибів, оскільки ними легше маніпулювати. Застосування придатних мікроорганізмів, таких як клітини-хазяї дріжджів і грибів, може забезпечити посттрансляційні модифікації (наприклад, міристоїлування, глікозилування, укорочення, ліпідизацію і фосфорилування тирозину, серину або треоніну), які можуть бути необхідні для придання оптимальної біологічної активності рекомбінантним продуктам експресії, згаданим в цьому документі. Придатні мікроорганізми включають бактерії, гриби і дріжджі. Переважно, мікроорганізм являє собою дріжджі. Переважно, вказаний трансформований мікроорганізм являє собою трансформовані дріжджі. Переважно, вказані трансформовані дріжджі походять з роду Saccharomyces. Більш переважно, вказані трансформовані дріжджі являє собою Saccharomyces cerevisiae. У одному варіанті здійснення трансформований мікроорганізм, описаний в цьому документі, здатний до більш високої активності ксилозоізомерази, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією. У іншому аспекті трансформований мікроорганізм, описаний в цьому документі, здатний до більш високої швидкості зростання в середовищі для зростання або на середовищі для зростання, яке містить ксилозу, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією. У наступному аспекті трансформований мікроорганізм, описаний в цьому документі, здатний до більш швидкого метаболізму ксилози, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією. У іншому аспекті трансформований мікроорганізм, описаний в цьому документі, здатний до більш швидкої продукції етанолу при вирощуванні в анаеробних умовах на ксилозі як джерелі вуглецю, ніж у еквівалентного мікроорганізму перед трансформацією. Мікроорганізм можна трансформувати з використанням способів, які є загальноприйнятими в даній галузі, таких як електропорація (Sambrook et al. 1989). Крім того, присутність послідовності в трансформованому мікроорганізмі можна визначати за допомогою селекції по зростанню на придатному середовищі, яке здійснює селекцію по зростанню трансформованого мікроорганізму. Альтернативно або додатково, присутність вбудованих гетерологічних послідовностей ДНК можна визначати прямою ПЛР колоній з використанням праймерів, 9 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 призначених специфічно для вбудованої послідовності. Такі способи добре відомі і є загальноприйнятими в даній галузі (див., наприклад, Sambrook et al., 1989, і Ausbel et al., 1995). Трансформовані мікроорганізми відповідно до даного винаходу можна використовувати в комбінації з одним або декількома іншими мікроорганізмами. Наприклад, один або декілька трансформованих мікроорганізмів відповідно до даного винаходу можна культивувати в комбінації щонайменше з одним мікроорганізмом, здатним продукувати, в певних умовах культивування, один або декілька компонентів, вибраних з групи, яка складається з: етанолу, ароматичних амінокислот, молочної кислоти, янтарної кислоти, оцтової кислоти, ацетальдегіду, фурфуралю, ітаконової кислоти, глутамінової кислоти, лимонної кислоти, крезолу, лізину, 3гідроксипропіонової кислоти, полі-3-гідроксиалканоатів, протокатехової кислоти, пірокатехолу, гваяколу, вератролу, резвератролу, ваніліну, ванілінової кислоти, ванілінового спирту, муконової кислоти, адипінової кислоти, 4-гідроксибензойної кислоти, 4-гідроксибензальдегіду, 4метоксибензойної кислоти, 4-амінобензоату, 4-гідроксіаніліну, 4-метоксіаніліну, хінолу, анізолу, фенолу, антранілової кислоти, 3-гідроксіантранілату, 2,3-дигідроксибензойної кислоти, 2амінофенолу, 1,4-циклогександіону, ізопрену і стиролу. У наступному аспекті передбачена комбінація (i) одного або декількох трансформованих мікроорганізмів відповідно до даного винаходу і (ii) щонайменше одного додаткового мікроорганізму, здатного продукувати, в певних умовах культивування, один або декілька компонентів, вибраних з групи, яка складається з: етанолу, ароматичних амінокислот, молочної кислоти, янтарної кислоти, оцтової кислоти, ацетальдегіду, фурфуралю, ітаконової кислоти, глутамінової кислоти, лимонної кислоти, крезолу, лізину, 3-гідроксипропіонової кислоти, полі-3гідроксіалканоатів, протокатехової кислоти, пірокатехолу, гваяколу, вератролу, резвератролу, ваніліну, ванілінової кислоти, ванілінового спирту, муконової кислоти, адипінової кислоти, 4гідроксибензойної кислоти, 4-гідроксибензальдегіду, 4-метоксибензойної кислоти, 4амінобензоату, 4-гідроксіаніліну, 4-метоксіаніліну, хінолу, анізолу, фенолу, антранілової кислоти, 3-гідроксіантранілату, 2,3-дигідроксибензойної кислоти, 2-амінофенолу, 1,4-циклогександіону, ізопрену і стиролу. Крім того, даний винахід належить до інокуляту, що містить комбінацію трансформованого мікроорганізму відповідно до даного винаходу і одного або декількох додаткових мікроорганізмів. Крім того, передбачається культуральне середовище, що містить комбінацію трансформованого мікроорганізму відповідно до даного винаходу і одного або декількох інших мікроорганізмів. Крім того, даний винахід належить до набору, що містить інокулят, що містить один або декілька мікроорганізмів відповідно до даного винаходу. Крім того, даний винахід належить до набору, що містить (i) інокулят, що містить один або декілька мікроорганізмів відповідно до даного винаходу, і (ii) інокулят, що містить один або декілька інших мікроорганізмів. ТРАНСФОРМОВАНІ ДРІЖДЖІ У переважному варіанті здійснення трансгенний мікроорганізм являє собою дріжджі. Огляд принципів експресії гетерологічних генів в дріжджах наданий, наприклад, в Methods Mol Biol (1995), 49:341-54, і Curr Opin Biotechnol (1997) Oct; 8(5):554-60. У цьому відношенні, дріжджі, такі як види Saccharomyces cerevisi або Pichia pastoris (див. FEMS Microbiol Rev (2000 24(1):45-66), можна використовувати як носій для експресії гетерологічних генів. Огляд принципів експресії гетерологічних генів в Saccharomyces cerevisiae і секреції продуктів генів приведений Е Hinchcliffe Е Kenny (1993, "Yeast as а vehicle for the expression of nd heterologous genes", Yeasts, Vol 5, Anthony Н Rose and J Stuart Harrison, eds, 2 edition, Academic Press Ltd.). Для трансформації дріжджів розроблено декілька протоколів трансформації. Наприклад, трансгенних Saccharomyces відповідно до даного винаходу можна отримувати, слідуючи вказівкам Hinnen et al., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, JD (1978, Nature, London, 275, 104); і Ito, Н et al. (1983, J Bacteriology 153, 163-168). Трансформовані клітини дріжджів можна відбирати з використанням різних селективних маркерів, таких як ауксотрофні маркери і домінантні маркери стійкості до антибіотиків. Експресуючий вектор Термін "експресуючий вектор" означає конструкцію, здатну до експресії in vivo або in vitro. У одному аспекті експресуючий вектор вбудований в геном придатного мікроорганізму. Термін "вбудований" переважно охоплює стабільне вбудовування в геном. 10 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Нуклеотидні послідовності, згадані в цьому документі, можуть бути присутніми у векторі, в якому нуклеотидна послідовність функціонально пов'язана з регуляторними послідовностями, здатними забезпечувати експресію нуклеотидної послідовності придатним мікроорганізмомхазяїном. Вектори трансформують в придатний мікроорганізм-хазяїн, як описано в цьому документі. Вибір вектора, наприклад, плазмідного, космідного або фагового вектора, часто залежить від мікроорганізму, в який його мають намір вбудувати. Вектори для застосування для даного винаходу можуть містити одну або декілька нуклеотидних послідовностей селективних маркерів, таких як нуклеотидна послідовність, яка забезпечує стійкість до антибіотика, наприклад, стійкість до ампіциліну, канаміцину, хлорамфеніколу або тетрацикліну. Альтернативно селекцію можна проводити шляхом котрансформації (як описано в WO91/17243). Вектори можна використовувати in vitro, наприклад, для трансфекції, трансформації, трансдукції або інфікування мікроорганізму-хазяїна. Крім того, вектор може містити нуклеотидну послідовність, що забезпечує реплікацію вектора в мікроорганізмі-хазяїні, що розглядається. Прикладами таких послідовностей є оріджини реплікації плазмід pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 і pU702. У переважному аспекті, мікроорганізм, здатний конвертувати ксилозу в ксилулозу, як згадується в цьому документі, містить нуклеотидну послідовність, яка кодує ксилозоізомеразу. Переважно, експресуючий вектор, як згадується в цьому документі, містить нуклеотидну послідовність, яка кодує ксилозоізомеразу. У наступному аспекті, переважно, мікроорганізм, здатний конвертувати ксилозу в ксилулозу, містить щонайменше один експресуючий вектор, що кодує ксилозоізомеразу. Переважно, в іншому аспекті мікроорганізм, здатний конвертувати ксилозу в ксилулозу, як згадується в цьому документі, може додатково містити щонайменше один експресуючий вектор, що кодує один або декілька ферментів, вибраних з групи, яка складається з ксилулокінази, Dрибулокінази, рибозо-5-фосфатізомерази, рибулозо-5-фосфатепімерази, трансальдолази, транскетолази і будь-якого іншого ферменту пентозофосфатного шляху. Більш переважно, вказаний мікроорганізм, здатний конвертувати альдопентозу в кетопентозу, як згадується в цьому документі, крім того, містить щонайменше один експресуючий вектор, що кодує ксилулокіназу. У одному аспекті експресуючий вектор, як згадується в цьому документі, може додатково кодувати один або декілька ферментів, вибраних з групи, яка складається з альдозо-1епімерази, ксилозоредуктази, D-ксилулозоредуктази, арабінозоредуктази, L-арабіт-4дегідрогенази, L-ксилулозоредуктази, L-арабінозоізомерази, рибулокінази, рибулозофосфат-4епімерази, D-ліксозоізомерази, D-рибозоізомерази, ксилулокінази, D-рибулокінази, рибулозо-5фосфатепімерази, рибозо-5-фосфатізомерази, трансальдолази і транскетолази. У одному аспекті експресуючий вектор, що згадується в цьому документі, крім того, може кодувати один або декілька ферментів, вибраних з групи, яка складається з альдозо-1епімерази, ксилулокінази, D-рибулокінази, рибозо-5-фосфатізомерази, D-рибулозо-5фосфатепімерази, трансальдолази, транскетолази і будь-якого іншого ферменту пентозофосфатного шляху. Переважно, вказаний експресуючий вектор, як згадується в цьому документі, крім того, кодує ксилулокіназу. У переважному аспекті мікроорганізм, здатний конвертувати ксилозу в ксилулозу, як згадується в цьому документі, крім того, містить щонайменше один експресуючий вектор, що кодує альдозо-1-епімеразу. Переважно, експресуючий вектор, що згадується в цьому документі, крім того, містить нуклеотидну послідовність, яка кодує альдозо-1-епімеразу. Регуляторні послідовності У деяких застосуваннях, нуклеотидна послідовність(і), згадана в цьому документі, функціонально пов'язана з регуляторною послідовністю, яка здатна забезпечувати експресію нуклеотидної послідовності, наприклад, вибраним мікроорганізмом. Як приклад, даний винахід охоплює застосування вектора, що містить нуклеотидну послідовність(і), згадану в цьому документі, функціонально пов'язану з такою регуляторною послідовністю, тобто вектор являє собою експресуючий вектор. Термін "функціонально пов'язаний" належить до сусіднього положення, де описані компоненти знаходяться у взаємозв'язку, що дозволяє їм функціонувати передбачуваним для них чином. Регуляторна послідовність, "функціонально пов'язана" з кодуючою послідовністю, лігована таким чином, щоб досягалася експресія кодуючої послідовності в умовах, сумісних з послідовностями контролю. 11 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "регуляторні послідовності" включає промотори і енхансери і інші регулюючі експресію сигнали. У одному варіанті здійснення регуляторна послідовність забезпечує конститутивну експресію нуклеотидної послідовності(ей), функціонально пов'язаної з регуляторною послідовністю, в клітині-хазяї. Як використовують в цьому документі терміни "конститутивно експресований" і "конститутивна експресія" належать до постійної транскрипції нуклеотидної послідовності, функціонально пов'язаної з регуляторною послідовністю (такою як конститутивний промотор). Таким чином, наприклад, культуральне середовище не повинне містити субстрат для активації експресії нуклеотидної послідовності, яка кодує ксилозоізомеразу. У іншому прикладі культуральне середовище може не містити субстрат, який інгібує регуляторну послідовність і, таким чином, інгібує експресію нуклеотидної послідовності, яка кодує ксилозоізомеразу. Термін "промотор" використовують в звичайному його значенні в даній галузі, наприклад, в значенні ділянки зв'язування РНК-полімерази. Посиленої експресії нуклеотидної послідовності(їй), що кодує фермент(и), згаданий в цьому документі, також можна досягати шляхом вибору гетерологічних регуляторних областей, наприклад, областей промотору, секреторної лідерної послідовності і термінатора. Переважно, нуклеотидна послідовність(і), згадана в цьому документі, функціонально пов'язана щонайменше з промотором. Також для регуляції експресії поліпептиду(ів), згаданого в цьому документі, можна використовувати інші промотори. Приклади придатних промоторів для спрямування транскрипції нуклеотидної послідовності в клітинах бактерій, грибів або дріжджів добре відомі в даній галузі. Крім того, промотор може включати елементи, які забезпечують або підвищують експресію в придатному хазяїні. Наприклад, ці елементи можуть являти собою консервативні області, такі як бокс Прібнова або ТАТА-бокс. У одному варіанті здійснення промотор забезпечує конститутивну експресію в клітині-хазяї нуклеотидної послідовності(ей), функціонально пов'язаної з промотором. Конструкції Термін "конструкція", який є синонімом таких термінів, як "кон'югат", "касета" і "гібрид", включає нуклеотидну послідовність, згадану в цьому документі, прямо або опосередковано пов'язану з промотором. Прикладом посереднього зв'язування є надання придатної спейсерної групи, такої як послідовність інтрону, така як Sh1-інтрон або ADH-інтрон, між промотором і нуклеотидною послідовністю(ями), згаданою в цьому документі. Це ж є справедливим для терміну "злитий" відносно даного винаходу, який включає пряме або опосередковане зв'язування. У деяких випадках ці терміни не охоплюють природну комбінацію нуклеотидної послідовності, яка кодує білок, звичайно асоційовану з промотором гена дикого типу, і коли вони обидва знаходяться в їх природному оточенні. Конструкція також може містити або експресувати маркер, який дозволяє селекцію генетичної конструкції. Для деяких застосувань,переважно, конструкція містить щонайменше нуклеотидну послідовність(і), згадану в цьому документі, функціонально пов'язану з промотором. Промотори Як згадується в цьому документі, в одному аспекті даний винахід належить до мікроорганізму, який трансформований нуклеотидною послідовністю, такою як промотор, яка забезпечує надекспресію мікроорганізмом ксилозоізомерази. Наприклад, в геном мікроорганізму вбудований промотор, який забезпечує надекспресію мікроорганізмом (наприклад, підвищену регуляцію) ендогенної нуклеотидної послідовності, яка кодує ксилозоізомеразу. У одному варіанті здійснення в геном мікроорганізму вбудований промотор, який забезпечує конститутивну експресію мікроорганізмом ендогенної нуклеотидної послідовності, яка кодує ксилозоізомеразу. У іншому аспекті промотор функціонально пов'язаний з нуклеотидною послідовністю, наприклад, в експресуючому векторі. У одному варіанті здійснення промотор забезпечує конститутивну експресію нуклеотидної послідовності(їй), функціонально пов'язаної з промотором, в клітині-хазяїні. У іншому аспекті промотор не придушується присутністю глюкози. Приклади придатних промоторів, які можна використовувати в мікроорганізмах відповідно до даного винаходу, таких як Saccharomyces cerevisiae, включають: промотор гена гліцеральдегід 12 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 3-фосфатдегідрогенази (GPD); промотор гена алкогольдегідрогенази (ADH); і промотор гена тиротропного ембріонального фактора (TEF). Переважні промотори, які можна використовувати для надекспресії ксилозоізомерази, можуть являти собою будь-який з регуляторних елементів, контролюючих експресію нуклеотидних послідовностей, що кодують білки, залучені в гліколіз і ферментацію глюкози в дріжджах, зокрема, в Saccharomyces, таких як S. cerevisiae. Їх прикладами є промотор глюкокінази (GLK1), промотор фосфоглюкозоізомерази (PGI1), промотор фосфофруктокінази (PFK1) і промотор гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (TDH3). Біопаливо Як використовують в цьому документі, термін "біопаливо" належить до палива (наприклад, рідкого палива), придатного для застосування (наприклад) в двигунах внутрішнього згоряння. Вказане біопаливо отримують з біологічного матеріалу, який містить пентозні цукри і/або з якого пентозні цукри можуть бути отримані гідролізом ферментативним шляхом і/або обробкою кислотою. Переважно, вказаний цукор являє собою альдопентозу ксилозу. Рослинні матеріали, які включають рослинні відходи, що містять лігноцелюлозний матеріал (наприклад: солома із злакових, така як пшенична солома; пульпа цукрового буряка; макуха цукрової тростини; солома сорго; солома сої; маїсова солома; кукурудзяна солома; деревна стружка і паперова пульпа) і цілі рослини (такі рослини, які вирощують для енергетичних цілей, наприклад, просо), є придатними джерелами пентозних цукрів, зокрема, альдопентозних цукрів (таких як ксилоза), для даного винаходу. Інші придатні джерела рослинного матеріалу включають продукти (іншими словами, джерела їжі і корму), що не є відходами, такі як екстракт цукрової тростини, екстракт цукрового буряка, сорго, соєві боби, пшеничний крохмаль і кукурудзяний крохмаль. Переважно, біопаливо, згадане в цьому документі, містить щонайменше один спирт. У переважному аспекті спирт вибраний з групи, яка складається з метанолу, етанолу, пропанолу і бутанолу. Більш переважно, біопаливо містить етанол. Переважно, вказане біопаливо отримують (або є отримуваним), іншими словами екстрагують (або є екстрагованим), з культурального середовища, в якому один або декілька трансформованих мікроорганізмів відповідно до даного винаходу культивуються в придатних умовах. Вказане біопаливо можна отримувати (або є отримуваним) з культурального середовища з використанням способів, які є загальноприйнятими в даній галузі, таких як видалення мікроорганізму центрифугуванням, виділення супернатанту з подальшою перегонкою і наступну стадію дегідратації з отриманням на 99,5 % чистого спирту, такого як етанол. Біопаливо може містити один або декілька інших компонентів біопалива, таких як бутанол. Один або декілька додаткових компонентів біопалива можна змішувати з біопаливом до і/або після того, як біопаливо отримують або екстрагують (є отримуваним або екстрагованим) з культури. Альтернативно або додатково, один або декілька інших компонентів біопалива можна продукувати культивуванням мікроорганізму в культуральному середовищі до і/або після і/або одночасно з культивуванням трансформованого мікроорганізму відповідно до даного винаходу в культуральному середовищі для отримання біопалива. Крім того, даний винахід належить до транспортного палива, яке містить біопаливо, продуковане з використанням мікроорганізмів відповідно до даного винаходу. Етанол, що використовується як транспортне паливо, може виконувати дві різних задачі: (i) він може діяти як оксигенована домішка, яка підвищує октанове число і знижує викид реформульованого бензину (RFG) (заміна тетраетилсвинцю або MTBE); (ii) він може виступати як часткова або повна заміна бензину стандартної якості (RG) для зниження залежності від постачання пальним. Безводний етанол має октанове число 130, і його можна додавати в концентраціях 5-10 % (в залежності від сезону) в бензин стандартної якості, отриманий прямо з нафтоперегінного заводу. Традиційно, тетраетилсвинець використовують для підвищення октанового числа, однак внаслідок питань охорони здоров'я, застосування свинцю заборонене практично у всьому світі. Додавання оксигенатів до бензину стандартної якості знижує викид монооксиду вуглецю, а також інших частинок, що приводить до забруднення повітря. Спочатку метил-трет-бутиловий ефір (MTBE) використовували як оксигенуючу домішку, однак поява домішки MTBE у водоносних шарах з питною водою змусила деякі штати заборонити застосування цього оксигенату. Етанол в зростаючій мірі використовують по всьому світу як заміну MTBE як оксигенуючу домішку для виготовлення RFG. 13 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Крім ролі як оксигенуючої домішки при виготовленні реформульованого бензину, етанол можна використовувати як загальну заміну для бензину стандартної якості. Автомобілі можуть використовувати суміші E10 (10 % доданий етанол) без модифікації двигуна. Крім того, виробляють транспортні засоби, які можуть працювати на 100 % етанолі, іншими словами, відсутня необхідність у викопному паливі. Трансформовані мікроорганізми відповідно до даного винаходу або мікроорганізми, отримані способом відповідно до даного винаходу, здатні продукувати біопаливо на більш високому рівні, ніж еквівалентний мікроорганізм перед трансформацією. Як використовують в цьому документі, термін "більш висока швидкість" належить до трансформованого мікроорганізму, який здатний продукувати в культуральному середовищі щонайменше на 5 %, 10 %, 20 %, 25 %, 30 % або 35 % більше біопалива (такого як біоетанол) на клітину, ніж еквівалентний мікроорганізм перед трансформацією при культивування в тих же умовах культивування протягом даного періоду часу в експонентній фазі зростання. Виникаючий з ксилози продукт Як використовують в цьому документі, термін "виникаючий з ксилози продукт" або "продукт, який походить з ксилози" належить до будь-якої сполуки, яка походить з ксилози. Приклади продуктів, що походять з ксилози, включають, але не обмежуються ними: етанол, ароматичні амінокислоти, молочну кислоту, янтарну кислоту, оцтову кислоту, ацетальдегід, фурфураль, ітаконову кислоту, глутамінову кислоту, лимонну кислоту, крезол, лізин, 3гідроксипропіонову кислоту, полі-3-гідроксіалканоати, протокатехову кислоту, пірокатехол, гваякол, вератрол, резвератрол, ванілін, ванілінову кислоту, ваніліновий спирт, муконову кислоту, адипінову кислоту, 4-гідроксибензойну кислоту, 4-гідроксибензальдегід, 4метоксибензойну кислоту, 4-амінобензоат, 4-гідроксіанілін, 4-метоксіанілін, хінол, анізол, фенол, антранілову кислоту, 3-гідроксіантранілат, 2,3-дигідроксибензойну кислоту, 2-амінофенол, 1,4циклогександіон, ізопрен і стирол. Продукт, який походить з ксилози, можна конвертувати в інший продукт. Наприклад, кетопентоза D-ксилулоза, який походить з альдопентози D-ксилози, може конвертуватися за допомогою пентозофосфатного шляху в етанол. Переважно, вказаний продутий, який походить з ксилози, являє собою один або декілька продуктів, вибраних з групи, яка складається з етанолу, ароматичних амінокислот, молочної кислоти, янтарної кислоти, оцтової кислоти, ацетальдегіду, фурфуралю, ітаконової кислоти, глутамінової кислоти, лимонної кислоти, крезолу, лізину, 3-гідроксипропіонової кислоти, поли-3гідроксіалканоатів, протокатехової кислоти, пірокатехолу, гваяколу, вератролу, резвератролу, ваніліну, ванілінової кислоти, ванілінового спирту, муконової кислоти, адипінової кислоти, 4гідроксибензойної кислоти, 4-гідроксибензальдегіду, 4-метоксибензойної кислоти, 4амінобензоату, 4-гідроксіаніліну, 4-метоксіаніліну, хінолу, анізолу, фенолу, антранілової кислоти, 3-гідроксіантранілату, 2,3-дигідроксибензойної кислоти, 2-амінофенолу, 1,4-циклогександіону, ізопрену і стиролу. Більш переважно, вказаний продукт, який походить з ксилози, являє собою етанол. Культуральне середовище У одному варіанті здійснення культуральне середовище містить ксилозу і/або джерело ксилози. Крім того, культуральне середовище може містити щонайменше одну додаткову пентозу. У переважному аспекті культуральне середовище додатково містить щонайменше одну альдопентозу. Переважно, трансформовані мікроорганізми вирощують в оптимальному культуральному середовищі для вказаного мікроорганізму. Оптимальне культуральне середовище можна визначати з використанням загальноприйнятих способів; крім того, можна визначати оптимальні умови зростання. У одному варіанті здійснення культуральне середовище містить один або декілька субстратів, здатних активувати експресію нуклеотидної послідовності, яка кодує ксилозоізомеразу в мікроорганізмі відповідно до даного винаходу, однак вказане культуральне середовище не містить який-небудь субстрат, здатний інгібувати нуклеотидну послідовність, яка кодує ксилозоізомеразу в мікроорганізмі відповідно до даного винаходу. Наприклад: якщо нуклеотидна послідовність, яка кодує ксилозоізомеразу, містить індукований ксилозою промотор, тоді середовище містить ксилозу. У одному аспекті вказане культуральне середовище містить приблизно 1 %, приблизно 2 %, приблизно 4 %, приблизно 8 %, приблизно 15 % або приблизно 25 % ксилози перед інокуляцією мікроорганізмом (тобто в нульовий момент часу). 14 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Переважно, вказане культуральне середовище містить оптимальні кількості солей, вітамінів і інших поживних речовин, необхідних для мікроорганізму. Мікроорганізми, переважно, культивують при їх оптимальній для зростання температурі. Кваліфікований фахівець здатний легко визначити оптимальну температуру для культивування мікроорганізмів, згаданих в цьому документі. У одному варіанті здійснення мікроорганізми культивують при приблизно 20 °C, 25 °C, 30 °C, 35 °C або 37 °C. У одному варіанті здійснення мікроорганізми культивують при приблизно від 35 °C до 39 °C, переважно при приблизно від 36 °C до 38 °C, більш переважно при приблизно від 35,5 °C до 37,5 °C. У одному варіанті здійснення мікроорганізми культивують протягом приблизно від 3 до 96 годин; переважно приблизно від 3 до 48 годин, приблизно від 3 до 24 годин, приблизно від 3 до 15 годин і приблизно від 3 до 6 годин. Переважно, мікроорганізми культивують протягом приблизно 3 годин, приблизно 6 годин, приблизно 15 годин, приблизно 24 годин, приблизно 48 годин або приблизно 96 годин. У одному аспекті мікроорганізм, зокрема, трансформований мікроорганізм, є стійким до спирту і/або стійким до кислоти. Термін "стійкий до спирту" відносно даного винаходу належить до мікроорганізмів, які здатні рости в культуральному середовищі, яке містить щонайменше 2 %, 5 %, 10 % або 15 % спирту. Як згадується в цьому документі, термін "стійкий до кислоти" належить до мікроорганізмів, які здатні рости в культуральному середовищі, яке має значення pH, яке дорівнює або менше ніж 6,5, 6,0, 5,0, 4,0 або 3,0. 7 У переважному аспекті культуральне середовище інокулюють щонайменше від 5×10 до 11 8 10 5×10 клітин на кг культурального середовища, переважно від 5×10 до 5×10 клітин на кг 9 10 культурального середовища, переважно від 1×10 до 1×10 клітин на кг культурального 9 середовища і більш переважно приблизно 5×10 клітин на кг культурального середовища. Терміни "інокулят" і "початкова культура" є взаємозамінними. Умови культивування дозволяють щонайменше підтримку мікроорганізму відповідно до даного винаходу або мікроорганізму, отриманого способом відповідно до даного винаходу. Умови культивування необов'язково можуть дозволяти зростання мікроорганізму відповідно до даного винаходу або мікроорганізму, отриманого способом відповідно до даного винаходу. Джерела ксилози Ксилоза є альдопентозою. Ксилоза може бути отримана з: рослинних матеріалів, як правило, що використовуються як харчові або кормові джерела (такі як: цукрова тростина, цукровий буряк, сорго, пшениця і кукурудза - які являють собою багаті крохмалем і багаті цукром рослинні матеріали); цілих рослин (таких як рослини, вирощені для енергетичних цілей, наприклад, просо); і, зокрема, матеріалів сільськогосподарських (рослинних) відходів (такі як: солома злакових, наприклад, пшенична солома; пульпа цукрового буряка; макуха, наприклад, макуха цукрової тростини; такі соломи, наприклад, як солома сорго, сої, маїсу або кукурудзи; і деревна стружка). Джерела ксилози для культурального середовища, описаного в цьому документі, включають лігноцелюлозні матеріали, що звичайно вважаються матеріалами сільськогосподарських відходів. Стебла, стовбури і листя містять лігноцелюлозний матеріал і, таким чином, є джерелами лігноцелюлозного матеріалу. Макуха цукрової тростини, кукурудзяна солома і деревна стружка (тільки геміцеллюлоза) є трьома з легко доступних джерел лігноцелюлозного матеріалу, оскільки їх вже збирають або запасають у великих кількостях з різних причин. Лігноцелюлозний матеріал складається, головним чином, з цукрів з довгим ланцюгом. У середньому дві третини з цих цукрів являють собою гексозні цукри, які, головним чином, присутні в целюлозі, і одна третина цукрів являють собою пентозні цукри, присутні, головним чином, в арабіноксиланових полімерах. Значна кількість який походить з геміцелюлози пентозного цукру являє собою ксилозу. Лігноцелюлозні матеріали можна гідролізувати для вивільнення гексозних і/або пентозних цукрів в цукрах з довгим ланцюгом в целюлозі, геміцелюлозі і лігніні. Гідроліз лігноцелюлозних матеріалів можна проводити кислотною обробкою при підвищеній температурі. Однак ця обробка може давати виникаючі з цукру побічні продукти, які є токсичними для більшості мікроорганізмів і перешкоджають конверсії цукру в етанол. Такі токсичні побічні продукти (якщо вони утворюються) можна видаляти, однак це звичайно є неекономічним. 15 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Альтернативно, лігноцелюлозні матеріали можна гідролізувати з використанням ферментів, які гідролізують целюлозу і геміцелюлозу. Переважно, в цьому процесі не утворюються токсичні побічні продукти. У переважному аспекті культуральне середовище містить матеріал, який походить з одного або декількох лігноцелюлозних матеріалів, які були оброблені (приклади таких способів обробки включають: обробка пором, паровий вибух, вологе окиснення, кислотний гідроліз, лужне вологе окиснення і розширення волокон аміаком) для вивільнення ксилози. Переважно, лігноцелюлозний матеріал обробляють за допомогою процесу ферментативного гідролізу. Вказаний гідролізованний лігноцелюлозний матеріал можна далі обробляти для екстракції цукрів перед застосуванням вказаного екстракту в культуральному середовищі. Гідроліз лігноцелюлозного матеріалу Первинна механічна обробка: Лігноцелюлозний матеріал при необхідності подрібнюють на фрагменти меншого розміру. Наприклад, пшеничну солому нарізують на фрагменти довжиною приблизно 5 см. Подальша гідротермічна попередня обробка: Гідротермічну попередню обробку лігноцелюлозного матеріалу можна проводити як попередню обробку парою з подальшою стадією промивання, тим самим отримуючи фракцію волокон і рідку фракцію. Фракція волокон містить більше ніж 90 % целюлози, лігнін, спочатку присутній в целюлозному матеріалі, і деяку кількість геміцелюлоз. Рідка фракція містить цукри геміцелюлоз (C5-цукру), більше ніж 90 % хлоридів лугів, що містяться в лігноцелюлозній біомасі, і велику частину інгібіторів ферментації, виникаючих при попередній обробці лігноцелюлозної сировини. Як правило, пшеничну солому нагрівають парою до температури між 180 і 200 °C протягом часу впливу 5-15 хв. Попередньо оброблену біомасу вивантажують з реактора високого тиску і промивають і пресують. Вивільнену пару збирають і повторно використовують для випарювання рідкої фракції з отриманням кормового мелясу. Ферментативний гідроліз: Подальший гідроліз полімерів цукрів можна проводити шляхом додавання целюлаз і геміцелюлаз, або перед ферментацією або в процесі ферментації, або, серед іншого, в одночасному процесі оцукрювання і ферментації. Гексози Гексозні цукри мають 6 атомів вуглецю. Альдогексози мають альдегід в 1 положенні, і кетогексози мають кетон у 2 положенні. Прикладом альдогексози є глюкоза. Прикладом кетогексози є фруктоза. Пентози Пентозні цукри мають 5 атомів вуглецю. Пентози або мають альдегідну функціональну групу в 1 положенні (альдопентози), або кетонову функціональну групу у 2 положенні (кетопентози). Прикладами пентоз є ксилоза, арабіноза, рибоза, ліксоза, ксилулоза і рибулоза. Альдопентози Прикладами альдопентоз є ксилоза, арабіноза, рибоза і ліксоза. У одному аспекті переважно вказаною альдопентозою є ксилоза. Ксилоза може являти собою L-ксилозу або D-ксилозу. Переважно, вказана ксилоза являє собою D-ксилозу. Кетопентози Прикладами кетопентоз є ксилулоза і рибулоза. У одному аспекті вказаною кетопентозою є ксилулоза або рибулоза. У одному переважному аспекті вказаною кетопентозою є ксилулоза. Ксилулоза може являти собою L-ксилулозу або D-ксилулозу. Переважно, вказана ксилулоза являє собою D-ксилулозу. У альтернативному варіанті здійснення вказана кетопентоза являє собою рибулозу. Більш переважно, вказана рибулоза являє собою D-рибулозу. Ферменти Номенклатурні номери ферментів (номери EC), згадані в цьому документі, належать до рекомендацій Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology по номенклатурі і класифікації ферментів, опублікованій в 1992 році (ISBN 0-12-2271653). Ферменти, згадані в цьому документі, можна отримувати за допомогою нуклеотидних послідовностей, що походять з широкої множини джерел. У одному аспекті нуклеотидні послідовності, що кодують ферменти, згадані в цьому документі, можуть походити або можуть бути отримані з видів Lactococcus (таких як Lactococcus lactis і Lactococcus lactis subsp. lactis), 16 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Geobacillus stearothermophilus, Enterococcus faecalis, Piromyces sp, види Thermoanaerobacter (такі як Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus і Thermoanaerobacter thermosulphurigenes), Pichia stipitis або Saccharomyces cerevisiae. Переважно, нуклеотидні послідовності, що кодують ферменти, згадані в цьому документі, походять або можуть бути отримані з видів Lactococcus (таких як Lactococcus lactis і Lactococcus lactis subsp. lactis). Ксилозоізомераза (EC 5.3.1.5) Ксилозоізомераза має номенклатурний номер EC: EC 5.3.1.5. Ксилозоізомераза може бути позначена як D-ксилозоізомераза, D-ксилозокетоізомераза або D-ксилозокетолізомераза. Термін "ксилозоізомераза" належить до ферменту, який здатний конвертувати D-ксилозу в D-ксилулозу і навпаки. Ксилозоізомераза, згадана в цьому документі, здатна діяти на D-ксилозу. Ксилозоізомераза може походити з бактерійних видів, таких як види Lactococcus. Зокрема, ксилозоізомераза може походити з Lactococcus lactis subsp. lactis; Lactococcus lactis subsp. lactis штам NRRL В-449; Lactococcus lactis subsp. lactis штам KF 147; Lactococcus lactis subsp. lactis штам DSM20175; і Lactococcus lactis subsp. lactis strain IO-1. Приклади ксилозоізомераз, придатних для застосування, як описано в цьому документі, включають ксилозоізомерази, що містять: амінокислотну послідовність, представлену як SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 або SEQ ID NO: 20, або її варіант, гомолог або похідне; амінокислотну послідовність, представлену як послідовність з реєстраційним номером GenBank ABX75758; або амінокислотну послідовність, представлену як послідовність з реєстраційним номером GenBank AAD20249. Приклади ксилозоізомераз, придатних для застосування, як описано в цьому документі, включають ксилозоізомеразу, що кодується: нуклеотидною послідовністю, представленою як SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 27 або SEQ ID NO: 28, або її варіантом, гомологом або похідним; нуклеотидною послідовністю, що кодує амінокислотну послідовність, представлену як SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 або SEQ ID NO: 20, або її варіант, гомолог або похідне. Альдозо-1-епімераза (EC 5.1.3.3) Альдозо-1-епімераза, згадана в цьому документі, здатна діяти на альдопентозу. Альдозо-1-епімераза має номенклатурний номер EC 5.1.3.3. Альдозо-1-епімераза може бути позначена як мутаротаза або альдозомутаротаза. Термін "альдозо-1-епімераза" належить до ферменту, який здатний конвертувати αальдозопентозу в β-альдопентозу і навпаки. У переважному варіанті здійснення альдозо-1-епімераза кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з: AAD20257, ABX75760, AAK05605, AAD20245, AAD20251, ABJ73095, ABI49935 і AAO80762 (реєстраційні номери NCBI). Більш переважно, альдозо-1-епімераза вибрана з групи, яка складається з: AAD20257, ABX75760, AAK05605, AAD20245 і AAD20251. Приклади альдозо-1-епімераз, придатних для застосування, як описано в цьому документі, включають альдозо-1-епімеразу, що кодується: нуклеотидною послідовністю гена альдозо-1епімерази Lactococcus lactis (реєстраційний номер NCBI AAD20245); нуклеотидною послідовністю гена GAL10 Saccharomyces cerevisiae (зокрема, частини, що кодує амінокислотну послідовність, що має активність мутаротази); і нуклеотидною послідовністю гена GAL10 Saccharomyces cerevisiae штаму D0002 (зокрема, частини, що кодує амінокислотну послідовність, що має активність мутаротази). Альдозоредуктаза (EC 1.1.1.21) Альдозоредуктаза має номенклатурний номер EC 1.1.1.21. Альдозоредуктаза може бути позначена як: поліолдегідрогеназа, альдегідредуктаза, ALR2, NADPH-альдопентозоредуктаза, + NADPH-альдозоредуктаза, алдитол:NADP оксидоредуктаза або алдитол:NADP 1оксидоредуктаза. Термін "альдозоредуктаза" належить до ферменту, який здатний конвертувати альдитол в альдозу і навпаки. Альдозоредуктаза може відновлювати більше одного типу альдози. Наприклад, один і той же фермент може бути здатний відновлювати як D-ксилозу, так і L-арабіноза, і, таким чином, такий фермент може називатися альдозоредуктазою, або він може бути названий більш конкретно по одному з субстратів, наприклад, ксилозоредуктаза. Ксилозоредуктаза (EC 1.1.1.21) У одному варіанті здійснення альдозоредуктаза являє собою ксилозоредуктазу. Ксилозоредуктаза має номенклатурний номер EC 1.1.1.21. 17 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "ксилозоредуктаза" належить до ферменту, який здатний конвертувати D-ксилозу в ксиліт і навпаки. Ксилозоредуктаза, згадана в цьому документі, здатна діяти на D-ксилозу. Приклади ксилозоредуктаз, придатних для застосування, як описано в цьому документі, включають ксилозоредуктазу, що кодується: нуклеотидною послідовністю гена ксилозоредуктази Pichia stipitis (PsXR); нуклеотидною послідовністю гена ксилозоредуктази Pichia stipitis штаму DSM3651 (PsXR) - реєстраційний номер NCBI X59465; нуклеотидною послідовністю Candida tenuis (вказана нуклеотидна послідовність, яка кодує ксилозоредуктазу, може бути отримана, як описана Kavanagh et al., 2003); і нуклеотидною послідовністю Neurospora crassa (вказана нуклеотидна послідовність, яка кодує ксилозоредуктазу, може бути отримана, як описана Woodyer et al., 2005). Арабінозоредуктаза (EC 1.1.1.21) У іншому варіанті здійснення альдозоредуктаза являє собою арабінозоредуктазу. Арабінозоредуктаза має номенклатурний номер EC 1.1.1.21. Термін "арабінозоредуктаза" належить до ферменту, який здатний конвертувати L-арабінозу в L-арабіт і навпаки. Арабінозоредуктаза, згадана в цьому документі, здатна діяти на L-арабінозу. D-ксилозоредуктази, відомі в цей час в даній галузі, також можуть діяти на L-арабінозу як субстрат зі схожою активністю. Таким чином, термін L-арабінозоредуктаза також може належати до ферментів, які класифіковані як такі, що є D-ксилозоредуктазами, і ксилозоредуктази, згадані в цьому документі як придатні для включення в метаболізм ксилози, аналогічно придатні для застосування у включенні в метаболізм арабінози в мікроорганізмі. У наступному варіанті здійснення альдозоредуктаза може бути здатна конвертувати Lліксозу в L-арабіт і навпаки. У іншому варіанті здійснення альдозоредуктаза може бути здатна конвертувати D-ліксозу в D-арабіт і навпаки. У іншому варіанті здійснення альдозоредуктаза може бути здатна конвертувати рибозу в рибіт (зокрема, D-рибозу в D-рибіт) і навпаки. Ксилулозоредуктаза (EC 1.1.1.9 і EC 1.1.1.10) Термін "ксилулозоредуктаза" охоплює D-ксилулозоредуктазу і L-ксилулозоредуктазу. D-ксилулозоредуктаза (EC 1.1.1.9) D-ксилулозоредуктаза має номенклатурний номер EC 1.1.1.9. D-ксилулозоредуктаза може бути позначена як ксилітдегідрогеназа, ксиліт-2-дегідрогеназа, 2,3-цисполіол(DPN)дегідрогеназа (C3-5), NAD-залежна ксилітдегідрогеназа, еритритдегідрогеназа або пентитол-DPN-дегідрогеназа. Термін "D-ксилулозоредуктаза" належить до ферменту, який здатний конвертувати ксиліт в D-ксилулозу і навпаки. D-ксилулозоредуктаза, згадана в цьому документі, здатна діяти на ксиліт. Приклади D-ксилулозоредуктаз, придатних для застосування, як описано в цьому документі, включають D-ксилулозоредуктазу, що кодується: нуклеотидною послідовністю гена Dксилулозоредуктази Pichia stipitis (PsXDH); і нуклеотидною послідовністю гена Dксилулозоредуктази Pichia stipitis штаму DSM3651 (PsXDH) - реєстраційний номер NCBI X55392. L-ксилулозоредуктаза (EC 1.1.1.10) L-ксилулозоредуктаза має номенклатурний номер EC 1.1.1.10. L-ксилулозоредуктаза може бути позначена як L-ксилітдегідрогеназа. Термін "L-ксилулозоредуктаза" належить до ферменту, який здатний конвертувати Lксилулозу в ксиліт і навпаки. L-ксилулозоредуктаза, згадана в цьому документі, здатна діяти на L-ксилулозу. Нуклеотидна послідовність, яка кодує L-ксилулозоредуктазу, може походити з Aspergillus niger, як описано Witteveen et al. (1994), або з дріжджів Ambrosiozyma monospora (Verho et al., 2004). Ксилулокіназа (EC 2.7.1.17) Ксилулокіназа має номенклатурний номер EC 2.7.1.17. Ксилулокіназа може бути позначена як D-ксилулокіназа. Термін "ксилулокіназа" належить до ферменту, який здатний конвертувати D-ксилулозу в Dксилулозо-5-фосфат і навпаки. Ксилулокіназа, згадана в цьому документі, здатна діяти на D-ксилулозу. Приклади ксилулокіназ, придатних для застосування, як описано в цьому документі, включають ксилулокіназу, що кодується: нуклеотидною послідовністю гена ксилулокінази Pichia stipitis (PsXKS); нуклеотидною послідовністю гена ксилулокінази Pichia stipitis штаму DSM3651 (PsXKS) - реєстраційний номер NCBI AF127802; нуклеотидною послідовністю гена 18 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ксилулокінази S. cerevisiae (ScXKS); і нуклеотидною послідовністю гена ксилулокінази S. cerevisiae штаму D0002 (ScXKS) - реєстраційний номер NCBI X61377. D-арабініт-4-дегідрогеназа (EC 1.1.1.11) D-арабініт-4-дегідрогеназа має номенклатурний номер EC 1.1.1.11. D-арабініт-4дегідрогеназа може бути позначена як D-арабітдегідрогеназа або арабітдегідрогеназа. Термін "D-арабініт-4-дегідрогеназа" належить до ферменту, який здатний конвертувати Dарабініт в D-ксилулозу і навпаки. D-арабініт-4-дегідрогеназа, згадана в цьому документі, здатна діяти на D-арабініт. Придатна D-арабініт-4-дегідрогеназа і відповідний ген описані Cheng et al 2005. L-арабініт-4-дегідрогеназа (EC 1.1.1.12) L-арабініт-4-дегідрогеназа має номенклатурний номер EC 1.1.1.12. L-арабініт-4дегідрогеназа може бути позначена як L-арабіт-4-дегідрогеназа або пентитол-DPNдегідрогеназа. Термін "L-арабініт-4-дегідрогеназа" належить до ферменту, який здатний конвертувати Lарабініт в L-ксилулозу і навпаки. L-арабініт-4-дегідрогеназа, згадана в цьому документі, здатна діяти на L-арабініт. Придатна L-арабініт-4-дегідрогеназа і відповідний ген описані Richard et al. (2001). L-арабінозоізомераза (EC 5.3.1.4) L-арабінозоізомераза має номенклатурний номер EC 5.3.1.4. L-арабінозоізомераза може бути позначена як L-арабінозокетолізомераза. Термін "L-арабінозоізомераза" належить до ферменту, який здатний конвертувати Lарабінозу в L-рибулозу і навпаки. L-арабінозоізомераза, згадана в цьому документі, здатна діяти на L-арабінозу. Прикладом нуклеотидної послідовності, яка кодує L-арабінозоізомеразу, є нуклеотидна послідовність, яка може бути отримана з Lactobacillus plantarum штаму NCIMB8826 (ATCC 14917) (ген, описаний під реєстраційним кодом NCBI NC_004567). Рибулокіназа (EC 2.7.1.16) Рибулокіназа має номенклатурний номер EC 2.7.1.16. Рибулокіназа може бути позначена як L-рибулокіназа. Термін "рибулокіназа" належить до ферменту, який здатний конвертувати (i) L-рибулозу в Lрибулозо-5-фосфат і навпаки; і/або (ii) D-рибулозу в D-рибулозо-5-фосфат і навпаки. Рибулокіназа, згадана в цьому документі, здатна діяти на L-рибулозу і/або D-рибулозу. Придатну нуклеотидну послідовність, яка кодує рибулокіназу, можна отримати з Lactobacillus plantarum штам NCIMB8826 (ATCC 14917) (ген, описаний по реєстраційним кодом NCBI NC_004567). D-рибулокіназа (EC 2.7.1.47) D-рибулокіназа має номенклатурний номер EC 2.7.1.47. Термін "рибулокіназа" належить до ферменту, який здатний конвертувати D-рибулозу в Dрибулозо-5-фосфат і навпаки. Приклад нуклеотидної послідовності, яка кодує D-рибулокіназу, може бути отриманий з Botryotinia fuckeliana (реєстраційний код GenBank CH476984). Під реєстраційним номером GenBank EDN20859 детально представлена амінокислотна послідовність D-рибулокінази. L-рибулозофосфат-4-епімераза (EC 5.1.3.4) L-рибулозофосфат-4-епімераза має номенклатурний номер EC 5.1.3.4. L-рибулозофосфат4-епімераза може бути позначена як рибулозофосфат-4-епімераза, фосфорибулозоізомераза, L-рибулозо-5-фосфат-4-епімераза, AraD або L-Ru5P. Термін "L-рибулозофосфат-4-епімераза належить до ферменту, який здатний конвертувати L-рибулозо-5-фосфат в D-ксилулозо-5-фосфат і навпаки. L-рибулозофосфат-4-епімераза, згадана в цьому документі, здатна діяти на L-рибулозо-5фосфат. Придатна нуклеотидна послідовність, яка кодує L-рибулозофосфат-4-епімеразу, може бути отримана з Lactobacillus plantarum штаму NCIMB8826 (ATCC 14917) (ген, описаний під реєстраційним кодом NCBI NC_004567). D-рибіт-4-дегідрогеназа (EC 1.1.1.56) D-рибіт-4-дегідрогеназа має номенклатурний номер EC 1.1.1.56. Цей фермент також може бути позначений як рибіт-2-дегідрогеназа, адонітдегідрогеназа або рибітдегідрогеназа. Термін "D-рибіт-4-дегідрогеназа" належить до ферменту, який здатний конвертувати рибіт в D-рибулозу і навпаки. D-рибіт-4-дегідрогеназа, згадана в цьому документі, здатна діяти на D-рибіт. Придатна D-рибіт-4-дегідрогеназа і відповідний ген описані Dothie et al., 1985. 19 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 D-ліксозоізомераза (EC 5.3.1.15) D-ліксозоізомераза має номенклатурний номер EC 5.3.1.15. Цей фермент також може бути позначений як D-ліксозокетолізомераза. Термін "D-ліксозоізомераза" належить до ферменту, який здатний конвертувати D-ліксозу в D-ксилулозу і навпаки. D-ліксозоізомераза, згадана в цьому документі, здатна діяти на D-ліксозу. Нуклеотидну послідовність, яка кодує D-ліксозо/L-рибозоізомеразу, можна клонувати з організму Acinetobacter sp. штаму DL-28 (Shimonishi and Izumori, 1996) або з Aerobacter aerogenes (Anderson and Allison, 1965). Рибозоізомераза (EC 5.3.1.20) Рибозоізомераза має номенклатурний номер EC 5.3.1.20. Цей фермент також може бути позначений як D-рибозоізомераза або D-рибозокетолізомераза. Термін "рибозоізомераза" належить до ферменту, який здатний конвертувати D-рибозу в Dрибулозу і навпаки. Рибозоізомераза, згадана в цьому документі, здатна діяти на D-рибозу. D-рибозоізомераза була знайдена в організмі Mycobacterium smegmatis (Izumori el al., 1975), з якого її можна клонувати. Рибулозо-5-фосфат-3-епімераза (EC 5.1.3.1) Рибулозо-5-фосфат-3-епімераза має номенклатурний номер EC 5.1.3.1. Цей фермент також може бути позначений як: пентозо-5-фосфат-3-епімераза, фосфокетопентозо-3-епімераза, фосфокетопентозоепімераза, фосфорибулозоепімераза, рибулозофосфат-3-епімераза; Dрибулозо-5-фосфатепімераза; D-рибулозофосфат-3-епімераза; D-рибулозо-5P-3-епімераза; Dксилулозо-5-фосфат-3-епімераза; еритрозо-4-фосфатізомераза; рибулозо-5-фосфат-3епімераза; і ксилулозофосфат-3-епімераза. Термін "рибулозо-5-фосфат-3-епімераза" належить до ферменту, який здатний конвертувати D-рибулозо-5-фосфат в D-ксилулозо-5-фосфат і навпаки. Приклади рибулозо-5-фосфат-3-епімерази, придатні для застосування, як описано в цьому документі, включають рибулозо-5-фосфат-3-епімеразу, що кодується: нуклеотидною послідовністю гена RPE1 S. cerevisiae; нуклеотидною послідовністю гена RPE1 S. cerevisiae штаму D0002; нуклеотидною послідовністю під реєстраційним кодом NCBI NP _012414; і рибулозо-5-фосфатізомеразу з Р. stiptitis, яка може бути знайдена під реєстраційним номером NCBI NP_012414. Рибозо-5-фосфатізомераза (EC 5.3.1.6) Рибозо-5-фосфатізомераза має номенклатурний номер EC 5.3.1.6. Цей фермент також може бути позначений як фосфопентоізомераза, фосфопентозоізомераза, фосфопентозоізомераза, фосфорибоізомераза, рибозо-5-фосфатепімераза, рибозофосфатізомераза, 5-фосфорибозоізомераза або D-рибозо-5-фосфаткетолізомераза. Термін "рибозо-5-фосфатізомераза" належить до ферменту, який здатний конвертувати Dрибозо-5-фосфат в D-рибулозо-5-фосфат і навпаки. Приклади рибозо-5-фосфатізомерази, придатної для застосування, як описано в цьому документі, включають рибозо-5-фосфаткетолізомеразу, що кодується: нуклеотидною послідовністю гена RKII S. cerevisiae; нуклеотидною послідовністю гена RKII S. cerevisiae штаму D0002; нуклеотидною послідовністю під реєстраційним кодом NCBI X94335; нуклеотидною послідовністю під реєстраційним кодом NCBI NP_014738, і рибозо-5-фосфатізомеразу з Р. stiptitis, яка може бути знайдена під реєстраційним номером NC_009043. Транскетолаза (EC 2.2.1.1) Транскетолаза має номенклатурний номер EC 2.2.1.1. Цей фермент також може бути позначений як глікольальдегідтрансфераза. Термін "транскетолаза" належить до ферменту, який здатний конвертувати седогептулозо7-фосфат + D-гліцеральдегід-3-фосфат в D-рибозо-5-фосфат + D-ксилулозо-5-фосфат і навпаки. Приклади транскетолаз, придатних для застосування, як описано в цьому документі, включають транскетолазу, що кодується: нуклеотидною послідовністю гена TKL1 Saccharomyces cerevisiae; нуклеотидною послідовністю гена TKL1 Saccharomyces cerevisiae штаму D0002; нуклеотидною послідовністю під реєстраційним кодом NCBI X73224; нуклеотидною послідовністю під реєстраційним кодом NCBI NP_015399, і транскетолазу з Р. stiptitis, яка може бути знайдена під реєстраційним номером CP000496. Трансальдолаза (EC 2.2.1.2) 20 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Трансальдолаза має номенклатурний номер EC 2.2.1.2. Цей фермент також може бути позначений як дигідроксіацетонтрансфераза, дигідроксиацетонсинтаза, формальдегідтранскетолаза або гліцеронтрансфераза. Термін "трансальдолаза" належить до ферменту, який здатний конвертувати седогептулозо7-фосфат + D-гліцеральдегід-3-фосфат в D-еритрозо-4-фосфат + D-фруктозо-6-фосфат і навпаки. Приклади трансальдолаз, придатних для застосування, як описано в цьому документі, включають трансальдолазу, що кодується: нуклеотидною послідовністю гена TAL1 Saccharomyces cerevisiae; нуклеотидною послідовністю гена TAL1 Saccharomyces cerevisiae штаму D0002; нуклеотидною послідовністю під реєстраційним кодом NCBI X15953; нуклеотидною послідовністю під реєстраційним кодом NCBI NP_013458, і трансальдолазу з Р. sliptitis, яка може бути знайдена під реєстраційним номером CP000502. Екзогенна ксилозоізомераза У одному аспекті ксилозоізомераза, згадана в цьому документі, являє собою екзогенну ксилозоізомеразу. У одному аспекті нуклеотидна послідовність, яка кодує ксилозоізомеразу, згадану в цьому документі, кодує екзогенну ксилозоізомеразу. Переважно, екзогенна ксилозоізомераза походить з мезофільного мікроорганізму. Більш переважно, екзогенна ксилозоізомераза походить з мезофільної бактерії. Як використовують в цьому документі, термін "мезофільний мікроорганізм" належить до мікроорганізму, який росте і/або найкращим чином розростається при температурі між 15 °C і 40 °C. Приклади мезофільних мікроорганізмів включають види Lactococcus, види Saccharomyces (такі як S. cerevisiae), види Escherichia (такі як Е. coli) і види Bacillus (такі як В. subtilis). У одному варіанті здійснення екзогенна ксилозоізомераза походить з вигляду Lactococcus. Переважно, екзогенна ксилозоізомераза походить з виду Lactococcus, здатного рости на ксилозі. Переважно, екзогенна ксилозоізомераза походить з Lactococcus lactis. Більш переважно, екзогенна ксилозоізомераза походить з Lactococcus lactis subsp. lactis. У найбільш переважному варіанті здійснення екзогенна ксилозоізомераза походить з Lactococcus lactis штаму NRRL В-4449, штаму DSM 20175, штаму KF147 або штаму IO-1. Мікроорганізм Lactococcus lactis subsp. lactis може бути позначений як Lactobacillus xylosus. Аналіз альдопентози Кількість альдопентози (такої як ксилоза) в розчині (такому як культуральне середовище) можна визначати колориметричний способом з флюроглюцином, як описано Ebert et al. (А Simplified, Colorimetric Micromethod for Xylose in Serum or Urine, with Phloroglucinol, 1979, Clin. Chem. 25, no.8, pp. 1440-1443). Кольоровий реагент складається з 0,5 г флюроглюцину (1,3,5-тригідроксибензол), 100 мл крижаної оцтової кислоти і 10 мл концентрованої HCl. До 950 мкл кольорового реагенту додають 50 мкл зразка. Суміш нагрівають до 100 °C протягом 4 хвилин, і зчитують поглинання суміші при 554 нм. Кількість альдопентози (такої як ксилоза) в зразку визначають згідно зі стандартною кривою, отриманою з тієї ж альдопентозою як стандартом. Цей спосіб також можна використовувати для визначення кількості арабінози, ліксози і рибози в культуральному середовищі. Аналіз кетопентози Кількість кетопентози (такої як ксилулоза) в розчині (такому як культуральне середовище) можна визначати колориметричним способом з цистеїн-карбазолом, як описано Zacharias Dische and Ellen Borenfreund (1951; J. Biol. Chem. 192 (2): 583). Аналіз ксилозоізомерази Величину активності ксилозоізомерази в розчині можна визначати таким чином. Перетворення ксилози в ксилулозу визначають в розчині, що містить деяку кількість ксилозоізомерази, 2 % ксилозу і 2 мМ MgCl2 в 20 мМ TRIS-буфері, pH 7,4, і інкубацію проводять при вибраній температурі. Реакцію починають додаванням ксилози і зупиняють вміщенням реакційної суміші або зразка реакційної суміші на лід. Час реакції, як правило, становить 30 або 60 хвилин, або зразки для подальшої реакції можна відбирати в різні моменти часу. Отриману ксилулозу кількісно визначають з використанням способу з цистеїн/карбазолом (Dische and Borenfreund, 1951). Одну одиницю активності ксилозоізомерази визначають як величину активності, яка каталізує перетворення 1 наномоль ксилози в ксилулозу на хвилину. У найбільш переважному аспекті трансформований мікроорганізм має активність ксилозоізомерази щонайменше 0,2 одиниці ксилозоізомерази на мг білка мікроорганізму. Величину активності ксилозоізомерази аналізують, як згадується в цьому документі, і вміст 21 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 білка визначають, як описано нижче. Мікроорганізми попередньо культивують протягом 96 годин або менше в культуральному середовищі, що містить ксилозу. Вміст білка Кількість білка (тобто вміст білка) в розчині визначали з використанням комерційно доступного набору для аналізу BCA (Pierce Biotechnology inc., USA) на основі аналізу з біцинхоніновою кислотою (Smith et al., 1985), з використанням бичачого сироваткового альбуміну як стандарту. Аналіз етанолу Кількість біопалива, такого як етанол, в розчині (такому як культуральне середовище) можна визначати з використанням комерційно доступного набору для аналізу етанолу, K-ETOH Kit, що виготовляється і продається Megazyme International, Bray Business Park, Bray, Co. Wicklow, Ірландія; або його можна визначати, наприклад, з використанням газової хроматографії. Пентозофосфатний шлях Кетопентози (такі як ксилулоза) конвертуються в етанол через пентозофосфатний шлях. Його приклад представлений на фігурі 4. Приклади ферментів, залучених до пентозофосфатного шляху, включають: транскетолазу, трансальдолазу, рибозо-5-фосфаткетолізомеразу і рибулозо-5-фосфат-3-епімеразу. У одному варіанті здійснення мікроорганізм відповідно до даного винаходу також трансформований для експресії або надекспресії одного або декількох ферментів, залучених до пентозофосфатного шляху. У одному варіанті здійснення мікроорганізм відповідно до даного винаходу також трансформований однією або декількома нуклеотидними послідовностями, які забезпечують надекспресію мікроорганізмом одного або декількох ферментів, залучених до пентозофосфатного шляху. Наприклад, в геном мікроорганізму вбудовують промотор, який забезпечує надекспресію мікроорганізмом ендогенної нуклеотидної послідовності, яка кодує фермент, залучений до пентозофосфатного шляху. У іншому варіанті здійснення мікроорганізм трансформований однією або декількома нуклеотидними послідовностями, що кодують один або декілька ферментів, залучених до пентозофосфатного шляху. Наприклад, мікроорганізм трансформований експресуючим вектором, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує один або декілька ферментів, залучених до пентозофосфатного шляху. Переважно, експресуючий вектор, згаданий в цьому документі, містить один або декілька промоторів, здатних надекспресувати одну або декілька нуклеотидних послідовностей, що кодують один або декілька ферментів, залучених до пентозофосфатного шляху. Приклади таких промоторів включають промотор GPD, промотор TEF і промотор ADP. Переважні промотори, які можна використовувати для надекспресії однієї або декількох нуклеотидних послідовностей, що кодують один або декілька ферментів, залучених до пентозофосфатного шляху, можуть являти собою будь-який з регуляторних елементів, які контролюють експресію нуклеотидних послідовностей, що кодують білки, залучені в гліколіз і ферментацію глюкози. Як використовують в цьому документі, термін "надекспресувати" у виразі "одна або декілька нуклеотидних послідовностей, які забезпечують надекспресію мікроорганізмом одного або декількох ферментів, залучених до пентозофосфатного шляху" і "один або декілька промоторів, здатних надекспресувати одну або декілька нуклеотидних послідовностей, що кодують один або декілька ферментів, залучених до пентозофосфатного шляху" належить до збільшення експресії від нульового рівня до деякого рівня експресії або починаючи з низького рівня експресії до більш високого рівня експресії (наприклад, підвищення регуляції), коли трансформований мікроорганізм порівнюють з еквівалентним мікроорганізмом перед трансформацією. Мікроорганізми, які надекспресують один або декілька ферментів, залучених до пентозофосфатного шляху, мають збільшену здатність каталізувати конверсію кетопентози (такої як ксилулозо-5-фосфат) в біопаливо (таке як етанол). Переважно, вказаний трансформований мікроорганізм, який надекспресує один або декілька ферментів, залучених до пентозофосфатного шляху, здатний каталізувати конверсію кетопентози (такої як ксилулозо-5-фосфат) в біопаливо (таке як етанол) з швидкістю, яка щонайменше на 10 %, 15 %, 20 % або 25 % більше перевищує швидкість у нетрансформованого мікроорганізму. Приклади мікроорганізмів, які надекспресують один або декілька ферментів, залучених до пентозофосфатного шляху, включають: (i) мікроорганізми, трансформовані одним або декількома експресуючими векторами, що кодують одну або декілька з транскетолази, трансальдолази, рибозо-5-фосфаткетолізомерази і рибулозо-5-фосфат-3-епімерази; і (ii) мікроорганізми, трансформовані для підвищення регуляції експресії однієї або декількох 22 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 нуклеотидних послідовностей, що кодують одну або декілька з транскетолази, трансальдолази, рибозо-5-фосфаткетолізомерази і рибулозо-5-фосфат-3-епімерази (перед трансформацією вказаний мікроорганізм був здатний експресувати один або декілька з цих ферментів в даному наборі умов культивування в ході експонентного зростання, однак після трансформації вказаний мікроорганізм здатний надекспресувати один або декілька з цих ферментів на більш високому рівні, в тих же умовах культивування, в процесі експонентного зростання). ВАРІАНТИ/ГОМОЛОГИ/ПОХІДНІ Даний винахід належить до застосування варіантів, гомологів і похідних будь-якої амінокислотної послідовності білка або будь-якої нуклеотидної послідовності, яка кодує такий білок. Зокрема, даний винахід належить до застосування варіантів, гомологів і похідних амінокислотної послідовності, яка кодується SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 або SEQ ID NO: 20. Крім того, даний винахід належить до застосування варіантів, гомологів і похідних нуклеотидної послідовності, яка кодує амінокислотну послідовність, представлену як SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 або SEQ ID NO: 20; і нуклеотидної послідовності, представленої як SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 27 або SEQ ID NO: 28. Наприклад, варіант, гомолог і похідне нуклеотидної послідовності (такої як SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 17, SEQ TD NO 12, SEQ ID NO: 27 або SEQ ID NO: 28; або нуклеотидна послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність, представлену як SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 або SEQ ID NO: 20), може містити аж до 30, 21, 15, 9, 6 або 3 замін в нуклеїновій кислоті. Наприклад, варіант, гомолог і похідне амінокислотної послідовності (такої як SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 або SEQ ID NO: 20) може містити аж до 10, 7, 5, 3, 2 або 1 амінокислотних замін. Без зв'язку з теорією, два амінокислотних залишки (а саме, D296 і D339) в ксилозоізомеразі можуть бути залучені до зв'язування двовалентних іонів металів в активному центрі (Meng, M. et al., 1993). У одному варіанті здійснення D296 і D339 важливі для зв'язування двовалентних іонів металів в активному центрі. Таким чином, в одному варіанті здійснення варіант, гомолог або похідне амінокислотної послідовності (такої як SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 або SEQ ID NO: 20) містить амінокислоту аспарагінову кислоту (D) в залишку 296 і/або амінокислоту аспарагінову кислоту (D) в залишку 339 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 і SEQ ID NO: 20 або еквівалентну заміну(и) в інших придатних амінокислотних послідовностях. Крім того, без зв'язку з теорією, амінокислотний залишок (гістидин 101) в ксилозоізомеразі може бути залучений до активного центра (Lee et al. 1989). У одному варіанті здійснення для активного центра важливий H101. Таким чином, в одному варіанті здійснення варіант, гомолог або похідне амінокислотної послідовності (такої як SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 або SEQ ID NO: 20) містить амінокислоту гістидин (Н) в залишку 101 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 і SEQ ID NO: 20 або еквівалентну заміну в інших придатних амінокислотних послідовностях. У одному варіанті здійснення варіант, гомолог або похідне амінокислотної послідовності (такої як SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 або SEQ ID NO: 20) містить амінокислоту аргінін (R) в залишку 391 і/або амінокислоту лізин (K) в залишку 407 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 і SEQ ID NO: 20 або еквівалентні заміни в інших придатних амінокислотних послідовностях. У одному варіанті здійснення варіант, гомолог і похідному нуклеотидної послідовності (такої як SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 27 або SEQ ID NO: 28; або нуклеотидна послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність, представлену як SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 або SEQ ID NO: 20) містить зміни, що мовчать, в послідовності кодонів для того, щоб послідовність була оптимізована переважними кодонами для конкретної клітини-хазяїна, в якій послідовність експресується. Наприклад, використання кодонів в послідовності можна оптимізувати на основі таблиці використання кодонів дріжджами з бази даних використання кодонів Kazusa (Nakamura et al., 2000). У цьому документі термін "гомолог" означає молекулу, що має деяку гомологію з амінокислотними послідовностями, що розглядаються, і нуклеотидними послідовностями, що розглядаються. У цьому документі термін "гомологія" може бути ототожнений з "ідентичністю". 23 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У даному контексті мають на увазі, що гомологічна послідовність включає амінокислотну послідовність, яка може бути щонайменше на 75, 80, 85 або 90 % ідентичною; переважно щонайменше на 95, 96, 97, 98 або 99 % ідентичною послідовності, що розглядається; і у найбільш переважному варіанті здійснення щонайменше на 98, 99 або 99,5 % ідентична послідовності, що розглядається. Як правило, гомолог містить ті ж активні центри і т.д., що і амінокислотна послідовність, що розглядається. Хоч гомологію також можна розглядати з точки зору схожості (тобто амінокислотні залишки, що мають схожі хімічні властивості/функцію), в контексті даного винаходу переважно виражати гомологію з точки зору ідентичності послідовностей. У даному контексті мають на увазі, що гомологічна послідовність включає нуклеотидну послідовність, яка може бути щонайменше на 75, 80, 85 або 90 % ідентичною; переважно щонайменше на 95, 96, 97, 98 або 99 % ідентичною послідовності, що розглядається; і у найбільш переважному варіанті здійснення щонайменше на 98, 99 або 99,5 % ідентична послідовності, що розглядається. Як правило, гомолог містить ті ж послідовності, які кодують активні центри і т.д., що і амінокислотна послідовність, що розглядається. Хоч гомологію також можна розглядати з точки зору схожості (тобто амінокислотні залишки, що мають схожі хімічні властивості/функцію), в контексті даного винаходу переважно виражати гомологію за допомогою ідентичності послідовностей. Порівняння гомології можна проводити візуально, або більш часто, за допомогою легко доступних програм для порівняння послідовностей. Ці комерційно доступні комп'ютерні програми можуть обчислювати % гомологію між двома або більше послідовностями. % гомологію можна обчислювати протягом безперервних послідовностей, тобто одну послідовність вирівнюють з іншою послідовністю, і кожну амінокислоту в одній послідовності прямо порівнюють з відповідною амінокислотою в іншій послідовності, по одному залишку за один раз. Це називають вирівнюванням "без пропусків". Як правило, таке вирівнювання без пропусків проводять тільки протягом відносно короткої кількості залишків. Хоч цей спосіб є дуже простим і логічним, він не враховує, наприклад, того, що в ідентичній в іншому випадку парі послідовностей, одна вставка або делеція приведе до виключення подальших амінокислотних залишків з вирівнювання, таким чином, потенційно приводячи до великого зниження % гомології при проведенні глобального вирівнювання. Отже, більшість способів порівняння послідовностей призначені для проведення оптимальних вирівнювань, в яких враховуються можливі вставки і делеції без надмірного погіршення показника загальної гомології. Цього досягають внесенням "пропусків" при вирівнюванні послідовностей, щоб спробувати максимально збільшити локальну гомологію. Однак ці більш складні способи привласнюють "штрафи за пропуски" для кожного пропуску, який виникає при вирівнюванні, так що для одного і того ж числа ідентичних амінокислот, вирівнювання послідовностей з максимально малою можливою кількістю пропусків, яка відображає більш високу спорідненість між двома порівнюваними послідовностями, досягне більш високого показника, ніж вирівнювання з багатьма пропусками. Звичайно використовують "вартість афінного пропуску", яка привласнює відносно високу вартість для кожного існуючого пропуску і менший штраф для кожного подальшого залишку в пропуску. Ця система оцінки пропусків є найбільш широко використовуваною. Високі штрафи за пропуски безумовно будуть приводити до оптимізованого вирівнювання з меншою кількістю пропусків. Більшість програм для вирівнювання допускають модифікацію штрафів за пропуски. Однак при використанні такого програмного забезпечення для порівняння послідовностей переважно використовувати величини за умовчанням. Наприклад, при використанні пакету програм GCG Wisconsin Bestfit штраф за пропуск за умовчанням для амінокислотних послідовностей становить -12 для пропуску і -4 для кожного продовження. Обчислення максимальної % гомології, таким чином, по-перше вимагає проведення оптимального вирівнювання з урахуванням штрафів за пропуски. Придатною комп'ютерною програмою для проведення такого вирівнювання є пакет програм GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al. 1984 Nuc. Acids Research 12 p387). Приклади іншого програмного забезпечення, яке може проводити порівняння послідовностей, включають, але не обмежуються ними, пакет th програм BLAST (див. Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4 Ed-Chapter 18), FASTA (Altschul et al., 1990 J. Mol Biol. 403-410) і набір інструментів порівняння GENEWORKS. Як BLAST, так і FASTA, доступні для пошуку як в автономному, так і в інтерактивному режимі (див. Ausubel et al., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, pages 7-58 to 7-60). Однак для деяких застосувань переважно використовувати програму GCG Bestfit. Також для порівняння білкової і нуклеотидної послідовностей доступний новий інструмент, який називається BLAST 2 24 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 Sequences (див. FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 і tatiana@ncbi.nlm.nih.gov). Хоч кінцеву % гомологію можна вимірювати у величинах ідентичності, процес вирівнювання сам по собі, як правило, не оснований на попарному порівнянні за принципом "все або нічого". Замість цього, звичайно використовують масштабну оцінюючу схожість матрицю, яка привласнює бали кожному попарному порівнянню, виходячи зі схожості і еволюційної відстані. Прикладом такої широко використовуваної матриці є матриця BLOSUM62, матриця за умовчанням для набору програм BLAST. У програмах GCG Wisconsin звичайно використовуються або загальновідомі величини за умовчанням, або спеціальна таблиця порівняння символів, якщо вона надана (для подальших деталей див. керівництво користувача). Для деяких застосувань переважно використовувати загальновідомі величини за умовчанням для пакету програм GCG, або у разі іншого програмного забезпечення, матрицю за умовчанням, таку як BLOSUM62. Альтернативно, процентну гомологію можна обчислювати з використанням в елементі множинного вирівнювання в DNASISTM (Hitachi Software), на основі алгоритму, аналогічному CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244). Після проведення програмним забезпеченням оптимального вирівнювання, можна обчислити % гомологію, переважно % ідентичність послідовностей. Програмне забезпечення, як правило, здійснює це як частину порівняння послідовностей і видає числовий результат. Послідовності також можуть мати делеції, вставки або заміни амінокислотних залишків, які викликають зміни, що мовчать, і приводять до функціонально еквівалентної молекули. Навмисні амінокислотні заміни можна проводити, виходячи зі схожості в полярності, заряді, розчинності, гідрофобності, гідрофільності і/або амфіпатичної природи залишків, при умові, що повторна зв'язуюча активність речовини зберігається. Наприклад, негативно заряджені амінокислоти включають аспарагінову кислоту і глутамінову кислоту; позитивно заряджені амінокислоти включають лізин і аргінін; і амінокислоти з незарядженими полярними кінцевими групами, маючі схожі величини гідрофільності,включають лейцин, ізолейцин, валін, гліцин, аланін, аспарагін, глутамін, серин, треонін, фенілаланін і тирозин. Консервативні заміни можна проводити, наприклад, згідно з таблицею нижче. Амінокислоти в одному блоці у другій колонці і переважно в одному рядку в третій колонці можуть замінювати одна одну: Неполярні АЛІФАТИЧНІ Полярні - незаряджені Полярні - заряджені АРОМАТИЧНІ 35 40 45 50 GAP ILV CSTM NQ DE KR HFWY Даний винахід також належить до гомологічної заміни (як заміну, так і заміщення використовують в цьому документі для позначення обміну існуючого амінокислотного залишку альтернативним залишком), яка може відбуватися, тобто до заміни подібної на подібну, такої як основний на основну, кислотній на кислотну, полярній на полярну і т. д. Також може відбуватися негомологічна заміна, тобто заміна залишку одного класу на заміну залишку іншого класу, або що альтернативно залучає включення неприродних амінокислот, таких як орнітин (що надалі позначається як Z), діаміномасляна кислота орнітин (що надалі позначається як В), норлейцин орнітин (що надалі позначається як О), пірилаланін, тієнілаланін, нафтилаланін і фенилгліцин. Неприродні амінокислоти, на які можна проводити заміни, також включають; альфа*- і альфа-двозаміщені* амінокислоти, N-алкіламінокислоти*, молочну кислоту*, галогенідні похідні природних амінокислот, такі як трифтортирозин*, п-Cl-фенілаланін*, п-Br-фенілаланін*, п-Iфенілаланін*, L-аліл-гліцин*,β-аланін*, L-α-аміномасляну кислоту*, L-γ-аміномасляну кислоту*, # L-α-аміноізомасляну кислоту*, L-ε-амінокапроєву кислоту , 7-аміногептанову кислоту*, L#* # метіонінсульфон , L-норлейцин*, L-норвалін*, п-нітро-L-фенілаланін*, L-гідроксипролін , Lтіопролін*, метильні похідні фенілаланіну (Phe), такі як 4-метил-Phe*, пентаметил-Phe*, L-Phe (4-аміно)#, L-Tyr (метил)*, L-Phe (4-ізопропіл)*, L-Tic (1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-3-карбоксильну кислоту)*, L-діамінопропіонову кислоту# і L-Phe (4-бензил)*. Позначення * використовували для цілей представленого вище обговорення (позначення гомологічної або негомологічної заміни), щоб показати гідрофобну природу похідного, в той час як # використовували, щоб показати гідрофільну природу похідного, #* вказує на амфіпатичні властивості. 25 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Варіанти амінокислотних послідовностей можуть включати придатні спейсерні групи, які можуть бути вбудовані між двома амінокислотними залишками послідовності, включаючи алкільні групи, такі як метильна, етильна або пропільна групи, в доповнення до амінокислотних спейсерів, таких як залишки гліцину або β-аланіну. Наступна форма зміни, що включає присутність одного або декількох амінокислотних залишків в пептоїдній формі, буде добре зрозуміла фахівцям в даній галузі. Для усунення сумнівів, "пептоїдну форму" використовують для позначення варіантних амінокислотних залишків, де α-вуглецева група замісника знаходиться на залишку атома азоту, а не на α-вуглецю. Способи отримання пептидів в пептоїдній формі відомі в даній галузі, наприклад, Simon RJ el al., PNAS (1992) 89(20), 93679371 і Horwell DC, Trends Biolechnol. (1995) 13(4), 132-134. Нуклеотидні послідовності для застосування в даному винаході можуть включати синтетичні або модифіковані нуклеотиди. У даній галузі відомий ряд різних типів модифікації олігонуклеотидів. Вони включають метилфосфонатні і фосфоротіоатні основні ланцюги і/або додавання акридинових або полілізинових ланцюгів на 3'- і/або 5'-кінці молекули. Для цілей даного винаходу потрібно розуміти, що нуклеотидні послідовності, описані в цьому документі, можна модифікувати будьяким способом, доступним в даній галузі. Такі модифікації можна проводити для підвищення активності in vivo або збільшення часу існування нуклеотидних послідовностей за даним винаходом. Також даний винахід охоплює застосування нуклеотидних послідовностей, які комплементарні послідовностям, представленим в цьому документі, або їх будь-якому похідному, фрагменту або похідному. Якщо послідовність комплементарна її фрагменту, тоді цю послідовність можна використовувати як зонд для ідентифікації схожих кодуючих послідовностей в інших організмах і т.д. Полінуклеотиди, які не є на 100 % гомологічними послідовностям, згаданим в цьому документі, можна отримувати рядом способів. Інші варіанти послідовностей, описаних в цьому документі, можна отримувати, наприклад, за допомогою бібліотек ДНК-зондів. Крім того, можна отримувати інші гомологи, і такі гомологи і їх фрагменти, як правило, здатні селективно гібридизуватися з послідовностями, представленими в списку послідовностей цього документа. Такі послідовності можна отримувати за допомогою бібліотек кДНК-зондів із зондами, що містять всю будь-яку з послідовностей в прикладених списках послідовностей або її частину в умовах від середньої до високої суворості. Варіанти і штамові/видові гомологи також можна отримувати з використанням виродженої ПЛР, в якій використовуються праймери, призначені для націлювання на послідовності у варіантах і гомологах, що кодують консервативні амінокислотні послідовності, в послідовностях, згаданих в цьому документі. Консервативні послідовності можуть бути передбачені, наприклад, шляхом вирівнювання амінокислотних послідовностей з декількох варіантів/гомологів. Вирівнювання послідовностей можна проводити з використанням комп'ютерного програмного забезпечення, відомого в даній галузі. Наприклад, широко використовують програму GCG Wisconsin PileUp. Праймери, які використовуються для виродженої ПЛР, містять одне або декілька вироджених положень, і їх використовують в умовах більш низької суворості, ніж умови для клонування послідовностей з праймерами з єдиною послідовністю, відносно відомих послідовностей. Альтернативно, такі полінуклеотиди можна отримувати сайт-направленим мутагенезом охарактеризованих послідовностей. Це може бути придатно, коли, наприклад, потрібні зміни, що мовчать, послідовності кодонів для оптимізації в кодони, переважні для конкретної клітинихазяїна, в якій мають намір експресувати полінуклеотидні послідовності. Можуть бути бажаними інші зміни послідовності для внесення ділянок розпізнавання ферментами рестрикції, або для зміни властивості або функції поліпептидів, які кодуються полінуклеотидами. Полінуклеотиди (нуклеотидні послідовності), згадані в цьому документі, можна використовувати для отримання праймера, наприклад, праймера для ПЛР, праймера для альтернативної реакції ампліфікації, зонда, наприклад, міченого міткою, яка забезпечує виявлення, загальноприйнятими способами з використанням радіоактивних або нерадіоактивних міток, або полінуклеотиди можна клонувати у вектори. Такі праймери, зонди і інші фрагменти мають довжину щонайменше 15, переважне щонайменше 20, наприклад, щонайменше 25, 30 або 40 нуклеотидів, і також охоплюються терміном "полінуклеотиди", як використовують в цьому документі. Полінуклеотиди, такі як ДНК-полінуклеотиди і зонди, згадані в цьому документі, можна продукувати рекомбінантними способами, синтетичними способами або будь-якими способами, доступними фахівцям в даній галузі. Також їх можна клонувати стандартними способами. 26 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Як правило, праймери отримують синтетичними способами, що залучають покрокове отримання бажаної послідовності нуклеїнової кислоти по одному нуклеотиду за один раз. Способи проведення цього синтезу з використанням автоматизованих технологій широко доступні в даній галузі. Більш довгі полінуклеотиди звичайно можна отримувати з використанням рекомбінантних способів, наприклад, з використанням способів клонування на основі ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція). Праймери можна конструювати так, щоб вони містили придатні ділянки розпізнавання ферментом рестрикції, так щоб ампліфіковану ДНК можна було клонувати в придатний клонуючий вектор. Далі винахід описаний за допомогою прикладів, і мають на увазі, що вони служать для допомоги фахівцеві в даній галузі в здійсненні винаходу і не призначені для обмеження якимнебудь чином об'єму винаходу. ПРИКЛАДИ Загальні способи технології рекомбінантних ДНК У даному винаході використовуються, якщо немає інших вказівок, загальноприйняті способи хімії, молекулярної біології, мікробіології, рекомбінантних ДНК і імунологія, які знаходяться в межах здатностей фахівця в даній галузі. Такі способи пояснюються в літературі. Див., наприклад, J. B. Roe, J. Crabtree and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: А Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part А: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Sambrook J., et al. (1989) Molecular Cloning: А Laboratory Manual, 2nd ed., Vol. 1-3. Cold Spring Harbor Laboratory Press; і Ausubel F. M., et al. (1995 (і періодичні доповнення)) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. ch. 9, 13 and 16. John Wiley & Sons, New York, N.Y. Кожен з цих загальних довідників включений в цей документ як посилання. Організми: Lactococcus є сімейством грампозитивних бактерій, що звичайно зустрічаються у всіх частинах світу. Штами цього сімейства мають тривалу історію безпечного застосування для ферментації молочних продуктів для продукції, наприклад, сиру. Такий штам використовують в цих прикладах: штам Lactococcus lactis DSM 20175, який може бути отриманий в депозитарній установі DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German collection of Microorganisms and Cell Cultures). Saccharomyces являє собою сімейство дріжджових штамів, що звичайно зустрічаються у всіх частинах світу. Вони мають тривалу історію безпечного застосування для випікання, пивоваріння і виноробства, і в цей час є найбільш добре охарактеризованими еукаріотичними організмами. Таким чином, вони є дуже популярним організмом для експериментального застосування в молекулярно-біологічних і мікробіологічних лабораторіях. У прикладах цього документа використаний штам S. cerevisiae BY4741. Цей штам може бути отриманий від Euroscarf (EUROpean Saccharomyces Cerevisiae ARchive for Functional Analysis - Німеччина). Всі зі штаму S. cerevisiae T0040, штаму S. cerevisiae T0028, штаму S. cerevisiae T0049 і штаму S. cerevisiae T0004, використаних в представлених нижче прикладах, являють собою ізогенні варіанти, сконструйовані з BY4741, отриманого від Euroscarf. Escherichia coli являє собою грампозитивну бактерію, яка звичайно зустрічається в нижньому відділі кишечника вищих тварин і людини. Багато які штами цього організму мають тривалу історію безпечного застосування в мікробіологічних і молекулярно-біологічних лабораторіях. Штам, що використовується в представлених нижче прикладах, являє собою штам Е. coli DH5-alpha, що широко використовується в молекулярно-біологічних лабораторіях для клонування і розмноження генетичного матеріалу. Цей штам може бути отриманий від компанії "InVitrogen" (InVitrogen Corporation, Каліфорнія, США). Thermoanaerobacter являє собою сімейство термофільних анаеробно зростаючих грампозитивних бактерійних штамів. Обидва штами, ферменти з яких використовуються в представлених нижче прикладах, Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus (DSM no. 15750) і Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes (ATCC 33743) спочатку виділені з термальних джерел, DSM no. 15750 в Ayas, Туреччина, і ATCC 33743 в Yellowstone National Park, США. Вони можуть бути отримані з DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German collection of Microorganisms and Cell Cultures). Однак генетичний матеріал, що кодує ферменти з цих штамів і використаний в прикладах, отриманий синтетично на основі зворотної трансляції амінокислотних послідовностей, вказаних в списку послідовностей як SEQ ID NO: 15 і SEQ ID NO: 16. 27 UA 108468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Pichia stipitis являють собою вигляд дріжджів, які виділені з кишечників личинок комах і термітів. Штам Pichia stipitis, гени з якого використовували в представлених нижче прикладах, являє собою штам Pichia stipitis DSM no. 3651, який може бути отриманий з DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German collection of Microorganisms and Cell Cultures). Pseudomonas являють собою різноманітне сімейство паличкоподібних аеробних грамнегативних бактерій, що звичайно зустрічаються у воді і в насінні рослин і тканинах рослин. Штам, що використовується в цих прикладах, являє собою штам Pseudomonas syringae DSM 50315, спочатку виділений з порізаної рослинної тканини. Цей штам може бути отриманий з депозитарної установи DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German collection of Microorganisms and Cell Cultures). Приклад 1 - Конструювання штаму S. cerevisiae, який експресує XI Lactobacillus xylosus і ксилулозокіназу Pichia stipitis. Приклад 1a - клонування TOPO гена D-ксилозоізомерази з Lactobacillus xylosus (Lactococcus Metis, штам DSM 20175), з використанням послідовностей праймерів, які основані на послідовності з реєстраційним кодом NCBI AF092042 (SEQ ID NO: 1). Цілий ген D-ксилозоізомерази L. xylosus (Lx XI) піддавали ПЛР-ампліфікації з ДНК, отриманої з штаму DSM 20175 з використанням праймерів, позначених як SEQ ID NO: 2 і SEQ ID NO: 3. Кодуюча область гена ксилозоізомерази, клонованого за допомогою ПЛР з штаму Lactococcus lactis DSM 20175 з використанням праймерів, представлених в SEQ ID NO: 2 і SEQ ID NO: 3, представлена в SEQ ID NO: 17. Вносили ділянку рестрикції для NheI, проксимальний ATG-ініціюючому кодону, і ділянку рестрикції для XhoI, дистальніше стоп-кодону, фланкуючі генів Lx XI. Як матрицю використовували ДНК з L. xylosus в концентрації 0,2 нг/мкл реакційної суміші для ПЛР. ПЛР проводили в 30 циклах з 30 секунд при 96 °C, 30 секунд при 50 °C і 150 секунд при 72 °C, з подальшою кінцевою інкубацією протягом 10 хвилин при 72 °C з використанням високоточної ДНК-полімерази Phusion High Fidelity DNA-polymerase (Finnzymes Oy, Фінляндія). Продукт ПЛР піддавали електрофоретичному розділенню на 1 % легкоплавкому агарозному гелі і виділяли фрагмент розміром 1339 т. п. н. Фрагмент ДНК піддавали клонуванню TOPO у вектор PCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen, США) згідно з інструкціями виготівника, і отриману плазміду використовували для трансформації Е. coli TOP10. Плазміда була названа PCR-Blunt 2 LxXI. Приклад 1b - Конструювання плазміди LxXI-2a, що містить ген ксилозоізомерази L. xylosus (LxXI) під контролем промотору GPD і термінатора CYC1 з S. cerevisiae. Висококопійний човниковий вектор Е. coli/S. cerevisiae P426-GPD (Mumberg et al., 1995) розщеплювали за допомогою SpeI і XhoI, і отримані кінці дефосфорилували лужною фосфатазою. Аналогічно, фрагмент ДНК, що кодує ген ксилозоізомерази L. xylosus вивільняли з вектора PCR-Blunt 2 LxXI (описаного в прикладі 1a) розщепленням за допомогою NheI і XhoI. Отриману лінеаризовану плазміду P426-GPD і фрагмент ДНК, що кодує ThXI, піддавали електрофоретичному розділенню на 1 % легкоплавкому агарозному гелі і виділяли. Два фрагменти ДНК лігували з отриманням плазміди, названої LxXI-2a. Приклад 1c - клонування TOPO гена D-ксилулокінази з штаму Pichia stipitis DSM36S1 на основі послідовності з реєстраційним кодом NCBI AF127802. Цілий ген D-ксилулокінази P. stipitis (PsXKS) піддавали ПЛР-ампліфікації з ДНК, отриманої зі штаму DSM3651 з використанням праймерів, вказаних в SEQ ID NO: 4 і SEQ ID NO: 5. Вносили ділянку рестрикції для NheI, проксимальний ATG-ініціюючому кодону, і ділянку рестрикції для XhoI, дистальніше стоп-кодону, фланкуючі генів PsXKS. Як матрицю використовували ДНК з Р. stipitis в концентрації 0,2 нг/мкл реакційної суміші для ПЛР. ПЛР проводили в 30 циклах з 30 секунд при 96 °C, 30 секунд при 50 °C і 150 секунд при 72 °C, з подальшою кінцевою інкубацією протягом 10 хвилин при 72 °C з використанням високоточної ДНК-полімерази Phusion High Fidelity DNA-polymerase (Finnzymes Oy, Фінляндія). Продукт ПЛР піддавали електрофоретичному розділенню на 1 % легкоплавкому агарозному гелі, і виділяли фрагмент розміром 1891 т. п. н. Фрагмент ДНК піддавали клонуванню TOPO у вектор PCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen, США) згідно з інструкціями виготівника, і отриману плазміду використовували для трансформації Е. coli TOP10. Плазміда була названа PCR-Blunt 2 P.stip XKS. Приклад 1d - Конструювання плазміди PsXKS-14a, що містить ген D-ксилулокінази (PsXKS) Р. stipitis під контролем промотору GPD і термінатора CYC1 з S. cerevisiae. Висококопійний човниковий вектор Е. coli/S. cerevisiae P426-GPD (Mumberg et al., 1995) розщеплювали за допомогою SpeI і XhoI, і отримані кінці дефосфорилували лужною фосфатазою. Аналогічно, фрагмент ДНК, що кодує ген ксилулозокінази Р. stipitis вивільняли з вектора PCR-Blunt 2 P.stip XKS (описаного в прикладі 1a) розщепленням за допомогою NheI і 28