Моноклональне антитіло і спосіб його застосування

Реферат: Винахід належить до гуманізованого антитіла проти CD6 ізотипу IgGl (Tlh), яке зв'язується з цистеїн-збагаченим доменом 1 (D1) фагоцитарного рецептора (SRCR) CD6, присутнього на поверхні епітеліальних клітин тимуса, моноцитів, активованих Т-клітин та ряду клітин інших типів. UA 104587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь, до якої належить винахід Цей винахід стосується гуманізованого антитіла проти CD6 ізотипу IgGl (T1h), яке зв'язується зі цистеїн-збагаченим доменом 1 (D1) фагоцитарного рецептора (SRCR) білка CD6, присутнього на поверхні епітеліальних клітин тимуса, моноцитів, активованих T-клітин та цілого ряду клітин інших типів. Цей винахід також стосується способів пригнічення проліферації Tклітин без блокування взаємодії CD6 та природних лігандів CD6, подібних до факторів клітинної адгезії активованих лейкоцитів (ALCAM). Цей винахід також стосується способу лікування різних захворювань із застосуванням антитіла проти CD6, яке зв'язується із SRCR доменом 1 (D1) білка CD6. Передумови створення винаходу CD6 являє собою важливий білок, який знаходиться на поверхні клітин і експресується головним чином людськими T-клітинами та субпопуляцією B-клітин, а при певних B-клітинних хронічних лімфоцитарних лейкозах також і нейронами [Aruffo el al., J. Exp. Med. 1991, 174:949; Kamoun et al., J. Immunol. 1981, 127:987; Mayer el al., J. Neuroimmunol. 1990. 29:193]. CD6 є членом великої родини білків, особливістю яких є присутність щонайменше одного домену, гомологічного збагаченому цистеїном домену фагоцитарного рецептора (SRCR) макрофагів типу I [Matsumoto, el al., J. Exp. Med. 1991, 173:55 та Resnick et al., Trends Biochem. Sci. 1994; 195]. Іншими членами цієї родини є CD5 [Jones et al., Nature. 1986, 323:346]; циклофілін C [Friedman el al. 1993, PNAS 90:6815]; фактор комплементу I, які зв'язують білки C3b та C4b активованого комплементу [Goldberger, et al., J. Biol. Chem. 1987, 262:10065]; WC-I великої рогатої худоби, експресовані тау/дельта T-клітинами [Wijingaard el al., J. Immunol. 1992, 149:3273] та M130 [Law et al., Eur. J. Immunol. 1993, 23:2320], маркер активації макрофагів. Результати досліджень із блокування, що були проведені із застосуванням моноклональних антитіл (mAb) проти CD6, дозволяють зробити припущення про те, що CD6 відіграє важливу роль у розвитку T-клітин шляхом регуляції адгезивних взаємодій T-клітин з епітеліальними клітинами тимуса (TE) [Patel et al., J. Exp. Med. 1995 181:1563-1568]. Додаткові дослідження показали, що CD6 може функціонувати як важлива допоміжна молекула при активації T-клітин. Наприклад, певні моноклональні антитіла проти CD6 є безпосередньо мітогенними для T-клітин [Gangemi et al., J. Immunol. 1989, 143:2439 та Boll et al.,1993 Int. Immunol, 7:783], у той час як інші є здатними костимулювати проліферацію T-клітин у поєднанні з антитілом проти CD3, антитілом проти CD2 або форбол-12-міристат-13-ацетатом (PMA) [Gangemi et al, J. Immunol. 1989, 143:2439; Morimoto et al, J. Immunol. 1988, 140:2165-2170; та Osorio et al., Cell. Immunol. 1994, 154:23]. Ще одним додатковим свідченням на користь ролі CD6 у активації T-клітин є результати досліджень, які демонструють, що CD6 стає гіперфосфорилованим на залишках Ser та Thr [Swack et al, Mol. Immunol. 1989 26:1037-1049 та J. Biol. Chem. 1991, 266:7137; Cardenas et al., J. Immunol. 1990, 145:1450-1455] та фосфорилованим на залишках Tyr [Wee et al., J. Exp. Med. 1993, 177:219-223] після активації T-клітин. У цих та інших дослідженнях висловлена думка про те, що CD6 є важливим модулятором функцій як незрілих, так і зрілих T-клітин in vivo, який впливає як на активацію, так і на трансдукцію сигналів T-клітин. Позаклітинний домен зрілого білка CD6 складається з трьох SRCR доменів (які нижче позначені як D1, D2 та D3). D3 відповідає проксимальному до мембрани SRCR домену, за яким йде коротка "стеблова" ділянка, яка складається з 33 амінокислот. Ці позаклітинні домени прикріплені до клітинної мембрани за допомогою короткого трансмембранного домену, за яким йде цитоплазматичний домен змінної довжини [Aruffo et al., J. Exp. Med. 1991, 174:949]. В результаті досліджень із застосуванням гібридних білків CD6-імуноглобуліну, які містили вибрані позаклітинні домени CD6, злиті з константними доменами людського IgG1 (CD6-Rgs), був ідентифікований і клонований ліганд CD6, позначений як "фактори клітинної адгезії активованих лейкоцитів" (ALCAM) [Wee, et al., Cell Immunol. 1994, 158:353-364; Patel, et al., J. Exp. Med. 1995. 181:1563-1568; Bowen et al., J. Exp. Med. 1995, 181:2213-2220]. ALCAM зв'язується з доменом 3 білка CD6, який відповідає проксимальному до мембрани SRCR домену [Whitney, et al., J. Biol. Chem. 1995, 270: 18187-18190]. Дослідження ролі взаємодії CD6 з ALCAM у регуляції T-клітин показали, що ця пара рецептор-ліганд здатна опосередковувати адгезію клітин, які експресують CD6, до епітеліальних клітин тимуса [Bowen et al., J. Exp. Med. 1995, 181:2213]. Ці та інші свідчення дозволяють припустити, що взаємодія CD6 з ALCAM є важливою для модулювання розвитку та активування T-клітин. Незважаючи на те, що визначення функціональних властивостей CD6 залишається неповним, моноклональне антитіло проти CD6 було успішно застосоване за клінічних умов для очищення кісткового мозку від T-клітин та попередників T-клітин. Встановлення того факту, що у пацієнтів, які одержують алогенний кістковий мозок, оброблений антитілом проти CD6, 1 UA 104587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 реєструється невелика кількість випадків виникнення реакції "трансплантат проти хазяїна" у поєднанні з високим рівнем приживлення трансплантата [Soiffer R.J., 1993, Bone Marrow Transplant.; 12 Suppl. 3:S7-10], призвело до відкриття невеликої CD6-негативної субпопуляції Tклітин периферичної крові (5-6 %) (Rasmussen. J. Immunol. 1994, 152: 527-536). Субпопуляція CD6-негативних T-клітин демонструвала нижчу алогенну реактивність у реакціях змішаної + культури лімфоцитів (MLR) у порівнянні з нормальними CD6 T-клітинами (Rasmussen. J. Immunol. 1994, 152: 527-536). Визначення функціональних властивостей цих CD6-негативних Tклітин також показало, що вони не реагують на алогенну стимуляцію, але можуть проліферувати при стимулюванні фітогемаглютиніном (PHA). Ці дані також підтверджують гіпотезу про те, що CD6 відіграє важливу роль у модулюванні функціонування T-клітин in vivo. Повідомляють також, що CD6 є частиною імунологічного синапсу, який опосередковує ранню та пізню взаємодію T-клітин та антигенпрезентуючих клітин (APC). (Gimferrer I. J. Immunol. 2004, 173: 2262-2270). Молекула CD6 N-глікозилується сайтом, чутливим до протеаз, і має внутрішньоланцюгові дисульфідні зв'язки. У опублікованих раніше повідомленнях зазначено, що CD6 існує у двох молекулярних формах: фосфорилованій формі (105 кДа) у спочиваючих T-клітинах і гіперфосфорилованій формі (130 кДа) у клітинах після активування протеїнкінази C стимулятором пухлинного росту, форбол-12-міристат-13-ацетатом (PMA) (Osorio M., Cellular Immunology, 1994, 154:123-133). В патенті США № 6,372,215, зміст якого включений до цього опису шляхом посилання, описані антитіла та інші зв'язувальні засоби, які специфічно зв'язуються з SRCR доменами 3 (D3) людського CD6 (hCD6) або "стеблової" ділянки людського CD6 (CD6S) і пригнічують зв'язування факторів клітинної адгезії активованих лейкоцитів (ALCAM) з CD6. У заявці на патент Куби 250/2006 від 26 грудня 2006 року під назвою "Pharmaceutical composition comprising the anti CD6 monoclonal antibody useful for the diagnosis and treatment of Rheumatoid Arthritis" зазначено, що T1h зв'язується з CD6 без пригнічення зв'язування CD6 з лігандом ALCAM. Зміст цієї заявки включений до цього опису шляхом посилання. Антитіло проти CD6 за цим винаходом запобігає активуванню T-клітин пригніченням проліферації T-клітин шляхом зв'язування з доменом, незалежним від домену, який взаємодіє з відомим лігандом CD6, саме ALCAM. У більш ранніх публікаціях та патентах описані послідовності мишачого моноклонального антитіла проти CD6 (IOR-T1) і амінокислотні модифікації, які були здійснені для гуманізації IORTl до T1h (гуманізоване IOR-T1). У патенті США № 5,712,120 та його аналозі EP 0699755 описані специфічні способи гуманізації мишачих моноклональних антитіл та послідовності антитіла IOR-T1 та антитіла T1h. У патенті США № 6,572,857 та його аналозі EP 0807125 описані послідовності антитіла IOR-T1 та антитіла T1h (гуманізоване IOR-T1). У публікації [Roque-Navarro L., et al., Hybridoma and Hybridomics 2003. 22:245-257] описані специфічні способи гуманізації мишачих моноклональних антитіл та послідовності антитіла IOR-T1 та антитіла T1h. Певні аспекти цього винаходу стосуються амінокислотних послідовностей варіабельної ділянки важкого і легкого ланцюга T1h. В цих аспектах встановлені нуклеотидна та амінокислотна послідовності T1h у тому вигляді, у якому вони експресуються клітинною лінією, яка застосовується для одержання T1h. Моноклональне антитіло за цим винаходом є здатним до зв'язування з доменом 1 (D1) CD6 і пригнічення проліферації T-клітин без перешкоджання зв'язуванню з ALCAM. Моноклональне антитіло за цим винаходом не індукує комплементзалежну цитотоксичність (CDC), антитілозалежну цитотоксичність (ADCC) та апоптоз in vitro. Мета винаходу Важливою метою цього винаходу є одержання моноклонального антитіла, здатного до зв'язування з доменом 1 (D1) CD6 та пригнічення проліферації T-клітин без перешкоджання зв'язуванню з ALCAM. Іншою важливою метою цього винаходу є створення способу модулювання запальних станів із застосуванням згаданого моноклонального антитіла. Ще одною важливою метою цього винаходу є створення способу модулювання запальних станів із застосуванням згаданого моноклонального антитіла у комбінації з імунодепресивними засобами. І ще одною важливою метою цього винаходу є створення способу модулювання запальних станів із застосуванням згаданого моноклонального антитіла у комбінації зі здатними до викликання протизапальної імунної реакції антигенами, такими як інсулін, GAD (декарбоксилаза глутамінової кислоти), MOG (мієліновий олігодендроцитний глікопротеїн), MBP (основний 2 UA 104587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мієліновий білок) та HSP60 (білок теплового шоку). Суть винаходу Відповідно, цей винахід стосується моноклонального антитіла, здатного до зв'язування з доменом 1 (D1) CD6 та до пригнічення проліферації T-клітин без перешкоджання зв'язуванню з ALCAM; способу модулювання запальних станів, таких як псоріаз, ревматоїдний артрит, або аутоімунних реакцій у пацієнтів, таких як побічні реакції, пов'язані із розсіяним склерозом або відторгненням трансплантата, реакцією "трансплантат проти хазяїна", діабетом типу I, псоріазом, шкірною Т-клітинною лімфомою, тироїдитом та іншими аутоімунними захворюваннями, опосередкованими Т-клітинами, із застосуванням згаданого моноклонального антитіла; способу модулювання запальних станів, таких як псоріаз, ревматоїдний артрит, або аутоімунних реакцій у пацієнтів, таких як побічні реакції, пов'язані з розсіяним склерозом або відторгненням трансплантата, реакцією "трансплантат проти хазяїна", діабетом типу I, псоріазом, шкірною Т-клітинною лімфомою, тироїдитом та іншими аутоімунними захворюваннями, опосередкованими Т-клітинами, із застосуванням згаданого моноклонального антитіла у комбінації з імунодепресивними засобами; та способу модулювання запальних станів, таких як розсіяний склероз або відторгнення трансплантата, реакція "трансплантат проти хазяїна", діабет типу I, із застосуванням згаданого моноклонального антитіла у комбінації зі здатними до викликання протизапальної імунної реакції антигенами, такими як інсулін, GAD, MOG, MBP та HSP60. Короткий опис прикладених фігур Фіг. 1: Фіг. 1a: Нуклеотидна послідовність VH та Vk T1h з плазмідної та геномної ДНК. Фіг. 1b: Амінокислотна послідовність VH та Vk. Фіг. 1c: Порівняння амінокислотної послідовності Vk, описаної у більш ранніх публікаціях, з послідовністю, розкритою у цьому патенті, для показу відмінностей послідовностей. Фіг. 2: Дані імуноферментного твердофазного аналізу (ELISA), проведеного на планшеті, сенсибілізованому CD6-Fc у присутності T1h та ALCAM або самого по собі T1h. Фіг. 3: Якщо MEM 98, антитіло, яке зв'язується з доменом 1 (Castro AA. M. et al., J. of Immunol., 178 (2007) 4351-4361), конкурує з T1h, то спостерігається дозозалежна конкуренція, що дозволяє зробити припущення про те, що обидва антитіла зв'язуються з одним і тим самим доменом, а саме доменом 1. Фіг. 4: Клітини лінії HUT 78, оброблені антитілом T1h (5 мкг/мл), антитілом hR3 (5 мкг/мл) та рапаміцином (1,2 мкг/мл) або без антитіла (як контроль) та інкубовані протягом ночі при температурі 37C у CO2-інкубаторі. Після цього клітини були оброблені розчином анексину V для мічення з подальшим протоковоцитометричним аналізом. Горизонтальна вісь – логарифм кількості анексин V-позитивних клітин у каналі FITC, вертикальна вісь – PI/PE техаський червоний. Фіг. 5: Калібраційний графік Sphero для каналу FITC. Фіг. 6: Густина рецепторів CD6 на T- та B-лімфоцитах різних здорових суб'єктів. T-клітини + демонструють у 10 разів більшу кількість рецепторів CD6, ніж CD6 B-клітини. Фіг. 7: ADCC аналізували із застосуванням ритуксану як позитивного контролю на клітинах лінії Daudi. Клітини лінії Daudi мітили CFSE, та інкубували з ритуксаном (2,5 мкг/мл, 5 мкг/мл, 10 мкг/мл) або без нього; hR3 (10 мкг/мл) застосовували як неспецифічний контроль, і PBMC застосовували як ефекторні клітини у відношенні 1:25, 1:50, 1:100. Згадані клітини інкубували протягом 6 год. 7AAD застосовували для виявлення цитотоксичних клітин. Клітини аналізували засобами CYAN ADP протокової цитометрії. Фіг. 8: Результати аналізу ADCC на клітинах лінії Daudi із застосуванням ритуксану на двовимірному точковому графіку. Фіг. 9: Результати аналізу ADCC на клітинах лінії HUT 78 із застосуванням T1h (5 мкг/мл) на двовимірному точковому графіку. Фіг. 10: Роль T1h у аналізі ADCC. Клітини лінії HUT 78 мітили CFSE, та інкубували з антитілом T1h або без нього; hR3 застосовували як неспецифічний контроль, і PBMC застосовували як ефекторні клітини у відношенні кількості клітин-мішеней до кількості ефекторних клітин, яка становила 1:1, 1:25, 1:50. Клітини-мішені та ефекторні клітини інкубували протягом ночі. 7AAD застосовували для виявлення цитотоксичних клітин. Клітини аналізували засобами протокової цитометрії. Фіг. 11: Роль T1h у аналізі ADCC. Клітини лінії HUT 78 мітили CFSE, та інкубували з антитілом T1h (5 мкг/мл та 10 мкг/мл) або без нього; hR3 (10 мкг/мл) застосовували як неспецифічний контроль, і PBMC застосовували як ефекторні клітини у відношенні 1:1, 1:25, 1:50. Клітини-мішені та ефекторні клітини інкубували протягом ночі. 7AAD застосовували для 3 UA104587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виявлення цитотоксичних клітин. Клітини аналізували засобами протокової цитометрії. Фіг. 12: Графіки a, b та c, d ілюструють два незалежні експерименти з 5 мкг/мл та 10 мкг/мл, відповідно, T1h та hR3 (неспецифічне антитіло), відповідно. На цих графіках показаний відсоток мертвих клітин при різних співвідношеннях кількості клітин-мішеней до кількості ефекторних клітин. Фіг. 13: Різниця ступеня цитотоксичності між ритуксаном та T1h у аналізі CDC із застосуванням аламарового синього. Фіг. 14: Гістограма CFSE, яка показує інтенсивність флуоресценції нестимульованих та фітогемаглютинін (PHA-M)-стимульованих клітин. FITC log по горизонтальній осі, кількість клітин по вертикальній осі. Ділянка (R 14) над піками використовувалась для підрахунку явищ як проліферації. Фіг. 15: Дозозалежне пригнічення лімфоцитів T1h у вигляді стовпчикової діаграми. На фігурі показаний відсоток пригнічення PHA-активованих лімфоцитів антитілом T1h у різних концентраціях (50 мкг/мл, 25 мкг/мл, 12,5 мкг/мл, 6,25 мкг/мл). hR3 (неспецифічне антитіло) застосовували з тією самою концентрацією. Фіг. 16: Повторення попереднього експерименту у вигляді незалежного експерименту. Дозозалежне пригнічення лімфоцитів антитілом T1h. На фігурі показаний відсоток пригнічення PHA-активованих лімфоцитів антитілом T1h у різних концентраціях (50 мкг/мл, 25 мкг/мл, 12,5 мкг/мл, 6,25 мкг/мл). hR3 (неспецифічне антитіло) застосовували з тією самою концентрацією. Фіг. 17: Присутність розчинного T1h (з концентрацією 10 мкг/мл) значно пригнічувала PHAопосередковану проліферацію лімфоцитів при проведенні аналізу із застосуванням аламарового синього на 96-лунковому планшеті. Фіг. 18: Схема планшета для проведення експериментів з кон'югованими антитілами: з антитілом проти CD3, антитілом проти CD3+T1h та антитілом проти CD3+ALCAM-Fc. Фіг. 19: Порівняння впливу на проліферацію лімфоцитів антитілом sT1h та shR3 (10 мкг/мл), відповідно, у присутності кон'югованого антитіла проти CD3, антитіла проти CD3+T1h та антитіла проти CD3+ALCAM-Fc. Як зазначено у методиці, застосовували різні кількості кон'югованого антитіла проти CD3 з фіксованою концентрацією T1h або ALCAM. Фіг. 20: Пробіт-аналіз попередніх даних, де нижня лінія – експериментальна крива, яку одержали з різними концентраціями антитіла проти CD3, ALCAM-Fc або антитіла проти CD6, відповідно. Штрих-пунктирна лінія – прогнозована крива, якщо досліджувана комбінація чинить адитивний вплив. Верхня лінія – крива, яку одержали експериментальним шляхом і яка у обох випадках проходить вище теоретично прогнозованої кривої, вказуючи на те, що досліджувана комбінація чинить синергічний вплив. Фіг. 21: Проліферація наївних T-клітин, індукована IL2 у різних концентраціях. Розчинне T1h та розчинне hR3 не демонстрували будь-якого впливу. PHA додають як позитивний контроль. Фіг. 22: Кон'юговане CD3 та CD3+ALCAM-Fc спричинювали проліферацію лімфоцитів, яка пригнічувалась розчинним T1h. IL2 разом із розчинним T1h продемонстрували часткове повернення пригнічення до норми за обох умов. Фіг. 23: Рівень експресії IL10, INFγ, IL6 та TNF зменшується розчинним T1h, порівняно з контролем (розчинне неспецифічне антитіло hR3), як у лунці з кон'югованим антитілом проти CD3, так і у лунці з кон'югованим антитілом проти CD3+ALCAM. Екзогенний IL2, який додавали разом із розчинним T1h, демонструє часткове повернення пригнічення до норми, що надає можливість висунути припущення про те, що пригнічення розчинного T1h опосередковується пригніченням IL2. На графіках показані середні значення двох незалежних експериментів. Фіг. 24: Спостерігається часткове зниження абсолютної кількості клітин, які експресують CD4 та CD25, у присутності розчинного T1h (sTlh), яка повертається до норми при додаванні sT1h та екзогенного IL2. Однак за середнім значенням інтенсивності флуоресценції, яке може корелюватись з абсолютною кількістю рецепторів, спостерігається значне зменшення MFI для CD4, і зменшення ще більш очевидне для CD25. Обидва згадані зменшення можуть бути повністю або частково повернені до норми, відповідно, шляхом додавання екзогенного IL2 (1,2 нг/мл). Це явище спостерігається як у лунках із кон'югованим антитілом проти CD3, так і у лунках із кон'югованим антитілом проти CD3 та ALCAM-Fc. Фіг. 25: Пригнічення проліферації розчинним T1h не опосередковується підвищеним апоптозом. PI-позитивні клітини є некротичними клітинами, у той час як анексин V FITCпозитивні клітини є апоптозними клітинами, а позитивними у обох випадках є пізні апоптозні клітини. З наведених даних випливає, що у порівнянні з контролем не спостерігається значного підвищення або зменшення кожного з параметрів загибелі при різних комбінаціях. Фіг. 26: PBMC обробляли антитілом T1h (10 мкг/мл), hR3 (ізотиповий контроль) або без антитіла (як контроль), та інкубували протягом 5 днів при температурі 37C у CO2-інкубаторі. 4 UA 104587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перед проведенням інкубування клітини стимулювали токсоїдом правця. Ступінь проліферації визначали із застосуванням барвника аламарового синього. У присутності T1h пригнічення проліферації не спостерігалось. Фіг. 27: Raji-клітини виявлені у цьому випадку із застосуванням імунофлуоресценції, згаданої вище (методика II), як справжні B-клітини, які також експресують антигени MHC класу II. Фіг. 28: PBMC проліферують у присутності Raji-клітин, оброблених мітоміцином. Позитивний контроль показує, що PBMC ростуть у присутності PHA. sT1h пригнічує проліферацію T-клітин (значною мірою, за t-критерієм Стьюдента), порівняно з відсутністю антитіла або у присутності контролю hR3. У кожному експерименті наведене середнє значення та середнє квадратичне відхилення, одержані із використанням даних із шести різних лунок. Фіг. 29: Реакція змішаної культури лімфоцитів та алогенних дендритних клітин – схема планшета. Фіг. 30: Реакція змішаної культури лімфоцитів та алогенних дендритних клітин із застосуванням T1h показує дозозалежне пригнічення PBMC. Позитивний контроль, пімекролімус, який є відомим інгібітором IL2, пригнічував проліферацію з усіма випробуваними концентраціями. Негативний контроль hR3 був подібним до експериментального контролю. Вісь Y – інтенсивність флуоресценції у відносних одиницях (RFU). Фіг. 31: Реакція змішаної культури лімфоцитів та алогенних дендритних клітин. Визначення рівнів цитокінів. IL6 та INFγ пригнічуються дозозалежним чином антитілом T1h, а також пімекролімусом, відомим інгібітором IL2. Короткий опис прикладених лістингів послідовностей SEQ ID NO: 1: Амінокислотна послідовність VH SEQ ID NO: 2: Амінокислотна послідовність VK SEQ ID NO: 3: Нуклеотидна (ДНК) послідовність VH SEQ ID NO: 4: Нуклеотидна (ДНК) послідовність VK Докладний опис винаходу Цей винахід стосується моноклонального антитіла, здатного до зв'язування з доменом 1 (D1) CD6 та до пригнічення проліферації T-клітин без перешкоджання зв'язуванню з ALCAM. У іншому варіанті здійснення цього винаходу згадане моноклональне антитіло містить амінокислотну послідовність, яка є на щонайменше 80 % гомологічною амінокислотній послідовності, представленій послідовністю SEQ ID NO: 1 або послідовністю SEQ ID NO: 2. У ще одному варіанті здійснення цього винаходу згадане моноклональне антитіло містить амінокислотну послідовність, яка є на щонайменше 80 % гомологічною нуклеотидній послідовності, представленій послідовністю SEQ ID NO: 3 або послідовністю SEQ ID NO: 4. У ще одному варіанті здійснення цього винаходу згадане антитіло не індукує комплементзалежну цитотоксичність (CDC) in vitro. У ще одному варіанті здійснення цього винаходу згадане антитіло не індукує антитілозалежну цитотоксичність (ADCC) in vitro. У ще одному варіанті здійснення цього винаходу згадане антитіло не індукує апоптоз in vitro. У ще одному варіанті здійснення цього винаходу згадане антитіло пригнічує проліферацію наївних PBMC (мононуклеари периферичної крові), індуковану кон'югованим антитілом проти CD3; комбінацією кон'югованого антитіла проти CD3 та антитіла проти CD6 або комбінацією кон'югованого антитіла проти CD3 та ALCAM. У ще одному варіанті здійснення цього винаходу згадане антитіло специфічно пригнічує односпрямовану MLR (реакція змішаної культури лімфоцитів), де Raji-клітини є антигенпрезентуючими клітинами, а PBMC проліферують. У ще одному варіанті здійснення цього винаходу згадане антитіло специфічно пригнічує односпрямовану аутологічну MLR, опосередковану PBMC. У ще одному варіанті здійснення цього винаходу згадане антитіло спричиняє пригнічення проліферації наївних Т-клітин шляхом значного зменшення рівня прозапальних цитокінів. У ще одному варіанті здійснення цього винаходу згадане антитіло спричиняє пригнічення проліферації наївних Т-клітин шляхом зменшення кількості CD25 та CD4. У ще одному варіанті здійснення цього винаходу згадане антитіло пригнічує проліферацію Тклітин шляхом опосередкування супресії IL2. У ще одному варіанті здійснення цього винаходу згадане антитіло демонструє посилення функціональної активності з додаванням екзогенного IL2. У ще одному варіанті здійснення цього винаходу згадане антитіло приймає участь у даунрегуляції прозапальних цитокінів IL6 та INFγ. У ще одному варіанті здійснення цього винаходу згадане антитіло не пригнічує популяції Тклітин пам'яті. 5 UA 104587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід стосується способу модулювання запальних станів, таких як псоріаз, ревматоїдний артрит, або аутоімунних реакцій у пацієнтів, таких як побічні реакції, пов'язані із розсіяним склерозом або відторгненням трансплантата, реакцією "трансплантат проти хазяїна", діабетом типу I, псоріазом, шкірною Т-клітинною лімфомою, тироїдитом та іншими аутоімунними захворюваннями, опосередкованими Т-клітинами, із застосуванням згаданого моноклонального антитіла. Цей винахід стосується способу модулювання запальних станів, таких як псоріаз, ревматоїдний артрит, або аутоімунних реакцій у пацієнтів, таких як побічні реакції, пов'язані з розсіяним склерозом або відторгненням трансплантата, реакцією "трансплантат проти хазяїна", діабетом типу I, псоріазом, шкірною Т-клітинною лімфомою, тироїдитом та іншими аутоімунними захворюваннями, опосередкованими Т-клітинами, із застосуванням згаданого моноклонального антитіла у комбінації з імунодепресивними засобами. Цей винахід стосується способу модулювання запальних станів, таких як розсіяний склероз або відторгнення трансплантата, реакція "трансплантат проти хазяїна", діабет типу I, із застосуванням згаданого моноклонального антитіла у комбінації зі здатними до викликання протизапальної імунної реакції антигенами, такими як інсулін, GAD, MOG, MBP та HSP60. У іншому варіанті здійснення цього винаходу згаданий спосіб включає введення в організм пацієнта терапевтично або фармацевтично ефективної кількості зв'язувального антитіла проти CD6, яке специфічно зв'язується з SRCR доменом 1 (D1) людського CD6 і не пригнічує зв'язування ALCAM з hCD6. У ще одному варіанті здійснення цього винаходу згадана фармацевтично ефективна доза становить 0,1-25 мг/кг на тиждень. У ще одному варіанті здійснення цього винаходу згадане моноклональне антитіло представлено амінокислотною послідовністю, яка є на щонайменше 80 % гомологічною амінокислотній послідовності, представленій послідовністю SEQ ID NO: 1 або послідовністю SEQ ID NO: 2. У ще одному варіанті здійснення цього винаходу згадане моноклональне антитіло представлено нуклеотидною послідовністю, яка є на щонайменше 80 % гомологічною нуклеотидній послідовності, представленій послідовністю SEQ ID NO: 3 або послідовністю SEQ ID NO: 4. Принципи цього винаходу будуть пояснені із посиланням на докладний опис варіантів здійснення цього винаходу, яким віддається перевага, разом з наведеними нижче прикладами. Наведені нижче приклади призначені для полегшення розуміння цього винаходу, і не призначені та не повинні розглядатись як такі, що якимось чином обмежують обсяг цього винаходу. Згадані Приклади не охоплюють докладних описів традиційних способів, які застосовуються у методиках аналізу. Такі способи є добре відомими фахівцям у цій галузі і описані у численних публікаціях, включених до цього опису як приклади. Якщо не зазначено інше, наукові та технічні терміни, вжиті у зв'язку з цим винаходом, будуть мати значення, які традиційно розуміються фахівцями у цій галузі. Крім того, якщо це не вимагається контекстом, терміни у однині будуть охоплювати множину, а терміни у множині будуть охоплювати однину. При описуванні та складанні формули цього винаходу наведена нижче термінологія буде вжита відповідно до наведених у цьому описі визначень. Термін "антитіло проти CD6" означає антитіло, яке специфічно зв'язується з SRCR доменом 1 (D1) людського CD6 (hCD6). У аспектах цього винаходу, яким віддається перевага, запропоновані антитіла та інші імуноглобуліни, у тому числі нативні та штучно модифіковані антитіла та фрагменти антитіл, які специфічно зв'язуються з SRCR доменом 1 людського CD6 і не перешкоджають зв'язуванню факторів клітинної адгезії активованих лейкоцитів (ALCAM) із CD6. Термін "моноклональне антитіло T1h" за цим винаходом охоплює також антитіло, яке містить важкий ланцюг та/або легкий ланцюг, який має амінокислотну послідовність, яку одержали з амінокислотної послідовності важкого ланцюга або легкого ланцюга, які входять до складу антитіла, шляхом делеції, заміни або додання однієї або декількох амінокислот. Вищезгадана часткова амінокислотна модифікація (делеція, заміна, інсерція або додання) може поширюватись на амінокислотну послідовність антитіла за цим винаходом шляхом часткового модифікування нуклеотидної послідовності, яка кодує амінокислотну послідовність. Таке часткове модифікування нуклеотидної послідовності може бути здійснене за стандартним способом із застосуванням відомих форм сайтспецифічного мутагенезу (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1984 Vol. 81: 5662). Один із варіантів здійснення цього винаходу, якому віддається перевага, являє собою 6 UA 104587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 моноклональне антитіло, яке специфічно зв'язується зі цистеїн-збагаченим доменом 1 (D1) фагоцитарного рецептора (SRCR) CD6, який містить варіабельну ділянку важкого ланцюга та легкого ланцюга, яка містить амінокислотну послідовність, яка є на щонайменше 80 % гомологічною амінокислотній послідовності, представленій послідовністю SEQ ID NO: 1 та послідовністю SEQ ID NO: 2. Інший варіант здійснення цього винаходу, якому віддається перевага, являє собою моноклональне антитіло, яке специфічно зв'язується зі цистеїн-збагаченим доменом 1 (D1) фагоцитарного рецептора (SRCR) CD6, який містить варіабельну ділянку важкого ланцюга та легкого ланцюга, яка містить нуклеотидну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 3 або її доповненням; та (b) нуклеїновокислотну молекулу, яка містить нуклеотидну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 4 або її доповненням. За одним із варіантів здійснення цього винаходу варіант T1h антитіла проти CD6 за цим винаходом, який специфічно зв'язується зі цистеїн-збагаченим доменом 1 (D1) фагоцитарного рецептора (SRCR) CD6, буде мати щонайменше приблизно 65 % ідентичність або гомологічність амінокислотної послідовності, щонайменше приблизно 70 % ідентичність або гомологічність амінокислотної послідовності, щонайменше приблизно 75 % ідентичність або гомологічність амінокислотної послідовності, щонайменше приблизно 80 % ідентичність або гомологічність амінокислотної послідовності, щонайменше приблизно 85 % ідентичність або гомологічність амінокислотної послідовності, щонайменше приблизно 90 % ідентичність або гомологічність амінокислотної послідовності, щонайменше приблизно 95 % ідентичність або гомологічність амінокислотної послідовності, щонайменше приблизно 98 % ідентичність або гомологічність амінокислотної послідовності, або щонайменше приблизно 99 % ідентичність або гомологічність амінокислотної послідовності у частині, яка відповідає амінокислотним залишкам, представленим послідовностями SEQ ID NO: 1 та SEQ ID NO: 2. Антитіло за цим винаходом не індукує комплементзалежну цитотоксичність (CDC) in vitro. Антитіло за цим винаходом не індукує антитілозалежну цитотоксичність (ADCC) in vitro. Антитіло за цим винаходом не індукує апоптоз in vitro. У іншому аспекті цей винахід також пропонує профілактичний, терапевтичний або діагностичний засіб для різних захворювань, у тому числі аутоімунних розладів, який містить як активний інгредієнт антитіло за цим винаходом або його функціональний фрагмент. Термін "антитілозалежна цитотоксичність (ADCC)" означає цитотоксичність типу, що індукується активацією макрофагів, природних клітин-кілерів, нейтрофілів або подібних клітин, які розпізнаються в результаті зв'язування константних ділянок антитіл з Fc-рецепторами, які експресуються на поверхні вищезгаданих клітин. На відміну від цього, термін "комплементзалежна цитотоксичність (CDC)" означає цитотоксичність типу, що індукується активацією системи комплементу, що відбувається в результаті зв'язування антитіла з антигеном. Відомо, що інтенсивність цих активностей змінюється у залежності від підкласів антитіл. Відомо також, що такі відмінності обумовлюються структурними відмінностями константних ділянок антитіл (Charles A. Janeway et al., Immunobiology, 1997, Current Biology Ltd/Garland Publishing Inc.). У інших варіантах здійснення цього винаходу розкриті нуклеотидна та амінокислотна послідовності варіабельної ділянки важкого та легкого ланцюга антитіла T1h. Цим встановлюється нуклеотидна та амінокислотна послідовність антитіла T1h у тому вигляді, у якому вона експресується лінією клітин, яка застосовується для виготовлення T1h. Для ідентифікування інших зв'язувальних засобів, які специфічно зв'язують hCD6, запропоновані методи скринінгу. Ці методи потребують введення в контакт еталонного моноклонального антитіла проти людського CD6 (hCD6), яке специфічно зв'язується з SRCR доменом 1 (D1) людського CD6 і не пригнічує зв'язування ALCAM з hCD6. Коли різні концентрації ALCAM-Fc були інкубовані при фіксованій концентрації T1h на планшеті для проведення ELISA, сенсибілізованому CD6-Fc, то антитіло T1h було виявлено при усіх концентраціях ALCAM-Fc. Цей експеримент дозволяє зробити припущення про те, що T1h зв'язується з доменом, який відрізняється від домену для зв'язування ALCAM (Домен 3). Коли MEM 98, антитіло, яке зв'язується з доменом 1 [Castro AA.M. et al., J. of Immunol., 178 (2007) 4351-4361], конкурує з T1h, спостерігається дозозалежна конкуренція, що дозволяє зробити припущення про те, що обидва зв'язуються з одним і тим самим доменом, а саме доменом 1. У інших аспектах цього винаходу запропоновані способи модулювання запальних станів, таких як запальні стани при розсіяному склерозі, відторгненні трансплантата, реакції "трансплантат проти хазяїна" (GvHD) та діабет типу I. Моноклональне антитіло T1h є здатним до пригнічення проліферації наївних T-клітин, яке спостерігається у реакції змішаної культури 7 UA 104587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лімфоцитів, у дослідженні опосередкованої PHA проліферації PBMC, а також проліферації PBMC у присутності кон'югованого антитіла проти CD3 та антитіла проти CD3+ALCAM-Fc. Згадане антитіло зменшує рівень прозапальних цитокінів і зменшує експресію рецептора IL2 (CD25) та CD4 на клітинах. Діабет типу I є інсулінозалежним і вважається аутоімунним захворюванням, опосередкованим T-клітинами. Тому припускається, що антитіло T1h має функцію, яка полягає у запобіганні зменшенню кількості базофільних інсулоцитів (β клітин) шляхом втручання у процес проліферації аутореактивних T-клітин. Якщо маса цих клітин є інтактною, то в результаті цього буде зменшена залежність від інсуліну. Таким чином, можливо, що, відповідно до профілю дії антитіла T1h, воно може бути ефективним у випадку діабету типу I в результаті стимулювання протизапальної реакції у комбінації з інсуліном, декарбоксилазою глутамінової кислоти (GAD) та білком теплового шоку 60 (HSP60). Поширюючи ту саму логіку, логічно буде припустити, що згадана молекула може працювати ефективніше з глюкагоноподібним пептидом-1 (GLPl) або його спорідненим міметиком ексендином-4, можливо, адитивним або навіть синергічним чином. GLP-1 та ексендин-4 посилюють опосередковане глюкозою виділення інсуліну, знижують рівні глюкагонів та підвищують рівні β клітин шляхом пригнічення апоптозу та стимулювання неогенезу цих клітин. T1h може бути ефективним у випадку розсіяного склерозу у комбінації з основним мієліновим білком (MBP) або мієліновим олігодендроцитним глікопротеїном (MOG). Крім того, T1h у комбінації з іншими невеликими молекулами, які відіграють протизапальну та імунодепресивну ролі, такими як сиролімус (Sirolimus), такролімус (Tacrolimus) та мофетил мікофенолату, може чинити специфічну терапевтичну сприятливу дію у випадку аутоімунних розладів, відторгнення трансплантата та GvHD. Ці способи включають введення в організм пацієнта терапевтично або фармацевтично ефективної кількості зв'язувального засобу проти CD6, який специфічно зв'язується з SRCR доменом 1 (D1) людського CD6 і не пригнічує зв'язування ALCAM з hCD6. Зв'язувальними засобами проти CD6, яким віддається перевага, для застосування у цих способах є моноклональні антитіла, у тому числі гуманізовані та людські моноклональні антитіла, а також модифіковані імуноглобуліни, такі як фрагменти антитіл та мутагенізовані форми нативних антитіл, які мають значну ідентичність амінокислотної послідовності з відповідним нативним антитілом і значною мірою поділяють із ним ту саму зв'язувальну специфічність. У інших аспектах цього винаходу запропоновані діагностичні композиції та способи + виявлення CD6, CD6 клітин та/або CD6-опосередкованої активності, наприклад, активності CD6, пов'язаної з активацією T-клітин, у in vitro та in vivo аналізах. У цих способах подібним чином застосовують зв'язувальні засоби проти CD6, які специфічно зв'язуються з SRCR доменом 1 (D1) людського CD6 і не пригнічують зв'язування ALCAM з hCD6. Різні функціональні властивості антитіла за цим винаходом можуть бути перевірені із застосуванням цілого ряду методів, у тому числі (але без обмеження ними) із застосуванням таких методів, в яких застосовують in vitro аналізи, in vivo аналізи, аналізи на основі клітин та селекційні методи. Багато властивостей можуть бути перевірені одночасно або окремо. Білки можуть бути очищені або неочищені, у залежності від вимог аналізу. У одному із варіантів здійснення перевірка являє собою якісний або кількісний зв'язувальний аналіз на зв'язування антитіл проти CD6 із молекулою білка, що, як відомо або вважається, зв'язує антитіло проти CD6. Такі аналізи часто включають моніторинг реакції клітин на антитіло проти CD6, наприклад, виживаність клітин, загибель клітин, клітинний фагоцитоз, лізис клітин, зміну клітинної морфології або транскрипційну активацію, таку як експресія клітинами природного гена або репортерного гена. Наприклад, такі аналізи можуть визначати здатність антитіл проти CD6 до викликання ADCC або CDC. Для певних аналізів можуть знадобитись додаткові клітини або компоненти, тобто крім клітин-мішеней, наприклад, сироватковий комплемент або ефекторні клітини, такі як моноцити периферичної крові (PBMC), природні клітини-кілери, макрофаги тощо. Оптимальні дози та схеми приймання лікарського засобу можуть бути легко визначені фахівцями у цій галузі, і вони будуть відрізнятись у залежності від фармакодинамічних властивостей конкретного засобу, часу та способу його введення, ефективності лікарського засобу та прогресування захворювання (у тому числі природи та ступеня розвитку симптомів згаданого захворювання). Крім того, фактори, пов'язані з конкретним пацієнтом, який зазнає лікування, у тому числі стать, вік, маса, раціон, фізична активність та супутні захворювання пацієнта, будуть обумовлювати необхідність у регулюванні доз та/або схем приймання. Фармацевтично ефективна доза становить 0,1-25 мг/кг на тиждень. Біологічні властивості антитіл проти CD6 за цим винаходом можуть бути визначені експериментами на рівні клітин, тканин та організму у цілому. Як відомо у цій галузі, лікарські 8 UA 104587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 засоби часто випробовують на тваринах, у тому числі (але без обмеження) на мишах, пацюках, кроликах, собаках, кішках, свинях та мавпах, для визначення ефективності лікарського засобу при лікуванні хвороби, або на моделі захворювання чи для визначення фармакокінетичних, токсичних та інших властивостей лікарського засобу. Вищенаведений опис винаходу ілюструє та характеризує цей винахід. Крім того, опис винаходу показує та характеризує репрезентативні варіанти здійснення винаходу, яким віддається перевага, але, як згадується вище, слід розуміти, що цей винахід може бути застосований у різноманітних інших комбінаціях, модифікаціях та середовищах і може бути змінений або модифікований із використанням винахідницьких ідей, розкритих у цьому описі, відповідно до поданого вище опису та/або відповідно до знань чи квалификації фахівця у відповідній галузі. Варіанти здійснення, опис яких наведений нижче, також призначені для пояснення найкращих способів практичного здійснення цього винаходу та надання можливості фахівцям у цій галузі застосувати цей винахід у таких або інших варіантах здійснення та з різними модифікаціями, яких потребують конкретні варіанти застосування цього винаходу. Таким чином, цей опис не призначений для обмеження цього винаходу формою, яка розкривається у цьому описі. Передбачається також, що пункти прикладеної формули винаходу повинні розглядатись як такі, що охоплюють альтернативні варіанти здійснення. 1. Нуклеотидна (як геномна, так і плазмідна) та амінокислотна послідовність T1h Для визначення нуклеотидної послідовності T1h були здійснені численні полімеразноланцюгові реакції із застосуванням геномної та плазмідної ДНК як матриці. Геномну ДНК одержали з клітин лінії NSO, які експресують T1h. Амінокислотну послідовність визначили із застосуванням ESI-TOF (електрон-стимульована іонізація з часопролітним аналізатором) та MALDI-TOF (мас-спектрометрія з іонізацією методом лазерної десорбції у матричному розчині з часопролітним аналізатором). Для визначення кінцевої амінокислотної послідовності вдались до пептидного картування із застосуванням різних ферментів, у тому числі трипсину, Lys-C та Glu-C. Послідовність, показана на Фіг. 1, у певній мірі відрізняється від вже опублікованої послідовності T1h у патенті США № 5712120, його аналозі EP 0699755, патенті США № 6572857 та його аналозі EP 0807125. Було встановлено, що послідовність, розкрита у цьому патенті, має повну функціональну активність стосовно своєї мішені, білка CD6, як вказано у численних прикладах, наведених нижче. 2. T1h зв'язується з доменом 1 (D1) рецептора CD6 Результати аналізу ELISA чітко показали, що присутність ALCAM у різних концентраціях не перешкоджає зв'язуванню T1h із CD6-Fc. Відсутність конкуренції між ALCAM та T1h дозволяє припустити, що обидва згадані засоби мають різні зв'язувальні домени. Коли MEM 98, антитіло, яке зв'язується з доменом 1 (D1) [Castro AA.M. et al., J. of Immunol., 178 (2007) 4351-4361], конкурує з T1h, спостерігається дозозалежна конкуренція, що дозволяє зробити припущення про те, що обидва антитіла зв'язуються з одним і тим самим доменом, а саме доменом 1. 3. T1h не індукує апоптоз у клітин HUT 78 Однією з ознак апоптозу є транслокація фосфотидилсерину (PS) з внутрішньої частини плазматичної мембрани до зовнішньої [J. Biol. Chem. 1990. 265: 4923-4928]. Аналіз фосфотидилсерину на зовнішньому листку апоптозної клітинної мембрани здійснюють із застосуванням анексину-V-флуоресцеїну та пропідію йодиду (PI) для диференціювання 2+ апоптозних та некротичних клітин. Анексин V являє собою Ca -залежний фосфоліпідзв'язувальний білок із високою спорідненістю до фосфотидилсерину [J. Immunol. Methods 1995. 184: 39-51]. У той час як PI зв'язується з явно некротичними клітинами, анексинV-флуоресцеїн зв'язується з апоптозними клітинами. Цей метод допомагає відрізнити популяції апоптозних та некротичних клітин. Рання апоптозна популяція є лише анексин V-позитивною, у той час як пізня апоптозна популяція є як анексин V-позитивною, так і PI-позитивною. У цьому експерименті винахідники виявили, що T1h має обмежений апоптозний потенціал у клітин HUT78, лінії клітин T-лімфоми, яка експресує CD6. Клітини HUT 78, оброблені T1h, продемонстрували 40 % апоптозу, що майже дорівнює відповідному показнику необробленого контролю на каналі анексин V FITC. Необроблені клітини та неспецифічний ізотиповий контроль, клітини, оброблені hR3 (моноклональне антитіло, яке зв'язується з EGFR (рецептор епідермального фактору росту)), продемонстрували 35,3 % та 36,5 % апоптозу, відповідно, у той час як позитивний контроль (рапаміцин) продемонстрував 54,3 % апоптозу. Ці дані дозволяють припустити, що T1h не опосередковує апоптоз у лінії клітин HUT 78. + 4. CD6 T- та B-клітини демонструють різницю у експресії рецепторів CD6 Тимоцити, зрілі Т-клітини, субпопуляція B-клітин, яку називають підтипом B-1, та певні клітини головного мозку експресують CD6 [J. Exp. Med. 1991. 174: 949-952; J. Immunol. 1997. 9 UA 104587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 158: 1149-1156]. Мета експерименту полягає у кількісному визначенні густини рецепторів та різниці експресії CD6 у T- і B-клітин, відповідно. Результати експериментів дозволяють зробити припущення про те, що густина рецепторів CD6 на T-клітинах є у 10 разів більшою, порівняно з B-клітинами. Цей спосіб не претендує на кількісне визначення абсолютної густини рецепторів, оскільки насичувальні кількості антитіл не застосовувались. Однак різниця у параметрах експресії у T- і B-клітин є чітко розрізнюваною. 5. T1h індукує слабку ADCC (антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність) Коли антитіло зв'язується з клітинами-мішенями або інфікованими клітинами, то Fc-ділянка антитіла зв'язується з Fc-рецепторами, присутніми на поверхні згаданих клітин, зокрема, природних клітин-кілерів (NK). Це потім спричиняє активацію згаданих клітин. Ці активовані клітини виділяють цитокіни та цитотоксичні гранули і стимулюють загибель клітин шляхом ініціювання апоптозу. Це явище відоме як антитілозалежна клітинноопосередкована цитотоксичність (ADCC). У цьому винаході популяцію клітин-мішеней (HUT 78/Daudi) мітять клітиносортувальним барвником CFSE (сукцинімідиловий складний ефір карбоксифлуоресцеїндіацетату). Згаданий барвник CFSE на основі флуоресцеїну має біохімічні властивості, які роблять його особливо добре придатним для мічення живих клітин [J. Immunol. Methods 2000. 243: 147-154]. До складу CFSE входять молекула флуоресцеїну, яка містить дві ацетатні складові та сукцинімідилскладноефірну функціональну групу. У цій формі він є мембранопроникним і нефлуоресцентним. Після дифузії у внутрішньоклітинне середовище ендогенні естерази видаляють ацетатні групи, в результаті чого згадані молекули стають високофлуоресцентними та непроникними для клітинної мембрани [J. Immunol. Methods 2000. 243: 147-154]. Клітинимішені, клітини лінії HUT 78, інкубують у присутності або за відсутності антитіла T1h. Ефекторні клітини (PBMC, зібрані методом центрифугування у градієнті густини Ficoll paque) додають у різних відношеннях (співвідношення кількості клітин-мішеней до кількості ефекторних клітин: 1:1, 1:25, 1:50, 1:100), та інкубують при температурі 37C протягом оптимального періоду часу. Для визначення загибелі клітин застосовують 7AAD. 7 аміноактиноміцин D (7AAD) проникає у мертву клітину і зв'язується з ДНК. Клітини, мічені CFSE, пропускають через дискримінаційне вікно клітинного сортера для визначення антитілоопосередкованої клітинної цитотоксичності клітин-мішеней. Клітини лінії Daudi застосовували для оцінювання аналізу із застосуванням ритуксану (Rituxan), який, як добре відомо, має сильну ADCC активність. Ритуксан протягом 6 год. продемонстрував більшу ніж 50 % цитотоксичність. У подібних умовах чотири незалежні експерименти показали, що при інкубуванні протягом ночі у присутності ефекторних клітин антитіло T1h індукує слабку ADCC у клітин лінії HUT 78. 6. T1h не опосередковує комплементзалежну цитотоксичність (CDC) Аналіз на основі аламарового синього (ресазурин (Resazurin)) застосовують для визначення здатності антитіла до стимулювання лізису клітин. Лізис індукують шляхом зв'язування антитіла з поверхневоклітинним антигеном, що спричиняє зв'язування та активацію комплементу, результатом чого є лізис клітини-мішені. Ресазурин є редокс-активним барвником, який при відновленні змінює забарвлення із синього на рожеве. Останні дані дозволяють припустити, що ресазурин проникає у цитоплазму клітин, де відновлюється до флуоресцентного продукту з подальшим зворотним виділенням у середовище [Eur. J. Biochem. 2000. 267: 5421-5426]. Результати цих експериментів переконливо доводять, що згадане антитіло не індукує CDC у лінії клітин, що експресує CD6, а саме у HUT 78. 7. T1h пригнічує PHA-опосередковану проліферацію лімфоцитів Фітогемаглютинін (PHA-M) застосовують для стимулювання поділу клітин у культурах лімфоцитів. PHA, лектиновий екстракт квасолі звичайної (Phaseolus vulgaris), містить сильнодіючі цитоаглютинуючі та мітогенні активності [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1982. 79: 16111615]. PHA містить родину п'яти ізолектинів (L4E0, L3E1, L2E2, L1E3, L0E4), кожен з яких являє собою тетрамер, який сукупно утримується нековалентними силами. Субодиниці належать до двох різних типів, позначених як лейкоцитарний (L) та еритроцитарний (E). Субодиниця L-типу має високу спорідненість до поверхневих рецепторів лімфоцитів, але низьку до поверхневих рецепторів еритроцитів, і несе відповідальність за мітогенні властивості ізолектинів. Субодиниця E-типу несе відповідальність за властивості аглютинування еритроцитів. PHA-P являє собою білкову форму, а PHA-M є мукопротеїновою формою цих ізолектинів [J. Biol. Chem. 1977. 252: 9018-9023]. PBMC мітять клітиносортувальним барвником CFSE (сукцинімідиловий складний ефір карбоксифлуоресцеїндіацетату). Після цього клітини інкубують з антитілом або без нього у різних концентраціях. Клітини стимулюють фітогемаглютиніном (PHA) для проліферації протягом трьох днів при температурі 37C. У процесі проліферації клітин CFSE рівномірно 10 UA 104587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розподіляється у дочірніх клітинах, де кожна наступна генерація буде мати половину інтенсивності флуоресценції клітин [J. Immunol. Methods 1994. 171: 131-137]. Відсоток пригнічення проліферації вважається впливом антитіла. Відсоток пригнічення проліферації оцінюють за такою формулою [{PHA-(T1h+PHA)}/PHA]100, де PHA означає проліферацію, індуковану PHA, T1h+PHA означає проліферацію, індуковану присутністю T1h та PHA. Ці дані дозволяють зробити припущення про те, що антитіло T1h опосередковує пригнічення проліферації PHA-стимульованих лімфоцитів дозозалежним чином. Відсоток пригнічення може відрізнятись у окремих суб'єктів, що спричинено природною відмінністю інтактних суб'єктів. Однак загальне дозозалежне пригнічення PHA-стимульованих лімфоцитів спостерігалось при застосуванні антитіла T1h, а при застосуванні неспецифічного антитіла hR3 ізотипу IgGl згадане пригнічення не спостерігалось. 8. T1h пригнічує PHA-опосередковану проліферацію лімфоцитів навіть у аналізі на основі аламарового синього на 96-лунковому планшеті У методику попереднього експерименту були внесені зміни, які полягали у застосуванні високопродуктивного планшетного аналізу, де свіжозібрані PBMC інкубують у 96-лункових планшетах з T1h або неспецифічним антитілом hR3 ізотипу IgGl або без них. Потім протягом трьох днів додають PHA для стимулювання проліферації лімфоцитів. Проліферацію визначають із застосуванням аламарового синього. Критерієм значущості є t-критерій Стьюдента. Результати цього випробування підтверджують той факт, що PHA-опосередкована проліферація лімфоцитів значною мірою пригнічується у присутності розчинного T1h, але не пригнічується у присутності неспецифічного антитіла hR3 ізотипу IgGl. Цей факт, разом із даними попереднього експерименту, вказує на роль T1h у пригніченні проліферації наївних Tклітин. 9. T1h зменшує проліферацію лімфоцитів, індуковану кон'югованим антитілом проти CD3, антитілом проти CD3+T1h та антитілом проти CD3+ALCAM Fc Відомо, що стимулювання через рецептор T-клітин (TCR) та костимуляторні рецептори ініціює переключення диференціації T-клітин з латентної стадії (стадії спочивання) на активовану стадію, особливістю якої є великі швидкості росту та проліферації, а також набуття ефекторної функції [Immunity 2007. 27: 173-178]. Рецептор людського CD6 являє собою глікопротеїн типу 1 (105-130 кДа), який експресується на незрілих тимоцитах, зрілих T-клітинах та клітинах субпопуляції B-лімфоцитів, яку називають субпопуляцією B1a, у різних ділянках головного мозку, а також у випадку хронічного B-клітинного лімфоцитарного лейкозу [J. Immunol. 2006. 177: 1152-1159]. CD6 є членом групи B SRCR суперродини білкових рецепторів, що випливає з присутності на його позаклітинній ділянці трьох збагачених цистеїном доменів довжиною від 100 амінокислот до 110 амінокислот, що є характерним для згаданої родини [J. Exp. Med. 5 1991. 174: 949-952]. Доступні дані вказують на те, що CD6 являє собою допоміжну молекулу, яка приймає участь у модулюванні процесів активації та диференціації лімфоцитів [J. Immunol. 2006. 177: 1152-1159]. На тимоцитах та спочиваючих зрілих T-клітинах CD6 частково зв'язується з комплексом TCR/CD3 [J. Immunol. 2004. 173: 2262-2270] та з CD5, близьким членом SRCR суперродини [J. Biol. Chem. 2003. 278: 8564-8571]. Крім того, CD6 накопичується у центральній частині зрілого імунологічного синапсу (IS), де він колокалізується з TCR/CD3 та CD5. Припускається також причетність CD6 до ранньої взаємодії T-клітин та APC, які впливають на визрівання IS, а також на проліферативні реакції T-клітин [J. Immunol. 2006. 177: 1152-1159, Eur. J. Immunol. 2004. 34: 930-940]. Однозначно встановлено, що оптимальна активація T-клітин, яка призводить до проліферації клітин, потребує щонайменше два стимуляторні сигнали. Один з них охоплює комплекс TCR-CD3, який розпізнає фрагменти пептидів, зв'язані з молекулами головного комплексу гістосумісності (MHC) класу I або класу II на антигенпрезентуючих клітинах (APC); другий сигнал, який не є антиген-специфічним, був названий стимуляторним або допоміжним сигналом, оскільки він, хоча і є основним, не спричиняє сам по собі проліферацію Т-клітин [Immunology 1998. 93: 358-365]. Були ідентифіковані декілька потенційних рецепторів костимуляторних сигналів та їх лігандів. Вони охоплюють взаємодії між CD4 та молекулами MHC класу II, CD8 з молекулами MHC класу I, CD2 з антигеном-3, асоційованим із лімфоцитарною функцією, CD5 з CD72, CD28 з B7-1/B7-2, а також CD6 з лігандом CD6 (D166 або ALCAM) [Immunology 1998. 93: 358-365; Curr. Opin. Immunol. 1995. 7: 389-395]. Існують літературні дані щодо впливу кон'югованого антитіла проти CD3 з антитілом або без нього на костимуляторну молекулу, результатом якого є проліферація лімфоцитів. При стимулюванні CD3, окремо або зшитого з CD2 або CD4, CD6 стає тимчасово фосфорилованим на двох крайніх C-кінцевих залишках тирозину (Y629 та Y662) [J. Exp. Med. 1993. 177: 219-223]. Таким чином, було показано, що CD6-опосередкований вплив на проліферацію Т-клітин 11 UA 104587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 охоплює тирозинкіназну активність, яка залежить від активації PKC (протеїнкіназа C) [Cell Immunol. 1995. 166: 44-52]. Незважаючи на те, що параметри шляху передавання сигналу CD6 визначені гірше за відповідні параметри CD28, іншої костимуляторної молекули, існують певні подібності між впливами цих двох поверхневоклітинних антигенів. Наприклад, лігування будьякого одного з двох згаданих рецепторів, посилене сигналами через комплекс TCR, стимулює проліферацію T-клітин [J. Immunol. 1989. 143: 2439-2447]. Вони можуть також ініціювати проліферацію T-клітин у присутності тканинного плазміногенного активатора (TPA), результатом чого є пригнічення рецепторів IL-2 (IL-2R) та мРНК IL-2 [Cell Immunol. 1995. 166: 44-52, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989. 86: 1333-1337]. Було показано також, що кон'югування антитіла проти CD6 та антитіла проти CD28 спричинювало проліферацію спочиваючих лімфоцитів незалежно від стимулювання антитілом проти CD3 [Immunology 1998. 93: 358-365]. У цьому винаході винахідники показали, що розчинне антитіло T1h пригнічує проліферацію T-клітин, опосередковану кон'югованим антитілом проти CD3, антитілом проти CD3+T1h та антитілом проти CD3+ALCAM Fc. Фактично винахідники визначили, що комбінація антитіла проти CD3+T1h та антитіла проти CD3+ALCAM є по суті синергічною на відміну від самого по собі антитіла проти CD3, про що свідчать результати пробіт-аналізу даних. Крім того, винахідники визначили, що додання стороннього IL2 (1,25 нг/мл) спричиняє часткове повернення до норми пригнічення проліферації Т-клітин, опосередкованого розчинним антитілом T1h. Аналізом цитокінів винахідники показали, що T1h переважно пригнічує γинтерферон (IFNγ), IL10 та TNF (фактор некрозу пухлин), і додання стороннього IL2 спричиняє часткове повернення до норми цих прозапальних цитокінів. Результати оцінювання густини рецепторів CD25 та CD4 у проліферуючих лімфоцитів дозволяють зробити припущення про те, що розчинний T1h спричиняє пригнічення обох цих маркерів, у той час як сторонній IL2 частково повертає до норми експресію цих маркерів. Ці дані у сукупності дозволяють зробити припущення про те, що T1h пригнічує проліферацію Т-клітин шляхом пригнічення прозапальних цитокінів, наприклад, гамма-інтерферону (IFNγ), і шляхом зниження експресії рецепторів IL2. Оскільки додання стороннього IL2 спричиняє часткове "посилення функціональної активності", результати, отримані винахідниками, як видається, дозволяють зробити припущення про те, що T1h може пригнічувати синтез IL2, опосередкований кон'югованим антитілом проти CD3, антитілом проти CD3+кон'юговане антитіло T1h та антитілом проти CD3+кон'югований ALCAM Fc. 9a. Титрування IL2 у наївних PBMC (мононуклеари периферичної крові) IL2 являє собою цитокін, який є необхідним і достатнімдля активування Т-клітин. Він передає сигнал через рецептор IL2, який він активує. Він відіграє критичну роль у розвитку Тклітин, Т-клітин імунологічної пам'яті та у розвитку регуляторних Т-клітин [J. Immunol. 1995. 155: 1151-1164]. За результатами цього експерименту у подальших експериментах застосовували оптимальну концентрацію IL2, яка становить 1,25 нг/мл. 9b. T1h спричиняє послаблення пригнічення прозапальних цитокінів, експресії рецепторів CD4 та CD25 без індукування апоптозу, і це пригнічення частково ліквідується у присутності стороннього IL2 Протокова цитометрія являє собою аналітичний інструмент, який надає можливість TM розрізнення різних частинок на основі їх розміру та кольору. У системі BD CBA використовуються набори частинок з дискретним спектром інтенсивності флуоресценції для TM одночасного виявлення численних визначуваних розчинних речовин. Система BD CBA поєднується з протоковою цитометрією з одержанням потужного засобу мультиплексного TM аналізу. Система BD CBA Human Th1/Th2 Cytokine II застосовується для кількісного визначення рівнів інтерлейкіну-2, інтерлейкіну-4, інтерлейкіну-6, інтерлейкіну-10, TNF та гаммаінтерферону у одному зразку [J. Immunol. Methods 2001. 254: 109-118]. Шість наборів гранул із неоднаковою інтенсивністю флуоресценції сенсибілізували іммобілізованими антитілами, специфічними до IL-2, IL-4, IL-6, IL10, TNF та гамма-інтерферону. TM Шість згаданих наборів гранул змішують для одержання системи BD CBA, яка розділяється у каналі FL3 протокового цитометра DAKO Cyan ADP. Гранули для захоплення цитокінів змішують з PE (фікоеритрин)-кон'югованими виявлювальними антитілами, після чого інкубують з рекомбінантними зразками, взятими за стандарт, або експериментальними зразками для одержання сендвіч-комплексів. Після одержання даних аналізу зразків із застосуванням протокового цитометра результати аналізу зразків відтворюють у графічній та табличній формі. Після проведення цих експериментів стає очевидним, що T1h спричиняє пригнічення проліферації наївних T-клітин, і це опосередковується значним зменшенням рівнів прозапальних цитокінів, а також зменшенням кількості CD25 та CD4. Додання екзогенного IL2 забезпечує повернення пригнічення до норми, а також підвищує експресію прозапальних 12 UA 104587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цитокінів і збільшує абсолютну кількість рецепторів як CD4, так і CD25. Ці результати наводять на думку про те, що пригнічення проліферації T-клітин T1h опосередковується пригніченням IL2, а додання екзогенного IL2 спричиняє "посилення функціональної активності". Винахідники виявили також, що зниження проліферації T-клітин не опосередковується індукуванням апоптозу. 10. T1h не пригнічує проліферацію T-клітин пам'яті Після розпізнання чужорідного антигену на антигенпрезентуючих клітинах T-клітини проліферують та ініціюють імунну реакцію. Певні з цих T-клітин перетворюються на T-клітини пам'яті, які циркулюють у системі, і при повторному стимулюванні тим самим антигеном ці клітини проліферують і ініціюють імунну реакцію. Більшість людей вакцинована проти токсоїду правця, і коли їх T-клітини стимулюються тим самим антигеном, T-клітини пам'яті у вакцинованих людей проліферують. Експериментальні результати показують, що токсоїд правця таки стимулює проліферацію T-клітин дозозалежним чином, але sT1h не демонструє жодного пригнічення проліферації цих клітин. Це дозволяє майже з певністю стверджувати, що T1h не пригнічує проліферації T-клітин пам'яті. Це факт на користь T1h терапії, оскільки проліферація циркулюючих T-клітин пам'яті не порушується, і пацієнти, які зазнають T1h терапії, не стають сприйнятливими до інфекції. 11. T1h пригнічує проліферацію T-клітин у реакції змішаної культури лімфоцитів, опосередкованій PBMC та Raji-клітинами Коли суміші лімфоїдних клітин від генетично різних суб'єктів культивують in vitro, спостерігається характерна реакція, яка була названа реакцією змішаної культури лімфоцитів (MLR) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1973. 70: 2707-2710]. Цю реакцію відносять до ранньої проліферативної фази з подальшою появою ефекторних лімфоцитів, які демонструють специфічну цитотоксичність стосовно клітин-мішеней, що несуть антигени, які застосовують для стимулювання вихідної реакції. Обидві популяції алогенних T-лімфоцитів проліферують у MLR, якщо тільки одну з популяцій не перетворюють на таку, що не реагує, шляхом обробки мітоміцином C або летальною дозою опромінення рентгенівськими променями. У згаданій останній системі, яку називають односпрямованою MLR, популяція, що не реагує, надає клітини-стимулятори, які експресують алотипові антигени клітин-стимуляторів. Уодноспрямованій MLR T H клітини-респондери розпізнають алогенні молекули MHC класу II на клітинах-стимуляторах, і проліферують у + відповідь на ці відмінності. Видалення CD4 TH клітин з популяції-респондера із застосуванням суміші антитіла проти CD4 та комплементу припиняє MLR і запобігає утворенню цитотоксичних Т-лімфоцитів (CTL). Було показано, що A-клітини, такі як макрофаги, також є важливими для MLR. Зараз є зрозумілим, що роль макрофагів полягає у активуванні T H-клітин, рестриктованих молекулами MHC класу II, проліферація яких визначається у MLR. У цьому винаході односпрямовану MLR здійснюють з Raji-клітинами, обробленими мітоміцином, в результаті чого вони стають антигенпрезентуючими клітинами, в той час як проліферацію визначають на PBMC. У опублікованих раніше літературних джерелах було показано, що Raji-клітини експресують ALCAM [J. Immunol. 2004. 173: 2262-2270]. Грунтуючись на результатах цього експерименту доходять висновку, що T1h специфічно пригнічує односпрямовану MLR, де Raji-клітини є антигенпрезентуючими клітинами, а PBMC – проліферують. 12. T1h пригнічує проліферацію T-клітин у реакції змішаної культури лімфоцитів, опосередкованій PBMC та зрілими дендритними клітинами У алогенній (антигенпрезентуючі клітини взяті від одного суб'єкта, а PBMC взяті від іншого суб'єкта) реакції змішаної культури лімфоцитів, де зрілі дендритні клітини (антигенпрезентуючі клітини) спричинюють проліферацію наївних PBMC, T1h пригнічує цю проліферацію дозозалежним чином. Дані показали, що спосіб дії спричинював пригнічення щонайменше двох головних прозапальних цитокінів, а саме IL6 та IFNγ. Матеріали і методи Лінії клітин та культура клітин: HUT 78 (лінія клітин людської T-клітинної лімфоми від ATCC (Американська колекція типових культур)) використовують як клітини-мішені. Клітини культивують у DMEM (модифіковане за способом Дульбекко середовищі Ігла), модифікованому за способом Ісков, яке містить NaHCO3 (2 мг/мл), 20 мМ HEPES, 2 мМ L-глутаміну та 20 % FBS (сироватка плода корови) (Invitrogen). Клітини лінії Daudi (B-клітинна лімфома, ATCC), клітини культивують у RPMI 1640, що містить NaHCO3 (2 мг/мл), 20 мМ HEPES, 2 мМ L-глутаміну та 10 % FBS (Invitrogen). Клітини лінії WIL2S (B-клітинна лімфома); клітини культивують у DMEM (модифіковане за 13 UA 104587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 способом Дульбекко середовище Ігла), яке містить NaHCO 3 (2 мг/мл), 20 мМ HEPES, 2 мМ Lглутаміну та 10 % FBS (Invitrogen). PBMC (мононуклеари периферичної крові) були застосовані як ефекторні клітини: PBMC виділяють шляхом центрифугування у градієнті густини Ficoll paque (Amersham, номер за каталогом: 17-14403-03). Лейкоцитні плівки одержують від здорових донорів і завжди безпосередньо перед використанням. Клітини культивують у RPMI 1640 (Invitrogen), що містить NaHCO3 (2 мг/мл), 20 мМ HEPES, 2 мМ розчин L-глутаміну та 5 % FBS (Invitrogen). Антитіла: Наведені нижче моноклональні антитіла проти CD6 були застосовані in vitro: Rituxan (ритуксан) (Genentech), антитіло hR3 (CIM, Гавана, Куба). 1PBS (фосфатно-сольовий буферний розчин) (Invitrogen, номер за каталогом: 10010). Буфер для сенсибілізації поверхонь (NaHCO3 – 8,4 г, Na2CO3 – 3,56 г у H2O (1000 мл), pH 9,5). PBS/твін (0,5 мл твін-20 (SIGMA) у 1000 мл PBS). Блокувальний розчин (1 % BSA (бичачий сироватковий альбумін) у PBS). RPMI 1640 (номер за каталогом: 11875, Invitrogen). DMEM, модифіковане за способом Ісков (Invitrogen, номер за каталогом: 12200-036). Аламаровий синій (Invitrogen, DAL-1100). TM Планшет-рідер Biotek (Synergy HT). Змішана людська сироватка. Периферична кров від здорового суб'єкта, зібрана у вакутейнер EDTA (етилендіамінтрифтороцтова кислота) (BD vaccutainer, номер за каталогом: 368457). DMEM, модифіковане за способом Ісков (Invitrogen), яке містить 1 % FBS (сироватка плоду корови). Апоптозній набір – номер за каталогом 1 988 549 (Roche). Протоковий цитометр: Dako Cyan ADP. Градієнт густини Ficoll paque (Amersham, номер за каталогом: 17-14403-03), RPMI 1640, номер за каталогом: 11875 (Invitrogen). FBS (сироватка плода корови), Gibco, номер за каталогом: 10082-147. Антитіло проти CD6-PE, антитіло проти CD6-FITC, антитіло проти D19-PECy5, антитіло проти CD3-FITC та антитіло проти CD4-Alexa (D Serotec, Великобританія). TM Калібрувальні частинки SPHERO Rainbow (номер за каталогом: RCP-30-5A). CFSE (Sigma, номер за каталогом: 21888), 7AAD (Invitrogen, номер за каталогом: V 35124). RPMI 1640 (Invitrogen), що містить NaHCO 3 (2 мг/мл), 20 мМ HEPES, 2 мМ L-глутаміну та 5 % FBS (Invitrogen). 96-лунковий планшет Fluotrac 600 – номер за каталогом: 655077 (Greiner Bio). Наведені нижче приклади представлені з ілюстративною метою, і не призначені для обмеження обсягу цього винаходу. Приклад 1a T1h та ALCAM при проведенні ELISA не зв'язуються з одним і тим самим доменом rhCD6FC/химера (R та D системи) (100 мкг/мл) розбавляли у буфері для сенсибілізації поверхонь, і додавали по 100 мкл у кожну лунку 96-лункового планшета Nunc-Maxisorp. Після цього планшет інкубували протягом ночі при температурі 4C. Планшет тричі промивали PBS твін-20. Після цього додавали 200 мкл блокувального розчину (2 % BSA+0,1 % твін-20 у 1PBS), та інкубували протягом 1 год. при температурі 37C. Після інкубування планшет знову тричі промивали PBS твін, після чого додавали моноклональне антитіло T1h (0,2 мг/мл) та rhALCAMFc (R та D системи) у різних концентраціях. Потім планшет інкубували протягом 1 год. при температурі 37C. Планшет послідовно тричі промивали із застосуванням PBS твін. У лунки додавали 200 мкл антилюдського IgG (Fab) 2 ALP (1:20000), розбавленого у блокувальному буфері, та інкубували протягом 1 год. при температурі 37C. Планшет тричі промивали PBS твін, у кожну лунку додавали 200 мкл p-нітрофенілфосфатного (PNPP) субстрату, та інкубували при температурі 37C доти, доки, приблизно через 15 хв, не з'являлось забарвлення. Зчитування здійснювали при 405 нм із застосуванням мікропланшет-рідера BIOTEK. Експеримент свідчить про те, що присутність ALCAM у різних концентраціях не перешкоджає зв'язуванню T1h з рецепторами CD6. Відсутність конкуренції між ALCAM та T1h дозволяє зробити припущення про те, що зв'язувальні домени для двох вищезгаданих засобів є різними (Фіг. 2). Приклад 1b T1h зв'язується з доменом 1 (D1) CD6 Якщо MEM 98, антитіло, яке зв'язується з доменом 1 (Castro AA.M. et al., J. of Immunol., 178 (2007) 4351-4361), конкурує з T1h, то спостерігається дозозалежна конкуренція, що дозволяє зробити припущення про те, що обидва антитіла зв'язуються з одним і тим самим доменом, а 14 UA 104587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 саме доменом 1 (Фіг. 3). Приклад 2 T1h не індукує апоптоз у клітин HUT78 5 5 Клітини збирали, і 1,5 мл клітин висівали (3,310 клітин/мл) (кінцева концентрація: 510 клітин) у кожну з призначених для проведення випробування 35 мм чашок. У відповідні чашки додавали необхідну кількість антитіла для одержання кінцевої концентрації 5 мкг/мл. У контрольну чашку антитіло не додавали. Як позитивний контроль використовували клітини, інкубовані з рапаміцином із концентрацією 1,2 мкг/мл. Клітини інкубували протягом ночі при температурі 37C у 5 % CO2-інкубаторі. Після цього клітини переносили у FACS пробірку (BD Falcon, номер за каталогом: 352054), і центрифугували при 1200 об/хв протягом 5 хв при кімнатній температурі (RT). Супернатант зливали, ресуспендували у 2 мл PBS, та центрифугували при 1200 об/хв протягом 5 хв при кімнатній температурі. Супернатант зливали, додавали 100 мкл розчину для мічення (анексин-V-флуоресцеїн), та інкубували протягом 10-15 хв при кімнатній температурі. Клітини промивали 2 мл PBS, і центрифугували при 1200 об/хв протягом 5 хв. Після цього супернатант зливали. Клітини ресуспендували у 0,5 мл PBS, і відбирали із застосуванням протокового цитометра (через дискримінаційне вікно клітинного сортера були пропущені 3000 клітин) із збудженням при 488 нм. Зразки зчитували у каналі FITC на анексин V, і у каналі PE техаський червоний – на PI. Для забезпечення компенсації використовували оброблені рапаміцином зразки лише з анексином V та лише з PI. Клітини HUT 78, оброблені T1h, продемонстрували 40 % апоптозу, який майже дорівнює апоптозу необробленого контролю у анексин V FITC каналі. Необроблені клітини та клітини, оброблені неспецифічним антитілом (антитіло hR3), продемонстрували 35,3 % та 36,5 % апоптозу, відповідно, у той час як позитивний рапаміциновий контроль продемонстрував 54,3 % апоптозу. Ці дані дозволяють зробити припущення про те, що T1h не опосередковує апоптоз у клітин HUT 78 (Фіг. 4). Приклад 3 Відмінність експресії рецепторів CD6 на Т- та В-лімфоцитах інтактних суб'єктів PBMC були ізольовані шляхом центрифугування у градієнті густини Ficoll paque (Amersham, номер за каталогом: 17-14403-03). Лейкоцитні плівки були одержані від здорових донорів, причому завжди безпосередньо перед використанням. Після цього PBMC промивали у PBS. 6 Потім PBMC ресуспендували у 5 мл 1 PBS при густині клітин 1,510 клітин/мл, та 100 мл додавали у кожну пробірку типу Falcon. У відповідну пробірку додавали 10 мкл кон'югованого антитіла (розведення 1:10), перемішували на вортексі, після чого інкубували при температурі 4C протягом 30 хв. Після інкубування у кожну пробірку додавали 2 мл 1PBS, після чого центрифугували при 1200 об/хв протягом 5 хв при кімнатній температурі. Супернатант зливали, і клітини ресуспендували у 0,5 мл 1PBS для відбирання їх із застосуванням протокового цитометра. Клітини (лімфоцити) пропускали через дискримінаційне вікно клітинного сортера для TM одержання необхідної популяції (3000 клітин) з FSC та SSC. Калібрувальні частинки SPHERO (номер за каталогом: RCP-30-5A) Rainbow також застосовували разом із вищезгаданими пробірками при таких самих значеннях напруги. Реєстрували середнє значення інтенсивності флуоресценції (тобто відносну яскравість) за номерами каналів для кожного піка. Середнє значення за номером каналу перетворювали на відносне значення за номером каналу за такою формулою: i. Відносне значення за номером каналу=(R/4)log(середнє значення за номером каналу10); ii. де R – роздільна здатність (тобто 256). Із застосуванням пакета електронних таблиць Excel був одержаний графік, в якому значення MEF (середня ефективна інтенсивність флуоресценції) визначені для кожного піка у залежності від відносного значення за номером каналу для одержання калібрувального графіка, як показано на Фіг. 5. Було одержане відносне значення за номером каналу для антитіла проти CD6 на T- та B-клітинах, яке нанесли на калібрувальний графік Sphero для кількісного визначення густини рецепторів CD6 на окремих клітинах різних субпопуляцій лімфоцитів. Виведені з графіка формули для обчислення кількості рецепторів на лімфоцитах мали такий вигляд: e·0,0366·x a) канал FITC: y=134,95 ; e·0,03736·x b) канал PE: y=23,6 . Густина рецепторів CD6 є у 10 разів більшою на T-клітинах, у порівнянні з B-клітинами. Було встановлено, що відмінність профілю експресії на T- та B-клітинах була чітко вираженою (Фіг. 6). Приклад 4 T1h спричиняє слабку ADCC (антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність) 5 Лінії клітин-мішеней (HUT 78/Daudi) збирали, і двічі промивали їх у PBS. Клітини (210 ) 15 UA 104587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ресуспендували у 1 мл 0,25 мкМ розчину CFSE (титрація CFSE є необхідною для клітин кожного типу для того, щоб підібрати таку концентрацію CFSE, щоб розчин CFSE не перетікав у канал PE Cy5). Клітини інкубували точно протягом 10 хв при температурі 37C. Для припинення реакції додали 2 мл RPMI, що містило 5 % FBS. Для видалення CFSE клітини двічі промивали 2 мл RPMI, що містило 5 % FBS. Після цього препарат клітин-мішеней ресуспендували у 5 середовищі RPMI із густиною клітин 110 клітин/мл, і додавали у кожну пробірку типу Falcon по 4 100 мкл (10 клітин). У відповідні пробірки додавали 50 мкл антитіла (5 мкг/мл, 10 мкг/мл), та інкубували протягом 30 хв при кімнатній температурі. Після цього у відповідні пробірки додавали PBMC (ефекторні клітини) при співвідношеннях кількості клітин-мішеней до кількості ефекторних клітин, які дорівнюють 1:1, 1:25, 1:50 та 1:100. Кінцевий об'єм у кожній пробірці доводили до 250 мкл, додаючи середовище. Кожну пробірку центрифугували протягом 2 хв при 1200 об/хв для стимулювання міжклітинної взаємодії, та інкубували при температурі 37C для одержання ADCC. Клітини лінії Daudi інкубували протягом 6 год. з ритуксаном, після чого використовували разом зі зразками як позитивний контроль. Після цього клітини промивали 1PBS. Додавали 100 мкл 7 AAD (6,25 мкг/мл), та інкубували при температурі 4C протягом 15 хв. Клітини промивали 1PBS, і центрифугували при 1200 об/хв при температурі 4C протягом 5 хв. Супернатант зливали, і клітини ресуспендували у 500 мкл 1PBS. Клітини відбирали зі швидкістю приблизно 200 явищ/с, і розглядали їх у каналах FITC та PE Cy5 протокового цитометра. Флуоресценція CFSE-позитивних клітин спостерігалась між другою та третьою декадою у логарифмічному масштабі без перетікання у канал PE Cy5. У цій популяції через дискримінаційне вікно були пропущені у загальній кількості 3000 FITC-позитивних клітин; оцінювали відсоток клітин, які демонстрували 7AAD (PE Cy5 позитивність) (Фіг. 7 та Фіг. 8). Згаданому аналізу крім контрольного неспецифічного антитіла були піддані також ефекторні клітини та клітини-мішені при співвідношенні кількості клітин-мішеней до кількості ефекторних клітин, яке становить 1:1, 1:25, 1:50 та 1:100. Відсоток апоптозу приймався як відсоток клітин у верхньому правому квадранті розкиду точкового графіка FITC/PE Cy5 (Фіг. 9). Приклад 5 ADDC, що спричиняється T1h у HUT 78 Базуючись на прикладі 4, аналіз ADCC здійснили за тією самою аналітичною методикою для перевірки впливу T1h на HUT 78. Клітини інкубували від 4 год. до до періоду часу, який дорівнював тривалості ночі. Оптимальні і стійкі результати одержали при інкубуванні протягом ночі. Результати чотирьох різних окремих експериментів in vitro дозволяють зробити припущення про те, що T1h індукує слабку ADCC у HUT 78 при інкубуванні протягом ночі у присутності ефекторних клітин (Фіг. 10, Фіг. 11 та Фіг. 12). Приклад 6 T1h не опосередковує комплементзалежну цитотоксичність (CDC) Змішану людську сироватку (щонайменше три зразки) цільної крові збирали у стерильну пробірку. Кров витримували до зсідання при кімнатній температурі протягом щонайменше 4 год., та центрифугували при 900g протягом 20 хв. Сироватку збирали, розподіляли на аліквоти, і зберігали при температурі -80C. Клітини-мішені (WH-2S/HUT-78) промивали у буфері 5 для розведень, та ресуспендували до одержання концентрації 210 клітин/мл. Антитіло розбавляли у буфері для чотирикратних розведень від бажаної кінцевої концентрації. Комплемент чотирикратно розбавляли від бажаної кінцевої концентрації (тобто розведення 1:2,5 для кінцевої концентрації 1:10). У кожну лунку 96-лункового планшета з плоским дном додавали по 50 мкл розбавленого антитіла, розбавленого комплементу та 50 мкл клітинної суспензії (10000 клітин на лунку). Були використані такі контрольні лунки: клітинимішені+антитіло саме по собі (спонтанна загибель клітин), клітини-мішені+сироватка сама по собі (фоновий лізис) та клітини-мішені+10 % SDS (додецилсульфат натрію) (для максимальної загибелі клітин). Позитивним контролем були клітини лінії Wil-2S, оброблені ритуксаном у різних концентраціях. 96-лунковий планшет інкубували протягом 2 год. при температурі 37C. У кожну лунку додавали аламаровий синій (50 мкл на лунку), і планшет інкубували протягом ночі при температурі 37C. Інтенсивність флуоресценції визначали із застосуванням спектрофотометра TM Biotek Synergy HT зі збудженням при 530 нм, емісією при 590 нм та чутливістю=35. Результати дозволяють зробити припущення про те, що T1h не індукує CDC на відміну від ритуксану (Фіг. 13). Приклад 7 T1h пригнічує PHA-опосередковану проліферацію лімфоцитів Лінії клітин та культура клітин: Цільну кров відбирали за стандартними флеботомічними методами у інтактних суб'єктів 16 UA 104587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 після одержання їх згоди. PBMC виділяли шляхом центрифугування у градієнті густини Ficoll paque (Amersham, номер за каталогом: 17-14403-03). Лейкоцитні плівки одержували від здорових донорів, причому завжди безпосередньо перед використанням. Клітини культивували у RPMI 1640 (Invitrogen), що містить NaHCO3 (2 мг/мл), 20 мМ HEPES, 2 мМ L-глутаміну та 10 % FBS (Invitrogen). Пригнічення проліферації лімфоцитів протоковою цитометрією із застосуванням CFSE 6 PBMC збирали, і промивали їх у PBS. Клітини (7,510 ) ресуспендували у 1 мл 2 мкМ розчину CFSE у PBS. Клітини інкубували точно протягом 10 хв при температурі 37C. Для припинення реакції додали 10 мл RPMI, яке містило 10 % FBS. Клітини двічі промивали 10 мл 6 PBS. Після цього клітинний препарат ресуспендували у 5 мл PBS із густиною клітин 1,510 клітин на 1 мл, і додавали у кожну пробірку типу BD FACS по 200 мкл. Додавали 200 мкл необхідного та неспецифічного антитіла з різними концентраціями (50 мкг/мл, 25 мкг/мл, 12,5 мкг/мл та 6,25 мкг/мл, відповідно), та інкубували протягом 30 хв при температурі 37C. У кожну пробірку додавали 2 мл PBS, і центрифугували при 1200 об/хв протягом 5 хв при кімнатній температурі для вимивання незв'язаного антитіла. До осаду у кожній пробірці додавали 1 мл RPMI, яке містило 10 % FBS. Для стимулювання проліферації у відповідну пробірку додавали 1 мл розчину PHA (20 мкг/мл) у RPMI, яке містило 10 % FBS. Загальний об'єм у пробірці становив 2 мл, кінцева концентрація PHA дорівнювала 10 мкг/мл. Пробірку перемішували на вортексі, та інкубували протягом 3 днів при температурі 37C у CO2-інкубаторі. Клітини промивали PBS, і центрифугували їх при 1200 об/хв при температурі 4C протягом 5 хв. Супернатант зливали, і ресуспендували у 500 мкл 1PBS. У загальній кількості виявили 20000 явищ зі швидкістю приблизно 200 явищ/с, і розглядали їх у каналі FITC. Відсоток пригнічення={[PHA-(T1h+PHA)]/PHA}100, (де: PHA=PHA-(клітини самі по собі) PHA+T1h=(PHA+Tl1h)-(клітини самі по собі) PHA+hR3=(PHA+hR3)-(клітини самі по собі)) Клітини самі по собі являють собою CFSE+клітини. Ці дані дозволяють зробити припущення про те, що антитіло T1h опосередковує пригнічення проліферації PHA-стимульованих лімфоцитів дозозалежним чином. Відсоток пригнічення може відрізнятись у окремих суб'єктів, що спричинено природною відмінністю інтактних суб'єктів. Однак загальне дозозалежне пригнічення PHA-стимульованих лімфоцитів спостерігалось при застосуванні антитіла T1h, а не при застосуванні неспецифічного антитіла hR3 (Фіг. 14, Фіг. 15 та Фіг. 16). Приклад 8 T1h пригнічує PHA-опосередковану проліферацію лімфоцитів навіть у аналізі на основі аламарового синього на 96-лунковому планшеті PBMC збирали насвіжо, і ресуспендували їх у RPMI, яке містило 5 % FBS, з концентрацією 5 410 клітин/мл. У кожну лунку додавали 50 мкл клітин. У відповідну лунку додавали 100 мкл антитіла (T1h або hR3) з двократною концентрацією (20 мкг/мл). У лунки без антитіла додавали 100 мкл середовища самого по собі. Після цього планшет інкубували протягом півгодини при температурі 37C. Для стимулювання проліферації лімфоцитів у відповідні лунки додавали 50 мкл PHA з чотирикратною концентрацією (20 мкг/мл). У решту лунок додавали 50 мкл середовища для доведення кінцевого об'єму до рівня 200 мкл/лунка в усіх лунках. Планшети інкубували протягом трьох днів у CO2-інкубаторі при температурі 37C. У кожну лунку додавали аламаровий синій (65 мкл), та інкубували протягом ночі у CO2-інкубаторі при температурі 37C. TM Інтенсивність флуоресценції визначали із застосуванням спектрофотометра Biotek Synergy HT зі збудженням при 530 нм, емісією при 590 нм та чутливістю=35. Результати цього аналізу підтверджують той факт, що PHA-опосередкована проліферація лімфоцитів значною мірою пригнічується у присутності розчинного T1h, але не у присутності неспецифічного антитіла hR3. Цей факт, разом із даними попереднього експерименту, вказує на певну роль T1h у пригніченні проліферації наївних T-клітин. Цей експеримент показує також, що аналіз пригнічення PHA-опосередкованої проліферації T-клітин може бути перетворений у традиційний планшетний аналіз, на відміну від попереднього експерименту, основу якого становила протокова цитометрія (Фіг. 17). Приклад 9 T1h зменшує проліферацію лімфоцитів, індуковану кон'югованим антитілом проти CD3, антитілом проти CD3+кон'югований T1h та антитілом проти CD3+кон'югований ALCAM Fc 50 мкл буфера для сенсибілізації поверхонь додавали у 96-лунковий планшет, 50 мкл антитіла проти CD3 із двократною концентрацією (1 мкг/мл) додавали до ряду А, як показано на Фіг. 18. З першого ряду А відбирали 50 мкл розбавленого антитіла, і послідовно розбавляли на 17 UA 104587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 планшеті до ряду E із застосуванням 12-канальної електронної піпетки. 50 мкл буфера для сенсибілізації поверхонь додавали у 1-4 стовпчики рядів A-E, 50 мкл антитіла (T1h (5-8) або ALCAM Fc (9-12)) з двократною концентрацією (2 мкг/мл) додавали у відповідні лунки, так що кінцева концентрація у лунках постійно становила 1 мкг/мл антитіла і різні концентрації антитіла проти CD3 (ряд A-E мав 1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл, 0,625 мкг/мл) (Фіг. 18). 100 мкл T1h або hR3 чи ALCAM (1 мкг/мл) додавали у відповідні лунки як контроль (як показано на матриці). Вищезгадане було здійснено на трьох планшетах, для контролю середовища, sT1h та shR3. Планшет інкубували при температурі 4C протягом ночі для забезпечення прикріплення антитіла до планшета. Блокування планшета Температуру планшета доводили до рівня кімнатної, і антитіло у буфері для сенсибілізації поверхонь відсмоктували із застосуванням пристрою Vaccusafe (IBS Integra BioSciences), сайти неспецифічного зв'язування блокували шляхом додання 200 мкл блокувального розчину у кожну лунку. Планшет інкубували при температурі 37C протягом 1 год., після чого двічі промивали сумішшю PBS/твін. Третє промивання здійснювали середовищем RPMI. Залишковий об'єм середовища обережно видаляли. Додання клітинної суспензії: У кожну лунку додавали 100 мкл PBMC (30000 клітин). У відповідні планшети додавали 100 мкл необхідного антитіла (T1h або hR3) з двократною концентрацією. У планшет для середовища додавали 100 мкл середовища. 96-лункові планшети інкубували протягом 72 год. при температурі 37C у 5 % CO2-інкубаторі. У кожну лунку додавали 65 мкл розчину аламарового синього, та інкубували протягом ночі при температурі 37C у 5 % CO2-інкубаторі. Інтенсивність флуоресценції зчитували із застосуванням 96-лункового флуориметра (Synergy HT із програмою Gen 5) зі збудженням при 530 нм та емісією при 590 нм (чутливість=35) (Фіг. 19). Комбінації кон'югованого антитіла проти CD3+T1h та антитіла проти CD3+ALCAM чинять синергічний вплив, на відміну від самого по собі кон'югованого антитіла проти CD3, про що свідчать результати пробіт-аналізу даних (Фіг. 20). Приклад 9a Титрування IL2 на наївних PBMC В усі лунки було додано 100 мкл середовища. До першого ряду А2-А10 було додано 100 мкл IL2 з двократною концентрацією (20 нг/мл). З першого ряду відібрали 100 мкл для проведення 5 послідовних розведень на планшеті до ряду H. В усі лунки додали 50 мкл суспензії PBMC (610 клітин/мл). Для доведення кінцевого об'єму до рівня 200 мкл у відповідну лунку було додано 50 мкл середовища або антитіла (T1h або hR3, 10 мкг/мл) чи PHA (10 мкг/мл). Планшет інкубували протягом 5 днів при температурі 37C у 5 % CO2-інкубаторі. У кожну лунку додали 65 мкл розчину аламарового синього, та інкубували протягом ночі при температурі 37C у 5 % CO2інкубаторі. Інтенсивність флуоресценції зчитували із застосуванням 96-лункового флуориметра (Synergy HT з програмою Gen 5) зі збудженням при 530 нм та емісією при 590 нм (чутливість=35). За результатами цього експерименту, було вирішено у подальших експериментах застосовувати IL2 з концентрацією, яка становить 1,25 нг/мл (Фіг. 21). Приклад 9b T1h спричиняє зниження рівня прозапальних цитокінів, і це пригнічення частково ліквідується у присутності екзогенного IL2 Аналіз цитокінів Одержання людських Th1/Th2 цитокінних стандартів 1 флакон ліофілізованих людських Th1/Th2 цитокінних стандартів відновлювали аналітичним розріджувачем (0,2 мл) з одержанням десятикратного основного об'єму стандарту і витримували для урівноважування протягом щонайменше 15 хв перед виконанням розведень. Пробірки (1275 мм, BD Falcon, номер за каталогом: 352008) мітили і розміщували у такому порядку: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 та 1:256. Із застосуванням піпетки у верхню стандартну пробірку вносили 900 мл аналітичного розріджувача. Також із застосуванням піпетки у кожну з решти пробірок вносили по 300 мкл аналітичного розріджувача. Послідовне розведення здійснювали шляхом перенесення 300 мкл із верхньої стандартної пробірки у пробірки з розведенням 1:2 при ретельному перемішуванні. Подальші послідовні розведення здійснювали шляхом перенесення 300 мкл із пробірки з розведенням 1:2 у пробірку з розведенням 1:4 і так далі до пробірки з розведенням 1:256 при ретельному перемішуванні. Одна пробірка, яка містила експериментальний розріджувач, була застосована як негативний контроль (0 пг/мл). Одержання змішаних гранул з іммобілізованими людськими Th1/Th2 цитокінами 18 UA 104587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Захватні гранули (реактиви А1-А6) знаходились у окремих склянках, і їх було необхідно змішувати безпосередньо перед змішуванням з PE виявлювальним реактивом, стандартами та зразками. Була визначена кількість аналітичних пробірок (у тому числі для стандартів та контролів), необхідна для проведення експерименту. Кожну суспензію захватних гранул перемішували на вортексі продовж декількох секунд перед змішуванням. 10 мкл аліквота кожної захватної гранули для кожної аналітичної пробірки, яка підлягала аналізу, була внесена у одну пробірку, яка була помічена "Змішані захватні гранули" (наприклад, 10 мкл захватних гранул IL218 аналітичних пробірок=необхідно 180 мкл захватних гранул IL-2). Одержання зразків: Експериментальні зразки розбавляли за бажаним коефіцієнтом розведення (тобто 1:2, 1:10 або 1:100), додаючи відповідний об'єм аналітичного розріджувача. Розведені зразки ретельно перемішували перед перенесенням зразків у відповідні пробірки для проведення аналізу, які вміщували змішані захватні гранули та PE виявлювальний реактив. Методика аналізу культурального супернатанту У відповідні пробірки для проведення аналізу додавали 50 мкл змішаних захватних гранул (одержаних за методикою, опис якої наведений у розділі "Одержання змішаних гранул з іммобілізованими людськими Th1/Th2 цитокінами"). Змішані захватні гранули перед доданням у пробірки для проведення аналізу перемішували на вортексі. У пробірки для проведення аналізу додавали 50 мкл людського Th1/Th2-II PE виявлювального реактиву. У контрольні пробірки для проведення аналізу додавали 50 мкл стандартних розведень стандарту людських Th1/Th2 цитокінів. У досліджувані пробірки для проведення аналізу додавали 50 мкл кожного експериментального зразка. Пробірки для проведення аналізу інкубували протягом 3 год. при кімнатній температурі, захищаючи їх від прямого попадання світла. У кожну пробірку для проведення аналізу додавали 1 мл буфера для промивання, і центрифугували при 200g протягом 5 хв. Супернатант із кожної пробірки для проведення аналізу обережно відсмоктували і видаляли. У кожну пробірку для проведення аналізу додавали 300 мкл промивального буфера для ресуспендування гранульованого осаду. Зразки аналізували на протоковому цитометрі (Фіг. 22 та Фіг. 23). Розчинний T1h пригнічує експресію рецепторів CD4 та CD25 на проліферуючих T-клітинах Умови проведення аналізу відповідали описаним у методиці проведення аналізу з кон'югованими антитілами, тобто сенсибілізація планшета та культивування PBMC, які були показані на Фіг. 18. Клітини відбирали з 96-лункового планшета у пробірку типу BD Falcon. У кожну пробірку додавали 2 мл 1PBS, і центрифугували при 1200 об/хв протягом 5 хв. Супернатант зливали, і до дебрісу додавали 100 мкл 1PBS. У кожну пробірку відбирали 100 мкл клітин, додавали 10 мкл флуорохрому, кон'югованого антитіла проти CD4 Alexa або антитіла проти CD25 PE, та інкубували протягом 30 хв при температурі 4C. Після завершення інкубування у кожну пробірку додавали 2 мл 1PBS, після чого центрифугували при 1200 об/хв протягом 5 хв при кімнатній температурі. Супернатант зливали. Клітини ресуспендували у 0,5 мл 1PBS для відбирання із застосуванням протокового цитометра. Клітини (лімфоцити) пропускали через дискримінаційне вікно клітинного сортера для одержання необхідної популяції (3000 клітин) із FSC та SSC. Визначали відсоток клітин та середню інтенсивність флуоресценції. Цей експеримент повторили тричі; при цьому наведена одна репрезентативна фігура. Повторюваність результатів була перевірена шляхом проведення незалежних експериментів (Фіг. 24). При проведенні вищезгаданого аналізу не спостерігалось підвищення апоптозу При проведенні аналізу, умови якого відповідали описаним у методиці проведення аналізу з кон'югованими антитілами (Приклад 9), клітини відбирали з 96-лункового планшета у пробірку типу BD Falcon, після чого їх мітили для аналізу на апоптоз. У кожну пробірку додавали 2 мл 1PBS, і центрифугували при 1200 об/хв протягом 5 хв. Супернатант зливали, і до дебрісу додавали 100 мкл 1 PBS. Додавали 100 мкл розчину для мічення (PI/анексин V), та інкубували протягом 30 хв при температурі 4C. Після завершення інкубування у кожну пробірку додавали 2 мл 1PBS, після чого центрифугували при 1200 об/хв протягом 5 хв при кімнатній температурі. Супернатант зливали. Клітини ресуспендували у 0,5 мл 1PBS для відбирання із застосуванням протокового цитометра. Клітини (лімфоцити) пропускали через дискримінаційне вікно клітинного сортера для одержання необхідної популяції (3000 клітин) з FSC та SSC (Фіг. 25). Результати цих експериментів ясно показують, що T1h спричиняє пригнічення проліферації наївних T-клітин, і це опосередковується значним зменшенням рівнів прозапальних цитокінів, а також зменшенням кількості CD25 та CD4. Додання екзогенного IL2 забезпечує повернення пригнічення до норми, а також підвищує експресію прозапальних цитокінів і збільшує абсолютну кількість рецепторів як CD4, так і CD25. Ці результати наводять на думку про те, що пригнічення 19 UA 104587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 проліферації T-клітин, спричинене T1h, опосередковується пригніченням IL2, а додання екзогенного IL2 спричиняє "посилення функціональної активності". Винахідники виявили також, що зниження проліферації T-клітин не опосередковується індукуванням апоптозу. Приклад 10 T1h не пригнічує проліферації T-клітин пам'яті у аналізі проліферації Т-клітин, опосередкованої токсоїдом правця PBMC були ізольовані шляхом центрифугування у градієнті густини Ficoll paque (Amersham, номер за каталогом: 17-14403-03). Лейкоцитні плівки одержували від здорових донорів, причому завжди безпосередньо перед використанням. Після цього PBMC промивали у PBS (Invitrogen). Потім PBMC ресуспендували у 2 мл середовища RPMI, яке містило 5 % FBS, при густині клітин 6 0,310 клітин/мл. Після цього клітини інкубували протягом 30 хв з T1h (10 мкг/мл) або без нього; антитіло hR3 було застосоване як неспецифічний контроль у стерильній 5 мл пробірці типу BD FACS. Після завершення інкубування клітини перемішували на вортексі, і у відповідні лунки було додано 100 мкл клітинної суспензії. Для стимулювання проліферації Т-клітин пам'яті у відповідні лунки було додано 100 мкл робочого розчину (10 мкг/мл, середовище RPMI, яке містило 5 % FBS) токсоїду правця (номер за каталогом: 582231, CALBIOCHEM). Планшети інкубували протягом п'яти днів у CO2-інкубаторі при температурі 37C. У кожну лунку додали 65 мкл аламарового синього, та інкубували протягом ночі у CO 2-інкубаторі при температурі 37C. TM Інтенсивність флуоресценції визначали із застосуванням спектрофотометра Biotek Synergy HT із збудженням при 530 нм, емісією при 590 нм та чутливістю=35 (Фіг. 26). Результати експериментів показують, що токсоїд правця таки стимулює проліферацію Tклітин дозозалежним чином, а sT1h не демонструє будь-якого пригнічення проліферації цих клітин. Це дозволяє майже з певністю стверджувати, що T1h не пригнічує проліферації T-клітин пам'яті. Це факт на користь T1h терапії, оскільки проліферація циркулюючих T-клітин пам'яті не порушується, і пацієнти, яких піддають T1h терапії, не стають сприйнятливими до інфекції. Приклад 11 T1h пригнічує проліферацію T-клітин у реакції змішаної культури лімфоцитів, опосередкованій PBMC та Raji-клітинами 5 Raji-клітини/PBMC збирали, і ресуспендували їх у 1PBS. 810 клітин/мл Raji-клітин/PBMC ресуспендували у 1 мл мітоміцину (25 мкг/мл). Клітини інкубували протягом 30 хв у CO2інкубаторі при температурі 37C. Після завершення інкубування у кожну пробірку додавали 2 мл RPMI, яке містило 5 % FBS, і центрифугували при 1200 об/хв протягом 5 хв при кімнатній температурі для видалення мітоміцину. Супернатант зливали, і знову додавали 2 мл RPMI, яке містило 5 % FBS, з подальшим центрифугуванням. Супернатант зливали, і клітини ресуспендували у середовищі RPMI. 5 50 мкл PBMC (410 клітин/мл) додавали у відповідні лунки 96-лункових планшетів з круглим дном. У відповідні лунки додавали 100 мкл розведення антитіл T1h або hR3 (10 мкг/мл), та інкубували протягом 30 хв у CO2-інкубаторі при температурі 37C. У відповідні лунки додавали 5 50 мкл оброблених мітоміцином Raji-клітин (410 клітин/мл). До аналітичних зразків були включені контролі, які містили оброблені мітоміцином Raji-клітини самі по собі, PBMC саме по собі, оброблені мітоміцином Raji-клітини+PHA, PBMC+PHA, оброблені мітоміцином Raji-клітини та PBMC. Планшет інкубували протягом 5 днів у CO 2-інкубаторі при температурі 37C. У кожну лунку додавали 65 мкл аламарового синього, та інкубували протягом ночі у CO 2-інкубаторі при температурі 37C. Інтенсивність флуоресценції визначали із застосуванням спектрофотометра TM Biotek Synergy HT зі збудженням при 530 нм, емісією при 590 нм та чутливістю=35. Таким чином, було виявлено, що T1h може специфічно пригнічувати односпрямовану MLR, де Raji-клітини є антигенпрезентуючими клітинами, а PBMC проліферують (Фіг. 27 та Фіг. 28). Приклад 12: Реакція змішаної культури лімфоцитів (дендритні клітини та лімфоцити периферичної крові (PBL)): MLR аналіз: MLR аналіз здійснили при відношенні DC:PBL=1:2. Матриця експерименту була розроблена з трьома концентраціями T1h, з позитивним контролем (пімекролімус) та негативним контролем (hR3). Згадана матриця показана на Фіг. 29. Послідовні розведення були відповідним чином зроблені на планшеті. PBL та/або DC додавали, як вказано на схемі планшета. PBL, оброблені мітоміцином С, додавали у відповідні лунки на планшеті. Кінцевий об'єм в усіх лунках дорівнював 200 мкл. MLR проводили з повторенням. Один планшет був призначений для проведення аналізу проліферації, другий для аналізу цитокінів. На завершувальній стадії обидва планшети піддавали нетривалому центрифугуванню, після чого витримували у CO 2-інкубаторі протягом 6 20 UA 104587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 днів. Аналіз проліферації: Після завершення інкубування планшет перевіряли на забрудненість під мікроскопом, і у кожну лунку додавали 20 мкл аламарового синього (10 % від загального об'єму на лунку). Зчитування проводили при чутливості 35 у різних часових рамках, розпочинаючи з 4 год. до періоду часу, який дорівнював тривалості ночі (Фіг. 30). Аналіз цитокінів: Супернатант збирали з кожної лунки, і для кожної групи супернатант змішували. Цитокіни TM аналізували засобами протокової цитометрії із застосуванням набору BD CBA Th1/Th2 kit II (Фіг. 31). У алогенній (антигенпрезентуючі клітини взяті від одного суб'єкта, а PBMC взяті від іншого суб'єкта) реакції змішаної культури лімфоцитів, де зрілі дендритні клітини (антигенпрезентуючі клітини) спричинюють проліферацію наївних PBMC, T1h пригнічує цю проліферацію дозозалежним чином. Дані показали, що спосіб дії спричинював пригнічення щонайменше двох головних прозапальних цитокінів, а саме IL6 та IFNγ. Приклад 13: Тваринна модель діабету типу I Відомо, що у мишей-самиць лінії NOD (неожиріла діабетична) розвивається спонтанний аутоімунний діабет, опосередкований Т-клітинами, що встановлюється з плином часу за підвищеними рівнями глюкози. Ця модель інсулінозалежного цукрового діабету (IDDM) є надзвичайно доброю моделлю для вивчення терапевтичної та профілактичної дії лікарських препаратів. Ця миша використовувалась для вивчення терапевтичної та профілактичної переваги сурогатного антитіла проти CD6 (пацюче моноклональне антитіло, яке зв'язується з мишачим CD6 подібно до того, як T1h зв'язується з людським CD6). У виконаному в невеликих маштабах експерименті було показано, що у тварин (від Harlan) захворювання розвинулось протягом 8-10 тижнів. Вік цих мишей на початку експерименту дорівнював 6-7 тижням. Дози у межах від 2,46 мг/кг на тиждень до 19,68 мг/кг на тиждень значно зменшували рівні глюкози, і фактично найвища доза зменшувала рівні глюкози до норми. Терапевтичне застосування лікарського препарату при проведенні подібного експерименту на десяти мишах затримувало початок захворювання дозозалежним чином. Затримка при найбільшій дозі становила три тижні. Приклад 14 Модель колаген-індукованого артриту Мишача модель колаген-індукованого артриту (CIA) є особливо прийнятною для вивчення ревматоїдного артриту на тваринній моделі. Згадана модель застосовується також у історичному плані для вивчення впливу молекул як засобів проти ревматоїдного артриту, у тому числі антитіл. При проведенні цього дослідження використовували мишей-самців лінії C57BL/6. Коротко кажучи, колаген курчат (CII) (від Sigma) розчиняли у 10 мМ розчині оцтової кислоти, і стерилізували із застосуванням 0,2 мкм фільтра. При проведенні дослідження здійснювали ін'єкції об'ємом 50 мкл. CII розчиняли з розрахунку 4 мг/мл для одержання 100 мкл об'ємів. Усі процедури проводили при температурі 2-8C. Вбиту теплом Mycobacterium tuberculosis тонко подрібнюють товкачем у ступці у поєднанні з неповним ад'ювантом Фрейнда (IFA). Після цього CII емульгували у цьому розчині шляхом їх перемішування. Усі процедури проводили при температурі 2-8C. Першу дозу вводять у основу хвоста, через два тижні вводять бустер-дозу. Після цього контролюють розвиток артриту. На десяти мишах, у яких розвинулось згадане захворювання, застосовували сурогатне антитіло проти CD6, яке специфічно виявляє мишачі CD6 на домені, подібному до того домену, на якому виявляє мишачі CD6 антитіло T1h. Дози у межах від 2,46 мг/кг на тиждень до 19,68 мг/кг на тиждень значно зменшували симптоми ревматоїдного артриту дозозалежним чином у цих мишей, у порівнянні з контрольними тваринами, яким лікарський препарат не вводили. Цими експериментами був встановлений той факт, що ревматоїдний артрит можна контролювати сурогатним антитілом, подібним до T1h. Приклад 15: Аутоімунний енцефаломієліт (EAE) Експериментальний аутоімунний енцефаломієліт (EAE) являє собою тваринну модель запалення головного мозку. Це запальне демієлінізуюче захворювання центральної нервової системи (ЦНС). Воно досліджується як модель демієлінізуючих захворювань людської ЦНС, у тому числі такого захворювання як розсіяний склероз. 21 UA 104587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Відомо, що миші лінії C57BL/6 є сприйнятливими до цього захворювання при введенні їм пацючого основного мієлінового білка за схемою ревакцинацій, за якою мишам вводять 200 мкг пацючого MBP у CFA у 0 день та 17 день з подальшим введенням стандартного коклюшного токсину. Наслідком обробки за цією схемою є виникнення монофазного захворювання помірної тяжкості, де гістологічними ознаками, які з'являються на 20 день, є запалення та пошкодження аксонів, але без значної демієлінізації. 10 мишам у експериментальній групі у різних концентраціях вводили сурогатне антитіло, подібне до T1h, яке зв'язується з подібним доменом у мишачих CD6, що і T1h у людських CD6. Доза коливалась у межах від 2,46 мг/кг на тиждень до 19,68 мг/кг на тиждень. Лікування значною мірою контролювало згадане захворювання дозозалежним чином, особливо при найвищій дозі, у порівнянні з групою, яка одержувала плацебо. Приклад 16 Алогенний трансплантат Шкірний трансплантат може відторгатись специфічним чином, коли шкіру інбредних мишей лінії А пересаджують мишам лінії В. Шкіра спочатку васкуляризується між 3 та 7 днями. Потім васкуляризована шкіра інфільтрується лімфоцитами, моноцитами, нейтрофілами та іншими запальними клітинами. На 7-10 день спостерігається зменшення ступеня васкуляризації трансплантованої тканини, і видимі ознаки некрозу з'являються через 10 днів. Цей експеримент проводили на двадцяти мишах (BALBc-WT), яким пересаджували шкірні трансплантати від мишей лінії C57BL6/WT. Шкіра була вирізана та пересаджена різним мишам лінії BALBc за стандартною хірургічною методикою. Десяти мишам у експериментальній групі у різних концентраціях вводили сурогатне антитіло, подібне до T1h, яке зв'язується з подібним доменом у мишачих CD6, як T1h – у людських CD6. Доза коливалась від 2,46 мг/кг на тиждень до 19,68 мг/кг на тиждень. Першу ін'єкцію зробили за тиждень до того, як мишам лінії BALB був пересаджений трансплантат. Ін'єкції робили протягом 6 тижнів після трансплантації. Дані, як видається, дозволяють зробити припущення про те, що толерантність до шкірних трансплантатів була більшою у тих мишей, які одержували лікарський препарат, у порівнянні з тваринами, яких не піддавали лікуванню. В усіх тварин, яких не піддавали лікуванню, у межах трьох тижнів спостерігалась некротизація трансплантатів. Толерантність до трансплантата також була дозозалежною у тварин, які одержували найвищу дозу, з тривалішим збереженням трансплантата. ЛІСТИНГ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ Biocon Ltd Melarkode, Ramakrishnan et al. Моноклональне антитіло і спосіб його застосування IP08494 4 PatentIn version 3.5 1 119 PRT Homo sapiens ПЕПТИД (1)...(119) 1 22 UA 104587 C2 5 10 2 107 PRT Homo sapiens ПЕПТИД (l)...(107) 2 23 UA 104587 C2 5 3 357 ДНК Homo sapiens екзон (1)...(357) 3 10 4 321 ДНК 24 UA 104587 C2 5 Homo sapiens екзон (1)...(321) 4 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 15 20 1. Моноклональне антитіло, що містить поліпептид важкого ланцюга та поліпептид легкого ланцюга, представлені послідовностями SEQ ID NO:1 та SEQ ID NО:2, відповідно, де згадані поліпептиди відповідають нуклеотидним послідовностям, представленим послідовностями SEQ ID NO:3 та SEQ ID NО:4, відповідно, яке специфічно зв'язується з доменом 1 (D1) CD6 та пригнічує проліферацію Т-клітин без перешкоджання зв'язуванню з ALCAM, причому згадане антитіло відрізняється тим, що воно має одну або декілька з наведених нижче властивостей: і) не індукує комплементзалежну цитотоксичність (CDC), антитілозалежну цитотоксичність або апоптоз in vitro; іі) пригнічує проліферацію наївних Т-клітин шляхом зменшення рівня прозапальних цитокінів; та ііі) не пригнічує проліферації Т-клітин пам'яті; причому згадане антитіло застосовують для лікування аутоімунних розладів, вибраних з групи, до складу якої входять розсіяний склероз, відторгнення трансплантата, діабет типу І, ревматоїдний артрит, псоріаз та інші аутоімунні розлади, опосередковані Т-клітинами, шляхом 25 UA 104587 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 введення згаданого антитіла в організм суб'єкта, який цього потребує, у фармацевтично ефективній дозі 0,1-25 мг/кг на тиждень. 2. Моноклональне антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що пригнічує проліферацію наївних РВМС, індуковану кон'югованим антитілом проти CD3; комбінацією кон'югованого антитіла проти CD3 та антитіла проти CD6 або комбінацією кон'югованого антитіла проти CD3 та ALCAM. 3. Моноклональне антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що специфічно пригнічує односпрямовану MLR, де Raji-клітини є антигенпрезентуючими клітинами, а РВМС проліферують. 4. Моноклональне антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що специфічно пригнічує односпрямовану аутологічну MLR, опосередковану РВМС. 5. Моноклональне антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що спричиняє пригнічення проліферації наївних Т-клітин шляхом зменшення кількості CD25 та CD4. 6. Моноклональне антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що пригнічує проліферацію Т-клітин шляхом опосередкування супресії IL2. 7. Моноклональне антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що демонструє посилення функціональної активності з доданням екзогенного IL2. 8. Моноклональне антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що приймає участь у даун-регуляції прозапальних цитокінів IL6 та INFγ. 9. Моноклональне антитіло за п. 1, яке застосовують для лікування аутоімунних розладів, вибраних із групи, до складу якої входять розсіяний склероз, відторгнення трансплантата, діабет типу І, ревматоїдний артрит, псоріаз та інші аутоімунні розлади, опосередковані Тклітинами, шляхом введення згаданого антитіла в організм суб'єкта, який цього потребує, у фармацевтично ефективній дозі 0,1-25 мг/кг на тиждень у комбінації з імунодепресивними засобами. 10. Моноклональне антитіло за п. 1, яке застосовують для лікування аутоімунних розладів, вибраних із групи, до складу якої входять розсіяний склероз, відторгнення трансплантата, діабет типу І, ревматоїдний артрит, псоріаз та інші аутоімунні розлади, опосередковані Тклітинами, шляхом введення згаданого антитіла в організм суб'єкта, який цього потребує, у фармацевтично ефективній дозі 0,1-25 мг/кг на тиждень у комбінації зі здатними до викликання протизапальної імунної реакції антигенами, вибраними з групи, до складу якої входять інсулін, GAD, MOG, МВР та HSP60. 11. Спосіб лікування аутоімунного розладу, вибраного з групи, до складу якої входять розсіяний склероз, відторгнення трансплантата, діабет типу І, ревматоїдний артрит, псоріаз та інші аутоімунні розлади, опосередковані Т-клітинами, який включає стадію введення антитіла, яке містить поліпептид важкого ланцюга та поліпептид легкого ланцюга, представлені послідовностями SEQ ID NO:1 та SEQ ID NO:2, відповідно, причому згадані поліпептиди відповідають нуклеотидним послідовностям, представленим послідовностями SEO ID NО:3 та SEQ ID NO:4, відповідно, у фармацевтично ефективній дозі 0,1-25 мг/кг на тиждень в організм суб'єкта, який цього потребує. 12. Моноклональне антитіло, яке містить поліпептид важкого ланцюга та поліпептид легкого ланцюга, представлені послідовностями SEQ ID NO:1 та SEQ ID NO:2, відповідно, яке застосовують для лікування шляхом введення у фармацевтично ефективній дозі 0,1-25 мг/кг на тиждень в організм суб'єкта, який цього потребує. 13. Моноклональне антитіло за п. 12, причому згадане антитіло вводять у комбінації зі здатними до викликання протизапальної імунної реакції антигенами, вибраними з групи, до складу якої входять інсулін, GAD, MOG, МВР та HSP60. 26 UA 104587 C2 27 UA 104587 C2 28