Гуманізоване антитіло до il-25

Реферат: Винахід належить до виділеного антитіла, способу його одержання, композиції, що містить вказане антитіло та способу його застосування для лікування або профілактики астми. UA 112965 C2 вс (12) UA 112965 C2 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ Інтерлейкін-25 (IL-25), також відомий як IL-17E, належить до групи цитокінів IL-17 і секретується лімфоцитами - Т-хелперами другого типу (Th2), а також тучними клітинами. IL-25 індукує вироблення інших цитокінів, включаючи цитокіни IL-4, IL-5 і IL-13, в різних тканинах і стимулює збільшення чисельності еозинофілів. Відмічена участь цитокіну IL-25 в хронічних запальних процесах шлунково-кишкового тракту, а ген IL-25 розташовується в хромосомній області, асоційованій з розвитком аутоімунних захворювань кишечнику, наприклад із запальним захворюванням кишечнику (ЗЗК). Загальноприйнята терапія ЗЗК основується на прийомі антибіотиків або стероїдних препаратів, проте дана стратегія не приводить до клінічної ремісії у пацієнтів. Підвищена експресія IL-25 відмічена в зразках, одержаних від пацієнтів, страждаючих астмою - захворюванням, до якого за оцінками схильні більше 300 мільйонів чоловік у всьому світі, що дозволяє передбачати, що підвищена експресія даного цитокіну має відношення до патофізіології астми і інших схожих захворювань. Таким чином, існує необхідність одержання ефективних антагоністів IL-25, які можуть знайти застосування при лікуванні захворювань і станів, що характеризуються підвищеною експресією IL-25, включаючи такі захворювання, як астма і запальне захворювання кишечнику. КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Даний винахід стосується агентів, що зв'язуються з мішенню, включаючи антитіла і їх зв'язувальні фрагменти, направлених на взаємодію з інтерлейкіном-25 (IL-25). Даний винахід додатково стосується різновидів RH2.5_R71V, що являє собою гуманізований (CDR-прищеплений) варіант мишачого антитіла 2C3, також званого в цьому документі "huDDG91" і "M9". Один з вказаних різновидів називається в цьому документі "M6 антитіло", або просто "M6". M6 виявляє цілий ряд корисних властивостей як in vitro, так і in vivo, включаючи, наприклад, підвищену афінність зв'язування з IL-25 в порівнянні з вихідним антитілом huDDG91, підвищену здатність інгібувати рецептор IL-25 в клітинних і рецепторних тестових системах в порівнянні з вихідним антитілом huDDG91, а також інші характеристики, такі як високий рівень експресії, висока розчинність, відсутність скільки-небудь значущої агрегації білків при очищенні, відсутність небажаних посттрансляційних модифікацій, білок-білкових взаємодій і окислення при очищенні. У одному варіанті здійснення даний винахід стосується агента, що зв'язується з мішенню, який зв'язується з IL-25, причому агент, що зв'язується з мішенню, зв'язується з однією або більше амінокислотними послідовностями, вибраними з групи, що складається з амінокислотних залишків 46-63 послідовності SEQ ID NO: 17, амінокислотних залишків 66-84 послідовності SEQ ID NO: 17 і амінокислотних залишків 129-135 послідовності SEQ ID NO: 17. У одному конкретному варіанті здійснення запропонований в даному винаході агент, що зв'язується з мішенню, може зв'язуватися з амінокислотними залишками 56-63 послідовності SEQ ID NO: 17 і амінокислотними залишками 66-74 послідовності SEQ ID NO: 17. У іншому варіанті здійснення агент, що зв'язується з мішенню, містить домен VL антитіла, який включає в себе ділянку CDR3, що, в свою чергу, містить амінокислотну послідовність QQYLAFPYTF (SEQ ID NO: 8). У іншому варіанті здійснення даний винахід стосується агента, що зв'язується з мішенню, який зв'язується з IL-25, причому агент, що зв'язується з мішенню, містить: а) домен VL антитіла, який містить ділянку CDR1, що включає амінокислотну послідовність SASQGISNYLN (SEQ ID NO: 6), ділянку CDR2, що включає амінокислотну послідовність YTSSLHS (SEQ ID NO: 7), і ділянку CDR3, що включає амінокислотну послідовність QQYLAFPYTF (SEQ ID NO: 8); і b) домен VH антитіла, який містить ділянку CDR1, що включає амінокислотну послідовність GYTMN (SEQ ID NO: 10), ділянку CDR2, що включає амінокислотну послідовність LINPYNGGTSYNQNFKG (SEQ ID NO: 11), і ділянку CDR3, що включає амінокислотну послідовність EDYDGYLYFAMDY (SEQ ID NO: 12). В одному конкретному варіанті здійснення агент, що зв'язується з мішенню, містить домен VL, який містить послідовність SEQ ID NO: 5, і домен VH, який містить послідовність SEQ ID NO: 9. У додатковому варіанті здійснення агент, що зв'язується з мішенню, цілком містить антитіло. У різних варіантах здійснення даний винахід додатково стосується виділеної нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує запропонований в даному винаході агент, що зв'язуєтьсяз мішенню, вектора експресії, що містить вказану нуклеотидну послідовність, і клітини-хазяїна, що несе такі вектори експресії. 1 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У інших варіантах здійснення даний винахід стосується способу вироблення агента, що зв'язується з мішенню, який включає культивування запропонованих в даному винаході клітинхазяїнів в умовах, які забезпечують вироблення агента, що зв'язується з мішенню. У подальшому варіанті здійснення даний винахід представляє композиції, які містять запропонований в даному винаході агент, що зв'язується з мішенню, і фармацевтично прийнятний носій. У додаткових варіантах здійснення даний винахід включає в себе способи лікування або профілактики захворювання або стану у потребуючого цього об'єкта, включаючи, крім іншого, астму і запальне захворювання кишечнику. У подальшому варіанті здійснення в даному винаході описане використання запропонованих в даному винаході агентів, що зв'язуються з мішенню, наприклад, у формі фармацевтичної композиції, для лікування захворювань або станів, включаючи запальні стани, такі як астма (включаючи алергічну астму), а також запальне захворювання кишечнику (наприклад, хвороба Крона і виразковий коліт). У інших варіантах здійснення даний винахід стосується агента, що зв'язується з мішенню, конкуруючого за зв'язування з IL-25 з агентом, що зв'язується з мішенню, який зв'язується з однією або більше амінокислотними послідовностями, вибраними з групи, що складається з амінокислотних залишків 46-63 послідовності SEQ ID NO: 17, амінокислотних залишків 66-84 послідовності SEQ ID NO: 17 і амінокислотних залишків 129-135 послідовності SEQ ID NO: 17. У одному конкретному варіанті здійснення агент, що зв'язується з мішенню, має афінність зв'язування з IL-25 людини, яка дорівнює приблизно 50 пM або менше. У іншому варіанті здійснення даний винахід додатково стосується запропонованого в даному винаході агента, що зв'язується з мішенню, який містить: а) домен VL антитіла, який містить амінокислотну послідовність, що має від 1 до приблизно 20 амінокислотних замін в порівнянні з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 5; b) домен VH антитіла, який містить амінокислотну послідовність, що має від 1 до приблизно 20 амінокислотних замін в порівнянні з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 9; або c) їх комбінацію. У ще одному варіанті здійснення даний винахід пропонує спосіб вироблення представленого в даному винаході агента, що зв'язується з мішенню, який включає: (а) забезпечення вихідного набору кодуючих домен VL нуклеїнових кислот, причому нуклеїнові кислоти або включають в себе підлягаючу заміні ділянку, що кодує ділянку CDR3, або не містять ділянку, що кодує ділянку CDR3; (b) об'єднання вихідного набору з нуклеїновою кислотою донора, яка кодує ділянку CDR3 домену VL і має амінокислотну послідовність QQYLAFPYTF (SEQ ID NO: 8), причому нуклеїнова кислота донора вбудовується в одну або більше нуклеїнових кислот вихідного набору для одержання набору продуктів нуклеїнових кислот, що кодують домен VL, які містять ділянку CDR3 домену, що має амінокислотну послідовність QQYLAFPYTF (SEQ ID NO: 8); (с) експресію нуклеїнових кислот набору продуктів для надання агентів, що зв'язуються з мішенню; (d) відбір агента, що зв'язується з мішенню, який специфічно зв'язується з однією або більше послідовностями, вибраними з групи, що складається з амінокислотних залишків 56-63 послідовності SEQ ID NO: 17, амінокислотних залишків 66-74 послідовності SEQ ID NO: 17 і амінокислотних залишків 129-135 послідовності SEQ ID NO: 17; і (е) виділення агента, що зв'язується з мішенню, або нуклеїнової кислоти, яка кодує агент, що зв'язується з мішенню. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Патент або комплект матеріалів заявки містить щонайменше одне кольорове креслення. Копії даного патенту або публікації заявки на патент з кольоровим кресленням (кресленнями) можна одержати при подачі відповідної заявки і внесення оплати. На фіг. 1 показані нуклеотидна послідовність (SEQ ID NO: 1) і амінокислотна послідовність (SEQ ID NO: 2) легкого ланцюга каппа антитіла huDDG91/RH2.5_R71V. Підкреслені ділянки в амінокислотній послідовності відповідають ділянкам CDR. Лідерна послідовність не включена. На фіг. 2 показані нуклеотидна послідовність (SEQ ID NO: 3) і амінокислотна послідовність (SEQ ID NO: 4) важкого ланцюга антитіла huDDG91/RH2.5_R71V. Підкреслені ділянки в амінокислотній послідовності відповідають ділянкам CDR. Лідерна послідовність не включена. У наведеній на фіг. 3 таблиці представлені властивості 9 потенційних моноклональних антитіл, включаючи M6, ідентифікованих при скринінгу 25-членної комбінаторної бібліотеки, побудованої на основі антитіла huDDG91/RH2.5_R71V. Курсивом виділені числа, одержані з іншого набору даних. R71V G1 належить до антитіла huDDG91. Два ряди R71V G1 являють 2 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 собою вимірювання з двох різних наборів даних. Залишки з підвищеною гідрофобністю виділені жовтим кольором. На фіг. 4A показані амінокислотні послідовності легкого ланцюга антитіла M6 (SEQ ID NO: 5) і його ділянки CDR (SEQ ID NO: 6-8). Підкреслені ділянки в амінокислотній послідовності вказують розташування ділянок CDR. Лідерна послідовність не включена. Виділені червоним жирним шрифтом амінокислотні залишки означають амінокислотні заміни відносно вихідної послідовності huDDG91/RH2.5_R71V. На фіг. 4B показані амінокислотні послідовності важкого ланцюга антитіла M6 (SEQ ID NO: 9) і його ділянки CDR (SEQ ID NO: 10-12). Підкреслені ділянки в амінокислотній послідовності вказують розташування ділянок CDR. Лідерна послідовність не включена. На фіг. 5 представлений графік, який демонструє, що антитіла M6 пригнічують IL-4/IL-25залежну продукцію IL-5 в наївних Т-клітинах CD4+ людини, попередньо стимульованих протягом 4 днів аутогенними дендритними клітинами в присутності rhIL-4 і rhIL-25, більшою мірою, ніж антитіло huDDG91 (M9). Як контроль використовували антитіло до ізотипу IgG1 (iso). n=4 донора. На фіг. 6A і 6B представлені графіки, що показують збільшення пригнічення IL-25-залежної продукції GROa антитілом M6 відносно антитіла huDDG91 (M9) в клітинах LS174T, стимульованих рекомбінантним IL-25 людини протягом 24 годин. На графіках, представлених на фіг. 6A і 6B, показані дані, одержані в двох різних експериментах. На фіг. 7A показана карта покриття послідовності амінокислотних залишків 1-78 IL-25 людини (SEQ ID NO: 13) при розщепленні пепсином в присутності 2M сечовини, 1M TCEP, гасіння при pH 3,0. Чорною лінією показаний спостережуваний пептид. На фіг. 7B показана карта покриття послідовності амінокислотних залишків 79-146 IL-25 людини (SEQ ID NO: 14) при розщепленні пепсином в присутності 2M сечовини, 1M TCEP, гасіння при pH 3,0. Чорною лінією показаний спостережуваний пептид. На фіг. 8A і 8B показані відмінності в рівнях дейтерування різних сегментів білка IL-25 людини (SEQ ID NO: 15 і SEQ ID NO: 16) при зв'язуванні з антитілом М6 в експериментах по Н/D-обміну. Кожний блок відповідає пептиду IL-25 людини і містить дані для шести часових інтервалів: 150 с і 500 с при pH 6, а також 150 с, 500 с, 1500 с і 5000 с при pH 7. Темно-синій колір вказує на відсутність захисту при зв'язуванні з антитілом M6. Інші кольори вказують на більший вміст дейтерію після обміну асоціація-в-розчині/дисоціація-в-колонці, ніж після обміну асоціація-в-колонці/дисоціація-в-колонці, як показано в правій вставці. Дейтерій, приєднаний до одного з двох перших амінокислотних залишків кожного іона, втрачається в процесі аналізу (розщеплення/розділення/мас-спектрометричний аналіз у водному середовищі), що є причиною невеликих пропусків в розподілі Н/D-обмінів. На фіг. 9A-9F представлені графіки, які показують вміст дейтерію в різних сегментах IL-25 людини після обміну при асоціації/дисоціації при pH 6 і pH 7, при 3 °C в колонці, що містить антитіло M6. Синім кольором показаний обмін типу асоціація-в-розчині/дисоціація-в-колонці, темно-червоним кольором показаний обмін типу асоціація-в-колонці/дисоціація-в-колонці. Всі проміжки часу обміну переведені в еквівалентний час обміну при pH 7 і 23 °C (наприклад, 150 с при pH 6 і 3 °C дорівнює 1,85 с при pH 7 і 23 °C). Залишки IL-25 людини, що представляються в кожному сегменті, вказані у верхній частині кожного графіка. На фіг. 10 представлена амінокислотна послідовність IL-25 людини (SEQ ID NO: 17). ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Даний винахід основується частково на ідентифікації високоафінного антитіла до IL-25 людини, званого в цьому документі "M6" (див. приклад 1), а також на ідентифікації амінокислотних залишків в IL-25 людини, які зв'язуються з антитілом M6, що проводиться за допомогою мас-спектрометрії воднево-дейтерієвого (Н/D) обміну (див. приклад 3). Відповідно, в одному варіанті здійснення даний винахід стосується агента, що зв'язується з мішенню, який зв'язується з IL-25, причому агент, що зв'язується з мішенню, зв'язується з однією або більше амінокислотними послідовностями, вибраними з групи, що складається з амінокислотних залишків 46-63, 66-84 і 129-135 IL-25 людини (SEQ ID NO: 17). Так, агенти, що зв'язуються з мішенню, які складають предмет даного винаходу, можуть зв'язуватися з амінокислотними залишками 46-63 послідовності SEQ ID NO: 17, амінокислотними залишками 66-84 послідовності SEQ ID NO: 17, амінокислотними залишками 129-135 послідовності SEQ ID NO: 17 або будь-якою їх комбінацією. У одному варіанті здійснення агенти, що зв'язуються з мішенню, які представляють предмет даного винаходу, зв'язуються з амінокислотами 56-63 послідовності SEQ ID NO: 17 і амінокислотами 66-74 послідовності SEQ ID NO: 17. Використовуваний в цьому документі термін "агент, що зв'язується з мішенню", стосується будь-якого білка або пептиду, що містить молекулу, яка містить щонайменше частину молекули 3 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імуноглобуліну, яка включає в себе щонайменше одну ділянку, що визначає комплементарність (CDR), важкого або легкого ланцюга, або ж її фрагмент, що зв'язує ліганд, який специфічно зв'язується з білком IL-25 ссавця (в т. ч. людини), або його фрагмент. Такі агенти, що зв'язуються з мішенню, можуть додатково включати в себе щонайменше частину варіабельної ділянки важкого або легкого ланцюга антитіла, щонайменше частину константної ділянки важкого або легкого ланцюга антитіла, щонайменше частину каркасної ділянки антитіла або будь-яку їх комбінацію. Подібні агенти, що зв'язуються з мішенню, модулюють, зменшують, антагонізують, пом'якшують, знижують, блокують, інгібують, анулюють і (або) інтерферують для щонайменше однієї активності або зв'язування IL-25 або для активності або зв'язування рецептора IL-25, in vitro, in situ і (або) in vivo. Як необмежувальний приклад, належно вибраний агент, що зв'язується з мішенню, який складає предмет даного винаходу, може з високою афінністю зв'язуватися з інгібуючим і (або) нейтралізуючим епітопом IL-25 людини, розпізнаваним описуваним в цьому документі антитілом M6. Агенти, що зв'язуються з мішенню, які складають предмет даного винаходу, не обмежуються агентами, які зв'язуються тільки з амінокислотними залишками 46-63, амінокислотними залишками 66-84 і (або) амінокислотними залишками 129-135 послідовності SEQ ID NO: 17. Так, в деяких варіантах здійснення агенти, що зв'язуються з мішенню, які складають предмет даного винаходу, можуть додатково зв'язуватися з одним або більше іншими фрагментами IL-25 людини, які не охоплюють амінокислотні залишки 46-63, амінокислотні залишки 66-84 і (або) амінокислотні залишки 129-135 послідовності SEQ ID NO: 17. У інших випадках агенти, що зв'язуються з мішенню, які складають предмет даного винаходу, можуть додатково зв'язуватися з одним або більше амінокислотними залишками IL-25 людини, фланкуючими амінокислотні залишки 46-63, амінокислотні залишки 66-84 і (або) амінокислотні залишки 129-135 послідовності SEQ ID NO: 17. У даному винаході додатково передбачаються агенти, що зв'язуються з мішенню, які зв'язуються з однією або більше ділянками IL-25 людини, що знаходяться в межах амінокислотних залишків 46-63, амінокислотних залишків 66-84 і (або) амінокислотних залишків 129-135 послідовності SEQ ID NO: 17, таких як, наприклад, ділянки IL-25, що складаються з щонайменше 5 амінокислот в межах амінокислотних залишків 46-63, амінокислотних залишків 66-84 і (або) амінокислотних залишків 129-135 послідовності SEQ ID NO: 17. Приклади ділянок IL-25, з якими можуть зв'язуватися агенти, що зв'язуються з мішенню, включають в себе амінокислоти 56-63 і (або) амінокислоти 66-74 послідовності SEQ ID NO: 17. Ділянка IL-25, або епітоп, з якою зв'язується агент, що зв'язується з мішенню, який складає предмет даного винаходу, може бути визначена з використанням будь-якого з декількох стандартних способів картування епітопів, добре відомих фахівцям в галузі, до якої належить даний винахід. Подібні способи включають в себе, наприклад, сайт-направлений мутагенез в поєднанні з аналізами зв'язування, картування епітопів з використанням пептидних пінів (див., наприклад, Geysen et al. Peptides: Chemistry and Biological, Proceedings of the Twelfth American Peptide Symposium / під ред. G.R. Marshall. - Escom, Leiden, 1988. - стор. 519-523), рентгенокристалографію, а також способи воднево-дейтерієвого (Н/D) обміну (наприклад, масспектрометрію Н/D-обміну). Згідно з наведеним в даному документі описом, мас-спектрометрію Н/D-обміну використовували для визначення епітопа(ів) в IL-25 людини, що упізнається і зв'язується антитілом M6 (див. приклад 3, а також фіг. 8A, 8B і 9A-9F). При перенесенні з води в розчин, що містить дейтерій (важка вода), відбувається збільшення маси білка, оскільки атоми водню в білку поступово заміняються дейтерієм (більш важким ізотопом водню). Імовірність водневодейтерієвого обміну в основному визначається структурою білка і доступністю для розчинника. Мас-спектрометрія Н/D-обміну використовується для вимірювання інтенсивності обміну і, як наслідок, структури білка і доступності для розчинника. При зв'язуванні невеликої молекули, або партнера по зв'язуванню з білком, з білком-мішенню останній піддається експериментально спостережуваним змінам інтенсивності Н/D-обміну. Ділянки поверхні, в яких розчинник витісняється при формуванні комплексу, Н/D-обмін здійснюють значно повільніше. Недоступні для розчинника ділянки можна використовувати для з'ясування місцезнаходження сайта зв'язування. Наприклад, у випадку взаємодії антиген-антитіло такі зміни вказують на місцезнаходження епітопа. Як правило, агент, що зв'язується з мішенню, який складає предмет даного винаходу, містить домен варіабельної ділянки легкого ланцюга (VL) антитіла в парі з доменом варіабельної ділянки важкого ланцюга (VH) антитіла, які утворюють домен зв'язування з IL-25. При створенні описаного в цьому документі винаходу було виявлено, що афінність зв'язування антитіла huDDG91 може бути поліпшена за рахунок заміни ділянки, що визначає 4 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 комплементарність (CDR), в домені VL антитіла huDDG91 (SEQ ID NO: 1), а саме ділянки CDR3, на QQYLAFPYTF (SEQ ID NO: 8). Відповідно, описаний в цьому документі винахід передбачає домени VL, що містять SEQ ID NO: 8, і агенти, що зв'язуються з мішенню, які містять такі домени VL. У деяких варіантах здійснення домени VL агентів, що зв'язуються з мішенню, які складають предмет даного винаходу, також містять ділянки CDR1 (SASQGISNYLN (SEQ ID NO: 6)) і CDR2 (YTSSLHS (SEQ ID NO: 7)) антитіл M6 і huDDG91. Інші відповідні ділянки VL CDR для включення в агенти, що зв'язуються з мішенню, які складають предмет даного винаходу, включають в себе, крім іншого, будь-які ділянки VL CDR1, показані на фіг. 3. У одному варіанті здійснення агенти, що зв'язуються з мішенню, які складають предмет даного винаходу, містять послідовність SEQ ID NO: 5, а також домен VL антитіла M6. У деяких варіантах здійснення агенти, що зв'язуються з мішенню, які складають предмет даного винаходу, містять домен VH, який містить послідовності SEQ ID NO: 10-12, відповідні ділянкам CDR антитіл M6 і huDDG91. Інші відповідні ділянки VH CDR для включення в агенти, що зв'язуються з мішенню, які складають предмет даного винаходу, включають в себе, крім іншого, будь-які ділянки VH CDR3, показані на фіг. 3. У переважному варіанті здійснення агенти, що зв'язуються з мішенню, які складають предмет даного винаходу, містять послідовність SEQ ID NO: 9, домен VH антитіл M6 і huDDG91. Домен VH може бути об'єднаний в пару з рядом доменів VL, відмінних від домену VL антитіла M6 (SEQ ID NO: 5). Переважно домен VH об'єднаний в пару з доменом VL, який містить ділянку CDR3, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 8. Описані в цьому документі послідовності ділянок CDR антитіла M6 можуть бути модифіковані шляхом вставок, замін або делецій і можуть бути включені в агент, що зв'язується з мішенню, який складає предмет даного винаходу, таким чином, щоб агент (наприклад, антитіло), що зв'язується з мішенню, який має модифіковану ділянку(и) CDR, зберігав здатність зв'язуватися з IL-25 людини і інгібувати його. Фахівець в даній галузі може пересвідчитися в збереженні вказаної активності за допомогою описаних в цьому документі функціональних аналізів. Ділянка CDR агента, що зв'язується з мішенню, який складає предмет даного винаходу, може мати, наприклад, міру гомології від приблизно 50 % до приблизно 100 %, переважно міру гомології від приблизно 80 % до приблизно 100 %, більш переважно міру гомології від приблизно 90 % до приблизно 100 % з відповідною ділянкою CDR антитіла M6, представленою послідовностями SEQ ID NO: 6, 7, 8, 10, 11 або 12. У одному варіанті здійснення ділянка CDR агента, що зв'язується з мішенню, який складає предмет даного винаходу, може мати міру гомології приблизно 100 % з відповідною ділянкою CDR антитіла M6, представленою послідовностями SEQ ID NO: 6, 7, 8, 10, 11 або 12. Агент, що зв'язується з мішенню, відповідно до даного винаходу може зв'язуватися з IL-25 з афінністю, яка по суті близька до афінності антитіла M6, описаного в цьому документі, або перевищує її. Наприклад, агент, що зв'язується з мішенню, який складає предмет даного винаходу, може виявляти афінність зв'язування відносно IL-25 (наприклад, відносно IL-25 людини) приблизно 50 пM (наприклад, приблизно 53 пM) або менше, наприклад приблизно 45 пM, приблизно 40 пM, приблизно 35 пM, приблизно 30 пM, приблизно 25 пM або приблизно 20 пM. Агент, що зв'язується з мішенню, як правило, специфічний до IL-25. Так, агент, що зв'язується з мішенню, не буде виявляти скільки-небудь значуще зв'язування відносно молекул, відмінних від свого специфічного партнера(ів) по зв'язуванню. Наприклад, було виявлено, що описане в цьому документі антитіло M6 не дає перехресну реакцію з IL-17A, IL-17C, IL-17D або IL-17F. Усунення такої перехресної реакції з іншими цитокінами, причетними до розвитку астми і схожих процесів, є бажаною характеристикою агентів, що зв'язуються з мішенню, в деяких варіантах здійснення даного винаходу. Афінність, або авідність агента, що зв'язується з мішенню, і антигену може бути визначена експериментально будь-яким відповідним способом (див., наприклад, Berzofsky et al. AntibodyAntigen Interactions, in Fundamental Immunology, під ред. Paul W.E., Raven Press: м. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк (1984); Kuby, Janis, Immunology, W.H. Freeman and Company: м. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк (1992)), а також способами, описаними в цьому документі. Виміряна афінність конкретної взаємодії антитіло-антиген може варіюватися залежно від різних умов (наприклад, концентрації солей, pH). Таким чином, вимірювання афінності і інших параметрів зв'язування антигену (наприклад, KD, Ka, Kd) переважно проводити із застосуванням стандартизованих розчинів антитіла і антигену і стандартизованого буферного розчину, такого як буферний розчин, описаний в цьому документі. Наприклад, специфічність може бути визначена за допомогою аналізу зв'язування, такого як, серед інших, ELISA, з використанням стандартного набору антигенів, аналізу Biacore і (або) аналізу Octet. Агент, що зв'язується з мішенню, відповідно до даного винаходу може 5 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розпізнавати IL-25, але не інші члени сімейства IL-17, зокрема будь-який з IL-17A, IL-17B, IL17C, IL-17D і IL-17F; в одному варіанті здійснення не розпізнаються всі п'ять вказаних молекул. Зв'язуванню агента, що зв'язується з мішенню, відповідно до даного винаходу з IL-25 можна запобігти за рахунок конкуренції з рекомбінантним IL-25. Афінність зв'язування і ефективність нейтралізації різних агентів, що зв'язуються з мішенню, можна порівнювати при відповідних умовах. Даний винахід також стосується агента, що зв'язується з мішенню, конкуруючого за зв'язування з IL-25 з таким агентом, що зв'язується з мішенню, який складає предмет даного винаходу, який зв'язується з однією або більше амінокислотними послідовностями, вибраними з групи, що складається з амінокислотних залишків 46-63 послідовності SEQ ID NO: 17, амінокислотних залишків 66-84 послідовності SEQ ID NO: 17 і амінокислотних залишків 129-135 послідовності SEQ ID NO: 17. У одному конкретному варіанті здійснення агент, що зв'язується з мішенню, має афінність зв'язування з IL-25 людини, яка менше ніж або дорівнює приблизно 50 пM. Для визначення того, які білки, антитіла і інші антагоністи конкурують за зв'язування з IL-25 з агентом, що зв'язується з мішенню, який складає предмет даного винаходу, і (або) спільно використовують ділянку епітопа, можливе проведення аналізу конкурентного зв'язування агента (наприклад, антитіла), що зв'язується з мішенню, який складає предмет даного винаходу. Ці аналізи, добре відомі фахівцям в даній галузі, дозволяють оцінити конкуренцію між антагоністами або лігандами за обмежену кількість сайтів зв'язування білка, наприклад, IL-25. Білок і (або) антитіло іммобілізують або переводять в нерозчинну форму до або після конкурентного аналізу, і частину зразка, що зв'язалася з білком IL-25, відділяють від частини зразка, що не зв'язалася, наприклад, шляхом декантування (якщо білок/агент, що зв'язується з мішенню, попередньо перевели в нерозчинну форму) або центрифугування (якщо білок/антитіло осадили після реакції конкурентного зв'язування). Крім того, конкурентне зв'язування можна визначити по тому, чи змінюється функціонування білка в результаті зв'язування або відсутності зв'язування агента, що зв'язується з мішенню, з даним білком: наприклад, молекула агента, що зв'язується з мішенню, може інгібувати або стимулювати ферментативну активність, наприклад, мітки. Як добре відомо фахівцям, для цих цілей можна також застосовувати імуноферментний аналіз (ELISA) і інші функціональні аналізи. Антитіла Агент, що зв'язується з мішенню, який складає предмет даного винаходу, переважно є молекулою антитіла. З метою даного винаходу термін "антитіло" охоплює цільні антитіла, продукти їх ферментативного розщеплення, їх конкретні фрагменти і варіанти, включаючи міметики антитіл, або фрагменти антитіл, що імітують структуру і (або) функцію антитіла або його конкретного фрагмента або частини, включаючи одноланцюжкові антитіла і їх фрагменти; кожний з яких містить щонайменше одну ділянку CDR. Функціональні фрагменти включають в себе антигензв'язувальні фрагменти, які зв'язуються з IL-25 ссавця. Наприклад, даний винахід охоплює фрагменти антитіла, здатні зв'язуватися з IL-25 або його частинами, включаючи, крім іншого, фрагменти Fab (наприклад, в результаті розщеплення папаїном), Fab' (наприклад, в результаті розщеплення пепсином і часткового відновлення) і F(ab') 2 (наприклад, в результаті розщеплення пепсином), facb (наприклад, в результаті розщеплення плазміном), pFc' (наприклад, в результаті розщеплення пепсином або плазміном), Fd (наприклад, в результаті розщеплення пепсином, часткового відновлення і реагрегації), Fv або scFv (наприклад, при застосуванні способів молекулярної біології) (див., наприклад, під ред. Colligan et al. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., м. Нью-Йорк (1994 2001); Colligan et al. Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, м. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, (1997 2001)). Такі фрагменти можуть бути одержані шляхом ферментативного розщеплення, синтетичними або рекомбінантними способами, як відомо фахівцям і (або) описано в цьому документі. Антитіла також можуть бути одержані в різних укорочених формах за допомогою генів антитіл, в яких перед природним стоп-сайтом введений один або більше стоп-кодонів. Наприклад, комбінаційний ген, що кодує ділянку важкого ланцюга F(ab') 2, може бути підготовлений з можливістю включати в себе послідовність ДНК, що кодує домен CH1 і (або) шарнірну область важкого ланцюга. Різні ділянки антитіл можуть бути зв'язані хімічно при застосуванні звичайних способів або можуть бути одержані як єдиний безперервний білок при застосуванні способів генної інженерії. Використовуваний в цьому документі термін "антитіло" також охоплює "химерні" антитіла, "гуманізовані" або "CDR-прищеплені" антитіла, що включають в себе будь-яку комбінацію описаних в цьому документі ділянок CDR M6 з одним або більше білками або пептидами, одержаними з немишачого, переважно людського, антитіла. Відповідно до даного винаходу 6 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пропонується одержання химерних або гуманізованих антитіл, в яких ділянки CDR одержані з антитіла M6. Так, в одному варіанті здійснення людська частина антитіла може включати в себе ділянки, які по суті не мають імуногенних властивостей у людей. Ділянки антитіл, одержані з людських антитіл, не обов'язково повинні бути на 100 % ідентичні людським антитілам. У переважному варіанті здійснення зберігається по можливості якомога більше число амінокислотних залишків для одержання нехтувано малої імуногенності, однак амінокислотні залишки людського антитіла можуть бути за необхідності модифіковані з метою забезпечення ефективності утвореного ділянками CDR сайта зв'язування з антигеном при одночасній максимальній гуманізації антитіла. Такі зміни або варіації необов'язково і переважно зберігають або ослабляють імуногенність у людини або інших видів відносно немодифікованих антитіл. Гуманізоване антитіло може бути вироблене нелюдською тваринною, або прокаріотичною, або еукаріотичною клітиною, здатною експресувати функціонально перебудовані гени людських імуноглобулінів (наприклад, важкого ланцюга і (або) легкого ланцюга). Крім того, якщо антитіло являє собою одноланцюжкове антитіло, воно може містити зв'язувальний пептид, відсутній в нативних антитілах людини. Наприклад, Fv може містити зв'язувальний пептид, такий як від двох до приблизно восьми гліцинів або інших амінокислотних залишків, який з'єднує варіабельну ділянку важкого ланцюга і варіабельну ділянку легкого ланцюга. Вважається, що такі зв'язувальні пептиди мають людське походження. У альтернативному варіанті здійснення вся варіабельна ділянка важкого ланцюга і варіабельна ділянка легкого ланцюга антитіла M6, показані на фіг. 4A і 4B (SEQ ID NO: 5 і 9), можуть бути об'єднані з людською константною і каркасною ділянками з одержанням агента, що зв'язується з мішенню, який складає предмет даного винаходу. Гени людини, які кодують константні (С) ділянки агента, що зв'язується з мішенню, який складає предмет даного винаходу, можуть бути одержані відомими способами з генів генної бібліотеки ембріональної печінки людини. Гени С-ділянок людини можуть бути одержані з генів будь-якої клітини людини, включаючи клітини, експресуючі і виробляючі імуноглобуліни. СНділянка людини може бути одержана з будь-якого відомого класу ізотипів Н-ланцюга людини, включаючи гамма, мю, альфа, дельта, епсилон, а також будь-які їх підтипи, такі як G1, G2, G3 і G4. Оскільки ізотип Н-ланцюга відповідає за різні ефекторні функції антитіла, при виборі СНділянки потрібно орієнтуватися на бажані ефекторні функції, такі як зв'язування комплементу, або активність залежної від антитіла клітинної цитотоксичності (ADCC). У одному варіанті здійснення СН-ділянка одержана з гамма 1 (IgG1). CL-ділянка людини може бути одержана з одного з ізотипів L-ланцюга людини, каппа або лямбда, переважніше каппа. Гени, що кодують С-ділянки імуноглобуліну людини, можуть бути одержані з клітин людини за допомогою стандартних способів клонування (див., наприклад, Sambrook et al. Molecular Cloning: А Laboratory Manual, 2-е видання, Cold Spring Harbor Press, Колд-Спринг-Харбор, штат Нью-Йорк (1989), і під ред. Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (1987, 1993)). Гени, що кодують С-ділянку людини, легко доступні з відомих клонів, які містять гени, що представляють вказані два класи L-ланцюга, п'ять класів Н-ланцюга, а також їх підкласи. Фрагменти химерного антитіла, такі як F(ab') 2 і Fab, можуть бути одержані шляхом дизайну відповідним чином укороченого гена химерного Н-ланцюга. Наприклад, химерний ген, що кодує ділянку Н-ланцюга фрагмента F(ab')2, включає в себе послідовності ДНК, що кодують домен CH1 і шарнірну ділянку Н-ланцюга, з трансляційним стоп-кодоном, що іде за ними, для одержання укороченої молекули. Як правило, в одному прикладі химерні антитіла, фрагменти і ділянки, які складають предмет даного винаходу, одержують шляхом клонування сегментів ДНК, що кодують антигензв'язувальні ділянки Н- і L-ланцюгів антитіла M6, а також приєднання вказаних сегментів ДНК до сегментів ДНК, що кодують CH- і CL-ділянки, відповідно, з одержанням химерних генів, що кодують імуноглобулін. Так, в одному варіанті здійснення створений злитий химерний ген, який містить перший сегмент ДНК, що кодує щонайменше антигензв'язувальну ділянку нелюдського походження, таку як функціонально модифікована V-ділянка із з'єднувальним (J) сегментом, зв'язаний з другим сегментом ДНК, що кодує щонайменше частину С-ділянки людини. Послідовність варіабельних ділянок антитіла M6 може бути модифікована за допомогою вставок, замін і делецій, при цьому агент, що зв'язується з мішенню, повинен зберігати свою здатність зв'язуватися з IL-25 людини і інгібувати його. Для зручності в цьому документі ми додержуємося схеми позначень, запропонованої Kabat et al. Залишки позначаються малими буквами або дефісами, так щоб представлені послідовності відповідали стандартній нумерації послідовності по Kabat. 7 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відповідно до даного винаходу, у випадку CDR-прищепленого або гуманізованого антитіла, коли ділянка CDR антитіла M6 об'єднана з людською ділянкою, в ділянці FR можуть бути збережені залишки, специфічні для вихідного антитіла, наприклад M6. Також можуть бути збережені залишки, які, згідно з наявними даними, є критичними для гуманізації інших антитіл. Цих рекомендацій потрібно додержуватися тією мірою, яка необхідна для формування утвореного ділянками CDR сайта зв'язування при одночасній максимальній гуманізації антитіла. Також можуть застосовуватися і добре відомі фахівцям способи конструювання або гуманізації нелюдських або людських антитіл. Як правило, гуманізоване або сконструйоване антитіло має один або більше амінокислотних залишків з джерела нелюдського походження, наприклад, крім іншого, миші, щура, кролика, нижчих приматів або інших ссавців. Ці амінокислотні залишки для людини звичайно називають "імпортованими" залишками, вони звичайно беруться з "імпортованих" варіабельних, константних або інших доменів відомої людської послідовності. Відомі послідовності Ig людини розкриті, наприклад, в ряді відкритих баз даних, таких як база даних NCBI Національного інститут охорони здоров'я США, або в публікаціях, наприклад, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Міністерство охорони здоров'я США (1983). Як відомо фахівцям, такі імпортовані послідовності можна використовувати для зниження імуногенності або для зниження, посилення або модифікації зв'язування, афінності, швидкості асоціації, швидкості дисоціації, авідності, специфічності, періоду напівжиття або будь-якої іншої відповідної характеристики. Як правило, частина або всі послідовності ділянок CDR нелюдського або людського походження можуть зберігатися, а послідовності варіабельних і константних ділянок нелюдського походження замінюються людськими або іншими амінокислотами. Антитіла можуть також бути необов'язково гуманізовані із збереженням високої афінності до свого антигену і інших сприятливих біологічних властивостей. Для досягнення цієї мети гуманізовані антитіла можуть бути необов'язково одержані в процесі аналізу вихідних послідовностей і різних концептуальних гуманізованих продуктів, використовуючи тривимірні моделі вихідних і гуманізованих послідовностей. Тривимірні моделі імуноглобулінів доступні і добре відомі фахівцям в даній галузі. Існують комп'ютерні програми, які ілюструють і відображають можливі тривимірні конформаційні структури вибраних потенційних послідовностей імуноглобулінів. Вивчення цих зображень дозволяє проаналізувати вірогідну роль залишків в функціонуванні потенційної послідовності імуноглобуліну, тобто провести аналіз залишків, які впливають на здатність потенційного імуноглобуліну до зв'язування зі своїм антигеном. Таким чином, із загального типового елемента структури і імпортованих послідовностей можуть бути вибрані і об'єднані залишки каркасної області так, щоб одержати бажану характеристику антитіла, наприклад підвищену афінність до цільового антигену (антигенів). Як правило, залишки ділянки CDR безпосередньо і найбільшою мірою залучені до антигензв'язувального впливу. Гуманізація або конструювання антитіл, які складають предмет даного винаходу, можуть бути виконані будь-яким відомим способом (включаючи, крім іншого, способи, описані в роботах Jones et al. Nature 321:522 (1986); Riechmann et al. Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al. Science 239:1534 (1988); Sims et al. J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987); Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al. J. Immunol. 151:2623 (1993); патентах США №№ 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539; 4816567, PCT/US98/16280, US 96/18978, US 91/09630, US 91/05939, US 94/01234, GB 89/01334, GB 91/01134, GB 92/01755; WO 90/14443, WO 90/14424, WO 90/14430, EP 229246, всі з яких повністю включені в цей документ шляхом посилання, включаючи цитовані літературні джерела. Людська константна ділянка агента, що зв'язується з мішенню, який складає предмет даного винаходу, може належати до будь-якого класу (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD і т. д.) або ізотипу і містити легкий ланцюг каппа або лямбда. У одному варіанті здійснення людська константна ділянка містить важкий ланцюг IgG або певний фрагмент, наприклад щонайменше один з ізотипів IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. У іншому варіанті здійснення агент, що зв'язується з мішенню, містить важкий ланцюг IgG1 і легкий ланцюг IgG1κ. Виділений агент, що зв'язується з мішенню, який складає предмет даного винаходу, може містити описані в цьому документі амінокислотні послідовності антитіла, що кодуються будь-яким відповідним полінуклеотидом. Агент, що зв'язується з мішенню, переважно зв'язується з IL-25 людини і таким чином частково або по суті нейтралізує щонайменше одну біологічну активність білка. Агент, що зв'язується з мішенню, або його вказана частина або різновид, частково або переважно по суті нейтралізує щонайменше одну біологічну активність щонайменше одного білка IL-25 або фрагмента, інгібуючи тим самим активності, опосередковані зв'язуванням IL-25 з рецептором IL-25 або іншими IL-25-залежними 8 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або опосередкованими механізмами. Використаний в цьому документі термін "нейтралізуюче антитіло" означає антитіло, яке може інгібувати IL-25-залежну активність приблизно на 20100 %, переважно щонайменше приблизно на 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 % або більше, залежно від типу використовуваного для визначення активності аналізу. Здатність агента, що зв'язується з мішенню, інгібувати IL-25залежну активність переважно оцінюється за допомогою щонайменше одного відповідного аналізу з використанням білка або рецептора IL-25, як описано в цьому документі і (або) як відомо фахівцям в даній галузі. Щонайменше одне антитіло, що складає предмет даного винаходу, зв'язується з щонайменше одним представленим в цьому документі епітопом, з яким зв'язується антитіло M6. Щонайменше один епітоп може містити щонайменше одну область зв'язування з антитілом, яка містить щонайменше одну ділянку білка, причому даний епітоп переважно містить щонайменше одну позаклітинну, розчинну, гідрофільну зовнішню або цитоплазматичну ділянку білка. Як правило, агент, що зв'язується з мішенню, який складає предмет даного винаходу, містить антигензв'язувальну ділянку, яка містить щонайменше одну ділянку, що визначає комплементарність (CDR1, CDR2 і CDR3), послідовностей SEQ ID NO: 10, 11 і 12 або варіанта щонайменше однієї варіабельної ділянки важкого ланцюга і щонайменше однієї людської ділянки, що визначає комплементарність (CDR1, CDR2 і CDR3) (SEQ ID NO: 6, 7 і 8), або варіанта щонайменше однієї варіабельної ділянки легкого ланцюга. Агенти, що зв'язуються з мішенню, які зв'язуються з IL-25 людини і які містять певну варіабельну ділянку важкого або легкого ланцюга або ділянки CDR, можуть бути одержані відповідними способами, такими як фагове відображення (Katsube Y. et al. Int J. Mol. Med, 1(5):863 868 (1998)), або відомими і (або) описаними в цьому документі способами із застосуванням трансгенних тварин. Наприклад, антитіло, конкретна ділянка або варіант можуть бути експресовані у відповідній клітині-хазяїні з використанням кодуючої їх нуклеїнової кислоти або її ділянки. Винахід, що розкривається, також стосується антитіл, антигензв'язувальних фрагментів, імуноглобулінових ланцюгів і ділянок CDR, що містять амінокислоти в послідовності, по суті ідентичній амінокислотній послідовності антитіла M6, описаній в цьому документі. Подібні антиIL-25 антитіла можуть включати в себе одну або більше амінокислотних замін, делецій або вставок, що є або результатом природного мутаційного процесу, або результатом описаних в цьому документі маніпуляцій. Переважно подібні антитіла або антигензв'язувальні фрагменти і антитіла, що містять такі ланцюги або ділянки CDR, можуть зв'язуватися з людським IL-25 з -9 високою афінністю (наприклад, при KD приблизно 10 M або менше). Амінокислотні послідовності, по суті ідентичні послідовностям, описаним в цьому документі, включають в себе послідовності, що містять консервативні заміни амінокислот, а також амінокислотні делеції і (або) вставки. Консервативною заміною амінокислоти називається заміна першої амінокислоти на другу амінокислоту, фізичні і (або) хімічні властивості якої (наприклад, заряд, структура, полярність, гідрофобність/гідрофільність) схожі з властивостями першої амінокислоти. До консервативних замін належать заміна однієї амінокислоти на іншу в наступних групах: лізин (K), аргінін (R) і гістидин (Н); аспартат (D) і глутамат (Е); аспарагін (N), глутамін (Q), серин (S), треонін (Т), тирозин (Y), K, R, Н, D і Е; аланін (А), валін (V), лейцин (L), ізолейцин (I), пролін (Р), фенілаланін (F), триптофан (W), метіонін (M), цистеїн (С) і гліцин (G); F, W і Y; С, S і Т. Кількість замін амінокислот, яку може зробити кваліфікований фахівець, залежить від багатьох факторів, включаючи описані вище. Кажучи загалом, кількість замін, вставок і делецій амінокислот для будь-якого даного анти-IL-25 антитіла, фрагмента або варіанта буде складати не більше 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1, наприклад 130 або будь-який діапазон або значення в цих межах, як указано в цьому документі. Амінокислоти в агенті, що зв'язується з мішенню, який складає предмет даного винаходу, які необхідні для його функціонування, можуть бути ідентифіковані відомими фахівцям способами, такими як сайт-направлений мутагенез або скануючий аланіном мутагенез (див., наприклад, Ausubel, цитований вище, розділи 8, 15; Cunningham and Wells, Science 244:10811085 (1989)). У останній процедурі по кожному залишку молекули вводять одиночні аланінові мутації. Одержані мутантні молекули потім тестуються на біологічну активність, включаючи, крім іншого, щонайменше одну активність по нейтралізації IL-25. Критичні для зв'язування з антитілом сайти також можуть бути ідентифіковані шляхом аналізу структури, наприклад шляхом кристалізації, ядерного магнітного резонансу або фотоафінного мічення (Smith et al. J. Mol. Biol. 224:899 904 (1992); і de Vos et al. Science 255:306 312 (1992)). Агенти, що зв'язуються з мішенню, які складають предмет даного винаходу, можуть без обмежень включати в себе щонайменше одну ділянку, послідовність або комбінацію, вибирану з 9 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 діапазону від 5 до всіх послідовних амінокислот, що описуються щонайменше однією з послідовностей SEQ ID NO: 5-12. Агент, що зв'язується з мішенню, може необов'язково додатково містити поліпептид з щонайменше однієї послідовності, що включає 70-100 % послідовних амінокислот щонайменше однієї з послідовностей SEQ ID NO: 5 або 9. У одному варіанті здійснення амінокислотна послідовність імуноглобулінового ланцюга або його ділянки (наприклад, варіабельна ділянка, CDR) має міру ідентичності приблизно 70-100 % (наприклад, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 або будь-який діапазон або значення в цих межах) з амінокислотною послідовністю відповідного ланцюга щонайменше однієї з послідовностей SEQ ID NO: 5 або 9. Наприклад, амінокислотну послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга можна порівняти з послідовністю SEQ ID NO: 5, або амінокислотну послідовність варіабельного ділянки важкого ланцюга можна порівняти з послідовністю SEQ ID NO: 9. Переважно 70-100 %ву міру ідентичності послідовності амінокислот (наприклад, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 або будь-який діапазон або значення в цих межах) визначають за допомогою відповідного комп'ютерного алгоритму, як відомо фахівцям в даній галузі. Приклади послідовностей варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів представлені в послідовностях SEQ ID NO: 5 і 9. Агенти, що зв'язуються з мішенню, які складають предмет даного винаходу, або їх конкретні варіанти, можуть містити будь-яку кількість послідовних залишків амінокислот з антитіла, яке складає предмет даного винаходу, причому дана кількість вибирається з групи цілих чисел в діапазоні 10-100 % від загальної кількості послідовних залишків в агенті, що зв'язується з мішенню. Довжина даної підпослідовності послідовних амінокислот необов'язково складає щонайменше приблизно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 або більше амінокислот, або будь-який діапазон або значення в цих межах. Крім того, кількість таких підпослідовностей може являти собою будь-яке ціле число, вибиране з групи, що складається з від 1 до 20, наприклад щонайменше 2, 3, 4 або 5. Як визначать фахівці, даний винахід включає в себе щонайменше одне біологічно активне антитіло, яке складає предмет даного винаходу. Біологічно активні антитіла мають специфічну активність, що складає щонайменше 20, 30 або 40 %, переважно щонайменше 50, 60 або 70 % і найбільш переважно щонайменше 80, 90, 95 або 100 % від активності природного (несинтетичного), ендогенного або спорідненого йому і відомого антитіла. Способи якісного і кількісного аналізу ферментативної активності і субстратної специфічності добре відомі фахівцям в даній галузі. У іншому аспекті даний винахід стосується агентів, що зв'язуються з мішенню, як описано в цьому документі, які модифіковані шляхом ковалентного приєднання органічного фрагмента. Така модифікація дозволяє створити антитіло або антигензв'язувальний фрагмент з поліпшеними фармакокінетичними властивостями (наприклад, збільшеним часом напівжиття in vivo в сироватці). Органічний фрагмент може являти собою лінійну або розгалужену гідрофільну полімерну групу, залишок жирної кислоти або ефіру жирної кислоти. У конкретних варіантах здійснення гідрофільна полімерна група може мати молекулярну масу в діапазоні від приблизно 800 до приблизно 120 000 дальтон і може являти собою поліалкангліколь (наприклад, поліетиленгліколь (ПЕГ), поліпропіленгліколь (ППГ)), вуглеводний полімер, амінокислотний полімер або полівінілпіролідон, а залишок жирної кислоти або ефіру жирної кислоти може містити від приблизно восьми до приблизно сорока атомів вуглецю. Модифіковані агенти, що зв'язуються з мішенню, які складають предмет даного винаходу, можуть містити один або більше органічних фрагментів, прямо або непрямо ковалентно зв'язаних з антитілом. Кожний органічний фрагмент, зв'язаний з антитілом або з антигензв'язувальним фрагментом, які складають предмет даного винаходу, може незалежно являти собою гідрофільну полімерну групу, залишок жирної кислоти або ефіру жирної кислоти. Використовуваний в цьому документі термін "жирна кислота" включає в себе одноосновні і двоосновні карбонові кислоти. Використовуваний в цьому документі термін "гідрофільна полімерна група" означає органічний полімер, що має більш високу розчинність у воді, ніж в октані. Наприклад, полілізин краще розчиняється у воді, ніж в октані. Так, антитіло, модифіковане шляхом ковалентного приєднання полілізину, охоплюється даним винаходом. Гідрофільні полімери, допустимі для модифікації антитіл, які складають предмет даного винаходу, можуть бути лінійними або розгалуженими і включають в себе, наприклад, поліалкангліколь (наприклад, ПЕГ, монометоксиполіетиленгліколь (мПЕГ), ППГ і т. п.), вуглеводні (наприклад, декстран, целюлозу, олігосахариди, полісахариди і т. п.), полімери гідрофільних амінокислот (наприклад, полілізин, поліаргінін, поліаспартат і т. п.), оксиди 10 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поліалканів (наприклад, поліетиленоксид, поліпропіленоксид і т. п.) і полівінілпіролідон. Гідрофільний полімер, що модифікує антитіло, яке складає предмет даного винаходу, переважно має молекулярну масу свого фрагмента в діапазоні від приблизно 800 до приблизно 150 000 дальтон. Наприклад, можна використовувати ПЕГ 5000 і ПЕГ20000, де нижній індекс означає середню молекулярну вагу полімеру в дальтонах. Гідрофільна полімерна група може мати від одного до приблизно шести замісників, вибираних з алкілів, залишків жирних кислот або ефірів жирних кислот. Гідрофільні полімери, що мають як замісники залишки жирних кислот або ефірів жирних кислот, можуть бути одержані відповідними способами. Наприклад, полімер, що містить аміногрупу, можна ввести в реакцію сполучення з карбоксилатом жирної кислоти або ефіру жирної кислоти, а активований карбоксилат (наприклад, активований N, Nкарбонілдіімідазолом) жирної кислоти або ефіру жирної кислоти можна ввести в реакцію сполучення з гідроксильною групою полімеру. Жирні кислоти і ефіри жирних кислот, допустимі для модифікації антитіл, що складають предмет даного винаходу, можуть бути насиченими або можуть містити один або більше ненасичених зв'язків. Жирні кислоти, допустимі для модифікації антитіл, які складають предмет даного винаходу, наприклад, включають в себе н-додеканоат (C12, лаурат), н-тетрадеканоат (C14, міристат), н-октадеканоат (C18, стеарат), н-ейкозаноат (C20, арахідат), н-докозаноат (C22, бегенат), н-триаконтаноат (C30), н-тетраконтаноат (C40), (цис)-DELTA9-октадеканоат (C18, олеат), повністю цис-DELTA5,8,11,14-ейкозатетраеноат (C20, арахідонат), октандикарбонову кислоту, тетрадекандикарбонову кислоту, октадекандикарбонову кислоту, докозандикарбонову кислоту і т. п. Відповідні ефіри жирних кислот включають в себе моноефіри дикарбонових кислот, що містять лінійну або розгалужену групу нижчого алкілу. Група нижчого алкілу може містити від одного до приблизно дванадцяти, переважно від одного до приблизно шести, атомів вуглецю. Модифіковані агенти, що зв'язуються з мішенню, можуть бути одержані відповідними способами, наприклад, шляхом взаємодії з одним або більше модифікуючими агентами. Використовуваний в цьому документі термін "модифікуючий агент" означає відповідну органічну групу (наприклад, гідрофільний полімер, жирну кислоту, ефір жирної кислоти), що містить активуючу групу. "Активуюча група" являє собою хімічний фрагмент або функціональну групу, здатну у відповідних умовах реагувати з другою хімічною групою з утворенням ковалентного зв'язку між модифікуючим агентом і другою хімічною групою. Наприклад, активуючі для реакції з амінами групи включають в себе електрофільні групи, такі як тозилат, мезилат, галоген (хлор, бром, фтор, йод), N-гідроксисукцинімідилові ефіри (NHS) і т. п. Активуючі групи, здатні взаємодіяти з тіолами, включають в себе, наприклад, малеїнімід, йодацетил, акрилоліл, піридилдисульфіди, тіол 5-тіол-2-нітробензойної кислоти (TNB-тіол) і т. п. Альдегідна функціональна група може зв'язуватися з амін- або гідразидвмісними молекулами, а азидна група може взаємодіяти з тривалентною фосфогрупою з утворенням фосфорамідатного або фосфорімідного зв'язку. Відповідні способи введення активуючих груп в молекули добре відомі фахівцям (див., наприклад, Hermanson G.T. Bioconjugate Techniques, Academic Press: м. СанДієго, штат Каліфорнія (1996)). Активуюча група може бути зв'язана з органічною групою (наприклад, гідрофільним полімером, жирною кислотою, ефіром жирної кислоти) безпосередньо або через з'єднувальний фрагмент, наприклад двовалентну групу C1-C12, де один або більше атомів вуглецю можуть бути заміщені гетероатомом, наприклад атомом кисню, азоту або сірки. Відповідні з'єднувальні фрагменти включають в себе, наприклад, тетраетиленгліколь, -(CH2)3-, NH-(CH-2)6-NH-, -(CH2)2-NH- і -CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-. Модифікуючі агенти, що містять з'єднувальний фрагмент, можуть бути одержані, наприклад, шляхом взаємодії моноВос-алкілдіаміну (наприклад, моно-Вос-етилендіаміну, моно-Вос-діаміногексану) з жирною кислотою в присутності 1-етил-3-(3-диметиламінопропіл)карбодііміду (EDC) з утворенням амідного зв'язку між вільним аміном і карбоксилатом жирної кислоти. Захисну групу Boc можна надалі видалити з продукту шляхом обробки трифтороцтовою кислотою (TFA) з відкриттям первинного аміну, який може бути зв'язаний з іншим карбоксилатом, як описано вище, або може реагувати з малеїновим ангідридом із замиканням одержаного продукту в цикл і одержанням активованого малеїнімідного похідного жирної кислоти (див., наприклад, Thompson et al. WO 92/16221, зміст якого повністю включений в цей документ шляхом посилання). Модифіковані агенти, що зв'язуються з мішенню, які складають предмет даного винаходу, можуть бути одержані шляхом взаємодії людського антитіла або антигензв'язувального фрагмента з модифікуючим агентом. Наприклад, органічні фрагменти можуть бути зв'язані з антитілом сайт-неспецифічним чином за допомогою реагуючого з аміном модифікуючого агента, наприклад N-гідроксисукцинімідилового (NHS) ефіру ПЕГ. Модифіковані людські антитіла або антигензв'язувальні фрагменти також можуть бути одержані шляхом відновлення 11 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дисульфідних зв'язків (наприклад, внутрішньоланцюжкових дисульфідних зв'язків) антитіла або антигензв'язувального фрагмента. Відновлене антитіло або антигензв'язувальний фрагмент потім може вступати в реакцію з реагуючим з тіолом модифікуючим агентом з одержанням модифікованого антитіла, яке складає предмет даного винаходу. Модифіковані людські антитіла або антигензв'язувальні фрагменти, що містять органічний фрагмент, зв'язаний з конкретними сайтами антитіла, яке складає предмет даного винаходу, можуть бути одержані відповідними способами, такими як зворотний протеоліз (Fisch et al. Bioconjugate Chem., 3:147 153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411 417 (1994); Kumaran et al. Protein Sci. 6(10):2233 2241 (1997); Itoh et al. Bioorg. Chem., 24(1):59 68 (1996); Capellas et al. Biotechnol. Bioeng., 56(4):456 463 (1997)) і способи, описані в роботі Hermanson G.T. Bioconjugate Techniques, Academic Press: м. Сан-Дієго, штат Каліфорнія (1996). Агенти, що зв'язуються з мішенню, які можуть знайти застосування в способах і композиціях, що складають предмет даного винаходу, характеризуються високою афінністю зв'язування з IL25 і необов'язково мають низьку токсичність. Зокрема, з метою даного винаходу можна використовувати агент, що зв'язується з мішенню, який складає предмет даного винаходу, в якому окремі компоненти, такі як варіабельна ділянка, константна ділянка і каркас, по окремості і (або) в сукупності, необов'язково і переважно мають низьку імуногенність. Агенти, що зв'язуються з мішенню, які можуть застосовуватися з метою даного винаходу, необов'язково характеризуються своєю здатністю впливати на пацієнтів протягом тривалого періоду з помітним полегшенням симптомів і низькою і (або) прийнятною токсичністю. Низька або прийнятна імуногенність і (або) висока афінність, а також інші відповідні властивості, можуть сприяти досягненню терапевтичних результатів. Під "низькою імуногенністю" в цьому документі розуміється індукування суттєвих HAHA-, HACA- або HAMA-імунних відповідей менше ніж у приблизно 75 % або переважно менше ніж у приблизно 50 % пацієнтів, що проходять лікування, і (або) індукування низьких титрів в процесі лікування (менше ніж приблизно 300, переважно менше ніж приблизно 100, за результатами вимірювання імуноферментним аналізом з використанням подвійних антигенів), див. роботу Elliott et al. Lancet, 344:1125 1127 (1994), яка повністю включена в цей документ шляхом посилання. Біспецифічні, гетероспецифічні, гетерокон'югатні або подібні антитіла також можуть бути використані як моноклональні гуманізовані антитіла, що мають специфічність зв'язування щонайменше до двох різних антигенів. У цьому випадку одна із зв'язувальних специфічностей реалізовується щонайменше для одного білка IL-25, а інша - для будь-якого іншого антигену. Способи одержання біспецифічних антитіл добре відомі фахівцям в даній галузі. Звичайно в основі рекомбінантного утворення біспецифічних антитіл лежить коекспресія двох пар важкий ланцюг-легкий ланцюг імуноглобулінів, де два важких ланцюги мають різні специфічності (Milstein and Cuello, Nature 305:537 (1983)). Через випадковий розподіл генів важких і легких ланцюгів імуноглобулінів ці гібридоми (квадроми) утворюють потенційну суміш з 10 різних молекул антитіл, причому тільки одна з них має правильну біспецифічну структуру. Очищення правильної молекули, яке звичайно виконується шляхом афінної хроматографії, є досить трудомістким процесом з низьким виходом продукту. Аналогічні процедури описані, наприклад, в публікації WO 93/08829, патентах США №№ 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, публікаціях WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, роботах Traunecker et al. EMBO J. 10:3655 (1991), Suresh et al. Methods in Enzymology 121:210 (1986), зміст яких повністю включений в цей документ шляхом посилання. IL-25 Білок IL-25, також відомий як IL-17E, доступний на ринку (наприклад, виробляється компанією R&D Systems, штат Міннесота, США), а також може бути клонований або синтезований по послідовностях IL-25, доступних фахівцям в даній галузі. Послідовність IL-25 людини (SEQ ID NO: 17) показана на фіг. 3. Для вироблення антитіл або використання в імуноаналізі можна використовувати будь-який фрагмент або комбінацію фрагментів білка IL-25 (наприклад, рекомбінантний білок IL-25), особливо фрагменти, укорочені з N-кінця. Наприклад, представлений на ринку рекомбінантний IL-25 людини (IL-17E) містить зрілу послідовність білка Tyr 33-Gly 177 (інв. № Q9H293), а представлений на ринку IL-25 миші містить залишки Val 17-Ala 169 мишачого IL-17E (інв. № NP_542767). Молекули нуклеїнових кислот Використовуючи надану в цьому документі інформацію і описані в даному винаході або широко відомі фахівцям способи, можна одержати молекулу нуклеїнової кислоти, що складає предмет даного винаходу, яка кодує щонайменше один агент, що зв'язується з мішенню, який складає предмет даного винаходу. 12 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Молекули нуклеїнових кислот, які складають предмет даного винаходу, можуть мати форму РНК, таких як мРНК, гяРНК, тРНК або будь-якої іншої форми, або форму ДНК, включаючи, крім іншого, кДНК і геномну ДНК, одержані шляхом клонування, шляхом синтезу або будь-яких їх комбінацій. ДНК може бути триланцюжковою, дволанцюжковою, одноланцюжковою або будьякою їх комбінацією. Будь-яка ділянка щонайменше одного ланцюга ДНК або РНК може бути кодуючим ланцюгом, також званим "смисловий", або некодуючим ланцюгом, також званим "антисмисловий ланцюг". Виділені молекули нуклеїнових кислот, які складають предмет даного винаходу, можуть включати в себе молекули нуклеїнових кислот, що містять відкриту рамку зчитування (ORF), необов'язково з одним або більше інтронами, наприклад, крім іншого, щонайменше однією специфічною ділянкою щонайменше однієї CDR, такої як CDR1, CDR2 і (або) CDR3, щонайменше одного важкого ланцюга (наприклад, послідовності SEQ ID NO: 10-12) або легкого ланцюга (наприклад, послідовності SEQ ID NO: 6-8); молекули нуклеїнових кислот, що містять кодуючу послідовність для варіабельної ділянки анти-IL-25 (наприклад, послідовності SEQ ID NO: 5 або 9); і молекули нуклеїнових кислот, що містять нуклеотидну послідовність, яка по суті відмінна від вищеописаних, але, в результаті виродження генетичного коду, також кодує щонайменше одне анти-IL-25 антитіло, як описано в цьому документі і (або) відомо фахівцям. Звичайно, генетичний код добре відомий фахівцям в даній галузі. Отже, для фахівця створення подібних вироджених варіантів нуклеїнових кислот, що кодують специфічні анти-IL-25 антитіла, які складають предмет даного винаходу, є звичайною процедурою. Див., наприклад, цитовану вище роботу Ausubel et al. Всі подібні варіанти нуклеїнових кислот вважаються включеними в даний винахід. Як указано в цьому документі, молекули нуклеїнових кислот, що складають предмет даного винаходу, які містять кодуючу анти-IL-25 антитіло нуклеїнову кислоту, можуть, крім іншого, включати в себе молекули, що кодують амінокислотну послідовність фрагмента самого антитіла, кодуючу послідовність для всього антитіла або його ділянки, кодуючу послідовність для антитіла, фрагмента або ділянки, а також додаткові послідовності, наприклад кодуючу послідовність для щонайменше одного сигнального лідерного або злитого пептиду, що містить або не містить вищезазначені додаткові кодуючі послідовності, такі як щонайменше один інтрон, в поєднанні з додатковими некодуючими послідовностями, включаючи, крім іншого, некодуючі 5'- і 3'- послідовності, такі як транскрибовані нетрансльовані послідовності, що грають важливу роль в транскрипції, процесингу мРНК, включаючи сигнали сплайсингу і поліаденілювання (наприклад, зв'язування рибосоми і стабільність мРНК), додаткову кодуючу послідовність, яка кодує додаткові амінокислоти, наприклад, що забезпечують додаткову функціональність. Так, кодуюча антитіло послідовність може бути злита з маркерною послідовністю, такою як послідовність, що кодує пептид, який полегшує очищення злитого антитіла, що містить фрагмент або ділянку антитіла. Полінуклеотиди, селективно гібридизовані з полінуклеотидом У даному винаході описані виділені нуклеїнові кислоти, які в умовах селективної гібридизації гібридизуються з полінуклеотидом, розкритим в цьому документі. Таким чином, полінуклеотиди даного варіанта здійснення можна використовувати для виділення, визначення і (або) кількісного аналізу нуклеїнових кислот, що містять подібні полінуклеотиди. Наприклад, полінуклеотиди, які складають предмет даного винаходу, можуть бути використані для ідентифікації, виділення або ампліфікації часткових або повних клонів в збережуваних бібліотеках. У деяких варіантах здійснення полінуклеотиди являють собою послідовності геномних або комплементарних ДНК, виділені або іншим чином комплементарні до кДНК з бібліотеки нуклеїнових кислот людини або іншого ссавця. Бібліотека кДНК переважно містить щонайменше 80 % повних послідовностей, переважно щонайменше 85 або 90 % повних послідовностей і більш переважно щонайменше 95 % повних послідовностей. Бібліотеки кДНК можуть бути нормалізованими для підвищення представництва рідких послідовностей. До послідовностей, що мають знижену міру ідентичності відносно комплементарних послідовностей, звичайно, але не виключно, застосовують умови гібридизації низької або середньої суворості. Умови середньої і високої суворості можуть також необов'язково застосовуватися для послідовностей з більш високою мірою ідентичності. Умови низької суворості дозволяють проводити селективну гібридизацію послідовностей, що мають міру ідентичності приблизно 70 %, і можуть використовуватися для ідентифікації ортологічних і паралогічних послідовностей. Полінуклеотиди, які складають предмет даного винаходу, необов'язково кодують щонайменше частину антитіла, яке кодується полінуклеотидами, описаними в цьому документі. Полінуклеотиди, які складають предмет даного винаходу, охоплюють послідовності нуклеїнових 13 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60кислот, які можна використовувати для селективної гібридизації з полінуклеотидом, що кодує антитіло, яке складає предмет даного винаходу. Див., наприклад, цитовані вище роботи Ausubel і Colligan, кожна з яких повністю включена в цей документ шляхом посилання. Конструювання нуклеїнових кислот Як добре відомо фахівцям, виділені нуклеїнові кислоти, які складають предмет даного винаходу, можуть бути одержані з використанням (а) рекомбінантних способів, (b) синтетичних способів, (с) способів очищення або їх поєднань. Для зручності нуклеїнові кислоти можуть містити інші послідовності на доповнення до полінуклеотиду, який складає предмет даного винаходу. Наприклад, в нуклеїнову кислоту для зручності виділення полінуклеотиду може бути вставлений сайт множинного клонування, що містить один або більше сайтів рестрикції ендонуклеазою. Також для зручності виділення трансльованого полінуклеотиду, який складає предмет даного винаходу, можуть бути вставлені трансльовані послідовності. Наприклад, гексагістидинова маркерна послідовність дозволяє використовувати зручні способи очищення білків, які складають предмет даного винаходу. Нуклеїнова кислота, яка складає предмет даного винаходу, виключаючи кодуючу послідовність, необов'язково являє собою вектор, адаптер або лінкер для клонування і (або) експресії полінуклеотиду, який складає предмет даного винаходу. Для оптимізації функцій таких послідовностей для клонування і (або) експресії при клонуванні і (або) експресії, зручності виділення полінуклеотиду або поліпшення впровадження полінуклеотиду в клітину в них можуть бути введені додаткові послідовності. Використання векторів клонування, векторів експресії, адаптерів і лінкерів добре відоме фахівцям (див., наприклад, цитовані вище роботи Ausubel або Sambrook). Рекомбінантні способи конструювання нуклеїнових кислот Виділені композиції нуклеїнових кислот відповідно до даного винаходу, наприклад РНК, кДНК, геномна ДНК або їх комбінація, можуть бути одержані з біологічних джерел за допомогою будь-якої кількості способів клонування, відомих фахівцям в даній галузі техніки. У деяких варіантах здійснення для ідентифікації потрібної послідовності в бібліотеці кДНК або геномної ДНК використовують олігонуклеотидні зонди, що селективно гібридизуються в суворих умовах з полінуклеотидами, які складають предмет даного винаходу. Виділення РНК і конструювання бібліотек кДНК і геномних ДНК добре відоме фахівцям (див., наприклад, цитовані вище роботи Ausubel або Sambrook). Способи скринінгу і ізолювання нуклеїнових кислот Скринінг по бібліотеці кДНК або геному можна здійснювати за допомогою зонда на основі послідовності полінуклеотиду, який складає предмет даного винаходу, такого як описаний в цьому документі. Зонди можуть використовуватися для гібридизації з послідовністю геномної ДНК або кДНК з метою виділення гомологічних генів в однакових або різних організмах. Фахівці в даній галузі визначать, що при виконанні аналізу можуть використовуватися різні міри суворості гібридизації, і як середовище для гібридизації, так і середовище для відмивання клітин можуть відповідати суворим умовам. У міру того, як умови гібридизації стають все більш суворими, необхідна для утворення дуплекса міра комплементарності між зондом і мішенню зростає. Міру суворості можна контролювати одним або більше параметрами, такими як температура, іонна сила, pH, присутність частково денатуруючого розчинника, наприклад формаміду. Наприклад, міру суворості гібридизації звичайно змінюють шляхом зміни полярності розчину реагентів, наприклад шляхом зміни концентрації формаміду в діапазоні від 0 до 50 %. Міра комплементарності (ідентичності послідовностей), необхідна для детектованого зв'язування, варіюється згідно з суворістю середовища для гібридизації і (або) середовища для відмивання клітин. Оптимальна міра комплементарності становить 100 %, або від 70 до 100 %, або будь-який діапазон або значення в цих межах. Однак потрібно розуміти, що невеликі варіації послідовностей в зондах і праймерах можуть бути компенсовані шляхом зменшення суворості середовища для гібридизації і (або) середовища для відмивання клітин. Способи ампліфікації РНК або ДНК добре відомі фахівцям і можуть бути використані згідно з даним винаходом без зайвих експериментів на основі описів і рекомендацій, представлених в цьому документі. Відомі способи ампліфікації ДНК або РНК без обмежень включають полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) і споріднені способи ампліфікації (див., наприклад, патенти США №№ 4683195, 4683202, 4800159, 4965188, Mullis et al.; патенти США №№ 4795699 і 4921794, Tabor et al.; патент США № 5142033, Innis; патент США № 5122464, Wilson et al.; патент США № 5091310, Innis; патент США № 5066584, Gyllensten et al; патент США № 4889818, Gelfand et al; патент США № 4994370, Silver et al; патент США № 4766067, Biswas; патент США № 4656134, Ringold), а також опосередковану РНК ампліфікацію, яка використовує антисмислову до цільової послідовності РНК як матрицю для синтезу дволанцюжкової ДНК (патент США № 14 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5130238, Malek et al., торгове найменування: NASBA); кожне цитоване джерело повністю включене в цей документ шляхом посилання (див., наприклад, цитовані вище роботи Ausubel або Sambrook). Наприклад, для ампліфікації послідовностей полінуклеотидів, які складають предмет даного винаходу, і зв'язаних з ними генів, безпосередньо з бібліотек геномної ДНК або кДНК можна використовувати технологію полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). ПЛР і інші способи ампліфікації in vitro також допустимі, наприклад, для клонування послідовностей нуклеїнових кислот, що кодують експресовані білки, для одержання нуклеїнових кислот, використовуваних як зонди для виявлення присутності необхідної мРНК в зразках, для секвенування нуклеїнових кислот або для інших цілей. Приклади методик, якими може керуватися фахівець для використання способів ампліфікації in vitro, можна знайти в цитованих вище роботах Berger, Sambrook і Ausubel, а також в патенті США № 4683202 (1987), Mullis et al.; і роботі Innis et al. PCR Protocols А Guide to Methods and Applications, ред., Academic Press Inc., м. Сан-Дієго, штат Каліфорнія (1990). Представлені на ринку набори для геномної ПЛРампліфікації добре відомі фахівцям. Див., наприклад, набір для геномної ПЛР Advantage-GC (Clontech). Крім того, для підвищення виходу продуктів тривалої ПЛР можна використовувати, наприклад, білок гена 32 фага T4 (Boehringer Mannheim). Синтетичні способи конструювання нуклеїнових кислот Виділені нуклеїнові кислоти, які складають предмет даного винаходу, також можуть бути одержані шляхом прямого хімічного синтезу відомими способами (див., наприклад, цитовану вище роботу Ausubel et al.). При хімічному синтезі, як правило, створюється одноланцюжковий олігонуклеотид, що може бути перетворений у дволанцюжкову ДНК шляхом гібридизації з комплементарною послідовністю або шляхом полімеризації ДНК-полімеразою з використанням одиночного ланцюга як матриці. Фахівець у даній галузі визначить, що, хоча хімічний синтез ДНК може бути обмежений послідовністю з 100 або більше основ, послідовності більшої довжини можуть бути одержані шляхом лігування більш коротких послідовностей. Касети рекомбінантної експресії Даний винахід додатково передбачає касети рекомбінантної експресії, що містять нуклеїнову кислоту, яка складає предмет даного винаходу. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка складає предмет даного винаходу, наприклад послідовність кДНК або геномної ДНК, що кодує антитіло, яке складає предмет даного винаходу, можна використовувати для конструювання касети рекомбінантної експресії, що може бути введена щонайменше в одну необхідну клітину-хазяїна. Касета рекомбінантної експресії, як правило, містить полінуклеотид, який складає предмет даного винаходу, функціонально зв'язаний з ініціюючими транскрипцію регуляторними послідовностями, що направляють транскрипцію полінуклеотиду в призначеній для цього клітині-хазяїні. Для керування експресією нуклеїнових кислот, які складають предмет даного винаходу, можна застосовувати як гетерологічні, так і негетерологічні (тобто ендогенні) промотори. У деяких варіантах здійснення виділені нуклеїнові кислоти, що виконують функцію промотору, енхансера або інших елементів, можуть бути введені у відповідні положення (до, після або в інтрон) негетерологічної форми полінуклеотиду, який складає предмет даного винаходу, з метою зменшення або збільшення експресії полінуклеотиду, який складає предмет даного винаходу. Наприклад, в ендогенні промотори можуть бути внесені зміни in vivo або in vitro шляхом мутації, делеції або заміни. Вектори і клітини-хазяїни Даний винахід також стосується векторів, що включають виділені молекули нуклеїнових кислот, які складають предмет даного винаходу, клітин-хазяїнів, створених методом генної інженерії з застосуванням рекомбінантних векторів, і вироблення щонайменше одного анти-IL25 антитіла з застосуванням добре відомих фахівцям рекомбінантних способів. Див., наприклад, цитовані вище роботи Sambrook et al. і Ausubel et al., кожна з який повністю включена в даний документ шляхом посилання. Полінуклеотиди можуть необов'язково бути приєднані до вектора, що містить селектований маркер, для поширення в організмі хазяїна. Як правило, плазмідний вектор вводять у преципітат, наприклад у преципітат з фосфатом кальцію або в комплекс із зарядженим ліпідом. Якщо вектор являє собою вірус, він може бути упакований in vitro у відповідну пакуючу клітинну лінію, а потім трансдукований у клітинихазяїни. ДНК-вставка повинна бути функціонально зв'язана з відповідним промотором. Експресуючі конструкції додатково містять сайти для ініціації і зупинення транскрипції, а також сайт зв'язування з рибосомою для трансляції в транскрибованій ділянці. Кодуюча частина зрілого транскрипту, експресованого описуваними конструкціями, переважно містить старткодон на початку і стоп-кодон (наприклад, UAA, UGA або UAG), належним чином розташований на кінці трансльованої мРНК, причому для експресії в клітинах ссавців або еукаріот переважними є стоп-кодони UAA і UAG. Експресуючі вектори переважно але необов'язково 15 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 містять щонайменше один селектований маркер. До таких маркерів без обмежень належать метотрексат (MTX), дигідрофолатредуктаза (DHFR, патенти США №№ 4399216; 4634665; 4656134; 4956288; 5149636; 5179017), ампіцилін, неоміцин (G418), мікофенолова кислота або глутамінсинтетаза (GS, патенти США №№ 5122464; 5770359; 5827739), стійкі в культурах еукаріотических клітин, і гени стійкості до тетрацикліну або ампіциліну в культивованих клітинах E. coli і інших бактерій або прокаріот (вищезгадані патенти повністю включені в даний документ шляхом посилання). Придатні середовища й умови культивування вищеописаних клітинхазяїнів добре відомі фахівцям. Придатні вектори повинні бути очевидні для фахівців у даній галузі. Введення векторної конструкції в клітину-хазяїна може бути зроблене шляхом кальційфосфатної трансфекції, трансфекції, опосередкованої ДЕАЕ-декстраном, трансфекції, опосередкованої катіонними ліпідами, електропорації, трансдукції, інфікування або іншими відомими способами. Такі способи описані в таких публікаціях, як цитовані вище роботи Sambrook, глави 14, 16, 18; і Ausubel, глави 1, 9, 13, 15, 16. Щонайменше одне антитіло, яке складає предмет даного винаходу, може бути експресоване в модифікованій формі, такій як злитий пептид, і може містити не тільки секреторні сигнали, але і додаткові гетерологічні функціональні області. Наприклад, до N-кінця антитіла може бути додана область додаткових амінокислот, особливо заряджені амінокислоти, для підвищення його стабільності і персистенції в клітині-хазяїні, а також в ході очищення або в ході наступних маніпуляцій і зберігання. Крім того, до антитіла, яке складає предмет даного винаходу, для спрощення очищення можуть бути додані пептидні фрагменти. Ці області можуть бути видалені перед одержанням готового антитіла або щонайменше одного його фрагмента. Подібні способи описані в багатьох стандартних лабораторних посібниках, таких як цитовані вище роботи Sambrook, глави 17.2917.42 і 18.1-18.74; і Ausubel, глави 16, 17 і 18. Фахівцям відомі численні експресуючі системи, за допомогою яких можна експресувати нуклеїнову кислоту, що кодує білок, який складає предмет даного винаходу. В альтернативному варіанті здійснення нуклеїнові кислоти, які складають предмет даного винаходу, можуть експресуватися в клітині-хазяїні шляхом запуску (маніпуляційного) експресії в клітині-хазяїні, яка містить ендогенну ДНК, що кодує антитіло, яке складає предмет даного винаходу. Такі способи добре відомі фахівцям і, наприклад, описані в патентах США №№ 5580734, 5641670, 5733746 і 5733761, повністю включених у даний документ шляхом посилання. Прикладом клітинних культур, використовуваних для одержання антитіл, їх специфічних фрагментів або варіантів, є клітини ссавців. Клітинна культура ссавців найчастіше має форму клітинних моношарів, хоча також можуть застосовуватися суспензії клітин або біореактори ссавців. У даній галузі розроблений ряд відповідних ліній клітин-хазяїнів, здатних експресувати інтактні глікозиловані білки. До них належать клітинні лінії COS-1 (наприклад, ATCC CRL 1650), COS-7 (наприклад, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (наприклад, ATCC CRL-10), CHO (наприклад, ATCC CRL 1610) і BSC-1 (наприклад, ATCC CRL-26), клітини Cos-7, клітини CHO, клітини hep G2, клітини P3  63Ag8.653, SP2/0-Ag14, клітини 293, клітини HeLa і подібні, наприклад, виробництва компанії American Type Culture Collection, м. Манассас, штат Вірджинія (www.atcc.org). До переважних клітин-хазяїнів належать клітини лімфоїдного походження, такі як мієломні і лімфомні. Найбільш переважні як клітини-хазяїни клітини P3  63Ag8.653 (інв. номер ATCC CRL-1580) і клітини SP2/0-Ag14 (інв. номер ATCC CRL-1851). В особливо переважному варіанті здійснення рекомбінантна клітина являє собою клітину ліній P3  63Ab8.653 або SP2/0-Ag14. Експресійні вектори для таких клітин можуть містити одну або більше з наступних послідовностей контролю експресії, таких як, крім іншого, що включають: точку початку реплікації; промотор (наприклад, пізні або ранні промотори SV40, промотор CMV) (патенти США №№ 5168062; 5385839), промотор HSV tk, промотор pgk (фосфогліцераткіназа), промотор EF-1 alpha (патент США № 5266491), щонайменше один імуноглобуліновий промотор людини; енхансер і (або) сайти інформації для обробки, наприклад сайти зв'язування рибосоми, сайти сплайсингу РНК, сайти поліаденілювання (наприклад, сайт додавання poly A великого Тантигену SV40) і послідовності, термінуючі транскрипцію. Див., наприклад, цитовані вище роботи Ausubel et al. і Sambrook et al. Інші клітини, використовувані для одержання нуклеїнових кислот або білків, які складають предмет даного винаходу, відомі і (або) доступні фахівцям з каталогу American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (www.atcc.org) або з інших відомих або комерційних джерел. Якщо використовуються еукаріотичні клітинихазяїни, у вектор звичайно вбудовуються послідовності поліаденілювання або термінуючі транскрипцію послідовності. Прикладом термінаторної послідовності є послідовність поліаденілювання з гена бичачого гормону росту. Також можуть включатися послідовності для точного сплайсингу транскрипту. Прикладом послідовності для сплайсингу є інтрон VP1 з SV40 (Sprague et al. J. Virol., 45:773 781 (1983)). Крім того, як добре відомо фахівцям, у вектор можна вводити генні послідовності для контролю реплікації в клітині-хазяїні. 16 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Композиції Даний винахід також передбачає щонайменше одну композицію з агентом, що зв'язується з мішенню, яка містить щонайменше два, щонайменше три, щонайменше чотири, щонайменше п'ять, щонайменше шість або більше агентів, що зв'язуються з мішенню, описаних у даному документі і (або) відомих фахівцям, у вигляді композиції, що не зустрічається в природі, суміші або форми. Процентні частки подібної композиції визначаються по вазі, об'єму, концентрації, молярності або моляльності в рідких або сухих розчинах, сумішах, суспензіях, емульсіях або колоїдах, як відомо фахівцям або описано в даному документі. Композиції, які складають предмет даного винаходу, можуть додатково містити щонайменше одну з будь-якої відповідної й ефективної кількості композиції або фармацевтичної композиції, що містить щонайменше один анти-IL-25 агент, що зв'язується з мішенню, для клітини, тканини, органа, тварини або пацієнта, що потребує такої модуляції, лікування або терапії, які необов'язково додатково містять щонайменше один антагоніст ФНО (наприклад, у тому числі антитіло або фрагмент ФНО, розчинний рецептор або фрагмент ФНО, їх злиті білки або низькомолекулярний антагоніст ФНО), протиревматичний препарат (наприклад, метотрексат, ауранофін, ауротіоглюкоза, азатіоприн, етанерцепт, тіомалат золота і натрію, сульфат гідроксихлорохіну, лефлуномід, сульфасалазин), міорелаксант, наркотичний засіб, нестероїдний протизапальний засіб (НПЗЗ), анальгетик, анестетик, седативний препарат, місцевий анестетик, нейром'язовий блокатор, бактерицидний препарат (наприклад, аміноглікозид, протигрибкові, протизапальні, противірусні препарати, карбапенеми, цефалоспорини, фторхінолони, макроліди, пеніциліни, сульфаніламіди, тетрацикліни, інші протимікробні препарати), антипсоріатичний препарат, кортикостероїдний препарат, анаболічний стероїд, антидіабетичний препарат, мінеральний, нутритивний, тиреоїдний препарати, вітамін, гормон, пов'язаний з обміном кальцію, протидіарейний, протикашлевий, протиблювотний, противиразковий, проносний, антикоагулянтний препарати, еритропоетин (наприклад, епоетин альфа), філграстим (наприклад, Г-КСФ, нейпоген), сарграмостим (ГМ-КСФ, лейкін), імунізатор, імуноглобулін, імуносупресори (наприклад, базиліксимаб, циклоспорин, даклізумаб), гормон росту, гормонозамісний препарат, модулятор естрогенових рецепторів, мідріатичний препарат, мідріатик, алкілувальний препарат, антиметаболіт, інгібітор мітозу, радіофармацевтичний препарат, антидепресант, антиманійний препарат, нейролептик, седативний, снодійний препарати, симпатоміметик, стимулятор, донепезил, такрин, антиастматичний препарат, бетаагоніст, інгаляційний стероїд, інгібітор лейкотриєнів, метилксантин, кромолін, адреналін або його аналог, дорназу альфа (пульмозим), цитокін або антагоніст цитокінів. Необмежувальні приклади таких цитокінів містять, крім іншого, будь-які з інтерлейкінів від IL-1 до IL-23. Відповідні дозування добре відомі фахівцям. Див., наприклад, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2-е видання, Appleton and Lange, м. Стемфорд, штат Коннектикут (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, м. Брухт-Лінда, штат Каліфорнія (2000 р.), кожний з який повністю включений у даний документ шляхом посилання. Подібні протиракові або протимікробні препарати також можуть містити молекули токсинів, які асоційовані, зв'язані з, входять до складу або вводяться спільно з щонайменше одним антитілом, яке складає предмет даного винаходу. Токсин може необов'язково забезпечувати вибіркове знищення патологічних клітин або тканин. Патологічною клітиною може бути ракова або інша клітина. Такі токсини можуть без обмежень являти собою очищений або рекомбінантний токсин або фрагмент токсину, що містить щонайменше один функціональний цитотоксичний домен токсину, наприклад, вибраний із щонайменше одного з рицину, дифтерійного токсину, токсину зміїної отрути або бактеріального токсину. Термін "токсин" також включає ендотоксини і екзотоксини, продуковані будь-якими природними, мутантними або рекомбінантними бактеріями або вірусами, здатними викликати будь-які патологічні стани у людей і інших ссавців, у тому числі токсичний шок, що може приводити до смерті. Такі токсини без обмежень можуть включати термолабільний ентеротоксин (LT) ентеротоксигенної E. coli, термостабільний ентеротоксин (ST), цитотоксин Shigella, ентеротоксини Aeromonas, токсин-1 синдрому токсичного шоку (TSST-1), стафілококовий ентеротоксин А (SEA), B (SEB) або C (SEC), стрептококові ентеротоксини і т. п. Такі бактерії без обмежень включають штами ентеротоксигенних видів E. coli (ETEC), ентерогеморагічних E. coli (наприклад, штами серотипу 0157:H7), бактерії Staphylococcus (наприклад, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), бактерії Shigella (наприклад, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii і Shigella sonnei), бактерії Salmonella (наприклад, Salmonella typhi, Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), бактерії Clostridium (наприклад, Clostridium perfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum), бактерії Camphlobacter (наприклад, Camphlobacter jejuni, Camphlobacter fetus), бактерії Heliobacter, (наприклад, Heliobacter), бактерії 17 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Aeromonas (наприклад, Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas pylon caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, бактерії Vibrios (наприклад, Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), бактерії Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa і Streptococci. Див., наприклад, Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3-є вид., стор. 1-13, Little, Brown and Co., м. Бостон (1990); під ред. Evans et al. Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2-е видання, стор. 239-254, Plenum Medical Book Co., м. Нью-Йорк (1991); Mandell et al. Principles and Practice of Infectious Diseases, 3-є видання, Churchill Livingstone, м. Нью-Йорк (1990); під ред. Berkow et al. The Merck Manual, 16-е вид., Merck and Co., м. Рауей, штат Нью-Джерсі, 1992; Wood et al. FEMS Microbiology Immunology, 76:121 134 (1991); Marrack et al. Science, 248:705 711 (1990), зміст яких повністю включено в даний документ шляхом посилання. Композиції, які складають предмет даного винаходу, можуть додатково містити щонайменше один з будь-яких відповідних допоміжних компонентів, включаючи, крім іншого, розріджувач, зв'язувальну речовину, стабілізатор, буфери, солі, ліпофільні розчинники, консервант, ад'ювант і т. п. Переважними є фармацевтично прийнятні допоміжні компоненти. Необмежувальні приклади таких стерильних розчинів і способів їх одержання добре відомі фахівцям і, зокрема, без обмежень описані в роботі Gennaro, Ed., Rеmіngtоn's Pharmaceutical Sciences, 18-е вид., Mack Publishing Co. (м. Істон, штат Пенсильванія) 1990. Фармацевтично прийнятні носії можна вибрати звичайним способом, виходячи зі способу введення, розчинності і (або) стабільності композиції, яка містить анти-IL-25 агент, що зв'язується з мішенню, фрагмент або варіант, як добре відомо фахівцям або описано в даному документі. Фармацевтичні наповнювачі і добавки, які можна використовувати в даній композиції, без обмежень включають білки, пептиди, амінокислоти, ліпіди і вуглеводи (наприклад, цукри, у тому числі моносахариди, ди-, три-, тетра- і олігосахариди; похідні цукрів, такі як альдити, альдонові кислоти, етерифіковані цукри і т. п.; і полісахариди або полімерні цукри), що можуть бути присутніми окремо або в комбінації, складаючи, окремо або в комбінації, від 1 до 99,99 % по масі або по об'єму. Приклади білкових наповнювачів включають сироватковий альбумін, такий як людський сироватковий альбумін (HSA), рекомбінантний людський альбумін (rHA), желатин, казеїн і т. п. Типові представники амінокислотних/антитільних компонентів, що також можуть виконувати функцію буферного компонента, включають аланін, гліцин, аргінін, бетаїн, гістидин, глютамінову кислоту, аспарагінову кислоту, цистеїн, лізин, лейцин, ізолейцин, валін, метіонін, фенілаланін, аспартам і т. п. Переважною амінокислотою є гліцин. Приклади вуглеводних наповнювачів, що можуть використовуватися з метою даного винаходу, включають, наприклад, моносахариди, такі як фруктоза, мальтоза, галактоза, глюкоза, D-маноза, сорбоза і т. п.; дисахариди, такі як лактоза, сахароза, трегалоза, целобіоза і т. п.; полісахариди, такі як рафіноза, мелезитоза, мальтодекстрини, декстрани, крохмалі і т. п.; і альдити, такі як маніт, ксиліт, мальтит, лактит, ксиліт сорбіт (глюцит), міоінозит і т. п. Переважними вуглеводними наповнювачами для використання з метою даного винаходу є маніт, трегалоза і рафіноза. Композиції можуть також містити буферний розчин або регулюючий рН агент; як правило, буферним розчином є сіль, одержана з органічної кислоти або основи. Типові буферні розчини включають солі органічних кислот, наприклад солі лимонної кислоти, аскорбінової кислоти, глюконової кислоти, вугільної кислоти, винної кислоти, бурштинової кислоти, оцтової кислоти або фталевої кислоти; буфер Тріс, гідрохлорид трометаміну або фосфатні буфери. Переважними буферами для використання в описуваних композиціях є солі органічних кислот, такі як цитрати. Додатково композиції, які складають предмет даного винаходу, можуть включати полімерні наповнювачі/добавки, такі як полівінілпіролідони, фіколи (полімерний цукор), декстрати (наприклад, циклодекстрини, такі як 2-гідроксипропіл-бета-циклодекстрин), поліетиленгліколі, смакові добавки, бактерицидні агенти, підсолоджувачі, антиоксиданти, антистатичні агенти, ПАР (наприклад, полісорбати, такі як TWEEN 80 і TWEEN 20), ліпіди (наприклад, фосфоліпіди, жирні кислоти), стероїди (наприклад, холестерин) і хелатуючі агенти (наприклад, ЕДТК). Ці й інші відомі фармацевтичні наповнювачі і (або) добавки, що можуть використовуватися з метою даного винаходу, добре відомі фахівцям, наприклад, перераховані в роботі Remington: The Science & Practice of Pharmacy, 19-е вид., Williams & Williams (1995), і в роботі Рhуsісіаn's Desk Reference, 52-е вид., Medical Economics, Montvale, N.J. (1998), що повністю включені в даний документ шляхом посилання. Переважними носіями або наповнювачами є вуглеводи (наприклад, сахариди й альдити) і буферні агенти (наприклад, цитрати) або полімерні агенти. Терапевтичні застосування В одному аспекті в даному винаході запропонований спосіб профілактики або зниження гіперчутливості дихальних шляхів у потребуючого такого лікування об'єкта (наприклад, людини), який включає введення об'єкту агента, що зв'язується з мішенню, зокрема молекули антитіла, що зв'язується з IL-25. В іншому аспекті в даному винаході запропонований спосіб 18 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 профілактики, полегшення або лікування астми у потребуючого такого лікування об'єкта, який включає введення об'єкту агента, що зв'язується з мішенню, зокрема молекули антитіла, що зв'язується з IL-25. Астма включає алергійну астму. Перераховані вище способи можуть застосовуватися з використанням агентів, що зв'язуються з мішенню (включаючи їх композиції), відповідно до даного винаходу, що можуть знайти застосування для зв'язування і переважно антагоністичної дії відносно IL-25, причому зазначені способи мають терапевтичний потенціал при різних захворюваннях і розладах за участі IL-25. Крім астми, такі захворювання включають інші розлади, пов'язані з запальним процесом, такі як запальне захворювання кишечнику (ЗЗК), наприклад хвороба Крона і виразковий коліт. Способи також можуть застосовуватися з використанням інших агентів, що зв'язуються з мішенню (включаючи їх композиції), які зв'язуються з IL-25 і можуть бути одержані за допомогою описаних нижче, у супровідних прикладах, способів. Агенти, що зв'язуються з мішенню (включаючи їх композиції), відповідно до даного винаходу можна використовувати при лікуванні (включаючи профілактичне лікування) або діагностиці у людей або тварин. Такий спосіб лікування або діагностики (який може включати профілактичне лікування) може включати введення зазначеному об'єкту ефективної дози агента, що зв'язується з мішенню, який складає предмет даного винаходу. Приклади відповідних захворювань і розладів обговорюються нижче. Також описується використання агента, що зв'язується з мішенню, (включаючи композиції, які його містять), який складає предмет даного винаходу, для виробництва лікарського препарату для введення людям або тваринам. Клінічні показання, при яких анти-IL-25 агент, що зв'язується з мішенню, можна використовувати для забезпечення позитивних клінічних результатів, включають будь-які показання, при яких IL-25 приводить до патологічних наслідків. Таким чином, у цілому, агент, що зв'язується з мішенню, який складає предмет даного винаходу, можна використовувати для лікування будь-якого стану, пов'язаного з небажаною відповіддю клітин Th2 або відповіддю клітин 2-го типу. Наприклад, агент, що зв'язується з мішенню, який складає предмет даного винаходу, можна використовувати для лікування алергії й астми, особливо астми. Анти-IL-25-терапію можна проводити ін'єкційно (наприклад, внутрішньовенно) або місцевим шляхом. Анти-IL-25 можна вводити з використанням генних технологій. Альтернативні стратегії приготування фармацевтичної композиції можуть дати препарати, допустимі для перорального введення або введення у вигляді супозиторіїв. Спосіб введення препарату може визначатися психохімічними особливостями лікування й особливостями захворювання з метою оптимізації ефективності лікування і мінімізації побічних ефектів. Відповідно до даного винаходу, представлені композиції можна вводити пацієнтам. Переважно здійснювати введення в "терапевтично ефективних кількостях", які є достатніми для поліпшення стану пацієнта. Поліпшення стану може полягати в щонайменше поліпшенні щонайменше одного симптому. Кількість, що фактично вводиться, а також інтенсивність і графік лікування будуть залежати від природи і тяжкості перебігу захворювання. Видача рекомендацій з лікування, наприклад рішення по дозуванню і т. д., знаходиться в сфері відповідальності лікарів загальної практики й інших медичних працівників. Придатні дозування антитіла добре відомі фахівцям; див. Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922. Точне дозування залежить від ряду факторів, включаючи мету використання антитіл (для діагностики або лікування), розмір і розташування оброблюваної області, точну природу антитіла (наприклад, цільне антитіло, фрагмент або діатело), а також природу будь-якої детектованої мітки або іншої молекули, прикріпленої до антитіла. Типове дозування антитіла складає 0,5 мг - 1,0 г. Таку дозу можна вводити внутрішньовенно як болюсне введення або інфузійно протягом декількох годин для одержання необхідної дози. Інші способи введення включають інфузійне внутрішньовенне введення протягом декількох годин для досягнення аналогічного повного кумулятивного дозування. Остання являє собою дозування для одиничного введення дорослому пацієнту, що може бути пропорційно скоректоване для дітей і немовлят, а також для інших форматів антитіла пропорційно його молекулярній вазі. Введення можна повторювати щодня, два рази на тиждень, щотижня або щомісяця, за розсудом лікаря. Як додатковий спосіб введення використовується нанесення поверхневого шару або включення іншим способом препарату в пристрій, що вводиться в тіло пацієнта, для яких оптимальна кількість антитіла буде визначатися за допомогою відповідних експериментів. У деяких переважних варіантах здійснення даного винаходу молекула антитіла являє собою мономерний фрагмент, такий як F(ab) або scFv. Такі фрагменти антитіла можуть мати перевагу у вигляді відносно короткого періоду напіввиведення і меншого ризику активації тромбоцитів, 19 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що викликається кластеризацією рецепторів. Кластеризуватися з активацією тромбоцитів можуть або молекули IL-25, або молекули IL-25 з FcγRII. При використанні цільного антитіла воно переважно повинно знаходитися у формі, нездатній активувати і (або) знищити тромбоцити. Переважним є IgG4-ізотип або, в альтернативному варіанті здійснення, "сконструйований" ізотип, одержаний на основі каркаса IgG1 (нові Fc-генні конструкції з публікації WO 99/58572, Clark, Armour, Williamson). Можна використовувати і менші фрагменти антитіла, такі як F(ab') 2. Крім того, можна використовувати цільні антитіла або фрагменти (наприклад, F(ab') 2 або діатіла) з подвійною епітопною специфічністю (наприклад, епітопи, розпізнавані scFv 2C3). Хоча такий варіант здійснення може сприяти кластеризації рецепторів, висока швидкість асоціації окремих рецепторів може вирішити цю проблему. Агенти, що зв'язуються з мішенню, які складають предмет даного винаходу, як правило, вводять пацієнтам у вигляді фармацевтичної композиції, до складу якої, крім агента, що зв'язується з мішенню, може входити щонайменше один додатковий компонент. Агент, що зв'язується з мішенню, який складає предмет даного винаходу, можна вводити як самостійний препарат або у комбінації з іншими видами лікування, одночасно або послідовно, залежно від підлягаючого лікуванню стану. Інші способи лікування можуть включати введення відповідних дозувань болезаспокійливих препаратів, таких як нестероїдні протизапальні препарати (наприклад, аспірин, парацетамол, ібупрофен або кетопрофен) або опіати, такі як морфін; введення протиблювотних засобів або введення щонайменше однієї іншої сполуки, що активно діє проти астми, як правило бронхорозширювального засобу, що викликає релаксацію дихальних шляхів або підсилює очищення слизових оболонок, наприклад бета-агоністи (наприклад, сальбутамол, сальметерол), динатрію кромоглікат, стероїди або інгібітор PDEIV. Способи аналізу У даному винаході описаний спосіб, який включає провокування або дозвіл зв'язування агента, що зв'язується з мішенню, описаного в даному документі, з IL-25. Як відзначено, таке зв'язування може відбуватися in vivo, наприклад, після введення пацієнту агента, що зв'язується з мішенню, або нуклеїнової кислоти, яка кодує агент, що зв'язується з мішенню, або ж зв'язування може відбуватися in vitro, наприклад, у тестових системах імуноферментного аналізу, тесту Biacore, тесту Octet, Вестерн-блотингу, при використанні способів імуноцитохімії, імунопреципітації або афінної хроматографії. Можливе кількісне визначення ступеня зв'язування агента, що зв'язується з мішенню, з IL25. Результат кількісного визначення може бути пов'язаний з кількістю антигену в тестованому зразку, що являє собою діагностичний інтерес. Реакційна здатність антитіл до зразка може бути визначена будь-яким відповідним способом. Одним з можливих способів є радіоімуноаналіз (RIA). При цьому антиген з радіоактивною міткою змішують з неміченим антигеном (тестований зразок) і проводять зв'язування з антитілом. Зв'язаний антиген фізично відділяють від незв'язаного антигену і визначають кількість радіоактивного антигену, що зв'язався з антитілом. Чим більше антигену міститься в тестованому зразку, тим менше буде кількість радіоактивного антигену, що зв'язався з антитілом. Можливий також тест на конкурентне зв'язування з нерадіоактивним антигеном, з використанням антигену або його аналога, зв'язаного з репортерною молекулою. Репортерна молекула може являти собою флуорохром, фосфоресціюючий агент або лазерний барвник зі спектрально ізольованими смугами поглинання або емісії. Придатні для цілей даного винаходу флуорохроми включають флуоресцеїн, родамін, фікоеритрин і Texas Red. Придатні для цілей даного винаходу хромогенні барвники включають діамінобензидин. Інші репортерні агенти включають макромолекулярні колоїдні частинки або інші частинки, такі як латексні кульки, що можуть бути забарвленими, магнітними або парамагнітними, а також біологічно або хімічно активні речовини, що можуть прямо або побічно приводити до утворення реєстрованих сигналів, що будуть виявлятися і реєструватися візуально, електронним або іншим способом. Ці молекули можуть являти собою ферменти, каталізуючі реакції, що приводять до появи або зміни забарвлення або, наприклад, викликають зміну електричних властивостей. Вони можуть бути молекулярно збудливими, так що електронні переходи між енергетичними рівнями приводять до характерних спектрів поглинання або емісії. Вони можуть включати хімічні об'єкти, використовувані в сполученні з біосенсорами. Також можна використовувати систему визначення типу біотин/авідин або біотин/стрептавідин з лужною фосфатазою. Сигнали, генеровані окремими кон'югатами антитіло-репортер, можна використовувати для одержання кількісних абсолютних або відносних даних по ступеню зв'язування відповідного антитіла в зразках (стандартних і тестованих). 20 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У даному винаході також запропоноване використання агента, що зв'язується з мішенню, як описано вище, для вимірювання рівнів антигенів з використанням конкурентного аналізу, тобто спосіб вимірювання рівня антигену в зразку шляхом використання запропонованого в даному винаході агента, що зв'язується з мішенню, для конкурентного аналізу. Цей спосіб можна використовувати в тих випадках, коли не потрібне фізичне відділення зв'язаного антигену від незв'язаного. Однією з можливостей є приєднання до агента, що зв'язується з мішенню, репортерної молекули, так щоб при зв'язуванні відбувалися фізичні або оптичні зміни. Репортерна молекула може прямо або побічно створювати реєстровані і переважно вимірювані сигнали. Приєднання репортерних молекул може бути здійснене прямо або опосередковано, ковалентно, наприклад з використанням пептидного зв'язку, або нековалентно. Приєднання за допомогою пептидного зв'язку може бути виконане в результаті рекомбінантної експресії злитого гена, що кодує антитіло ірепортерну молекулу. У даному винаході також запропоноване безпосереднє вимірювання рівнів антигену шляхом використання агента, що зв'язується з мішенню, відповідно до даного винаходу, наприклад, у біосенсорній системі. Фахівець у даній галузі може вибрати відповідний режим зв'язування згідно зі своїми перевагами і загальними знаннями. ПРИКЛАДИ Нижче наведені описи прикладів здійснення даного винаходу. Приклад 1. Одержання M6, високоафінного гуманізованого антитіла до IL-25 Як вихідна молекула для одержання варіантів з поліпшеною афінністю зв'язування з IL-25 був вибраний huDDG91, гуманізований (CDR-щеплений) варіант мишачого 2C3 моноклонального анти-IL25 антитіла. Легкий каппа-ланцюг послідовності huDDG91, виключаючи лідерну послідовність, показаний на фіг. 1 (SEQ ID NO: 2), де підкреслені амінокислотні послідовності CDR-петель, відповідно до позначень Kabat. Послідовність важкого ланцюга huDDG91 (SEQ ID NO: 4) показана на фіг. 2, де підкреслена амінокислотна послідовність ділянок CDR, відповідно до позначень Kabat. huDDG91 також відомий як RH2.5_R71V. Створення і характеризація мишачих 2C3 моноклонального анти-IL25 антитіла описані в міжнародній заявці № PCT/GB2008/001365, опублікованій 30 жовтня 2008 р. як документ WO 2008/129263, зміст якого повністю включено в даний документ шляхом посилання. Для створення варіантів huDDG91 з використанням стандартної методології були сконструйовані бібліотеки фагового відображення, основані на послідовності huDDG91. Бібліотеки Fab афінно сортували з використанням біотинільованого IL-25. За допомогою імуноферментного аналізу (ELISA) вибрали фрагменти (Fab), що зв'язують антиген, зі ступенем зв'язування, який порівнянний зі ступенем зв'язування huDDG91 (IgG4) або перевищує його. Вибрані Fab перетворили в моноклональні антитіла (mAb) наступним чином. Сконструювали комбінаторну бібліотеку з 5 різних легких ланцюгів і 5 різних важких ланцюгів (включаючи легкі і важкі ланцюги huDDG91). Використані в бібліотеці легкі і важкі ланцюги відрізнялися один від одного в амінокислотних послідовностях ділянок CDR1 і CDR3 легкого ланцюга й у послідовності ділянки CDR3 важкого ланцюга. Використовуючи дані легкі і важкі ланцюги, сконструювали 25 mAb (IgG1), які експресували в невеликій кількості в клітинах лінії HEK293 і очистили. Кожний з одержаних mAb протестували на афінність зв'язування з IL-25, клітинне інгібування і інгібування рецепторів наступним чином: - визначили афінність зв'язування з IL-25 з використанням стандартної тестової системи IL25 ELISA і при проведенні аналізу зв'язування Biacore. Відібрали кандидатів, у яких K D менше 50 пM для IL-25 людини і KD більше 100 нM для IL-17A, C, D і F людини; - досліджували клітинне інгібування за допомогою стандартного тесту з використанням клітин ниркової карциноми людини лінії TK-10 (що реагують на IL-25; реєстрація по реакції на IL25 і IL-8; здатні розрізнити між собою розчинний IL-25R і вихідне mAb), a також тест на основі Tклітинної системи CD4+. Для тестової системи TK-10 відібрали mAb з концентрацією IC50 меншою, ніж у вихідного антитіла huDDG91, і інгібуванням секреції IL-25 >90 % при концентрації mAb 10 нМ. Для тестової T-клітинної системи CD4+ відібрали mAb, що викликають інгібування продукції IL-5, яке дорівнює або перевищуюче інгібування, що викликається вихідним антитілом huDDG91; - оцінювали інгібування рецепторів з використанням технології електрохемілюмінесцентного імуноаналізу (ECLIA) на основі модифікованих кульок. Відібрали кандидатів, що викликають більше ніж триразове збільшення концентрації IC50 для зв'язування IL-25 з рецептором у порівнянні з вихідним антитілом huDDG91 при концентрації mAb 10 нМ. Ґрунтуючись на цих критеріях, вибрали 9 потенційних mAb (фіг. 3). Усі кандидати продемонстрували прийнятні рівні експресії і бажані профілі SE-HPLC і SDS-PAGE при експресії 21 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 в клітинах лінії HEK293 і очищенні з використанням стандартних протоколів. Усі 9 кандидатів транзитно експресували в масштабі 10 л у клітинах лінії СНО (яєчника китайського хом'ячка), очистили за допомогою системи Mab Select SuRe (GE Healthcare Life Sciences), замістили буфер на фосфатний буферний розчин (PBS) і сконцентрували. Афінність зв'язування з IL-25 кожного з 9 потенційних mAb була значно вище, ніж у huDDG91. Використовуючи стандартні способи й аналізи, кожне mAb також досліджували на рівень експресії, ідентичність (SDSPAGE), розчинність, агрегацію (SE-HPLC), посттрансляційну модифікацію, білок-білкові взаємодії й окислювання. Деякі з потенційних mAb при експресії в клітинах лінії СНО, очищенні й обробці в стандартних умовах випадали в осад при концентруванні, мали низькі виходи і (або) небажані профілі SDS-PAGE і SE-HPLC. Одне mAb, позначене M6, відібрали для наступного вивчення, виходячи з його більш високого рівня експресії, високої розчинності, відсутності значної агрегації білків при очищенні і відсутності небажаних посттрансляційних модифікацій, білок-білкових взаємодій і окислювання при очищенні. Приклад 2. Характеризація антитіла M6 Матеріали і способи Тестова система на основі клітин епітелію товстого кишечнику людини лінії LS 174T Клітинну лінію клітин епітелію товстого кишечнику людини LS 174T (CL-188) одержали від компанії ATCC (м. Манассас, штат Вірджинія) і культивували в модифікованому по способу Дульбекко середовищі Ігла (DMEM, компанія Invitrogen, м. Карлсбад, штат Каліфорнія) з додаванням 10 % FBS, пеніциліну і стрептоміцину, при температурі 37 °C в атмосфері 5 % CO2. 5 Клітини висівали на 96-ямковий планшет для культивування з густиною 110 клітин/мл і загальним об'ємом 100 мкл і залишили на ніч для закріплення. Попередньо приготували комплекси антитіл до IL-25 (M6 і M9) з рекомбінантним білком IL-25 людини (Centocor), для цього одну і ту ж кількість білка IL-25 (кінцева концентрація 10 нг/мл) змішували з варійовною кількістю анти-IL-25 антитіла, титрованого в послідовних 3-кратних або напівлогарифмічних розведеннях, і інкубували при температурі 37 °C протягом 1 год. Культуральне середовище обережно відсмоктували і заміняли на комплекс білок IL-25/IL-25-антитіло, і клітини інкубували протягом ночі 18-22 год. Потім планшети з культурою центрифугували при 1200 об./хв. протягом 2 хв. для запобігання перенесенню клітинних залишків, і супернатант збирали і тестували на GROa з використанням імуноферментного аналізу (ELISA, R&D Systems, м. Міннеаполіс, штат Міннесота). Результати Аналіз послідовності M6 показав наявність трьох амінокислотних замін у порівнянні з послідовністю huDDG91, усі три заміни знаходилися в ділянці CDR3 легкого ланцюга (див. фіг. 3). Амінокислотні послідовності легкого (SEQ ID NO: 5) і важкого (SEQ ID NO: 9) ланцюгів антитіла M6 і їх ділянок CDR представлені на фіг. 4. За допомогою тестової системи Biacore установили, що антитіло M6 має афінність зв'язування з IL-25 людини, що у 3-5 разів перевищує афінність зв'язування huDDG91 з IL-25 людини (фіг. 3). Більше того, антитіло M6 зв'язувалося з IL-25 селективно, оскільки зв'язування з IL-17A, C, D або F людини не відбувалося. Перехресну реакційну здатність антитіла M6 досліджували на IL-25 яванських макак cynoIL-25 і IL-25 гризунів (миші). На перехресну реакційну здатність з cynoIL-25 вказувала афінність у межах 5-кратної афінності до IL-25 людини, інгібування лігандів рецептора і тест із використанням клітин лінії TK-10. Використовуючи ці критерії, було встановлено, що антитіло M6 зв'язується з IL-25 макак і мишей. Використовуючи описані в прикладі 1 клітинні тест-системи, було показано, що антитіло M6 має підвищене інгібування рецепторної активності в порівнянні з huDDG91, маючи більше ніж у три рази меншу концентрацію IC50 у порівнянні з huDDG91 (фіг. 3). Крім того, використання описаних у прикладі 1 клітинних тест-систем показало, що антитіло M6 виявляє підвищене клітинне інгібування IL-25 людини в порівнянні з huDDG91 (фіг. 3 і 5). Цей результат був підтверджений за допомогою аналізу на клітинах епітелію товстого кишечнику людини лінії LS 174T (фіг. 6А і 6B), проведеного, як описано вище. Приклад 3. H/D-обмінне картування епітопа в IL-25 людини, що упізнається антитілом M6 Короткий опис Передбачуваний епітоп у IL-25 людини, що упізнається антитілом M6, картували з використанням мас-спектрометрії воднево-дейтерієвого обміну ExSar™, виконаної компанією ExSar Corporation (м. Монмут-Джанкшн, штат Нью-Джерсі). Матеріали і способи I. Оптимізація розщеплення/розділення IL-25 22 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (1) IL-25 розморозили на льоду. (2) Розділили на 18100 мкл аліквот і заморозили всі аліквоти, крім однієї. (3) Змішали 10 мкл розчину 0,28 мг/мл (16,6 мкМ) IL-25 з 30 мкл фосфатного буфера (PBS), pН 7,0 у воді → [IL-25] = 0,07 мг/мл (4,2 мкМ). (4) Змішали 40 мкл (3) з різними гасильними розчинами. (5) Ввели 55 мкл зразка в систему ExSAR. (6) Пропустили зразок через колонку з іммобілізованим пепсином з витратою 200 мкл/хв. у буфері A (0,05 % TFA у H2O). (7) Продукти розщеплення пепсином ввели в колонку-пастку з оберненою фазою й знесолили буфером A з витратою 200 мкл/хв. протягом 3 хв. (8) Пептиди, одержані в результаті розщеплення пепсином, розділили в колонці C18, використовуючи лінійний градієнт 13→40 % буфера B (95 % ацетонітрил, 5 % H2O, 0,0025 % TFA) протягом 23 хв. (9) Пептиди реєстрували за допомогою мас-спектрометрії. II. Іммобілізація M6 4.1. Експериментальна процедура для іммобілізації M6 (5) Колонку mAb (104 мкл) заповнили 600 мкл антитіла M6, зв'язаного зі смолою POROS, використовуючи потік 500 мкл/хв. буфера A (0,05 % TFA у H2O) і тримач колонки з нержавіючої сталі розміром 2,130 мм. (6) Колонку з антитілами помістили у ванну охолоджувача, установленого на температуру 3 °C, забезпечивши лінії подачі реагенту в колонку і збирання реагенту на виході колонки. У лінії подачі реагентів установили скляний фільтр із порами розміром 2 мкм для фільтрування реагентів і зразків. 23 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (7) Зрівноважили колонку з антитілами з використанням 2250 мкл "буфера H". Для вимірювання pН розчину наприкінці лінії використовували індикаторний папір, щоб упевнитися в нейтральному значенні pН. (8) Змішали 10 мкл розчину 0,28 мг/мл (16,6 мкМ) IL-25 з 30 мкл "буфера H" → [IL-25] = 4,1 мкМ (еквівалентно 166 пмоль). (9) Зазначену суміш ввели в зрівноважену колонку з антитілами. (10) Використовуючи шприцевий насос, при температурі 3 °C ввели в колонку 200 мкл "буфера H" (поміщеного в шприц Гамільтона об'ємом 500 мкл) і зібрали 540 мкл фракцій. (11) Використовуючи шприцевий насос, при температурі 3 °C ввели в колонку 200 мкл 0,8 % мурашиної кислоти і зібрали 540 мкл фракцій. (12) У скляній вставці приготували контрольний зразок, змішавши 10 мкл розчину 0,28 мг/мл (16,6 мкМ) IL-25 з 30 мкл "буфера H". (13) Центрифугували усі вставки, що містять фракції або контрольний зразок, щоб струсити вниз краплі рідини на стінках вставки. Закрили і промаркували пробірки з вставками. (14) Нейтральні і кислотні фракції і контрольний зразок установили в піддон 4 термостата Cool Stack у непарні гнізда з номерами від 3 до 23 у наступному порядку: контрольний зразок, нейтральне промивання 1, 2, 3, 4, 5 і кислотне промивання 1, 2, 3, 4, 5. (15) У парні гнізда з номерами від 4 до 24 піддона 4 термостата Cool Stack установили одинадцять порожніх пробірок із кришками. (16) Кожну фракцію змішали з 20 мкл 2M сечовини, 1M TCEP, pН 3,0. (17) Ввели 55 мкл погашеного розчину в систему ExSAR без пепсинових колонок. (18) Зразок ввели в колонку-пастку в буфері A з витратою 200 мкл/хв. (0,05 % TFA), знесолили протягом 3 хв. і елюювали з лінійним градієнтом 13-40 % буфера B (95 % ацетонітрилу, 5 % H2O, 0,0025 % TFA) протягом 23 хв. (19) Елюати аналізували мас-спектрометрично в режимі MS1:Centroid. IV. Експериментальна процедура обміну типу асоціації-в-розчині/дисоціації-в-колонці (1) Підготували розчин 50 мM цитрату, 2 мM фосфохоліну-12 (Fos-choline-12), pН 6,0 у H2O. (2) Підготували фосфатний буферний розчин (PBS) з 2 мM фосфохоліну-12, pН 7,0 у H2O. (3) Підготували фосфатний буферний розчин (PBS), pН 7,0 у H2O. (4) Як "буфер для обміну H" використовували один з розчинів (1)-(3). (5) Підготували "буфер для обміну HH", змішавши 1 частину фосфатного буферного розчину (PBS), pН 7,0 у H2O і 3 частини "буфера для обміну H". (6) Підготували розчин 50 мM цитрату, 2 мM фосфохоліну-12 (Fos-choline-12), pН 6,0 у D2O). (7) Підготували фосфатний буферний розчин (PBS) з 2 мM фосфохоліну-12 (Fos-choline-12), pН 7,0 у D2O. (8) Підготували фосфатний буферний розчин (PBS), pН 7,0 у D 2O. (9) Як "буфер для обміну D" використовували один з розчинів (6)-(8). (10) Підготували "буфер для обміну HD", змішавши 1 частину фосфатного буферного розчину (PBS), pН 7,0 у H2O і 3 частини "буфера для обміну D". (1) Колонку з mAb (об'єм шару 104 мкл) розмістили і зрівноважили усередині холодного боксу при температурі 3 °C. (2) Колонку з mAb очистили 2250 мкл 0,8 % мурашиної кислоти. (3) Колонку з mAb промили 2250 мкл "буфера для обміну HD" для зрівноважування колонки. (4) Змішали 10 мкл розчину 0,28 мг/мл (16,6 мкM) IL-25 з 30 мкл "буфера для обміну D" при температурі 3 °C → [IL-25] = 0,07 мг/мл (4,2 мкM), [D2O] = 75 % (початий відлік часу асоціації). (5) Інкубували суміш протягом 150, 500, 1 500 або 5 000 с при температурі 3 °C. (6) Суміш (40 мкл) ввели в колонку з mAb. (7) Колонку з mAb промили 100 мкл "буфера для обміну HD" при температурі 3 °C. (8) Колонку з mAb промили 200 мкл охолодженого "буфера для обміну HH" (при першому ж контакті H2O з колонкою закінчений відлік часу асоціації і початий відлік часу дисоціації). (9) Інкубували суміш при температурі 23 °C протягом 75, 250, 750 або 2 500 с. (10) У колонку з mAb ввели 120 мкл охолодженої 0,8 % мурашиної кислоти (при введенні кислоти в колонку відразу ж закінчений відлік часу дисоціації). (11) Ввели додатково 40 мкл охолодженої 0,8 % мурашиної кислоти, щоб елюювати антиген з колонки з mAb. 24 UA 112965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (12) 40 мкл фракції зібрали в скляну вставку. (13) У зібрані 40 мкл фракції додали 20 мкл охолодженого розчину 2M сечовини, 1M TCEP, pН 3,0. (14) Ввели 55 мкл погашеного розчину з проведеним обміном у систему ExSAR з пепсиновою колонкою і колонкою C18 (пепсинова колонка: об'єм шару 104 мкл; швидкість потоку в пепсиновій колонці 200 мкл/хв.; колонка C18: градієнт 13-40 % буфера B протягом 23 хв.). Установили час розщеплення 3 хв. (15) Елюати аналізували мас-спектрометрично в режимі MS1:Profile. V. Експериментальна процедура обміну типу асоціації-в-колонці/дисоціації-в-колонці (1) Колонку з mAb (об'єм шару 104 мкл) розмістили і зрівноважили усередині холодного боксу при температурі 23 °C. (2) Колонку з mAb очистили 2250 мкл 0,8 % мурашиної кислоти. (3) Колонку з mAb промили "буфером для обміну HH" для зрівноважування колонки. (4) Змішали 10 мкл розчину 0,28 мг/мл (16,6 мкМ) IL-25 з 30 мкл "буфера для обміну H" при температурі 3 °C → [IL-25] = 0,07 мг/мл (4,2 мкM), [D2O] = 0 %. (5) Суміш ввели в колонку з mAb. (6) Колонку з mAb промили 100 мкл "буфера для обміну HH". (7) Реакцію асоціації ініціювали пропусканням 200 мкл "буфера для обміну HD" через колонку з mAb (початий відлік часу асоціації). (8) Інкубували колонку з mAb протягом 150, 500, 1500 або 5000 с при температурі 3 °C. Аналогічно 5.2. Аналогічно вищеописаній процедурі IV, стадії 10-14. Аналогічно вищеописаній процедурі IV, стадія 15. VI. Експериментальна процедура для експерименту з повним дейтеруванням (1) Змішали 10 мкл розчину 0,28 мг/мл (16,6 мкМ) IL-25 з 30 мкл "буфера для обміну D". (2) Одержану суміш витримали при температурі 60 °C протягом 3 год. (3) Потім остудили її до кімнатної температури. (4) Помістили 40 мкл суміші в колонку з mAb. (5) Ввели 100 мкл "буфера для обміну HD" у колонку з mAb. Аналогічно вищеописаній процедурі IV, стадії 10-14. Аналогічно вищеописаній процедурі IV, стадія 15. Дейтерій, приєднаний до перших двох амінокислотних залишків кожного іона, втрачається в процесі аналізу (розщеплення/розділення/мас-спектрометричний аналіз у водному середовищі). Цим і пояснюються невеликі пропуски в профілі H/D-обміну на фіг. 8A і 8B. Експерименти без дейтерування, обмінні експерименти й експерименти повного дейтерування проводили для кожного білка. Експерименти без дейтерування використовували для ідентифікації іонів, а також для точного визначення m/z кожного іона без дейтерію. Експерименти повного дейтерування ідентифікували втрату дейтерію кожним іоном у процесі аналізу (розщеплення/розділення/масспектрометрія у водному середовищі). В експериментах цього типу можна розрахувати число дейтронів до мас-спектрометричного аналізу і після обмінної реакції типу асоціації або асоціаціїдисоціації. В експериментах з обміном типу асоціації-дисоціації час дисоціації складав половину часу асоціації. Це є наслідком того, що при однакових значеннях рН істинна швидкість обміну H→D складає половину істинної швидкості обміну D→H. Результати Розщеплення IL-25 IL-25 розщеплювали обробкою пепсином у різних умовах. Найкращі результати розщеплення IL-25 пепсином одержали при гасінні 2 частин розведеного розчину IL-25 1 частиною розчину 2M сечовини, 1M TCEP, pН 3,0 і розщепленні в пепсиновій колонці при витраті 200 мкл/хв. Найкращими умовами для розділення виявилися наступні: колонка C18 з лінійним градієнтом 13-40 % буфера B (95 % ацетонітрилу, 5 % H2O і 0,0025 % TFA) у буфері A протягом 23 хв. Ступінь покриття послідовності IL-25 після розщеплення пепсином склав 100 % (= 146/146; фіг. 7A і 7B). Іммобілізація M6 і тест зв'язувальної здатності колонки з M6 Зразок IL-25 без розщеплення пепсином дав один хроматографічний пік при 8,5 хв. Зразок виявився чистим. Антитіло M6 успішно кон'югували зі смолою POROS AL, використовуючи хімію основ Шиффа. Результати тестування зв'язувальної здатності колонки з M6 при трьох різних умовах у системі ExSAR показані в таблиці 1. Стежили за інтактним піком з m/z=1875 (+18) і 25 UA 112965 C2 5 1985 (+17). При всіх проаналізованих умовах зв'язування випробування IL-25 не елюювався з колонки при промиванні нейтральними розчинами, указуючи на те, що при нейтральних умовах весь введений IL-25 (166 пмоль) зв'язується з колонкою з M6. IL-25 може неспецифічно прилипати до колонки з M6. Тільки 17-18 % введеного IL-25 було виведено з колонки при промиванні кислим розчином за відсутності детергенту. Крім того, зворотний тиск колонки з M6 при повторних введеннях IL-25 поступово збільшувався. Виведення покращилося при додаванні фосфохоліну-12. Таблиця 1 Умови, використані для тестування зв'язувальної здатності колонки з антитілами M6 "буфер H" температура 50 мM цитрат, pН 6 3 °C 50 мM цитрат, 2 мM 3 °C фосфохолин-12, pН 6 ФБР, pН 7 3 °C (a) (b) (c) пепсин нейтральний 0% кислий 18 % 0% 24 % 0% 17 % Стовпець між "температура" і "нейтральний" озаглавлений "пепсин". Ідентифікація епітопа Експерименти по обміну при асоціації IL-25 у розчині проводили при температурі 23 °C і pН 10 7. 15 20 Показано, що IL-25 є відносно динамічним білком. Найсильніший захист спостерігали в сегментах, що охоплюють амінокислотні залишки 56-63 і 66-74 (фіг. 8А і 9С; таблиця 2). Аналогічні сегменти, що охоплюють амінокислотні залишки 4663 і 66-84, показали стабільний слабкий захист (фіг. 8А, 9С і 9D; таблиця 2). Пограничні показники захисту спостерігали для сегментів, що охоплюють амінокислотні залишки129-135 (фіг. 8B, 9E і 9F; таблиця 2). Таблиця 2 Відмінності в рівнях дейтерування в різних сегментах IL-25 людини після експериментів обміну при асоціації/дисоціації при рН 7 і рН 8 при температурі 23 °C pH6 pH6 pH7 pH7 pH7 pH7 початок кінець заряд 150 500 150 500 1500 5000 3 3 3 12 23 23 23 23 46 46 56 66 66 77 87 90 104 105 112 9 15 20 20 42 43 45 53 53 63 63 74 84 84 101 101 109 109 126 1 2 2 1 2 2 3 3 1 3 1 2 2 2 2 2 1 1 2 -3 % -3 % 1% 0% 3% 3% 2% 2% 2% 8% 7% 6% 9% 3% 2% 2% 0% 3% 2% -5 % 0% 4% 1% 1% 1% 1% -1 % 5% 7% 10 % 2% 2% 0% 0% 0% 2% -1 % 1% 2% -1 % 1% 0% 2% 0% 2% 11 % 9% 11 % 5% 1% 3% 0% 0% 3% -1 % 0% 1% 0% 0% 0% 1% 1% 1% 7% 8% 13 % 7% 3% 3% 1% 1% 2% -1 % -3 % -3 % 0% -1 % -1 % 1% 1% 0% 1% 6% 7% 6% -2 % -2 % 0% 0% 4% 1% 5% -1 % -1 % 1% 3% 0% -2 % -1 % 0% 0% 2% 0% -2 % -2 % 1% 1% -2 % 0% 0% 26 середнє значення 0% -2 % 0% 1% 1% 0% 1% 1% 1% 5% 6% 8% 4% -2 % 1% 1% 0% 1% 2% UA 112965 C2 Продовження таблиці 2 Відмінності в рівнях дейтерування в різних сегментах IL-25 людини після експериментів обміну при асоціації/дисоціації при рН 7 і рН 8 при температурі 23 °C pH6 pH6 pH7 pH7 pH7 pH7 початок заряд 150 500 150 500 1500 5000 112 129 133 138 140 5 кінець 127 135 135 146 146 2 2 1 1 1 7% 3% -2 % 1% -1 % -4 % 6% 3% 1% 7% 1% 8% 7% -1 % 3% 4% 4% 5% -2 % -2 % -3 % 8% 5% 0% -2 % 1% 0% 2% 1% 2% середнє значення 1% 5% 3% 0% 1% Зміст усіх цитованих у даному документі патентів, опублікованих заявок і літературних джерел повністю включений в даний документ шляхом посилання. Хоча даний винахід був викладений і описаний з посиланнями на наведені приклади варіантів його здійснення, фахівці в даній галузі визначать, що можливі різні зміни у формі і деталях без відхилення від суті винаходу, охоплюваного прикладеною формулою винаходу. 27 UA 112965 C2 28