Нові композиції пухлиноасоційованих пептидів, що зв’язуються з молекулами і або іі класу лейкоцитарного антигену людини (hla) для розробки вакцин

Реферат: Винахід належить до нових композицій пухлино-асоційованих пептидів, що зв'язуються з молекулами І або II класу лейкоцитарного антигену людини (HLA), у складі вакцин для застосування в імунотерапевтичних методах, зокрема до композицій для імунотерапії раку, зокрема раку нирки та мозку, особливо, гліоми, та в конкретному випадку, гліобластомного раку, а також до композицій вакцин для викликання протипухлинних імунних реакцій. UA 104572 C2 (12) UA 104572 C2 UA 104572 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Цей винахід стосується нових композицій пухлиноасоційованих пептидів, що зв'язуються з молекулами І або II класу лейкоцитарного антигену людини (HLA), у складі вакцин для застосування в імунотерапевтичних методах. Зокрема, цей винахід стосується композицій для імунотерапії раку, зокрема, раку нирки. Крім того, цей винахід стосується композицій вакцин для викликання протипухлинних імунних реакцій. Для цілей даного винаходу, усі довідкові матеріали, які зазначені в ньому, включені шляхом посилань в усій своїй повноті. Композиція для ін'єкції, яка містить пептиди, у вигляді порошку та розріджувач, що складається з гідрокарбонату натрію, розкрита в патенті WO 2007/028573 для вакцинації гіпернефроми. Однак, ця композиція має ряд недоліків. Основним недоліком є погана розчинність, яка ускладнює її використання в будь-яких випадках, наприклад, при клінічному застосуванні. Для того, щоб розчинити порошок в композиції, пробірку, яка містить пептиди, що підлягають розчиненню, та розріджувач треба енергійно струшувати протягом трьох хвилин, після чого піддати ультразвуковій гомогенізації впродовж однієї хвилини, та знову струшувати одну хвилину. Такі заходи не можуть застосовувати усі лікарі в своїй практиці, оскільки вони часто не мають потрібного обладнання, і, таким чином, суміш, яка зберігається в архіві, може не бути однорідною, як це потрібно для ефективного використання. Додаткова проблема, яка стосується композиції, пов'язана з тим фактом, що враховуючи швидкість розчинення активних інгредієнтів із застосуванням гідрокарбонату натрію в даних концентраціях, одержаний в результаті розчин можна використовувати тільки приблизно 30 хвилин. До того ж, характеристики наведеної вище композиції з часом змінюються, і це робить безпечне використання практично неможливим. Після зберігання розкритої в патенті композиції протягом 12 місяців із застосуванням різних температур у діапазоні від -20 °C до +25 °C, не може бути одержаний прозорий розчин, навіть після використання ультразвукового гомогенізатора протягом декількох хвилин. Тобто, продовжує існувати потреба в нових пептидних композиціях з поліпшеною розчинністю та посиленим зволоженням ліофілізату, для одержання безпечного та ефективного препарату, зокрема, у випадку протиракової вакцинації. Цей винахід задовольняє цю потребу. Цей винахід в одному з його переважних аспектів пропонує фармацевтичні композиції, які вміщують від 2 до 18, переважно, менше 15, більш переважно, менше 13, ще більш переважно, від 2 до 12 пептидів та, ще більш переважно, від 3 до 12 пухлиноасоційованих пептидів; де кожний пептид має довжину від 8 до 22 амінокислот, переважно, від 9 до 16 амінокислот; де зазначені пептиди демонструють розчинність в 90-процентній оцтовій кислоті щонайменше 2.7 мг/мЛ; манітол та полоксамер 188, де вагове співвідношення зазначеного пептиду(ів) до манітолу і полоксамеру 188 знаходиться в діапазоні від 1:5:1.5 до 1:8:2.2 включно; або манітол та Tween 80®, де вагове співвідношення пептидів до манітолу і Tween 80 знаходиться в діапазоні від 1:2:1.5 до 1:8:2.2 включно. В іншому переважному аспекті, цей винахід пропонує фармацевтичну композицію згідно з пунктом 1, яка складається щонайменше з двох пептидів, де зазначені пептиди містять амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка включає послідовності від SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO: 10, або від SEQ ID NO: 12 до SEQ ID NO: 23; за умови, що композиція містить щонайменше один пептид, що включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12 або SEQ ID NO: 13, чи її варіант або сіль; і, крім того, містить манітол і полоксамер 188, де вагове співвідношення пептидів до манітолу і полоксамеру 188 знаходиться в діапазоні від 1:5:1.5 до 1:8:2.2 включно. Ще в одному з переважних аспектів, цей винахід пропонує фармацевтичну композицію згідно із пунктом 1, яка складається щонайменше з двох пептидів, де зазначені пептиди вміщують амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка включає послідовності від SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO: 10, або від SEQ ID NO: 12 до SEQ ID NO: 23; за умови, що композиція містить щонайменше один пептид, що включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12 або SEQ ID NO: 13 чи її варіант або сіль; і, крім того, містить манітол і Tween 80®, де вагове співвідношення пептидів до манітолу і Tween 80® знаходиться у діапазоні від 1:2:1.5 до 1:8:2.2 включно. Переважно, композиція, відповідно до винаходу, є прийнятною для стабільних композицій, які вміщують надзвичайно гідрофобні пептиди (наприклад, ІМА-СНІ-001; SEQ ID NO: 23). Цей конкретний пептид, наприклад, зовсім не розчинюється у воді та є лише слабо розчинним в 90процентній оцтовій кислоті (розчинність приблизно 2.9 мг/мЛ). Незвичайним фактом виявилося 1 UA 104572 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 те, що тепер можливо розробляти пептид згідно з SEQ ID NO: 23 з будь-яким іншим пептидом в іншій композиції, що могла б використовуватися відносно живих істот. Отже, в наявній заявці розкривається композиція для комбінування від 2 до 18 пептидів, переважно, менше 15, більш переважно, менше 13, ще більш переважно, від 2 до 12 пептидів та, ще більш переважно, від 3 до 12 пептидів, з довжиною пептиду від 8 до 22 амінокислот, переважно, від 9 до 16 амінокислот, за умови, що пептиди демонструють розчинність в 90процентній оцтовій кислоті щонайменше 2.7 мг/мЛ, переважно, 2.9 мг/мЛ; і крім того, з вміщенням манітолу і полоксамеру 188, де вагове співвідношення пептидів до манітолу і полоксамеру 188 знаходиться в діапазоні від 1:5:1.5 до 1:8:2.2 включно. В переважному втіленні фармацевтичної композиції, відповідно до цього винаходу, вагове співвідношення пептидів до манітолу і полоксамеру 188 знаходиться в діапазоні від 1:0:2 до 1:0:2.2 включно. Ще одне переважне втілення цього винаходу пропонує фармацевтичну композицію, наведену вище, яка складається щонайменше з двох пептидів, де зазначені пептиди містять амінокислоту, вибрану з групи, яка включає послідовності від SEQ ID NO: 12 до SEQ ID NO: 23; за умови, що композиція містить щонайменше один пептид, який включає SEQ ID NO: 12 чи SEQ ID NO: 13 або їхній варіант; і крім того містить манітол Tween 80®, де переважне вагове відношення пептидів до манітолу і Tween 80® знаходиться в діапазоні від 1:5:0.5 до 1:5:2 включно. Переважно, пептиди цього винаходу мають загальну довжину від 9 до 16 амінокислот. Пептиди можуть включати непептидні зв'язки. В інших переважних втіленнях, фармацевтичні композиції містять пептиди, які складаються з амінокислотних послідовностей, визначених в SEQ ID NO: 1 та/або SEQ ID NO: 2, і, крім того, вміщують щонайменше один пептид, що включає амінокислотну послідовність, визначену в будь-якій з послідовностей від SEQ ID NO: 3 до SEQ ID NO: 10. В деяких переважних втіленнях, фармацевтична композиція може, крім того, містити пептид, який включає амінокислотну послідовність, визначену в SEQ ID NO: 11, за умови, що зазначений пептид не є відповідним повним пухлиноасоційованим поліпептидом. В інших втіленнях, фармацевтична композиція може додатково включати пептид, що складається з амінокислотної послідовності, визначеної в SEQ ID NO: 11. В інших переважних втіленнях, фармацевтичні композиції вміщують пептиди, які складаються з амінокислотних послідовностей, визначених в SEQ ID NO: 12 та/або SEQ ID NO: 13 і, крім того, вміщують щонайменше один пептид, що включає амінокислотну послідовність, визначену в будь-якій з послідовностей від SEQ ID NO: 14 до SEQ ID NO: 23. В деяких переважних втіленнях, ця фармацевтична композиція може додатково містити пептид, який включає амінокислотну послідовність, визначену в SEQ ID NO: 11, за умови, що зазначений пептид не є відповідним повним пухлиноасоційованим поліпептидом. В інших втіленнях, фармацевтична композиція може, крім того, містити пептид, що складається з амінокислотної послідовності, зазначеної в SEQ ID NO: 11. В окремих втіленнях, пептиди, які присутні в композиції, вибираються з пептидів, що є специфічними для тканин, ракових захворювань та/або окремих пацієнтів. В подальших переважних втіленнях, фармацевтична композиція може додатково містити щонайменще один прийнятний ад'ювант. Ад'юванти є речовинами, які неспецифічно збільшують або посилюють імунну реакцію (наприклад, імунні реакції, в яких посередниками виступають CTLs і Т-хелпери (Тн) на антиген, і, таким чином, їх можна вважати корисними для медикаменту цього винаходу. Прийнятні ад'юванти включають, без обмежень, 1018 ISS, солі алюмінію, Amplivax, AS15, БЦЖ, СР870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, флагелін чи TLRS-ліганди, одержані з флагеліну, FLТЗ-ліганд, GM-CSF, ІС30, ІС31, Іміквімод (ALDARA), резіміквімод, ImuFact IMP321, інтерлейкіни, такі як IL2, IL-13, IL-21, альфа- чи бета-інтерферон або їхні пегільовані похідні, IS Patch, ISS (імуностимулюючі послідовності), ISCOMATRIX, ISCOMs (імуностимулюючі комплекси), Juvlmmune, LipoVac, MALP2, MF59, монофосфорильований ліпід А, Монтанід IMS 1312, Монтанід ISA 206, Монтанід ISA 50V, Монтанід ISA-51, емульсії типу "вода в маслі" та "масло в воді", ОK-432, ОМ-174, ОМ-197-МР-ЕС, ONTAK, OspA, векторну систему PepTel®, PLG і мікрочастинки декстрану, резіквімод, SRL172, Віросоми та інші вірусоподібні частинки, YF-17D, VEGF trap, R848, бета-глюкан, РаmЗСуs, стимулон Aquila's QS21, який виділяється з сапоніну, мікобактеріальні екстракти, синтетичні імітатори стінок бактеріальних клітин, а також інші патентовані ад'юванти, такі як Ribi's Detox, Quil або Superfos. Переважними є такі ад'юванти, як ад'ювант Фрейнда або GM-CSF. Кілька імунологічних ад'ювантів (наприклад, MF59), специфічних для дендритних клітин, та їхнє приготування, були описані раніше (Dupuis M et al. 2 UA 104572 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1998; Allison 1998). Також можуть застосовуватись цитокіни. Окремі цитокіни були прямо співвіднесені із впливом на міграцію дендритних клітин до лімфоїдних тканин (наприклад, TNFα), прискорюючи перетворення дендритних клітин в ефективні антиген-презентуючі клітини для Т-лімфоцитів (наприклад, GM-CSF, IL-1 та IL-4) (Патент США № 5,849,589, окремо включений в цей документ шляхом посилання в усій своїй повноті) та діючи як імуноад'юванти (e.g., IL-12, IL15, IL-23, IL-7, альфа-IFN, бета-IFN) (Gabrilovich et al. 1996). Доповідалося про те, що імуностимулюючі CpG-олігонуклеотиди також посилюють ефект ад'ювантів у вакцинному складі. Теоретично, не будучи зв'язаними, CpG-олігонуклеотиди діють шляхом активації природної (не здобутої) імунної системи за допомогою Toll-подібних рецепторів (TLR), переважно, TLR9. Активація TLR9, ініційована CpG, посилює антигенспецифічні гуморальні та клітинні реакції на широкий спектр антигенів, пептидні чи протеїнові антигени, живі або вбиті віруси, вакцини на основі дендритних клітин, аутологічні клітинні вакцини та полісахаридні кон'югати в профілактичних і терапевтичних вакцинах. Більш важливо те, що така активація посилює визрівання та диференціацію дендритних клітин, що в результаті збільшує активацію ТH1 клітин і генерацію цитотоксичних Т-лімфоцитів (CTL), навіть за відсутності допомоги CD4 Т-клітин. Активація ТH1 індукована стимуляцією TLR9, зберігається навіть у присутності вакцинних ад'ювантів, таких як солі алюмінію чи неповний ад'ювант Фрейнда (IFА), які зазвичай сприяють активації Т H2. CpG-олігонуклеотиди демонструють навіть більшу ад'ювантну активність, коли формулюються чи вводяться разом із іншими ад'ювантами або в таких композиціях, як мікрочастинки, наночастинки, ліпідні емульсії чи подібні композиції, які є особливо необхідними для індукування сильної реакції, коли антиген відносно слабкий. Вони також прискорюють імунну реакцію та дають змогу зменшити дози антигену приблизно у два порядки в порівнянні з реакціями антитіл на вакцину в повній дозі без CpG в деяких експериментах (Krieg et al. 2006). В Патенті США № 6,406,705 В1 описується комбіноване використання CpG-олігонуклеотидів, ад'ювантів, що не вміщують нуклеїнових кислот, та антигену для індукування антиген-специфічної імунної реакції. CpG ТLR9-антагоністом є dSLIM (імуномодулятор з подвійно-нитчастим контуром), розроблений фірмою Mologen (Берлін, Німеччина), який являє собою переважний компонент фармацевтичної композиції цього винаходу. Також можуть використовуватись інші TLR-зв'язувальні молекули, наприклад, TLR 7, TLR 8 та/або TLR 9, зв'язані з РНК. Інші приклади прийнятних ад'ювантів включають, без обмежень, хімічно модифіковані олігонуклеотиди CpG (наприклад, CpR, Idera), дсРНК аналоги (дc - двониткові), такі як Роlу(І:С) і AmpliGen, бактеріальні ДНК чи РНК, інші ніж CpG, a також невеликі імуноактивні молекули та антитіла, такі як циклофосфамід, сунітініб (sunitinib), Бевасізумаб (Bevacizumab), целебрекс (celebrex), NCX-4016, сілденафіл (sildenafil), тадалафіл (tadalafil), варденафіл (vardenafil), сорафеніб (sorafenib), темозоломід (temozolomide), темзіролімус (temsirolimus), XL-999, СР547632, пазораніб (pazopanib), VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, анти- CTLA4 та SC58175, які можуть діяти терапевтично та/або як ад'ювант. Кількості та концентрації ад'ювантів та домішок, прийнятних у контексті цього винаходу, можуть бути легко визначені досвідченим спеціалістом без неналежного експериментування. Переважними ад'ювантами є dSLIM, альфа-, бетаінтерферон, CpG7909, IC31, Іміквімод, резіміквімод, PeviTer, РНК, тадалафіл, темозоломід та Juvlmmune. Переважними ад'ювантами є dSLIM, BCG, OK432, іміквімод, резіміквімод, GMCSF, альфаінтерферон, PeviTer та Juvlmmune, або їхні комбінації. В переважному втіленні фармацевтичної композиції відповідно до винаходу, ад'ювант вибирається з групи, яка складається з факторів стимулювання колоній, таких як Фактор Стимулювання Колоній Гранулоцитів-макрофагів (GM-CSF, сарграмостим), іміквімод, резіквімод та альфа-інтерферон. В переважному втіленні фармацевтичної композиції відповідно до винаходу, ад'ювант вибирається з групи, що складається з факторів стимулювання колоній, таких як Фактор Стимулювання Колоній Гранулоцитів-макрофагів (GM-CSF, сарграмостим), іміквімод та резіміквімод. В переважному втіленні фармацевтичної композиції відповідно до винаходу, ад'ювантом є іміквімод або резіміквімод. Композиція може застосовуватись для парентерального введення, наприклад, підшкірного, інтрадермального, внутрішньом'язового чи перорального введення. Пептиди також можуть вводитись разом із імуностимулюючими речовинами, наприклад, цитокінами. Фармацевтичні композиції винаходу можуть застосовуватися як протиракова вакцина. 3 UA 104572 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід також включає комплект, який складається щонайменше з одного з вищенаведених пептидів та/або зазначеної фармацевтичної композиції, підготовленої завчасно або в окремих контейнерах чи пробірках для змішування на місці. Переважним є комплект, що включає: (а) контейнер з фармацевтичною композицією відповідно до винаходу, в розчині або в ліофілізованій формі; (b) додатково, другий контейнер з розріджувачем або відновлюючим розчином для цієї ліофілізованої композиції та/або щонайменше один ад'ювант; та (с) додатково, інструкції по (і) використанню розчину, або (іі) відновленню та/або використанню зазначеної ліофілізованої композиції. Крім того, переважним є комплект відповідно до винаходу, який додатково містить один чи кілька (і) буферів, (іі) розріджувачів, (ііі) фільтрів, (iv) голок та (v) шприців. Фігура 1: Аналітична хроматограма пептидів, одержана за допомогою HPLC (високоефективної рідинної хроматографії) (SEQ ID NO: 1-11), які вміщують бета-нафтилаланін (NAL), як внутрішній стандарт. Фігура 2: Стабільність композиції 1 (контрольної) без будь-яких наповнювачів при +25 °C. Фігура 3: Стабільність композиції 2 відповідно до винаходу, з манітолом та Lutrol F68® (Полоксамер 188) при +25 °C. Фігура 4: Стабільність композиції 3 відповідно до винаходу, з манітолом та Tween 80® при +25 °C. Фігура 5: Стабільність композиції 4 відповідно до винаходу, з манітолом та Tween 80®при+25 °C. Фігура 6: Стабільність композиції 1 (контрольної) без будь-яких наповнювачів при +40 °C. Фігура 7: Стабільність композиції 2 відповідно до винаходу, з манітолом та Lutrol F68® (Полоксамер 188) при +40 °C. Фігура 8: Стабільність композиції 3 відповідно до винаходу, з манітолом та Tween 180® при +40 °C. Фігура 9: Стабільність композиції 4 відповідно до винаходу, з манітолом та Tween 80® при +40 °C. Фігура 10: Вплив наповнювачів Полоксамеру 188 (Lutrol F68®, поставляється фірмою BASF Ludwigshafen, Німеччина) та манітолу на індукування CD8+ Т-клітин in vivo. Миші були умертвлені через 9 днів після імунізації; клітини селезінки були зібрані, зафарбовані тетрамером та проаналізовані за методом проточної цитометрії. Процент тетрамер-позитивних клітин від усіх CD8+ Т-клітин відображається з інтервалами помилок, що показують стандартне відхилення середнього значення. Усі три пептидно-імунізовані групи значно відрізняються від негативних контролів, що було доведено з використанням параметричного критерію Стьюдента (р 90 % уражених меланомою ділянок у людей. Хоча CSPG4 не є явно пухлиноспецифічним, пухлинореактивні CD4+ Т-клітини у пацієнтів, хворих на меланому, та у здорових людей розпізнають CSPG4693-709 на HLA-DRHекспресуючих клітинах меланоми за відсутністю аутоімунітету (Erfurt et al., 2007). Експресія CSPG4 також була описана в деяких нормальних тканинах, крім активованих періцитів, таких як ендотеліальні клітини, хондроцити, клітини гладких м'язів, окремі базальні кератіноцити в епідермісі, а також клітини у волосяній фолікулі (Campoli et al., 2004). Під час ангіогенезу та у відповідь на патології ЦНС, високорухливі клітини CSPG4 зазнають швидких морфологічних змін та направляються на ділянки, де відбувається ріст та відновлення судин. CSPG4 надмірно експресується як клітинами пухлин, так і періцитами на кровоносних судинах злоякісних пухлин мозку (Chekenya and Pilkington, 2002). При імплантації клітин з лінії СSРG4-позитивних клітин гліоми людини в мозок імунодефіцитних безтимусних пацюків, було показано, що ці пухлини мали більш високу мікросудинну щільність, в порівнянні з пухлинами контрольних тварин, тобто, передбачається, що CSPG4-експресія регулює функцію та структуру судинної системи пухлини хазяїна (Brekke et al., 2006). В експерименті з ксенотрансплантатом, коли матеріал біопсії GBM (мультиформної гліобластоми) пересаджувався безтимусним пацюкам, було визначено, що CSPG4 головним чином асоціюється з кровоносними судинами на періцитах і компонентах базальної мембрани судинної системи пухлини, та експресія також 10 UA 104572 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 асоціювалася з ділянками високої проліферації клітин (Chekenya et al., 2002а). Крім того, експресія CSPG4 відбувалася паралельно прогресуванню пухлини в моделі імплантації гліоми (Wiranowska et al., 2006). CSPG4 диференційовано експресується в гліомах людини, з більш високою експресією в високозлоякісних гліомах в порівнянні з низько-злоякісними (Chekenya et al., 1999). Висока експресія CSPG4 корелюється зі стійкістю до багатьох лікарських засобів, опосередкованою збільшеною активацією передачі сигналів α3β1-інтегріну / РІ3К та їхніх мішеней по низхідній, сприяючи виживанню клітин (Chekenya et al., 2008). FABP7: Білки, що зв'язують жирні кислоти (FABP) являють собою цитозольні білки з молекулярною масою 14-15 kDa, які, як передбачається, беруть участь у накопиченні, транспортуванні та спрямуванні жирних кислот (FA). Передбачається, що вони збільшують розчинність FA у цитоплазмі при транспортуванні FA між мембранними компартментами, та доставляють FA до їхніх мішеней у ядрі (Glatz et al., 2002). FABP можуть регулювати концентрацію FA і, таким чином, випливати на різні клітинні функції, такі як ензиматична активність, генна експресія, клітинний ріст та диференціація (Glatz and Storch, 2001). мРНК FABP7 експресується у тканинах нейроепітеліального походження, а також в злоякісних гліомних пухлинах (ступенем III і IV МОЗ). Ген був ідентифікований в хромосомному діапазоні 6q22-23, який також містить протоонкоген с-mус та часто зазнає втрату гетерозиготності в злоякісній гліомі. Аналіз ліній клітин злоякісної гліоми показав, що FABP7 часто ко-експресується з гліальним фібрилярним кислим білком (GFAP), що може свідчити про те, що клітина, з якої походить злоякісна гліома, може бути клітиною-прекурсором астроцитів, яка потенційно може експресувати обидва білки в нормі чи при формуванні пухлини (Godbout et al., 1998). Білок FABP7 демонструє нуклеарну та цитоплазматичну експресію в GBM, яка варіюється від помірної до значної. РАВР7-трансфековані клітини гліоми виявляють в 5 разів більшу міграцію, ніж контрольні клітини. Тобто, більш короткий загальний період виживання, асоційований з надмірною експресією FABP7, особливо в GBM, може бути обумовлений збільшеною міграцією та інвазією клітин пухлин в оточуючу мозкову паренхіму (Liang et al., 2005). Подальший аналіз розповсюдження FABP7 в пухлинах астроцитоми вказує на збільшені рівні FABP7 в інфільтруючих ділянках пухлин, що передбачає важливу роль FABP7 у стимулюванні інфільтрації злоякісних клітин в сусідні тканини мозку (Mita et al., 2007). FABP7 демонструє варіабельні рівні експресії та субклітинну локалізацію в гліальних тканинах та усіх ступенях астроцитоми. Однак, переважно, нуклеарна локалізація FABP7, вірогідно, асоціюється з інфільтративним фенотипом гліомних клітин та метаболічних шляхів типу EGFR, оскільки його нуклеарна транслокація визначається після активації EGFR та асоціюється з несприятливим прогнозом в EGFR-позитивних GBM. Більше того, ніяка нуклеарна імунореактивність FABP7 не може спостерігатися в астроцитомі І ступеню (Liang et al., 2006; Kaloshi et al., 2007). Х-зв'язаний нейролігін 4 є членом сімейства білків клітинної адгезії, який, як виявляється, відіграє певну роль у визріванні та функціонуванні неврональних синапсів. Члени сімейства нейролігінів мають схожу структурну організацію, з N-термінальним сигнальним пептидом, естеразо-подібним доменом з двома ділянками альтернативного сплайсингу, невеликою лінкерною ділянкою послідовностей з низькою ідентичністю перед трансмембранним доменом і короткою цитозольною частиною з високо консервативним С-кінцем. Найвищі відносні рівні мРНК нейролігіну 4 були виявлені у серці. Більш низька експресія була встановлена в печінці, скелетних м'язах та підшлунковій залозі, в той час як у мозку, плаценті, легенях та нирках мРНК Нейролігіну 4 було важко визначити (Bolliger et al., 2001). Мутації в Х-зв'язаному гені NLGN4 - потенційна причина порушень при різних видах аутизму, та є інформація щодо мутацій у декількох пацієнтів з аутизмом, синдромом Аспергера та затримкою психічного розвитку (Jamain et al., 2003; Laumonnier et al., 2004; Lawson-Yuen et al., 2008). Описано лише кілька випадків зв'язку NLGN4X з раком: Надмірна експресія NLGN4X була виявлена в стромальних пухлинах шлунково-кишкового тракту у дітей та молодих дорослих людей, в порівнянні з дорослими старшого віку (Prakash et al., 2005). Тенасцин С: Позаклітинний матрикс, що оточує клітини пухлин, відрізняється від позаклітинного матриксу в нормальних тканинах. Тенасцин-С (TNC) є білком позаклітинного матриксу, експресія якого підвищується в процесах, тісно зв'язаних з високою міграційною активністю, таких як розвиток ембріону (Bartsch et al., 1992), загоєння ран (Mackie et al., 1988) та неопластичні процеси (Chiquet-Ehrismann, 1993; Chiquet-Ehrismann and Chiquet, 2003). Крім того, TNC надмірно експресується в судинах тканин, які мають високий проліферативний індекс, і це вказує на участь TNC в ангіогенезі новоутворень (Kirn et al., 2000). В нормальному мозку людини експресія TNC визначається дуже рідко, в той час як злоякісних гліомах він 11 UA 104572 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 експресується у великій кількості (Bourdon et al., 1983). TNC-експресія може бути індукована гіпоксією (Lal et al., 2001), або TGF-бетаІ, що забезпечує механізм інвазії високозлоякісних гліом в здорову паренхіму (Hau et al., 2006), чи гастрином, який значною мірою модулює міграцію клітин GBM людини (Kucharczak et al., 2001). Експресія TNC знижує тропоміозин-1 і таким чином дестабілізує актинові стресові волокна. Він додатково знижує експресію Wnt інгібітору Dickkopfl. Оскільки знижена експресія тропоміозину-1 та збільшена передача сигналів Wnt тісно зв'язані з трансформацією та пухлиногенезом, TNC специфічно модулює ці шляхи передачі сигналів для посилення проліферації клітин гліоми (Ruiz et al., 2004). Периваскулярне прокрашування TNC навколо кровоносних судин, які забезпечують пухлину, спостерігається в тканинах GBM, але рідше зустрічається в гліомах ступеню II і III за класифікацією МОЗ, і це означає, що інтенсивність TNC-прокрашування залежить від ступеню злоякісності пухлини; найсильніше прокрашування вказує на несприятливий прогноз (HeroldMende et al., 2002). TNC також сприяє генерації ніші стволових клітин в субвентрикулярній зоні (SVZ), організуючи передачу сигналів фактору росту для прискорення розвитку нервових стволових клітин. Домінуючим ефектом TNC на клітини в SVZ є регуляція прогресування розвитку (Garcion et al., 2004). TNC - найсильніший індуктор спрямованої міграції нервових стволових клітин (NSC) у людини. Отже, пухлиногенерований ЕСМ (позаклітинний матрикс) створює сприятливе оточення для тропізму NSC в розсіяні пухлинні клітини (Ziu et al., 2006). NRCAM (Нейрональна молекула клітинної адгезії) - це нейрональна трансмембранна молекула клітинної адгезії з множинними імуноглобуліноподібними доменами С2-типу та фібронектиновими доменами типу III. Вона бере участь в управлінні, рості та фасцикуляції нервових клітин (Grumet et al., 1991; Morales et al., 1993; Stoeckli and Landmesser, 1995; Perrin et al., 2001; Sakurai et al., 2001), формуючи гомофільні, а також гетерофільні взаємодії з іншими молекулами IgCAM (Volkmer et al., 1996; Sakurai et al., 1997; Zacharias et al., 1999). Анкирінзв'язуючий NRCAM (Davis and Bennett, 1994) підвищено експресується на ендотеліальних тканинах, які формують трубку, що вказує на його можливу роль у формуванні трубки та ангіогенезі (Aitkenhead et al., 2002). NRCAM є геном-мішенню комплексу В-катеніну та плакоглобуліну-LEF/TCF (фактору стимуляції лімфоїдних клітин / Т-клітинного фактору), який сприяє онкогенезу (Conacci-Sorrell et al., 2002). Ектодомен NRCAM може бути відділений від поверхні клітини металопротеазоподібною активністю. Такий відділений домен здатний активувати різні шляхи передачі сигналів, посилює рухомість клітин та сприяє пухлиногенезу у мишей (Conacci-Sorrell et al., 2005). NRCAM підвищено регулюється в анапластичних астроцитомах і тканинах пухлин GBM, в порівнянні з нормальним мозком, та підвищені рівні корелюються з інвазивними властивостями (Sehgal et al., 1998). Антисенсна РНК проти NRCAM зменшує пухлиногенну здатність клітин GBM у людини (Sehgal et al., 1999). IGF2BP3 є членом сімейства білків, що зв'язують мРНК інсуліноподібного фактору зросту-ll, який залучений до локалізації, оновлення і трансляційного контролю мРНК. Білок містить кілька KН (K-гомологічних)-доменів, які є важливими в РНК-зв'язуванні, і відомо про те, що вони беруть участь у синтезі та метаболізмі РНК. Експресія відбувається, переважно, під час розвитку ембріону та була описана для деяких пухлин. Отже, IGF2BP3 вважається онкофетальним білком (Liao et al., 2005). Наявність високо транскрибованих рівнів IGF2BP3 у багатьох ракових тканинах, в порівнянні з контрольними, вказує на те, що білок IGF2BP3 може відігравати функціональну роль в проліферації трансформованих клітин. Ця гіпотеза підкріплюється висновком, що єдина не злоякісна тканина людини, яка експресує транскрипт IGF2BP3, - це плацента, тканина, що характеризується ростом і проліферацією клітин (Mueller-Pillasch et al., 1997). Наприклад, IGF2BP3 експресується в зразку світлоклітинної RCC, та його експресія асоціюється із запущеною стадією та ступенем первинних пухлин. Крім того, позитивна експресія IGF2BP3 асоціюється з підвищеним в 5-10 разів ризиком віддалених метастаз і на 42 %-50 % вищим ризиком смерті від RCC (Hoffmann et al., 2008; Jiang et al., 2006; Jiang et al., 2008). IGF2BP3 також в значній мірі експресується в карциномах підшлункової залози. В 2 дослідженнях, більше 90 % зразків тканин пухлин підшлункової залози продемонстрували експресію IGF2BP3 після імунного викрашування, в той час як тканини підшлункової залози без новоутворень були негативні на IGF2BP3. Крім того, експресія поступово збільшувалася разом із ступенем пухлини (Yantiss et al., 2005; Yantiss et al., 2008). Значне підвищення експресії IGF2BP3 також було виявлене у високозлоякісних уротеліальних пухлинах, але він зазвичай не експресується в доброякісному уротелії або 12 UA 104572 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 низько-злоякісних уротеліальних пухлинах. Більше того, у пацієнтів з IGF2BP3-позитивними пухлинами набагато нижча виживаність без прогресування та безрецидивна виживаність, ніж у пацієнтів з IGF2BP3-негативними пухлинами (Li et al., 2008; Sitnikova et al., 2008; Zheng et al., 2008). Бревікан (BCAN) - це мозкоспецифічний член сімейства лектиканів хондроїтин-сульфатпротеогліканів. Доповідається про дві ізоформи BCAN: це повна ізоформа, яка виділяється в позаклітинний матрикс, та коротша ізоформа з послідовністю, яка прогнозує домен глікофосфатиділінозітолу (GPI). Виділена ізоформа в значній мірі експресується з народження до 8-річного віку та на момент досягнення віку в 20 років зменшується до низьких рівнів, які утримуються в нормальній корі головного мозку дорослої людини. Ізоформа GPI експресується на рівномірно низьких рівнях протягом розвитку (Gary et al., 2000). BCAN належить до сімейства протеогліканів, зазвичай описуваних як бар'єрні молекули, які перешкоджають клітинній та нейритній рухомості в нервовій системі дорослих людей (Viapiano and Matthews, 2006). In vivo, BCAN експресується навколо границь рострального міграційного потоку (Jaworski and Fager, 2000) та є основним підвищено експресованим компонентом гліального рубця після травми нервової системи (Jaworski et al., 1999). BCAN демонструє різко підвищену регуляцію в гліомах, де може бути виявлена експресія, збільшена приблизно в сім разів в порівнянні з нормальними рівнями. мРНК BCAN не була виявлена у зразках кори головного мозку дорослих людей, які померли без неврологічних ускладнень. Різко протилежним є той факт, що мРНК BCAN була визначена в кожному з 27 хірургічних зразків гліоми людини, і це означає, що BCAN міг би бути унікальним і селективним маркером гліоми (Jaworski et al., 1996). Рецептороподібна протеїн тирозин-фосфатаза, Zetal (PTPRZ1, РТР-ξ) - PTPRZ1 є членом сімейства рецептороподібних протеїн тирозин-фосфатаз та кодує однопрохідний мембранний білок типу І з двома цитоплазматичними тирозин-протеїн-фосфатазними доменами, доменом альфа-карбонової ангідрази та фібронектиновим доменом типу III. Експресія цього гену індукується в клітинах раку ЖКТ (Wu et al., 2006), раку молочної залози (Perez-Pinera et al., 2007), в ремієльованих олігодендроцитах ушкоджень внаслідок множинного склерозу (Harroch et al., 2002) та в клітинах нирки ембріону людини в умовах гіпоксії (Wang et al., 2005). І білок, і транскрипт надмірно експресуються в клітинах гліобластоми, сприяючи їхній гаптотактичній міграції (Lu et al., 2005), та геномній ампліфікації ДНК в гліобластомі (Mulholland et al., 2006). Хітіназа 3-подібна 2 (CHI3L2) - CHI3L2 була спочатку ідентифікована з хондроцитів та підвищено експресована, наприклад, при остеоартріті (Steck et al., 2002). Хоча білок ще недостатньо добре характеризований, він найбільш вірогідно виділяється у позаклітинний простір. Він часто описувався як цільовий антиген в ревматоїдному артриті. Експериментальна антиангіогенезна індукція трансфекцією siPHK (VEGF-A) клітинної лінії гліоми людини викликала підвищену регуляцію CHI3L2. Сурвівін (BIRC5) - Експресія BIRC5 (сурвівіну), члена сімейства білків-інгібіторів апоптозу (ІАР), підвищена в фетальних тканинах та в різних видах ракових захворювань людини. Передбачається, що сурвівін здатний регулювати клітинну проліферацію та смерть апоптотичних клітин. Дуже високі рівні експресії сурвівіну визначаються, зокрема, в гліобластомі (Angileri et al., 2008). Існує думка, що надмірна експресія сурвівіну в гліомах мозку може грати важливу роль в злоякісній проліферації, антиапоптозі та ангіогенезі (Zhen et al., 2005; Liu et al., 2006). Зокрема, для гліобластоми, але також і для інших пухлинних об'єктів, експресія сурвівіну була в значній мірі асоційована зі ступенем злоякісності (з найбільшою експресією сурвівіну в гліобластомі) та більш короткою загальною виживаністю в порівнянні з пацієнтами з сурвівіннегативними пухлинами (Kajiwara et al., 2003; Saito et al., 2007; Uematsu et al., 2005; Mellai et al., 2008; Granda et al., 2006; Xie et al., 2006; Sasaki et al., 2002; Chakravarti et al., 2002). Білки сімейства матричної металопротеїнази (ММР) беруть участь у руйнуванні позаклітинної матриці в нормальних фізіологічних процесах, таких як розвиток ембріону, репродукція, ремоделювання тканин, а також у патологічних процесах, таких як артрит та метастазування (Mott 2004). Матрична металопротеїназа 7 (ММР 7) виділяється як пасивний пропротеїн 29.6 kDa, що активується при розщепленні позаклітинними протеїназами. Активний фермент має молекулярну масу 19.1 kDa та зв'язує два іони цинку та два іони кальцію на підгрупу (Miyazaki 1990; Browner 1995). ММР7 розпадається на желатини, фібронектин та казеїн (Miyazaki 1990; Quantin 1989) і відрізняється від більшості членів сімейства ММР тим, що не містить консервативного С-термінального білкового домену (Gaire 1994). ММР7 часто виявляється надмірно експресованою в злоякісній тканині (Lin 2004; Bramhall 1997; Denys 2004) та існує думка, що вона сприяє інвазії пухлинних клітин in vivo (Wang 2005). 13 UA 104572 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ці білки можуть бути мішенню пухлиноспецифічної імунної реакції при багатьох видах ракових захворювань. Пептид HBV-001 внутрішнього антигену вірусу Гепатиту В не має походження з ендогенного пухлиноасоційованого антигену людини, а одержується з внутрішнього антигену вірусуГепатиту В. По-перше, він дозволяє кількісно порівняти величину Т-клітинних реакцій, індукованих пухлиноасоційованими пептидами (TUMAP), які використовуються в фармацевтичних композиціях цього винаходу, і, таким чином, зробити важливі висновки щодо їхньої здатності викликати протипухлинні реакції. По-друге, він функціонує як важливий позитивний контроль у випадку відсутності будь-яких Т-клітинних реакцій у пацієнта. По-третє, він також дозволяє визначити статус імунокомпетентності пацієнта. Інфекція, викликана вірусом Гепатиту В (HBV), є одною з основних причин захворювання печінки, від якого страждають приблизно 350 мільйонів людей в усьому світі (Rehermann 2005). Внаслідок легкості передачі горизонтальним та вертикальним шляхом та потенціалу переходу у хронічну форму, що може призвести до цирозу печінки та гепатоклітинної карциноми, HBV завдає серйозного впливу системі охорони здоров'я в багатьох країнах світу. Геном HBV (Previsani 2002) складається з частково двониткової кільцевої ДНК. У віріонах HBV, він компонується разом із коровим білком НВс та іншими білками для формування нуклеокапсиду, що знаходиться в зовнішній оболонці, яка містить ліпіди та HBs сімейства поверхневих білків (також називається "оболонковий білок"). Антигенні детермінанти, що асоціюються з НВс та HBs, відомі як HBcAg та HBsAg, відповідно. Ці антигени зв'язані з серологічними реакціями, тобто, реакціями антитіл, що визначаються у крові пацієнтів та є одними з найбільш клінічне прийнятних систем антигенів-антитіл для діагностування HBV-інфекції. НВс буде представляти новий чужорідний антиген для усіх осіб, які не мають попередньої історії HBV-інфекції. Оскільки імуногенні пептиди добре відомі для цього антигену (Bertoletti 1993; Livingston 1997), один пептид з десяти амінокислот з HBcAg був обраний як позитивний контроль антигену в ІМА. Індукування НВс-пептидоспецифічних ЦТЛ буде згодом використовуватись як маркер імунокомпетентності пацієнта та успішної вакцинації. Фармацевтичні композиції цього винаходу можуть використовуватись для парентерального введення, наприклад, підшкірного, інтрадермального, внутрішньочеревного, внутрішньовенного, внутрішньом'язового чи перорального введення. Для цього, пептиди розчиняються або суспендуються у фармацевтично прийнятному, переважно, водному, носії. Крім того, композиція також може містити наповнювачі, такі як антиоксиданти, консерванти, буферні елементи, зв'язувальні речовини, очисники, розчинники та ароматизатори. Пептиди також можуть вводитись разом із імуностимулюючими речовинами, наприклад, цитокінами. Вичерпний перелік наповнювачів, які можуть бути використані у такій композиції, можна знайти, наприклад, в книзі A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press. Композиції винаходу можуть використовуватись для попередження, профілактики та/або лікування аденоматозних чи ракових захворювань. Фармацевтичні композиції цього винаходу можуть вводитись пацієнту, який страждає на аденоматозне чи ракове захворювання, асоційоване з відповідним пептидом чи антигеном послідовності SEQ ID NO: 1-10, або пацієнту, який страждає на рак мозку, зокрема, гліому, особливо, гліобластомне ракове захворювання, асоційоване з відповідним пептидом чи антигеном послідовності від SEQ ID NO: 11 до 22 або від 11 до 23. Пептиди у фармацевтичній композиції здатні ініціювати у пацієнта імунну реакцію, посередником в якій виступають Тклітини. Як зазначалось вище, у випадку гіпернефроми фармацевтична композиція, відповідно до цього винаходу, переважно, містить пептид, який складається з амінокислотної послідовності, визначеної в SEQ ID NO:1 та/або SEQ ID NO:2, і, крім того, містить щонайменше один додатковий пухлиноасоційований пептид, який складається з амінокислотної послідовності, визначеної в послідовностях від SEQ ID NO: 3 до SEQ ID NO: 10. У випадку раку мозку, зокрема, гліоми, особливо, гліобластомного раку, фармацевтична композиція, переважно, містить послідовність, зазначену в SEQ ID NO: 12 та/або SEQ ID NO: 13, і крім того містить щонайменше один додатковий пухлиноасоційований пептид, який складається з амінокислотної послідовності, визначеної в SEQ ID NO: 11, від 14 до 22 та/або 23. Переважно, пептиди, присутні у фармацевтичних композиціях цього винаходу, мають загальну довжину від 9 до 100, переважно, від 9 до 30, і, найбільш переважно, від 9 до 16 амінокислот. Крім того, щонайменше один пептид відповідно до будь-якої послідовності від SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO: 23 може включати непептидні зв'язки. Переважна фармацевтична композиція винаходу (переважно, для вакцини для лікування гіпернефроми) містить пептид, який складається з амінокислотної послідовності, визначеної в SEQ ID NO: 1 та/або SEQ ID NO: 2, та в інших втіленнях, крім того, містить щонайменше один 14 UA 104572 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 пептид, який складається з амінокислотної послідовності, визначеної в послідовності від SEQ ID NO: 3 до SEQ ID NO: 11. Ще одна переважна фармацевтична композиція винаходу (вакцина для лікування раку мозку, зокрема, гліоми, особливо, гліобластомного раку) містить пептид, який складається з амінокислотної послідовності, визначеної в SEQ ID NO: 12 та/або SEQ ID NO: 13, та в інших втіленнях, крім того, містить щонайменше один пептид, який складається з амінокислотної послідовності, визначеної в послідовності від SEQ ID NO: 11 до SEQ ID NO: 22 та/або 23. Пептид також може бути міченим, чи може бути гібридним білком або гібридною молекулою. + Пептиди, послідовність яких надається в цьому винаході, як очікується, стимулюватимуть CD8 цитотоксичні Т-лімфоцити (CTL). Однак, стимуляція є більш ефективною в присутності допомоги + CD4 Т-клітин. Отже, гібридний партнер або частини гібридної молекули належним чином + + утворюють епітопи, які стимулюють CD4 Т-клітини. CD4 стимулюючі епітопи добре відомі в цій галузі та включають епітопи, ідентифіковані в анатоксині правця. В іншому переважному втіленні пептид є гібридним білком, зокрема, вміщуючим N-термінальні амінокислоти HLA-DRантиген-асоційованого інваріантного ланцюга (Іі). В одному з втілень пептид винаходу є укороченим білком людини чи гібридним білком, або фрагментом білка та іншої поліпептидної частини, за умови, що частина, яка включає білок людини, містить одну чи декілька амінокислотних послідовностей винаходу. Пептиди, прийнятні у фармацевтичній композиції, можуть бути, по суті, чистими, або поєднаними з імуностимулюючим ад'ювантом, чи використовуватись в комбінації з імуностимулюючими цитокінами, чи можуть вводитись з належною системою доставки, наприклад, ліпосомами, мікро-, наночастинками, міцелами, емульсіями, гелями. Вакцинація пептидами, як правило, потребує використання ад'ювантів, і як такої переважною є GM-CSF (GM-CSF людини є у продажу під комерційною назвою Sargramostim®, Leukine®, та його можна придбати у фірмі Berlex, тепер Bayer HealthCare Pharmaceuticals). Інші прийнятні ад'юванти включають стимулон Aquila's QS21 (Aquila Biotech, Ворчестер, Масачусетс, США), який виділяється з сапоніну, мікобактеріальні екстракти та синтетичні імітатори стінок бактеріальних клітин, а також патентовані ад'юванти, наприклад, Ribi's Detox. Також може використовуватись Quil А, інший ад'ювант, одержуваний з сапоніну (Superfos, Данія). Можуть використовуватись і інші ад'юванти, такі як ад'ювант Фрейнда. Також може бути прийнятним надання пептиду в поєднанні з гемоцианіном лімфи равлика (KLH) чи мананом (див. патент WO 95/18145 та роботу Longenecker et al (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690,276-291). Оскільки ад'ювант визначається як речовина, яка посилює імунну реакцію на антиген (MedlinePlus® Medical Dictionary, NIH), можуть використовуватись інші речовини з цією метою, включаючи, без обмежень, агоністів tollподібних рецепторів (TLR-агоністи), переважно, речовини, які агоністично взаємодіють з TLR 3, 7, 8 та 9, такі як протамін-стабілізуюча РНК, CpG-олігонуклеотиди, CpR-олігонуклеотиди, бактеріальна ДНК, імідазокіноліни та ін. Інші речовини, відомі в цій галузі, які є прийнятними для посилення імунної реакції, включають, без обмежень, інгібітори індуцибельної синтази окису азоту (iNOS), аргінази (ARG1), індолеамін-2,3-діоксігенази (IDO), рецептору 1 фактору судинного ендотеліального росту (VEGFR-1), фактору судинного ендотеліального росту (VEGF), циклооксігенази-2 (СОХ-2), TGFбета рецептору І (TGF-beta-RI). Такі інгібітори можуть бути, наприклад, моноклональними антитілами проти молекул чи малих молекул. Малі молекули та моноклональні антитіла, відомі в даній галузі як такі, що мають інгібіторну функцію відносно факторів, згаданих вище, і, таким чином, ефект посилення імунної реакції, - це, наприклад, 1-МТ, NCX-4016, рофекоксіб (rofecoxib), селебрекс (celebrex), ВЕС, ABH, nor-NOHA, SB-505124, SD-208, LY580276, AMD3100, аксітініб (axitinib), бевасізумаб (bevacizumab), JSI-124, CPA-7, XL-999, ZD2171, пазопаніб (pazopanib), CP-547632 та VEGF Trap. Крім того, речовини, які зменшують кількість регуляторних Т-клітин (CD4+, CD25+, FoxP3+), є прийнятними як ад'юванти. Вони включають, наприклад, циклофосфамід (Cytoxan), ONTAK (денілейкін діфтітокс), Sunitinib, анти-СТLА-4 (MDX-010, СР-675206), анти-СВ25, анти-ССL22 та анти-GITR, але не обмежуються ними. Переважні кількості пептидів у фармацевтичних композиціях цього винаходу можуть варіюватися від приблизно 0.1 до 100 мг, переважно, від приблизно 0.1 до 1 мг та, найбільш переважно, від приблизно 300 мкг до 800 мкг на 500 мкл розчину. Термін "приблизно" означає +/- 10 процентів від даного значення, якщо не зазначено інше. Спеціаліст у цій галузі здатний скорегувати фактичну кількість пептиду, який використовується, на основі кількох факторів, наприклад, імунного статусу індивідуального пацієнта та/або кількості TUMAP, що є присутньою в конкретному виді раку. 15 UA 104572 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фармацевтичні композиції цього винаходу пропонують композицію з надзвичайно посиленою розчинністю та зволоженням ліофілізату в порівнянні з композиціями, відомими раніше. Це було досягнуто завдяки використанню спеціальної композиції наповнювачів. Таким чином, були розроблені фармацевтичні композиції цього винаходу, які вміщують пептиди в послідовностях від SEQ ID NO: 1 до 10 або від SEQ ID NO: 1 до 11 та їхні варіанти, які демонструють відмінну стабільність при зберіганні при (-20 °C, +5 °C, +25 °C) та можуть бути легко ресолюбілізовані. Термін "стабільність при зберіганні" означає, що процент побічних продуктів не перевищує 5 % за два роки. Крім того, термін "стабільність" означає, що специфічні властивості, такі як розчинність, оптична прозорість розчину та кількість частинок у розчині відчутно не змінюються протягом цього періоду часу. Термін "легко ресолюбілізований" означатиме, що ліофілізат може повністю розчинятися завдяки використанню буферного розчину або інших наповнювачів від кількох секунд до двох хвилин без застосування ультразвукового гомогенізатору. Крім того, композиція може легко вводитись пацієнту, який потребує лікування, шляхом i.d. (інтрадермального) та, менш переважно, s.c. (підшкірного) введення. Значення рН, одержаного в результаті розчинення, має бути від рН 2.7 до рН 9. В іншому втіленні, фармацевтична композиція цього винаходу може включати цукри, цукрові спирти, амінокислоти, такі як гліцин, аргінін, глютамінова кислота та інші, як формувачі рамки. Цукри можуть бути моно-, ді- або трисахаридами. Дані цукри можуть використовуватись самостійно, а також в комбінації з цукровими спиртами. Приклади цукрів включають глюкозу, манозу, галактозу, фруктозу чи сорбозу як моносахариди, сахарозу, цукрозу, лактозу, мальтозу чи трегалозу як дисахариди, та рафінозу як трисахарид. Цукровий спирт може бути, наприклад, манітозою. Переважні інгредієнти - це сахароза, цукроза, лактоза, мальтоза, трегалоза, маніт та/або сорбіт і, більш переважно манітол. Крім того, фармацевтичні композиції цього винаходу можуть включати фізіологічні наповнювачі, що добре переносяться (див. Довідник по фармацевтичним наповнювачам Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5-те видання, під редакцієк Raymond Rowe, Paul Sheskey and Sian Owen, Pharmaceutical Press (2006)), наприклад антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота чи глутатіон, консерванти, такі як фенол, m-крезол, метил- чи пропілпарабен, хлорбутанол, тіомерсал або бензалконіумхлорид. стабілізатор, формувач рамки, такий як сахароза, цукроза, лактоза, мальтоза, трегалоза, манітоза, маніт та/або сорбіт, маніт та/або лактоза та солюбілізатор, такий як поліетиленгліколі (PEG), тобто, PEG 3000, 3350, 4000 або 6000, чи циклодекстрини, тобто, гідроксипропіл-β-циклодекстрин, сульфобутилетил-βциклодекстрин або γ-циклодекстрин, чи декстрани або полоксаомери, такі як полоксаомер 407® (poloxaomer 407®), полоксамер 188, або Tween 20®, Tween 80®. В переважному втіленні фармацевтичні композиції цього винаходу включають один або кілька добре переношуваних наповнювачів, вибраних з групи, яка складається з антиоксидантів, формувачів рамки та стабілізаторів. Цей винахід стосується висновку, що композиції, які включають щонайменше два комплекти пептидів, відповідно до послідовностей від SEQ ID NO: 1 до 10 або SEQ ID NO: 1 до 11, манітол та полоксамер 188 у певних відношеннях, призводять до композицій, які демонструють набагато посилену стабільність і можуть розчиняться без використання ультразвукової обробки. Крім того, сольватація вимагає лише кількох секунд. Як характерна ознака ліофілізату, візуально повинен спостерігатися розчин від прозорого до опалового, після відновлення 4.2 % розчином бікарбонату натрію. Ці характеристики ресолюбілізації фармацевтичних композицій даного винаходу відтворюються навіть після зберігання лікарського препарату при температурі -20 °C, +5 °C та +25 °C протягом 2 років. Крім того, цей винахід стосується композицій, які включають щонайменше чотири комплекти пептидів, згідно із послідовностями від SEQ ID NO: 11 до SEQ ID NO: 22, від SEQ ID NO: 11 до SEQ ID NO: 23, від SEQ ID NO: 12 до SEQ ID NO: 22 або від SEQ ID NO: 12 до SEQ ID NO: 23, де манітол та полоксамер 188 у певному відношенні призводять до композицій, які можуть легко розчинятися. Як характерна ознака ліофілізату, візуально повинен спостерігатися розчин від прозорого до опалового, після відновлення 4.2 % розчином бікарбонату натрію. Окремі пептиди в описаній композиції є стабільними протягом щонайменше 3 місяців після зберігання при 20 °C, +5 °C та +25°. У переважному втіленні, фармацевтичні композиції цього винаходу вміщують конкретне співвідношення пептидів:манітолу:Тwееn 80® (по вазі), у діапазоні від 1:2:1.5 до 1:8:2.2 включно. Див. в таблиці нижче інші переважні відношення, які включені в цей винахід. Особливо переважним є відношення 1:5:2. Інше особливо переважне відношення - це 1:8:2. 16 UA 104572 C2 5 В іншому переважному втіленні, фармацевтичні композиції цього винаходу вміщують певне співвідношення пептидів:манітолу:полоксамеру 188 (по вазі), у діапазоні від 1:5:1.5 до 1:8:2.2 включно. Див. в таблиці нижче інші переважні відношення, які включені в цей винахід. Переважним відношенням є 1:5:1. Ще одне особливо переважне співвідношення пептидів:манітолу:полоксамеру 188 по вазі становить 1:8:2. Більш переважна композиція включає суміш пептидів:манітолу: полоксамеру 188® у відношенні 1:5:2 по вазі (див. приклад 2). Ще одне співвідношення включає пептиди:манітол:полоксамер 188 у відношенні від 1:0:2 до 1:2:2.2 по вазі. Інші втілення цього винаходу включають такі співвідношення по вазі: 10 Пептиди 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Манітол 5 5 5 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7 7 7 7 7,5 7,5 7,5 Полоксамер188 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2 2,1 2,2 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2 2,1 2,2 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2 2,1 2,2 1,5 1,6 1,7 1 7,5 1,8 1 1 1 1 7,5 7,5 7,5 7,5 1,9 2 2,1 2,2 Пептиди 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Переважно для препарату ІМА950 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17 Манітол 8 8 8 8 8 8 8 8 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 0 0 0 Полоксамер 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2 2,1 2,2 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2 2,1 2,2 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2 2,1 2,2 2 2,1 2,2 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4 UA 104572 C2 Пептиди 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 5 10 15 20 25 30 Манітол TweenSO® 2 1,5 2 1,6 2 1,7 2 1,8 2 1,9 2 2 2 2,1 2 2,2 3 1,5 3 1,6 3 1,7 3 1,8 3 1,9 3 2 3 2,1 3 2,2 4 1,5 4 1,6 4 1,7 4 1,8 4 1,9 4 2 4 2,1 4 2,2 Пептиди 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Манітол TweenSO® 5 1,5 5 1,6 5 1,7 5 1,8 5 1,9 5 2 5 2,1 5 2,2 6 1,5 6 1,6 6 1,7 6 1,8 6 1,9 6 2 6 2,1 6 2,2 7 1,5 7 1,6 7 1,7 7 1,8 7 1,9 7 2 7 2,1 7 2,2 Пептиди 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Манітол 8 8 8 8 8 8 8 8 2,1 2,1 2,1 2,1 2,1 2,1 2,1 2,1 Фармацевтичні композиції цього винаходу можуть бути люфілізовані. Одержаний ліофілізат може бути перетворений в розчинний стан шляхом додання водного розчинника. Переважно, водний розчин буде можливо безпосередньо вводити пацієнту парентерально. Отже, ще одне втілення цього винаходу - це водна фармацевтична композиція розкритих вище композицій, яка одержується шляхом відновлення ліофілізату, описаного вище, водним розчинником. Прийнятний рН-діапазон становить рН 2-12 для внутрішньовенного та внутрішньом'язового введення, але щодо підшкірного введення діапазон зменшується до 2.7-9.0, оскільки швидкість розбавлення in vivo зменшується в результаті більшої вірогідності опромінення в місці ін'єкції. Strickley Robert G., Pharm. Res., 21, NO: 2, 201-230 (2004). Переважно, водна фармацевтична композиція винаходу має рН-значення від 7 до 9, і більш переважне рН-значення становить від 8 до 9, та ще більш переважне рН-значення - від 8.3 до 8.7. Фармацевтичні композиції цього винаходу є фізіологічно добре переношуваними, такими, що легко виробляються, точно дозуються, та демонструють відмінну стабільність при зберіганні відносно концентрації, продуктів розпаду та агрегатів під час зберігання. Препарати можуть стабільно зберігатись протягом 2 років у морозильній камері при -20 °C, у холодильнику при (+28 °С) та навіть при кімнатній температурі (+25 °C) та відносній вологості 60 %. Фармацевтичні композиції цього винаходу є, переважно, стерильними та формульованими для введення in vivo. Цей винахід також пропонує метод викликання імунної реакції у суб'єкта, причому зазначений метод включає введення суб'єкту, який потребує цього, фармацевтичної композиції цього винаходу, де зазначені пептиди, їхні варіанти чи солі вводяться в ефективній кількості, переважно, в кількості, що є ефективною для викликання цих імунних реакцій. Винахід, крім того, пропонує використання фармацевтичної композиції винаходу у медикаменті для введення суб'єкту, з метою викликання імунної реакції проти раку. Також включене використання фармацевтичної композиції цього винаходу для лікування раку, переважно, раку нирки, та використання у виготовленні медикаменту для введення суб'єкту для викликання імунної реакції проти раку і, таким чином, для лікування раку. Пептиди, використані у фармацевтичній композиції, є переважно чистими, або по суті чистими і бажано по суті гомогенними (тобто, без забруднюючих пептидів чи білків, та ін.). "По суті чистий" означає пептидний препарат з чистотою за аналізом HPLC щонайменше 90 %, та 18 UA 104572 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 переважно щонайменше 95 %. "По суті гомогенний" означає пептидний препарат, який містить щонайменше 99 % пептиду, на основі загальної ваги пептиду в препараті. Крім того, цей винахід включає комплект, в якому знаходиться: (a) контейнер, який містить фармацевтичну композицію, як описано вище, в розчині або в ліофілізованій формі; (b) додатково, другий контейнер, який містить розріджувач або відновлюючий розчин для ліофілізованої композиції; та (c) додатково, інструкції по (і) використанню розчину або (іі) відновленню та/або використанню ліофілізованої композиції. Комплект може, крім того, включати один чи кілька (і) буферів, (іі) розріджувачів, (ііі) фільтрів, (iv) голок, або (v) шприців. Контейнер, переважно, є пляшкою, пробіркою, шприцом чи тестовою пробіркою; та він може бути контейнером багаторазового використання. Фармацевтична композиція є, переважно, ліофілізованою. Комплекти цього винаходу, переважно, включають ліофілізовану композицію цього винаходу в належному контейнері та інструкції по її відновленню та/або використанню. Належні контейнери включають, наприклад, пляшки, пробірки (наприклад, пробірки з двох частин), шприці (такі як двокамерні шприці) і тестові пробірки. Контейнер може бути виготовлений з різних матеріалів, таких як скло чи пластмаса. Переважно, комплект та/або контейнер містить/ вміщують інструкції на контейнер або такі, що відносяться до нього, із вказівками щодо відновлення та/або використання. Наприклад, на ярлику може вказуватися, що ліофілізована композиція повинна бути відновлена до концентрацій пептидів, як зазначено вище. Ярлик, крім того, може зазначати, що композиція є прийнятною або призначена для підшкірного введення. Контейнер, вміщуючий композицію, може бути пробіркою багаторазового використання, яка дозволяє робити повторні введення (наприклад, від 2 до 6 введень) відновленої композиції. Комплект, крім того, може включати другий контейнер з прийнятним розріджувачем (наприклад, розчином бікарбонату натрію). Після змішування розріджувача та ліофілізованої композиції, остаточна концентрація пептиду у відновленій композиції становить, переважно, щонайменше 0.15 мг/мл/пептид (=75 мкг) та переважно не більше 3 мг/мг/пептид (=1500 мкг). Комплект, крім того, може включати інші матеріали, бажані з комерційної точки зору та із врахуванням використання, включаючи інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки, шприці та вкладиші з інструкціями по використанню. Комплекти цього винаходу можуть включати один контейнер, який містить композицію фармацевтичних композицій, відповідно до цього винаходу, з іншими компонентами чи без них (наприклад, інші сполуки або фармацевтичні композиції інших сполук) чи включати окремий контейнер для кожного компоненту. Переважно, комплекти винаходу включають композицію винаходу, упаковану для використання, в комбінації з одночасним введенням другої сполуки, такої, як ад'юванти (наприклад, хіміотерапевтична речовина, природний продукт, гормон чи антагоніст, антиангіогенезний агент чи інгібітор, апоптоз-індукуючий агент або хелатор) чи їхню фармацевтичну композицію. Компоненти комплекту можуть бути завчасно змішані, чи кожний компонент може бути в окремому контейнері, до введення пацієнту. Компоненти комплекту можуть бути надані в одному чи кількох рідких розчинах, переважно, водному розчині, більш переважно, стерильному водному розчині. Компоненти комплекту також можуть надаватись як речовини у твердому стані, які можуть перетворюватися на рідини шляхом додання прийнятних розчинників, які переважно вміщені в іншому окремому контейнері. Контейнер терапевтичного комплекту може являти собою пробірку, тестову пробірку, колбу, пляшку, шприц або будь-який інший засіб для зберігання твердого тіла чи рідини. Зазвичай, коли є більш ніж один компонент, комплект буде включати другу пробірку чи другий контейнер, який дозволяє окреме дозування. Комплект може також містити інший контейнер для фармацевтично прийнятної рідини. Переважно, терапевтичний комплект буде включати апарат (наприклад, одну чи кілька голок, шприців, крапельниць, піпетку та ін.), який робить можливим введення речовин винаходу, що становлять компоненти цього комплекту. Ця композиція є такою, що прийнятна для введення пептидів будь-яким прийнятним способом, наприклад, пероральним (ентеральним), носовим, очним, підшкірним, інтрадермальним, внутрішньом'язовим, внутрішньовенним або трансдермальним. Переважно, введення здійснюється s.c, та більш переважно, i.d. методом.Введення може виконуватись за допомогою інфузійного насосу. Процедура аналітичного дослідження: Ідентичність, чистота та вміст пептиду визначаються із використанням аналітичної RPHPLC-хроматографії. Довжина хвилі при визначенні становить 220 нм. 19 UA 104572 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Перевірка стабільності (Стабільність тестових композицій): а) вакцина для лікування гіпернефроми: Різні ліофілізати були перевірені відносно стабільності кожного конкретного пептиду при +25 °C та +40 °C, із використанням HPLC-аналізу. Випробування з навантаженням при +25 °C та +40 °C були виконані для визначення тенденцій щодо того, яка композиція більш стабільна при температурі навколишнього середовища та більш високих температурах. Пептиди, відповідно до SEQ ID NOs: 1-10, були ліофілізовані без наповнювачів та з доданням манітолу і Полоксамеру 188 (Lutrol F68®) або Tween 80®. Були виготовлені такі тестові композиції, і оцінена стабільність при +25 °C та +40 °C, із використанням HPLC-аналізу: Композиція 1: Пептиди без будь-яких наповнювачів; Композиція 2: Пептиди: манітол: Lutrol F68® (Полоксамер 188) (1:5:2 по вазі); Композиція 3: Пептиди: манітол: Tween 80® (1:5:2 по вазі); та Композиція 4: Пептиди: манітол: Tween 80® (1:5:1 по вазі). Вихідні вимірювання HPLC були виконані для кожної композиції до зберігання в кліматичній камері, метизацією метою, зміст двох пробірок був повністю розчинений в 30 % оцтовій кислоті і виміряний за допомогою RP-HPLC повторним визначенням. Для забезпечення порівняння між окремими вимірюваннями, використовувався В-нафтил-аланін як внутрішній стандарт, та ліофілізувався разом з пептидами. Через 7, 14, 21 та 28 днів ще дві пробірки були видалені з кліматичної камери для оцінки стабільності. Оцінка даних виконувалась шляхом повторного визначення однієї пробірки. Для одного моменту часу та температури, були використані дві окремі пробірки для одержання чотирьох результатів обробки загалом. Ці значення були взяті для розрахунку стандартного відхилення, показаного як величину помилки на відповідній діаграмі. В результаті експериментів, стабільність кожного окремого пептиду композиції з манітолом і Lutrol F68® є порівнянною з результатами, одержаними композицією без наповнювачів. Композиції, які вміщують Tween 80®, демонструють посилений розпад IMA-RGS-001 зокрема при +40 °C та збільшення сигналу, особливо для пептиду ІМА-ADF-001. Таке збільшення може бути обумовлене одночасною елюацією домішок, викликаною розпадом пептидів. b) Вакцина для лікування гліобластомного клітинного раку: Різні ліофілізати були випробувані відносно розчинності та стабільності формульованих пептидів у суміші. Пептиди, відповідно до послідовності SEQ ID NOs: 11-23, були ліофілізовані без наповнювачів та з доданням Манітолу/Полоксамеру 188 (Lutrol F68®) та Манітолу/Tween 80®. Були виготовлені наведені нижче тестові композиції, та перевірені їхні рівні розчинності в різних розчинах та стабільність при +25 °C та +40 °C. Композиція 1: Пептиди без будь-яких наповнювачів; Композиція 2: Пептиди: манітол: Lutrol F68® (Полоксамер 188) (1:5:2 по вазі); Композиція 3: Пептиди: манітол: Tween 80® (1:5:2 по вазі). Стабільність обох композицій була в рівній мірі добра. Розчинність була найкращою із використанням композиції 2, яка давала прозору та безкольорову суміш, в той час як в композиції три в деяких випадках спостерігався невеликий осад при більш високих концентраціях. Із використанням композиції 1, ніяке розчинення не було взагалі можливе. В результаті експериментів, стабільність кожного окремого пептиду композиції з манітолом/Lutrol F68® та манітолом/Tween 80® є порівнянною з результатами, одержаними композицією без будь-яких наповнювачів. Без наповнювача композиція не є розчинною в прийнятних розчинах, наприклад в гідрокарбонаті натрію (4.2 %). Розрахунок ефективності для препарату ІМА901: Був перевірений вплив наповнювачів Полоксамеру 188 та манітолу на ефективність прямування Т-клітин. Неактивними наповнювачами в композиції ІМА901 є Полоксамер 188 (Lutrol F68®) і манітол. Ці два наповнювача не були включені в композицію ІМА901 у випробуванні фази 1 та були включені у пробну композицію фази 2 для посилення розчинності та стабільності ІМА901 "в дії". В цьому дослідженні, вплив даних речовин га ефективність примування Т-клітин в моделі мишей був перевірений після пептидної імунізації з використанням пептиду моделі миші. Не спостерігалося ніяких токсичних ефектів Полоксамеру 188 (Lutrol F68®) та манітолу. Т-клітинне примування було проаналізовано тетрамерним викрашуванням та проточною цитометрією ex vivo через дев'ять днів після імунізації. Додання Полоксамеру ® (Lutrol Р68®)/манітолу до розчину імунізації не змінює ефективність примування + CD8 Т-клітин. Принцип тесту 20 UA 104572 C2 + 5 10 15 20 25 30 35 b Імунізація: Для примування простих CD8 Т-клітин, імуногенний Н2-К -зв'язуючий пептид Ovaa57-264 (SIINFEKL) в комбінації з ад'ювантом, зазвичай використовуваним для імунізації мишей (CpG-деоксіолігонуклеотид) в 4.2 % бікарбонатному буфері, був введений b інтрадермально самицям мишей віком 8-12 тижнів (штам C57BL/6, Н2 , 3 миші на групу). Розчини ін'єкцій з Полоксамером 188 (Lutrol F68® (16.5 мг/мл)) та манітолом (41.3 мг/мл) та без них порівнювалися. Концентрації наповнювачів ті ж самі, що планувалися для розчину ін'єкції ІМА901. Позитивні контролі були імунізовані підшкірним методом з використанням пептидного розчину, що вміщував CpG, емульсований в класичному Titermax® (Sigma-Aldrich). Тетрамерне викрашування: Через 9 днів, миші були умертвлені, та Ova 257-264-специфічні Тклітини селезінки були проаналізовані ex vivo тетрамерним викрашуванням та проточною цитометрією. Тетрамерна технологія дозволяє робити специфічне та високочутливе визначення Т-клітин, в яких є порівнянний Т-клітинний рецептор. Результати: Ніяких токсичних ефектів Полоксамеру 188 (Lutrol F68® BASF, Ludwigshafen, Німеччина)/манітолу не спостерігалося локально на місці ін'єкції або системно. Група позитивного контролю, CpG-rpyna та група CpG/Полоксамер 188/манітол демонстрували значно вищу частоту пептидоспецифічних Тклітин в порівнянні з негативними контролями (р