Фармацевтична композиція пухлиноасоційованих пептидів та її застосування для лікування ракових захворювань

Реферат: Винахід належить до імунотерапевтичних пептидів та їхнього використання в імунотерапії, зокрема, в імунотерапії раку. В винаході розкриваються епітопи пухлиноасоційованих пептидів Т-клітин-хелперів разом або в поєднанні з іншими пухлиноасоційованими пептидами, котрі служать активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, стимулюючих протипухлинні імунні реакції. UA 103202 C2 (12) UA 103202 C2 Фіг. 2: In vitro –зв’язування пептидів класу ІІ IMA950 з HLA-DR алелями 1000 HLA-DR1 HLA-DR2 HLA-DR3 HLA-DR4 HLA-DR5 HLA-DR6 HLA-DR7 900 800 600 500 400 300 200 100 = pass/fail control 100 positive control pass/fail control IMA-MET-004_6-20 IMA-MET-004_2-16 0 IMA-BIR-002 relative binding 700 UA 103202 C2 5 Цей винахід відноситься до імунотерапевтичних пептидів та їхнього використання в імунотерапії, зокрема, в імунотерапії раку. В цьому винаході розкриваються епітопи пухлиноасоційованих пептидів Т-клітин- хелперів, разом або в поєднанні з іншими пухлиноасоційованими пептидами, котрі служать активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, стимулюючих протипухлинні імунні реакції. Зокрема, композиція пептидів цього винаходу може використовуватись в композиціях вакцин для викликання протипухлинних імунних реакцій проти гліом. Для цілей даного винаходу, уся довідкова література, наведена в ньому, включена шляхом посилань в усій повноті. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Рівень техніки Гліоми - це пухлини головного мозку, які мають походження з гліальних клітин у нервовій системі. Гліальні клітини, які зазвичай називаються нейроглія чи просто глія, є не нервовими клітинами, котрі забезпечують підтримку та харчування клітин, утримують гомеостаз, утворюють мієлін та беруть участь в передачі сигналів в нервовій системі. Дві найбільш важливі підгрупи гліом - це астроцитоми та олігодендроцитоми, названі відповідно до типу нормальних гліальних клітин, з яких вони походять (астроцити або олігодендроцити, відповідно). Мультиформна гліобластома (далі іменується "гліобластома"), що належить до підгрупи астроцитом, є найбільш типовою злоякісною пухлиною мозку у дорослих людей, що становить приблизно 40 % усіх злоякісних пухлин мозку та близько 50 % гліом. Вона агресивно втручається у центральну нервову систему та відзначається найвищим рівнем злоякісності (клас IV) серед усіх гліом. Хоча є стабільний прогрес в лікуванні цього захворювання, завдяки досягненням в нейровізуалізації, мікрохірургії, різноманітним варіантам лікування і препаратам, таким як темозоломід та опромінювання, гліобластоми залишаються невиліковними. Смертність від цієї пухлини мозку дуже висока: середня тривалість життя дорівнює від 9 до 12 місяців після першого діагнозу. 5річна виживаність в період спостерігання з 1986 по 1990 рік становила 8.0 %. На даний час, п'ятирічна виживаність після інвазивного лікування, включаючи повне видалення пухлини, все ж таки менше 10 %. Відповідно, існує велика медична потреба в альтернативному і ефективному терапевтичному методі. Пухлинні клітини гліобластом є найбільш недиференційованими серед пухлин мозку, отже клітини пухлини мають великий потенціал міграції та проліферації і є високоінвазивними, що пояснює дуже несприятливий прогноз. Гліобластоми призводять до смерті внаслідок швидкого, агресивного та інфільтративного росту в мозку. Тип інфільтративного росту відповідає за нерезектабельний характер цих пухлин. Гліобластоми також відносно резистентні до опромінювання та хіміотерапії, і тому випадки рецидивів після курсу лікування є частими. Крім того, імунна реакція на неопластичні клітини є достатньо неефективною, з точки зору повного знищення усіх неопластичних клітин після хірургічного видалення та променевої терапії. Гліобластоми розділяються на первинні гліобластоми (de novo) та вторинні гліобластоми, в залежності від різниці в генному механізмі протягом злоякісної трансформації недиференційованих астроцитів або гліальних прекурсорних клітин. Вторинна гліобластома зустрічається у людей віком до 45 років. Протягом, в середньому, 4-5 років вторинна гліобластома розвивається з астроцитоми більш низької злоякісності в недиференційовану астроцитому. І навпаки, первинна гліобластома, переважно, зустрічається у старших людей, з середнім віком 55 років. В цілому, первинна гліобластома є швидкоплинною гліобластомою, яка характеризується прогресуванням пухлини протягом 3 місяців з того стану, коли не виявлено ніяких клінічних або патологічних аномалій. Гліобластома мігрує по мієлінованих нервах та широко розповсюджується в центральній нервовій системі. В більшості випадків хірургічне втручання має лише обмежений тривалий терапевтичний ефект. Клітини злоякісної гліоми уникають детекції імунною системою хазяїна, оскільки вони генерують імуно-супресивні речовини, що погіршують проліферацію T-клітин та виробництво імуно-стимулюючого цитокіну IL-2. Внутрішньочерепні неоплазми можуть виникати з будь-яких конструкцій чи типів клітин, присутніх в ЦНС, включаючи мозок, м'які мозкові оболонки, гіпофіз, череп і навіть залишкові ембріональні тканини. Загальна щорічна захворюваність на первинні пухлини мозку в Сполучених Штатах становить 14 випадків на 100 000 людей. Найбільш типовими первинними пухлинами мозку є менінгіоми, які представляють 27 % від усіх первинних пухлин мозку, та гліобластоми - 23 % від усіх первинних пухлин мозку (в той час як гліобластоми нараховують 40 % злоякісних пухлин мозку у дорослих). Більшість з цих пухлин мають агресивну дію та 1 UA 103202 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 високу злоякісність. Первинні пухлини мозку - найбільш розповсюджені солідні пухлини у дітей, і вони є второю найчастішою причиною смерті від раку у дітей, після лейкемії. Пошук ефективних методів лікування гліобластом у пацієнтів все ще триває. Ведуться дослідження в галузі імунотерапії, або лікування із залученням імунної системи, у боротьбі з цими неопластичними клітинами. Перші багатообіцяючі результати були отримані компанією Northwest Biotherapeutics в імунотерапевтичних дослідженнях у людей, хворих на гліобластому, при використанні препарату "DCVax Brain", за допомогою якого можуть індукуватися антигенспецифічні реакції CTL, що призводять до тривалої середньої виживаності в порівнянні з середньою виживаністю, одержаною при використанні стандартних методів лікування, при мінімальній токсичності. Колоректальна карцинома Згідно із даними Американського Товариства по Боротьбі з Раком, колоректальний рак (CRC) є третім з найбільш розповсюджених видів раку в США, на який захворюють більш ніж 175 000 нових пацієнтів кожного року. В США, Японії, Франції, Німеччині, Італії, Іспанії та Великобританії він уражає більш ніж 480 000 людей. Колоректальний рак є однією з найчастіших причин смертності від раку в розвинених країнах. Дослідження показують ймовірність виникнення колоректального раку як результату взаємодії між успадкованими факторами та впливом зовнішнього середовища. В більшості випадків, попередниками колоректальних пухлин вважаються аденоматозні поліпи; однак, переродження може тривати багато років. Основним фактором ризику колоректального раку є вік, оскільки 90 % випадків захворювання діагностуються у людей старше 50 років. Інші фактори ризику колоректального раку, за даними Американського Товариства по Боротьбі з Раком, включають вживання алкоголю, раціон харчування з великим вмістом жирів та/або червоного м'яса і недостатнім вживанням фруктів та овочів. Захворюваність продовжує зростати, зокрема, в таких регіонах, як Японія, де це може бути обумовлено переходом на західний стиль харчування, з надмірною кількістю жирів та м'яса в раціоні та зменшенням вживання харчових волокон. Однак, частота захворювань зростає не настільки швидко, як раніше, і це може бути обумовлено більш активним скринінгом та видаленням поліпів, що запобігає переродженню поліпів на рак. Як і у відношенні більшості солідних пухлин, терапією першого ряду є хірургічне втручання, однак, його переваги обмежуються ранніми стадіями захворювання, в той час як у значної частини пацієнтів діагностується запущена стадія. Стандартом лікування прогресуючого колоректального раку є режими хіміотерапії, які базуються на схемах з використанням фторурацила. Більшість таких режимів - це так звані схеми FOLFOX (інфузійне введення 5фторурацилу/лейковоріну плюс оксаліплатін) та FOLFIRI (ірінотекан, лейковорін, бюлюсне і тривале інфузійне введення 5-FU). Введення цитотоксичних препаратів третього покоління, таких як ірінотекан та оксаліплатін, збільшило надію на значне підвищення ефективності лікування, але прогноз все ще відносно несприятливий, і виживаність, в цілому, залишається на рівні приблизно 20 місяців при наявності метастаз, отже, незадоволені потреби стосовно лікування цієї хвороби поки що є високими. Останнім часом з'явилося нове покоління медикаментів, що діють цілеспрямовано на молекулярному рівні, таких як Avastin (бевакізумаб) та Erbitux (цетуксімаб), і близько 40 сполук знаходяться на завершальному етапі клінічної розробки для різних стадій колоректального раку. Комбінації декількох з цих сполук збільшують кількість потенційних варіантів терапії, які очікуються в майбутньому. Переважна більшість речовин є у фазі 2, причому на EGFR (рецептори епідермального фактора росту) ці сполуки діють частіше, ніж будь-які інші ліки, розроблені для колоректального раку, і це обумовлено фактом, що приблизно у 80 % хворих на колоректальний рак експресія EGFR підвищується. Зараз проводяться клінічні дослідження пацієнтів з II стадією захворювання, з поєднанням хіміотерапії та недавно ухвалених моноклональних антитіл (mAb) (цетуксімаб + ірінотекан або FOLFOX4; бевакізумаб як одиночний препарат або разом з FOLFOX4). Очікується, що період спостережень для одержання статистично значимих результатів цих досліджень становитиме від трьох до чотирьох років. Моноклональні антитіла (mAb), які на даний час використовуються в онкології, в цілому мають прекрасні шанси щодо їхнього використання без втручання в активну імунотерапію. Фактично, були одержані доклінічні дані, які свідчать про те, що зниження експресії VEGF (фактору росту ендотелія судин) (за допомогою бевакізумабу) позитивно впливає на активацію T-клітин, опосередковану DC (дендритними клітинами). Рак простати та інші пухлини 2 UA 103202 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Рак простати (рак передміхурової залози) є основною причиною смерті від раку у чоловіків: за наявними оцінками, в 2007 році було зареєстровано 27 050 смертельних випадків від цієї хвороби. Хоча з початку 1990-х років смертність серед білих чоловіків та афроамериканців знижувалася, показники смертності у афроамериканців залишаються більш ніж в два рази вищими, ніж у білих чоловіків. Рак простати - це найчастіше діагностований вид раку у чоловіків. За невиясненими до цього часу причинами, захворюваність у афроамериканців значно більша, ніж у білих. Показники захворюваності на рак простати значно змінилися за останні 20 років: із швидким збільшенням за період 1988-1992 років, різким спадом в 1992-1995 роках, та помірним ростом з 1995 року. Ці тенденції, значною мірою, відображають покращення скринінгу раку простати з аналізом крові для визначення рівня простато-специфічного антигену (PSA). Помірний зріст випадків захворювання за останнє десятиріччя, скоріше за все, пояснюється широко поширеним PSA-скринінгом серед чоловіків, молодших 65 років. Показники частоти захворювання на рак простати вирівнялися у чоловіків віком 65 років і більше. Захворюваність досягла піку у білих чоловіків в 1992 році (237.6 на 100 000 осіб) та афроамериканців у 1993 році (342.8 на 100 000 осіб). Лікування раку простати може включати пильне спостереження, хірургічне втручання, променеву терапію, терапію Високо-інтенсивним Фокусованим Ультразвуком (HIFU), хіміотерапію, кріохірургію, гормональну терапію або комбінацію деяких з цих методів. Вибір варіанту лікування залежить від стадії захворювання, індексу Глісона та рівня PSA. Іншими важливими факторами є вік чоловіка, загальний стан його здоров'я та відношення до потенційного лікування і можливих побічних ефектів. Оскільки будь-яке лікування може мати серйозні побічні ефекти, такі як еректильна дисфункція та недержання сечі, обговорення методу лікування часто зосереджується на досягненні балансу між задачами терапії та ризиками змін у стилі життя. Якщо рак поширюється за межі передміхурової залози, варіанти лікування значно змінюються, оскільки більшість лікарів, котрі займаються терапією раку передміхурової залози, використовують різні номограми для прогнозування ймовірності поширення. Лікування пильним спостереженням, HIFU, променевою терапією, кріохірургією та хірургічним втручанням взагалі пропонуються чоловікам, у яких рак залишається в межах передміхурової залози. Гормональна терапія та хіміотерапія часто призначаються у випадку захворювання, котре поширюється за межі передміхурової залози. Однак, є й винятки: променева терапія може використовуватись для деяких запущених пухлин, а гормональна терапія – для певних випадків пухлин на ранній стадії. Кріотерапія, гормональна терапія та хіміотерапія також можуть пропонуватись, якщо первісний варіант лікування не дає результату, і рак прогресує. У значної кількості пацієнтів, хворих на рак простати, які перенесли радикальну простатектомію внаслідок клінічно очікуваного росту, обмеженого ураженим органом, заключний гістологічний аналіз хірургічної проби показує локальне екстенсивне поширення пухлини за межі органу. У цих пацієнтів відзначається високий ризик ранніх місцевих рецидивів, що, як правило, можуть бути виявлені як підвищений рівень PSA, тобто, біохімічний рецидив. Можливі методи лікування в цьому випадку включають дистанційну променеву терапію та гормон-пригнічувальну терапію; однак, цінність таких терапевтичних підходів, зокрема, для подовження тривалого виживання пацієнта, не може вважатися доказаним. Крім того, треба враховувати можливі ускладнення, пов'язані з лікуванням, такі як розвиток звуження уретри (променева терапія), втрата лібідо та імпотенція, ризик зменшення солей кальцію в кістках скелету, що проявляється як остеопороз, та помітно збільшений ризик патологічних переломів кісток (при гормон-пригнічувальній терапії). Більш ніж 90 % усіх випадків раку простати виявляються на локальній та реґіонарній стадії; відносний показник 5-річної виживаності для пацієнтів, у яких пухлини діагностувалися на цих стадіях, досягає 100 %. Протягом останніх 25 років, 5-річна виживаність для усіх стадій в сукупності збільшилася з 69 % приблизно до 90 %. Відповідно до останніх даних, відносна 10річна виживаність становить 93 %, а 15-річна виживаність - 77 %. Значне покращення в показниках виживаності, зокрема, на рівні 5 років, можна частково віднести на рахунок раннього діагностування та удосконалення лікування. Проте, виживаність значно знижується після того, як пухлина поширюється на інші тканини та органи. Рак легенів За попередніми оцінками, в 2007 році в США очікується 210 000 нових випадків захворювання на рак легенів, що нараховує приблизно 15 % діагнозів раку. Захворюваність значно знижувалася у чоловіків, з 102 випадків на 100 000 осіб в 1984 році до 78.5 в 2003 році. У жінок зараз захворюваність залишається на одному й тому ж рівні після тривалого періоду 3 UA 103202 C2 5 10 15 20 25 зростання. Рак легенів клінічно класифікується як мілкоклітинний (13 %) або немілкоклітинний (87 %) рак, для цілей лікування. Рак легенів є причиною більшості смертей від ракових захворювань і у чоловіків, і у жінок. За прогнозами в 2007 році очікується 160 390 смертельних випадків від цього захворювання, що становить близько 29 % усіх смертей від раку. Щорічно, починаючи з 1987 року, від раку легенів вмирало більше жінок, ніж від раку молочної залози. Протягом періоду 1991-2003 років, показники смертності у чоловіків продовжували істотно знижуватися, приблизно на 1.9 % на рік. Зріст смертності від раку легенів у жінок припинився після постійного підвищення протягом кількох десятиліть. Ці тенденції в смертності від раку легенів відображають зменшення в кількості курців за останні 30 років. Методи лікування визначаються типом (мілкоклітинний чи немілкоклітинний) та стадією раку і включають хірургічне втручання, променеву терапію, хіміотерапію та спрямовану біологічну терапію, з використанням, наприклад, бевакізумабу (Avastin®) та ерлотінібу (Tarceva®). Для локалізованого раку, хірургічне втручання є зазвичай переважним методом лікування. Недавні дослідження вказують на те, що виживаність у випадку немілкоклітинного раку легенів на ранній стадії покращується завдяки хіміотерапії після проведення операції. Оскільки захворювання, як правило, вже є поширеним на момент його виявлення, часто використовуються променева терапія та хіміотерапія, іноді в поєднанні з хірургічною операцією. Хіміотерапія, окремо чи разом з променевою терапією, є взагалі переважним методом лікування мілкоклітинного раку легенів; при такій схемі лікування у великої кількості пацієнтів спостерігається ремісія, яка є в деяких випадках довготривалою. 1-річна відносна виживаність для раку легенів трохи підвищилася з 37 % в 1975-1979 роках до 42 % в 2002 році, значною мірою завдяки удосконаленням в хірургічній техніці та комбінованій терапії. Однак, 5-річний рівень виживаності для усіх стадій разом – лише 16 %. Виживаність становить 49 % для випадків, визначених, коли захворювання ще локалізоване; однак, лише 16 % діагнозів раку легенів ставиться на такій ранній стадії. 4 UA 103202 C2 Таблиця 1 Прогноз нових випадків захворювання на рак та смертельних випадків для обох статей для США в 2007 р. (Американське Товариство по Боротьбі з Раком. Факти і цифри про рак - 2007 р. Атланта: American Cancer Society; 2007) Прогноз нових випадків Прогноз смертельних випадків захворювання Обидві статі Чоловіки Жінки Обидві статі Чоловіки Жінки Гліома та рак мозку 20 500 11 170 9 330 12 740 7 150 5 590 Рак молочної залози 180 510 2 030 178 480 40 910 450 40 460 Рак простати 218 890 218 890 27 050 27 050 Рак стравоходу 15 560 12 130 3 430 13 940 10 900 3 040 Колоректальний рак 112 340 55 290 57 050 52 180 26 000 26 180 Рак нирки 51 190 31 590 19 600 12 890 8 080 4 810 Рак підшлункової залози 37 170 18 830 18 340 33 370 16 840 16 530 Плоско-клітинний рак; Не Не Не Не Не кератиноцитні 1 000 000 визначено визначено визначено визначено визначено новоутворення шкіри Лейкемія 44,240 24 800 19 440 21 790 12 320 9 470 Рак легенів 213 380 114 760 98 620 160 390 89 510 70 880 Неходжкінська лімфома 63 190 34 210 28 990 18 660 9 600 9 060 Рак яєчників 22 430 22 430 15 280 15 280 Меланома 59 940 33 910 26 030 8 110 5 220 2 890 Локалізація 5 10 15 20 25 30 35 Отже, існує необхідність в новому ефективному та безпечному методі лікування гліобластоми, пухлини передміхурової залози, раку молочної залози, раку стравоходу, колоректального раку, світло-клітинного раку нирки, раку легенів, ЦНС, раку яєчників, меланоми, раку підшлункової залози, плоско-клітинного раку, лейкемії, медулобластоми та інших пухлин, в яких спостерігається надмірна експресія сурвівіну, для покращення стану пацієнтів без використання хіміотерапевтичних речовин або інших засобів, які можуть призвести до серйозних побічних ефектів. Детальний опис винаходу Усі терміни, що використовуються в цьому винаході, мають визначення, наведені нижче, якщо не вказано інше. Термін "пептид" використовується тут для визначення ряду амінокислотних залишків, з'єднаних один з одним, як правило, пептидними зв'язками між альфа-аміно- та та карбонільною групами суміжних амінокислот. Зазвичай пептиди мають довжину 9 амінокислот, але можуть мати довжину лише 8 амінокислот чи досягати довжини 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 або 18 амінокислот. Термін "олігопептид" використовується тут для визначення ряду амінокислотних залишків, з'єднаних один з одним, як правило, пептидними зв'язками між альфа-аміно- та карбонільною групами суміжних амінокислот. Довжина олігопептиду не є критичною для винаходу, якщо в ньому вміщені належний епітоп чи епітопи. Олігопептиди, як правило, за довжиною є меншими, ніж приблизно 30 амінокислот, та більшими, ніж приблизно 14 амінокислот. Термін "поліпептид" означає ряд амінокислотних залишків, з'єднаних один з одним, як правило, пептидними зв'язками між альфа-аміно- та карбонільною групами суміжних амінокислот. Довжина поліпептиду не є критичною для винаходу, якщо він вміщує належні епітопи. На відміну від термінів "пептид" чи "олігопептид", термін "поліпептид" вживається для визначення молекул, які вміщують більш ніж приблизно 30 амінокислотних залишків. Пептид, олігопептид, білок чи полінуклеотид, що кодує таку молекулу, є "імуногенним" (тобто, "імуногеном" в рамках цього винаходу), якщо він здатний індукувати імунну реакцію. У випадку цього винаходу, імуногенність більш специфічно визначена як здатність індукувати Тклітинну реакцію. Отже, "імуноген" буде молекулою, здатною індукувати імунну реакцію, та у випадку цього винаходу, - молекулою, здатною індукувати Т-клітинну реакцію. T-клітинний "епітоп" є молекулою короткого пептиду, що зв'язується з рецептором MHC класу I чи II, формуючи потрійний комплекс (альфа-ланцюг MHC класу I, бета-2-мікроглобулін та пептид), здатний розпізнаватися T-клітиною, яка має відповідний T-клітинний рецептор, що зв'язується з MHC/пептидним комплексом з належною афінністю. Пептиди, що зв'язуються з MHC-молекулами класу I, як правило, мають довжину 8-14 амінокислот, і найбільш типовою є 5 UA 103202 C2 5 10 15 20 довжина 9 амінокислот. Епітопи T-клітин, що зв'язуються з MHC-молекулами класу II, як правило, мають довжину 12-30 амінокислот. У випадку пептидів, котрі зв'язуються з молекулами MHC класу II, один і той самий пептид та відповідний T-клітинний епітоп можуть займати спільний коровий сегмент, але мати різну загальну довжину, внаслідок того, що бокові послідовності відрізняються за довжиною вище аміно-кінця ключової послідовності та нижче її карбоксильного кінця, відповідно. Рецептори MHC класу II мають більш відкриту конформацію, пептиди, зв'язані з рецепторами MHC класу II, відповідно, не повністю заглиблені в структуру пептидно-зв'язуючої "кишені" МНС-молекули класу II, як в пептидно-зв'язуючій "кишені" MHCмолекули класу І. Дивно, але це не відноситься до пептиду послідовності SEQ ID NO: 1, оскільки невеликі варіації в довжині пептиду ведуть до значного зниження активності (див. нижче). У людей існують три різні генетичні локуси, які кодують МНС-молекули класу I (MHCмолекули людини також визначаються як лейкоцитарні антигени людини (HLA)): HLA-A, HLA-B та HLA-C. HLA-A*0l, HLA-A*02 та HLA-A*ll є прикладами різних алелей MHC класу І, що можуть експресуватися з цих локусів. В геномі людини є три різні локуси для генів MHC класу II: HLA-DR, HLA-DQ та HLA-DP. Рецептори MHC класу II є гетеродімерами, що складаються з альфа- та бета-ланцюгу, обидва з яких закріплюються в клітинній мембрані через трансмембранну ділянку. HLA-DRB1*04 та HLADRB1*07 – два приклади різних бета-алелей MHC класу II, котрі, як відомо, кодуються в цих локусах. Алелі класу II дуже поліморфні, наприклад, описано кілька сот різних HLA-DRB1алелей. Для HLA-A*02 та серотипів HLA-DR, що зустрічаються найчастіше, частота експресії в різних популяціях показана в Таблиці 2. Таблиця 2 Частота експресії F для HLA*A02 та серотипів HLA-DR, що зустрічаються найчастіше. Значення частоти виводяться із частот гаплотипу Gf в американській популяції, на основі адаптованих даних роботи Mori et al., де використовується формула Харді-Вейнберга F=1-(1-Gf)². Комбінації A*02 з визначеними алелями HLA-DR можуть бути збагаченими чи менш частими, ніж очікувалося від їхніх окремих частот, внаслідок невипадкового розподілу. За детальними даними звертайтесь до роботи Chanock et al. HLA-алель A*02 DR1 DR2 DR3 DR4 DR5 DR6 DR7 DR8 DR9 25 30 35 Частота експресії HLA*02 та серотипів HLA-DR в межах Північноамериканських субпопуляцій Білі американці Афро-американці Монголоїди Латиноамриканці 49.1 % 34.1 % 43.2 % 48.3 % 19.4 % 13.2 % 6.8 % 15.3 % 28.2 % 29.8 % 33.8 % 21.2 % 20.6 % 24.8 % 9.2 % 15.2 % 30.7 % 11.1 % 28.6 % 36.8 % 23.3 % 31.1 % 30.0 % 20.0 % 26.7 % 33.7 % 25.1 % 31.1 % 24.8 % 19.2 % 13.4 % 20.2 % 5.7 % 12.1 % 12.7 % 18.6 % 2.1 % 5.8 % 18.6 % 2.1 % Отже, для терапевтичних та діагностичних цілей в значній мірі доцільним є пептид, що зв'язується з належною афінністю з кількома різними рецепторами HLA класу II. Пептид, який зв'язується з кількома різними молекулами HLA класу II, називається гетерогенним лігандом. Посилання на ДНК-послідовність в цьому винаході включає однониткові та двониткові ДНК. Отже, конкретна послідовність, якщо контекст не передбачає іншого, відноситься до однониткової ДНК такої послідовності, дуплексу такої послідовності з її комплементом (двониткова ДНК) та комплементу такої послідовності. Термін "кодуюча ділянка" відноситься до тієї частини гену, яка природним чи нормальним способом кодує продукт експресії того гену в його природному геномному середовищі, тобто, до ділянки, що кодує in vivo природний продукт експресії гену. Кодуюча ділянка може бути з нормального гену, або гену, що мутував чи був змінений, або навіть бути з послідовності ДНК чи гену, повністю синтезованого в лабораторії з використанням методів, добре відомих досвідченим фахівцям в галузі синтезу ДНК. Термін "нуклеотидна послідовність" відноситься до гетерополімеру дезоксирібонуклеотидів. 6 UA 103202 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Нуклеотидна послідовність, що кодує конкретний пептид, олігопептид чи поліпептид, може мати природне походження чи створюватися синтетичним шляхом. В цілому, сегменти ДНК, що кодують пептиди, поліпептиди та білки цього винаходу, збираються з фрагментів кДНК та коротких олігонуклеотидних лінкерів, або з серії олігонуклеотидів, для одержання синтетичного гену, здатного експресуватися в рекомбінантній транскрипційній одиниці, яка вміщує регуляторні елементи, одержані з мікробного чи вірусного оперону. Термін "продукт експресії" означає поліпептид або білок, котрий є природним трансляційним продуктом гену та будь-якої нуклеїново-кислотної послідовності, що кодує еквіваленти, які є результатом деградації генетичного коду, і також кодує ті ж амінокислоти. Термін "фрагмент", стосовно кодуючої послідовності, означає частину ДНК, яка вміщує менш ніж повну кодуючу ділянку, і продукт експресії якої зберігає по суті ту ж біологічну функцію чи діяльність, що й продукт експресії повної кодуючої ділянки. Термін "сегмент ДНК" відноситься до полімеру ДНК, у формі окремого фрагменту чи як компонент більшої структури ДНК, що одержаний з ДНК, виділеної принаймні один раз по суті в чистій формі, тобто, без забруднюючих ендогенних матеріалів та в кількості чи концентрації, яка дає змогу ідентифікувати, виконувати маніпуляції та відновлювати сегмент і його складові нуклеотидні послідовності за допомогою стандартних біохімічних методів, наприклад, з використанням вектору клонування. Такі сегменти надаються у формі відкритої рамки зчитування, без порушень внутрішніми нетрансльованими послідовностями, чи інтронами, які зазвичай присутні в еукаріотичних генах. Послідовності нетрансльованих ДНК можуть бути присутні по низхідній від відкритої рамки зчитування, де вони не заважають маніпуляціям або експресії кодуючих ділянок. Термін "праймер" означає коротку нуклеїново-кислотну послідовність, котра може бути спарена з однією ниткою ДНК та надає вільний 3'OH-кінець, на якому ДНК-полімераза розпочинає синтез дезоксирібонуклеотидного ланцюгу. Термін "промотор" означає ділянку ДНК, включену у зв'язування РНК-полімерази для ініціації транскрипції. Термін "відкрита рамка зчитування (ORF)" означає серію тріплетів, що кодують амінокислоти без будь-яких термінаційних кодонів, та є послідовністю, яка може (потенційно) транслюватися в білок. Термін "виділений" означає, що матеріал видаляється зі свого первісного середовища (наприклад, природного середовища, якщо він має природне походження). Наприклад, природно існуючий полінуклеотид чи поліпептид, присутній у живих тварин, не є виділеним, але той самий полінуклеотид чи поліпептид, відокремлений від якихось чи всіх співіснуючих матеріалів в природній системі, є виділеним. Такі полінуклеотиди можуть бути часткою вектору, та/або такі полінуклеотиди чи поліпептиди можуть становити частину композиції і продовжувати бути виділеними, якщо такий вектор чи композиція не є частиною свого природного середовища. Полінуклеотиди та рекомбінантні чи імуногенні поліпептиди, розкриті відповідно до цього винаходу, також можуть бути в "очищеній" формі. Термін "очищений" не вимагає абсолютної чистоти; він має на увазі відносне визначення та може включати препарати високого ступеню очищення або препарати, які тільки частково очищені, в тому сенсі, як спеціалісти в цій галузі розуміють такі терміни. Наприклад, окремі клони, виділені з бібліотеки кДНК, були умовно очищені до електрофорезної однорідності. Очищення вихідного матеріалу чи природного матеріалу принаймні на порядок величини, переважно на два-три порядки, та більш переважно, на чотири- п'ять порядків величини, чітко передбачається в цьому винаході. Крім того, заявлений поліпептид, котрий має чистоту переважно в 99.999 %, або принаймні в 99.99 % чи 99.9 %; і навіть бажано 99 % за вагою, чи більше, також чітко пропонується. Нуклеїнові кислоти та продукти експресії поліпептидів, що розкриваються відповідно до цього винаходу, а також вектори експресії, які вміщують такі нуклеїнові кислоти та/або такі поліпептиди, можуть бути в "збагаченій формі". Термін "збагачений" в тому виді, в якому він використовується тут, означає, що концентрація матеріалу принаймні в 2, 5, 10, 100 або 1000 разів перевищує його природну концентрацію (наприклад), переважно 0.01 %, за вагою, принаймні переважно приблизно 0.1 % за вагою. Також передбачаються збагачені препарати приблизно в 0.5 %, 1 %, 5 %, 10 % та 20 % за вагою. Послідовності, структури, вектори, клони та інші матеріали, які складають цей винахід, можуть переважно бути у збагаченій чи виділений формі. Термін "активний фрагмент" означає фрагмент, що генерує імунну реакцію, тобто, має імуногенну функцію, при введенні (разом чи як додатково з прийнятним ад'ювантом) тварині, наприклад, ссавцю, такому як кролик чи миша, і також включаючи людину. Така імунна реакція 7 UA 103202 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 має вид стимуляції Т-клітинної реакції у тварини-реципієнта, такої як людина. Альтернативно, "активний фрагмент" також може використовуватись для індукування Т-клітинної реакції in vitro. В цьому винаході терміни "частка", "сегмент" і "фрагмент", якщо вони використовуються по відношенню до поліпептидів, означають безперервну послідовність залишків, таких як амінокислотні залишки, причому ця послідовність утворює підгрупу більшої послідовності. Наприклад, якщо поліпептид був підданий обробці будь-якою з типових ендопептідаз, таких як трипсин або химотрипсин, олігопептиди, одержані в результаті такої обробки, будуть представляти частки, сегменти чи фрагменти початкового поліпептиду. Це означає, що будьякий такий фрагмент буде обов'язково вміщувати, як частину своєї амінокислотної послідовності, сегмент, фрагмент або частину, яка є по суті ідентичною, якщо не повністю ідентичною, послідовності від SEQ ID NO: 1 до 20, котра відповідає природним або "вихідним" білкам послідовностей від SEQ ID NO: 1 до 20. Якщо такі терміни використовуються стосовно полінуклеотидів, вони означають продукти, одержані після обробки зазначених полінуклеотидів будь-якою з типових ендонуклеаз. Відповідно до цього винаходу, термін "процентна ідентичність" або "процент ідентичності", відносно послідовності, означає, що послідовність порівнюється із заявленою або описаною послідовністю після вивірки послідовності, яка порівнюється ("Порівняна Послідовність"), з описаною або заявленою послідовністю ("Контрольна Послідовність"). Процентна ідентичність визначається відповідно до наведеної нижче формули: Процентна ідентичність = 100 [I -(C/R)] де C - кількість різниць між Контрольною Послідовністю та Порівняною Послідовністю на довжині вивірки в інтервалі порівняння між Контрольною Послідовністю та Порівняною Послідовністю, де (i) кожна основа чи амінокислота в Контрольній Послідовності, котра не має відповідної вивіреної основи чи амінокислоти у Порівняній Послідовності, і (ii) кожній розрив у Контрольній Послідовності та (iii) кожна вивірена основа чи амінокислота у Контрольній Послідовності, яка відрізняється від вивіреної основи чи амінокислоти у Порівняній Послідовності, становить різницю; та R - це кількість основ чи амінокислот в Контрольній Послідовності на довжині вивірки з Порівняною Послідовністю з будь-яким розривом, утвореним в Контрольній Послідовності, також зарахованим як основа чи амінокислота. Якщо існує вивірка між Порівняною Послідовністю та Контрольною Послідовністю, для якої процентна ідентичність, розрахована вище, є приблизно рівною чи більшою, ніж зазначена мінімальна Процентна Ідентичність, то Порівняна Послідовність має зазначену мінімальну процентну ідентичність до Контрольної Послідовності, навіть якщо можуть існувати вивірки, в яких розрахована, як описано вище, Процентна Ідентичність менша, ніж зазначена Процентна Ідентичність. Первісні пептиди, що розкриваються в цьому винаході, можуть модифікуватися заміщенням одного чи кількох залишків на різних, можливо, селективних, ділянках пептидного ланцюгу, якщо не зазначається інше. Такі заміщення можуть бути консервативного характеру, наприклад, коли одна амінокислота замінюється амінокислотою подібної структури та характеристик, тобто, коли гідрофобна амінокислота замінюється іншою гідрофобною амінокислотою. Навіть більш консервативною буде заміна амінокислот такого ж чи подібного розміру та хімічного характеру, наприклад, коли лейцин замінюється ізолейцином. В дослідженнях варіацій послідовностей в сімействах природних гомологічних білків, певні амінокислотні заміщення частіше допускаються, ніж інші, і вони часто демонструють кореляцію зі схожістю в розмірі, заряді, полярності та гідрофобності між первісною амінокислотою та її заміною, і це є основою для визначення "консервативних заміщень". Консервативні заміщення визначаються тут як заміни в межах однієї з наведених нижче п'яти груп: Група 1 – малі аліфатичні, неполярні чи слабо полярні залишки (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Група 2 – полярні, негативно заряджені залишки та їхні аміди (Asp, Asn, Glu, Gln); Група 3 – полярні, позитивно заряджені залишки (His, Arg, Lys); Група 4 – великі аліфатичні неполярні залишки (Met, Leu, Ile, Val, Cys); та Група 5 - великі ароматичні залишки (Phe, Tyr, Trp). Менш консервативні заміщення можуть включати заміну однієї амінокислоти іншою, котра має подібні характеристики, але трохи відрізняється за розміром, наприклад, заміна аланіну ізолейциновим залишком. Високо-неконсервативні заміни можуть включати заміщення кислотної амінокислоти полярною, або навіть такою, що є основною за своїм характером. Такі "радикальні" заміщення не можуть, однак, відхилятись як потенційно неефективні, оскільки їхні хімічні наслідки не є повністю прогнозованими, та радикальні заміщення також можуть 8 UA 103202 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 несподівано призвести до сприятливих ефектів, які неможливо передбачити за простими хімічними принципами. Безумовно, такі заміщення можуть включати структури, інші ніж звичайні L-амінокислоти. Отже, D-амінокислоти можуть заміщуватися L-амінокислотами, котрі зазвичай виявляються в антигенних пептидах винаходу та охоплюються розкриттям в ньому. Крім того, амінокислоти, які мають нестандартні R-групи (тобто, R-групи, інші ніж можна знайти в типових 20 амінокислотах природних білків) також можуть використовуватись для заміщення, з метою виробництва імуногенів та імуногенних поліпептидів, відповідно до цього винаходу. Якщо виявляється, що заміщення в більш ніж одній позиції призводять до утворення пептиду по суті з еквівалентною чи більшою антигенною активністю, як визначено нижче, тоді комбінації цих заміщень будуть досліджуватись з метою визначення, чи мають комбіновані заміщення додатковий чи синергічний вплив на антигенність пептиду. Більшою частиною, не більш ніж 4 позиції в пептиді замінюються одночасно. Термін "Т-клітинна реакція" означає специфічну проліферацію та активацію ефекторних функцій, індукованих пептидом in vitro чи in vivo. Для CTL, обмежених MHC класу I, ефекторними функціями можуть бути лізис клітин-мішеней з імпульсно введеним пептидом, пептидним прекурсором чи клітин-мішеней, природно презентуючих пептид, секреція цитокінів, переважно гамма-інтерферону, TNF-альфа, або IL-2, індукована пептидом, секреція ефекторних молекул, переважно, гранзимів чи перфорінів, індукована пептидом, або дегрануляція. Для Т-клітин- хелперів, обмежених MHC класу II, ефекторні функції – це, ймовірно, індукована пептидом секреція цитокінів, переважно, IFN-гамма, TNF-альфа, IL-4, IL5, IL-10 або IL-2, чи індукована пептидом дегрануляція. Можливі ефекторні функції для CTL і Тклітин- хелперів не обмежуються цим переліком. Імунотерапевтичні підходи до лікування Стимуляція імунної реакції залежить від наявності антигенів, які визнаються імунною системою хазяїна як чужорідні. Виявлення існування пухлино-асоційованих антигенів дало можливість використовувати імунну систему хазяїна для втручання у ріст пухлини. Зараз досліджуються різні механізми використання як гуморальних, так і клітинних важелів імунної системи для імунотерапії раку. Окремі елементи клітинної імунної реакції здатні специфічно розпізнавати та знищувати клітини пухлин. Виділення цитотоксичних T-лімфоцитів (CTL) з пухлино-інфільтруючих клітинних популяцій чи з периферичної крові наводить на думку, що такі клітини грають важливу роль в природному імунному захисті проти раку. Зокрема, CD8-позитивні T-клітини, які розпізнають молекули класу I головного комплексу гістосумісності (MHC), що презентують пептиди зазвичай з 8-10 залишків, одержані з білків чи дефектних продуктів рибосом (DRIPS) (Schubert U, Antón LC, Gibbs J, Norbury CC, Yewdell JW, Bennink JR.; Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes; Nature 2000; 404(6779):770-774), котрі розташовані в цитозолях, відіграють значну роль в цій реакції. MHC-молекули людини також визначаються як лейкоцитарні антигени людини (HLA). Є два класи MHC-молекул: MHC-молекули класу I, котрі можна знайти на більшості клітин, що мають ядро; вони презентують пептиди, які є результатом протеолітичного розщеплення, переважно, ендогенних, цитозольних білків чи білків ядра, DRIPS та більшіх за розміром пептидів. Однак, пептиди, одержані з ендосомних компартментів чи екзогенних джерел, також часто зустрічаються на молекулах MHC класу I. Цей некласичний спосіб презентування класом I визначається як крос-презентування в науковій літературі. MHC-молекули класу II, переважно, знаходяться на професійних антиген-презентуючих клітинах (APC); вони презентують пептиди екзогенних білків, що поглинаються АPC в ході ендоцитозу, та проходять подальшу обробку. Стосовно классу І, описуються альтернативні способи процесингу антигенів, що дозволяють пептидам з ендогенних джерел презентуватися молекулами MHC класу II (наприклад, аутофагоцитоз). Комплекси пептиду та MHC-молекули класу I розпізнаються CD8-позитивними цитотоксичними T-лімфоцитами, які презентують відповідні рецептори Т-клітин (TCR), а комплекси пептиду і MHC-молекули класу II розпізнаються CD4-позитивними Т-клітинамихелперами, що презентують відповідні TCR. CD4-позитивні T-клітини- хелпери відіграють важливу роль в регулюванні ефекторних функцій протипухлинних реакцій T-клітин, і з цієї причини ідентифікація епітопів CD4-позитивних T-клітин, які одержуються з пухлино-асоційованих антигенів (TAA) може мати велике значення для розробки фармацевтичних продуктів для викликання протипухлинних імунних реакцій (Gnjatic, S., D. Atanackovic, E. Jäger, M. Matsuo, A. Selvakumar, N.K. Altorki, R.G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y.T. Chen, A. Knuth, and L.J. Old. Survey of naturally occurring CD4+T-cell responses against NY-ESO-1 in cancer patients: Correlation with antibody responses. Proc. Natl. Acad. Sci. 9 UA 103202 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 U.S.A. 2003, 100 (15): 8862-7). CD4-позитивні T-клітини можуть призвести до локального зростання рівнів гамма-інтерферону. На моделях ссавців, наприклад, мишей, було продемонстровано, що навіть за відсутністю ефекторних клітин CTL (тобто, CD8-позитивних T-лімфоцитів), CD4-позитивні T-клітини є достатніми для візуалізації інгібування пухлин шляхом інгібування ангіогенезу завдяки секреції гамма-інтерферону (IFNγ) (Qin, Z. and T. Blankenstein. CD4+T-cell--mediated tumor rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells. Immunity. 2000, 12:677-686). Крім того, було показано, що CD4-позитивні T-клітини, які розпізнають пептиди з пухлино-асоційованих антигенів, представлених молекулами HLA класу II, можуть протидіяти розвитку пухлин за допомогою індукування реакцій антитіл (Ab) (Kennedy, R.C., M.H. Shearer, A.M. Watts, and R.K. Bright. CD4+T lymphocytes play a critical role in antibody production and tumor immunity against simian virus 40 large tumor antigen. Cancer Res. 2003, 63:1040-1045). На відміну від пухлино-асоційованих пептидів, які зв'язуються з молекулами HLA класу I, лише невелика кількість лігандів класу II TAA була описана на цей час (www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de). Оскільки визначальна експресія молекул HLA класу II зазвичай обмежується клітинами імунної системи, можливість виділення пептидів класу II безпосередньо з первинних пухлин не вважалася ймовірною. Однак, автори винаходів за останній час досягли успіху в ідентифікації ряду епітопів MHC класу II безпосередньо з пухлин (EP 1642905, EP 1760088; Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Müller M, Krämer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K,Stevanović S.; Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin Cancer Res. 2006; 12:4163-4170). За відсутності запалення, експресія молекул MHC класу II, переважно, зводиться до клітин імунної системи, зокрема, до антиген-презентуючих клітин (APC), наприклад, моноцитів, клітин, що походять з моноцитів, макрофагів, дендритних клітин. При дослідженні пацієнтів з пухлинами було несподівано виявлено, що клітини пухлини експресують MHC-молекули класу II (Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Müller M, Krämer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanović S.; Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin Cancer Res. 2006; 12:4163-4170). Для того, щоб пептид індукував (викликав) клітинну імунну реакцію, він повинен зв'язуватися з MHC-молекулою. Цей процес залежить від алелі MHC-молекули та специфічного поліморфізму амінокислотної послідовності пептиду. Пептиди, зв'язані з MHC класу I, як правило, мають довжину 8-10 амінокислотних залишків та зазвичай вміщують два консервативні залишки ("якір") в своїй послідовності, що взаємодіє з відповідною порожниною зв'язування MHC-молекули. Таким чином, кожна MHC-алель має "мотив зв'язку", що визначає, які пептиди можуть специфічно зв'язуватися з порожниною зв'язування (Rammensee HG, Bachmann J, Stevanovic S. MHC ligands and peptide motifs, Landes Bioscience, USA, 1997). В імунній реакції, залежній від MHC, пептиди повинні не тільки мати здатність зв'язуватися з певними молекулами MHC, експресованими пухлинними клітинами, вони також мають розпізнаватися T-клітинами, презентуючими специфічні T-клітинні рецептори (TCR). Антигени, котрі розпізнаються пухлино-специфічними цитотоксичними T-лімфоцитами, тобто, їхні епітопи, можуть бути молекулами, одержаними з усіх класів білків, таких як ферменти, рецептори, транскрипційні фактори та ін. Крім того, пухлино-асоційовані антигени, наприклад, також можуть бути присутні тільки в клітинах пухлин, зокрема, як продукти генів, що мутували. Іншим важливим класом пухлино-асоційованих антигенів є тканино-специфічні антигени, такі як CT ("cancer testis")-антигени, що експресуються в різних видах пухлин та в здоровій тканині сім’яників. Було ідентифіковано різні пухлино-асоційовані антигени. Крім того, проведена значна дослідницька робота по ідентифікації додаткових пухлино-асоційованих антигенів. Деякі групи пухлино-асоційованих антигенів, котрі також згадуються в літературі як пухлино-специфічні антигени, є тканино-специфічними. Деякі групи пухлино-асоційованих антигенів, котрі також згадуються в літературі як пухлино-специфічні антигени, є тканино-специфічними. Приклади включають, без обмежень, тирозиназу для меланоми, простато-специфічні антигени (PSA) та простатичні специфічні мембранні антигени (PSMA) для раку простати і хромосомні кросовери (транслокації), такі як bcr/abl у лімфомі. Однак, ряд ідентифікованих пухлино-асоційованих антигенів зустрічається в багатьох видах пухлин, а деякі з них, такі як онкогенні білки та/або гени-супресори пухлин (огляд генів-супресорів пухлин для раку нирки наведений, наприклад, в роботі Linehan WM, Walther MM, Zbar B. The genetic basis of cancer of the kidney. J Urol. 2003 10 UA 103202 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Dec; 170 (6Pt1):2163-72), котрі фактично викликають трансформаційну дію, зустрічаються практично в усіх видах пухлин. Наприклад, звичайні білки клітин, що контролюють ріст та диференціацію клітин, такі як p53 (приклад гена-супресора пухлин), ras, c-met, myc, pRB, VHL та HER-2/neu, можуть накопичувати мутації, і це призводить до посилення експресії цих генних продуктів, таким чином роблячи їх онкогенними (McCartey et al. Cancer Research, 1998, 15:58 2601-5; Disis et al. Ciba Found. Symp. 1994, 187:198-211). Ці білки-мутанти також можуть бути мішенню пухлино-специфічної імунної реакції при багатьох видах ракових захворювань. Імунотерапія у пацієнтів, хворих на рак, чітко спрямована на активацію клітин імунної системи специфічним чином, зокрема, так званих цитотоксичних T-клітин (CTL, також відомих як "клітини-кілери" і як CD8-позитивні T-клітини), проти пухлинних клітин, а не проти здорових тканин. Клітини пухлин відрізняються від здорових клітин експресією пухлино-асоційованих білків. Молекули HLA на клітинній поверхні презентують клітинний вміст назовні, таким чином дозволяючи цитотоксичній T-клітині проводити диференціацію між здоровою та пухлинною клітиною. Це здійснюється за допомогою розбивки усіх білків всередині клітини на короткі пептиди, котрі потім додаються до молекул HLA і презентуються на клітинній поверхні. Пептиди, які презентуються на пухлинних клітинах, але не презентуються (або в незначній мірі презентуються) на здорових клітинах тіла, називаються пухлино-асоційованими пептидами (TUMAP). Длятого, щоб білки розпізнавалися цитотоксичними T-лімфоцитами як пухлино-специфічні або пухлино-асоційовані антигени, та з метою використання в лікуванні, мають бути дотримані деякі попередні умови. Антиген повинен експресуватися, головним чином, клітинами пухлин, а не нормальними здоровими тканинами, чи бути присутнім в здорових клітинах в порівняно невеликих кількостях. Крім того, бажано, щоб відповідний антиген був не тільки присутнім в будь-якому виді пухлини, але також знаходився у високих концентраціях (наприклад, кількість копій відповідного пептиду на клітину). Пухлино-специфічні та пухлино-асоційовані антигени часто походять з білків, що беруть безпосередню участь у трансформації нормальної клітини в пухлинну клітину внаслідок їхньої функції, наприклад, в контролі клітинного циклу чи апоптозі. До того ж, наступні мішені цих білків, які є основною причиною трансформації, можуть мати підвищену експресію і, відповідно, бути непрямим чином асоційованими з пухлинами. Такі непрямо пухлино-асоційовані антигени також можуть бути мішенями у вакцинаційному підході. Істотно важливою в обох випадках є присутність епітопів в амінокислотній послідовності антигену, оскільки такий пептид ("імуногенний пептид"), що одержується з пухлиноасоційованого антигену, повинен призводити до Т-клітинної реакції in vitro чи in vivo. По суті, будь-який пептид, здатний зв'язувати молекулу MHC, може функціонувати як Tклітинний епітоп. Передумовою для індукування Т-клітинної реакції in vitro чи in vivo є наявність T-клітини з відповідним рецептором TCR та відсутність толерантності до цього конкретного епітопу. T-клітини - хелпери відіграють важливу роль в регуляції ефекторної функції CTL в протипухлинному імунітеті. Епітопи Т-хелперів, які запускають реакцію цих клітин типу TH1, підтримують ефекторні функції CD8-позитивних T-клітин- кілерів, котрі включають цитотоксичні функції, спрямовані проти клітин пухлин, що експресують комплекси пухлино-асоційованого пептиду/MHC на своїх клітинних поверхнях. Таким чином, епітопи пухлино-асоційованих пептидів Т-хелперів, самостійно чи в комбінації з іншими пухлино-асоційованими пептидами, можуть служити активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, які стимулюють протипухлинні імунні реакції. Оскільки обидва типи реакцій, залежні від CD8 та CD4, спільно та синергічно роблять свій внесок у протипухлинну дію, для розробки протипухлинних вакцин важливими є ідентифікація та характеристика пухлино-асоційованих антигенів, які розпізнаються CD8-позитивними CTL (молекули MHC класу I) чи CD4- позитивними CTL (молекули MHC класу II). Отже, задача цього винаходу полягає в знаходженні композицій пептидів, які вміщують пептиди, що зв'язуються з MHC-комплексами будь-якого класу. Перші клінічні дослідження з використанням пухлино-асоційованих пептидів розпочали в середині 90-х років минулого століття Бун (Boon) та його колеги, переважно, для індікації меланоми. Клінічні реакції в найбільш вдалих з цих досліджень варіювалися від 10 % до 30 %. Тяжкі побічні ефекти чи серйозна аутоімунність не повідомлялися в будь-яких клінічних дослідженнях із використанням монотерапії вакциною на основі пептидів. Є дані про вітіліго у слабкій формі, що спостерігалася у деяких пацієнтів, які проходили лікування меланомоасоційованими пептидами. Однак, примування одного виду CTL зазвичай є недостатнім для знищення усіх пухлинних клітин. Пухлини дуже мутагенні і тому здатні швидко реагувати на атаки CTL, змінюючи свою білкову модель для уникнення розпізнавання цитотоксичними Т-лімфоцитами. З метою протидії 11 UA 103202 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пухлинним механізмам уникнення, для вакцинації використовується широкий діапазон специфічних пептидів. Таким способом, проти клітини може бути розпочата широка одночасна атака відразу кількома CTL-клонами. Це може зменшити шанси того, що пухлина уникатиме імунної реакції. Така гіпотеза була недавно підтверджена в клінічному дослідженні лікування пацієнтів, хворих на меланому в останній стадії. Лише за кількома винятками, пацієнти, що мали якнайменш три визначені T-клітинні реакції, продемонстрували об'єктивні клінічні реакції чи стабілізацію захворювання, а також збільшену виживаність (інформація одержана при особистому спілкуванні з J. Banchereau), в той час як у широкої більшості пацієнтів з менш ніж трьома T-клітинними реакціями було діагностовано прогресуюче захворювання. Вивчення робіт заявників на патенти показало подібний ефект, коли пацієнти, хворі на гіпернефрому, проходили лікування вакциною, що складалася з 13 різних пептидів (H. SinghJasuja, S. Walter, T. Weinschenk, A. Mayer, P. Y. Dietrich, M. Staehler, A. Stenzl, S. Stevanovic, H. Rammensee, J. Frisch; Correlation of T-cell response, clinical activity and regulatory T-cell levels in renal cell carcinoma patients treated with IMA901, a novel multi-peptide vaccine; ASCO Meeting 2007 Poster # 3017; M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901, ASCO meeting 2007; Poster # 3017). Основна задача розробки протипухлинної вакцини полягає, таким чином, не тільки в ідентифікації та характеристиці нових пухлино-асоційованих антигенів та епітопів імуногенних Тхелперів, які походять з них, але й в комбінуванні різних епітопів для збільшення ймовірності реакції більш, ніж на один епітоп для кожного пацієнта. Отже, задача цього винаходу полягає в знаходженні комбінацій амінокислотних послідовностей таких пептидів, що мають здатність зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності людини (MHC) класу I (HLA класу I) чи II (HLA класу II). Додаткова задача цього винаходу полягає в наданні ефективної протиракової вакцини, яка базується на комбінації пептидів. Автори цього винаходу виділили і характеризували пептиди, які зв'язуються з молекулами HLA классу I або II, безпосередньо з пухлин ссавців, тобто, зразків первинних пухлин у пацієнтів, переважно, хворих на гліобластому, але також з первинних зразків тканин колоректальних карцином, гіпернефроми, пухлин легенів, підшлункової залози, злоякісної меланоми та пухлини шлунку. Цей винахід пропонує пептиди, що походять з антигенів, які асоціюються з пухлиногенезом, та мають здатність зв'язуватися в достатній мірі з молекулами MHC (HLA) класу II для запуску імунної реакції лейкоцитів людини, зокрема, лімфоцитів, в особливості, T-лімфоцитів, головним чином, CD4-позитивних T-лімфоцитів, а конкретніше, CD4-позитивних T-лімфоцитів, що виступають посередниками в імунних реакціях TH1-типу. Цей винахід також пропонує пептиди, що походять з антигенів, які асоціюються з пухлиногенезом, та мають здатність зв'язуватися в достатній мірі з молекулами MHC (HLA) класу I для запуску імунної реакції лейкоцитів людини, зокрема, лімфоцитів, в особливості, Tлімфоцитів, головним чином, CD8- позитивних цитотоксичних T- лімфоцитів, а також комбінацій з двох варіантів, що є особливо прийнятними для вакцинації пацієнтів, хворих на рак. Відповідно до цього винаходу, задача вирішується шляхом надання фармацевтичної композиції, котра складається принаймні з двох пептидів, що вміщують амінокислотну послідовність, обрану з групи, яка включає послідовності від SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO: 8, та/або вміщує варіант амінокислотної послідовності, що є принаймні на 80 % гомологічним послідовності від SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO: 8, та/або полінуклеотид, який вміщує нуклеїнову кислоту, що кодує послідовності SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 8 або варіант амінокислотної послідовності, та фармацевтично прийнятний носій. Фармацевтичні композиції цього винаходу можуть також вміщувати якнайменш один додатковий пептид, який вміщує амінокислотну послідовність, обрану з групи, яка включає послідовності від SEQ ID NO: 9 до SEQ ID NO: 20, або включає варіант амінокислотної послідовності, що є принаймні на 80 % ідентичний послідовності від SEQ ID NO: 9 до SEQ ID NO: 20, чи полінуклеотид, який вміщує нуклеїнову кислоту, що кодує послідовності від SEQ ID NO: 9 до SEQ ID NO: 20 або варіант амінокислотної послідовності. Пептиди можуть мати загальну довжину від 8 до 100 амінокислот, переважно від 8 до 30 амінокислот, та найбільш переважно від 8 до 17 амінокислот. Пептиди також можуть мати непептидні зв'язки. Як описується нижче, пептиди, за винятком MET-005, що є основою цього винаходу, були ідентифіковані як презентовані клітинами, що несуть в собі MHC класу I чи II. Отже, усі ці конкретні пептиди, а також інші пептиди, які включають послідовність (тобто, похідні пептиди) викликають специфічну T-клітинну реакцію, хоча ступінь, в якій ця реакція буде індукуватися, може варіюватися в залежності від конкретного пептиду та пацієнта. Різниця, наприклад, може 12 UA 103202 C2 5 10 бути викликана мутаціями в пептидах. Фахівцю, який має досвід в цій галузі, добре відомі методи, що можуть бути застосовані для визначення ступеню індукування реакції окремим пептидом, зокрема, із посиланням на приклади, наведені в цьому винаході, та відповідну довідкову літературу. Переважно, варіанти винаходу будуть індукувати T-клітини, що перехресно реагують з відповідним пептидом винаходу. Пептиди походять з пухлино-асоційованих антигенів, зокрема, пухлино-асоційованих антигенів з функціями, наприклад, в протеолізі, ангіогенезі, рості клітин, регуляції клітинного циклу, діленні клітин, регуляції транскрипції, регуляції трансляції, інвазії тканин і т. ін. В Таблиці 3 наведені пептиди та функція білку, з якого походять пептиди. Таблиця 3 Пептиди цього винаходу і функція вихідного білку Ід. № Ід.номер послідоПослідовність пептиду вності 1 CSP-001 TMLARLASA 2 3 4 5 6 7 8 15 20 25 30 35 Символ гену CSPG4 FABP7LTFGDVVAV 001 NLGN4X- NLDTLMTYV 001 TNC-001 AMTQLLAGV FABP7 NRCAM001 IGF2BP3001 BCA-002 MET-005 GLWHHQTEV NRCAM KIQEILTQV ALWAWPSEL TFSYVDPVITSISPKYG NLGN4X Функція Зв'язується з MHC Трансмембранний HLA-A*02 протеоглікан, що бере участь в неоваскуляризації ЦНС-специфічний білок, HLA-A*02 який зв'язує жирні кислоти Молекула клітинної адгезії HLA-A*02 HLA-A*02 IGF2BP3 Білок позаклітинного матриксу Нейрональна молекула клітинної адгезії мРНК-зв'язуючий білок BCAN MET Протеоглікан Рецептор фактору росту HLA-A*02 подовжений TUMAP HLA класу I TNC HLA-A*02 HLA-A*02 Хондроїтин сульфат протеоглікан 4 (CSPG4) CSPG4 (хондроїтин сульфат протеоглікан) представляє інтегральний мембранний хондроїтин сульфат протеоглікан. Він відомий як ранній маркер розвитку меланоми на поверхні клітин, який бере участь в стимуляції проліферації, міграції та інвазії клітин пухлин. CSPG4 в значній мірі експресується більш ніж у 90 % випадків меланомних уражень у людини. Хоча CSPG4 не є чітко пухлино-специфічним, пухлино-реактивні CD4-позитивні T-клітини розпізнають CSPG4693-709 на HLA-DR11-експресуючих клітинах меланоми у пацієнтів, хворих на меланому, а також у здорових людей, за відсутності ауто-імунності. Експресія CSPG4 стимулює інтегрин-опосередковане поширення клітин, фосфорилювання FAK (кінази фокальної адгезії) та активацію ERK1/2 (кінази, що регулюється позаклітинними сигналами). Крім того, на основі даних in vitro з'являються докази того, що CSPG4 відіграє важливу роль в ангіогенезі пухлин. Наприклад, як виявилося, CSPG4-позитивні пухлини мають значно збільшений ступінь неоваскулярізації та об'єми судин, і було продемонстровано, що CSPG4 блокує ангіостатін, котрий зазвичай інгібує проліферацію та ангіогенез ендотеліальних клітин. Незрілі судини також вміщують CSPG4-позитивні періцити, що наводить на думку про роль цієї клітинної популяції в модуляції проліферації ендотеліальних клітин шляхом блокування інгібіторних ефектів ангіостатіну в ході розвитку судин. Також була описана експресія CSPG4 в деяких нормальних тканинах, крім активованих періцитів, таких, наприклад, як ендотеліальні клітини, хондроцити, клітини гладких м'язів, окремі базальні кератиноцити в епідермісі, а також клітини у волосяному фолікулі. При ангіогенезі та у відповідь на патології ЦНС, високо-рухливі клітини CSPG4 зазнають швидких морфологічних змін та направляються на ділянки, де відбувається ріст та відновлення судин. CSPG4 надмірно експресується як клітинами пухлин, так і періцитами на кровоносних 13 UA 103202 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 судинах злоякісних пухлин мозку. Шляхом імплантації клітин з лінії CSPG4-позитивних клітин гліоми людини в мозок імунодефіцитних безтимусних пацюків, було показано, що ці пухлини мають більшу мікро- судинну щільність, в порівнянні з пухлинами контрольних тварин, і це означає, що експресія CSPG4 регулює функцію та структуру судинної системи пухлини, одержаної з організму хазяїна. В експерименті з введенням безтимусним пацюкам біоптатів GBM (мультиформної гліобластоми), було виявлено, що CSPG4, переважно, асоціюється в кровоносних судинах як з періцитами, так і з компонентами базальної мембрани судин пухлини, та його експресія також зв'язана з ділянками високої клітинної проліферації. Крім того, можна провести паралель між експресію CSPG4 та розвитком пухлини в моделі імплантації гліоми. Злоякісна прогресія підтримується перехресними зв'язками між пухлиною та її стромою, де активована строма живить проліферативні та інвазивні неопластичні клітини, надаючи новоутворені судини, компоненти позаклітинного матриксу та стимуляторні фактори росту. В цьому контексті, CSPG4 грає значну роль в активації строми пухлини шляхом змін в клітинній адгезії, міграції, проліферації та судинному морфогенезі. CSPG4 по-різному експресується в гліомах людини - більш висока експресія спостерігається в гліомах з високою злоякісністю, в порівнянні з низько-злоякісними гліомами. Висока експресія CSPG4 корелюється з резистентністю до багатьох лікарських засобів, що опосередковується збільшеною активацією передачі сигналів α3β1-інтегрин/PI3K та їхніх мішеней по низхідній, що сприяє виживанню клітин. Білок 7 мозкової тканини, що зв'язує жирні кислоти (IMA-FABP7-001) Білки, що зв'язують жирні кислоти (FABP), являють собою цитозольні білки з молекулярною масою 14-15 кДа, котрі вважаються такими, що беруть участь у накопиченні, транспортуванні та спрямуванні жирних кислот (FA). Передбачається, що вони збільшують розчинність FA у цитоплазмі при транспортуванні FA між мембранними компартментами, та доставляють жирні кислоти до їхніх мішеней у ядрі. FABP можуть регулювати концентрацію FA і таким чином впливати на різні клітинні функції, такі як ензиматична активність, генна експресія, ріст та диференціація клітин. Нервова тканина вміщує чотири з дев'яти відомих типів FABP з чітко вираженим просторово-часовим розподілом. FABP7 в значній мірі експресується в радіальних гліальних клітинах по усій центральній нервовій системі, що розвивається, і поступово знижується у дорослих людей. Цей білок є необхідним для індукованої нейронами гліальної диференціації та подальшої міграції нейронів впродовж гліальних процесів, але він не має впливу на проліферацію та адгезію клітин. В клітинах Шванна, експресія FABP7 є наслідком передачі сигналів EGFR Ras-незалежного шляху та регулює взаємодії між клітинами Шванна та аксонами в нормальних периферичних нервах та пухлинах периферичних нервів. мРНК FABP7 експресується у тканинах нейро-епітеліального походження, а також в злоякісних гліомних пухлинах (ступеню III і IV за класифікацією МОЗ). Ген був ідентифікований в хромосомному діапазоні 6q22-23, який також вміщує протоонкоген c-myc та часто зазнає втрату гетерозиготності в злоякісній гліомі. Аналіз ліній клітин злоякісної гліоми показав, що FABP7 часто ко-експресується з гліальним фібрилярним кислим білком (GFAP), і це може свідчити про те, що клітина, з якої походить злоякісна гліома, може бути клітиною-прекурсором астроцитів, що потенційно може експресувати обидва білки в нормальному стані чи при формуванні пухлини. Білок FABP7 демонструє нуклеарну та цитоплазматичну експресію в GBM, яка варіюється від помірної до значної. FABP7-трансфековані клітини гліоми виявляють в 5 разів більшу міграцію, ніж контрольні клітини. Таким чином, більш короткий загальний період виживання, асоційований з надмірною експресією FABP7, особливо в GBM, може бути обумовлений збільшеною міграцією та інвазією клітин пухлин в оточуючу мозкову паренхіму. Подальший аналіз розповсюдження FABP7 в пухлинах астроцитоми вказує на збільшені рівні FABP7 в інфільтруючих ділянках пухлин, що передбачає важливу роль FABP7 у стимулюванні інфільтрації злоякісних клітин в сусідні тканини мозку. FABP7 демонструє варіабельні рівні експресії та субклітинну локалізацію в гліальних тканинах та усіх ступенях астроцитоми. Однак, переважно нуклеарна локалізація FABP7, вірогідно, асоціюється з інфільтративним фенотипом гліомних клітин та метаболічних шляхів типу EGFR, оскільки його нуклеарна транслокація визначається після активації EGFR та асоціюється з несприятливим прогнозом в EGFRпозитивних GBM. Більше того, ніяка нуклеарна імунореактивність FABP7 не може спостерігатися в астроцитомі I ступеню. Х-зв'язаний нейролігін 4 (IMA-NLGN4X-001) Х-зв'язаний нейролігін 4 є членом сімейства білків клітинної адгезії, котрий, як виявляється, відіграє певну роль у визріванні та функціонуванні нейрональних синапсів. Члени сімейства нейролігінів мають схожу структурну організацію, з N-термінальним сигнальним пептидом, 14 UA 103202 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 естеразо-подібним доменом з двома ділянками альтернативного сплайсингу, невеликою лінкерною ділянкою послідовностей з низькою ідентичністю перед трансмембранним доменом і короткою цитозольною частиною з високо консервативним C-кінцем. Найвищі відносні рівні мРНК нейролігіну 4 були виявлені у серці. Більш низька експресія була визначена в печінці, скелетних м'язах та підшлунковій залозі, в той час як у мозку, плаценті, легенях та нирках мРНК Нейролігіну 4 було важко визначити. Мутації в X- зв'язаному гені NLGN4 - потенційна причина порушень при різних видах аутизму, та є інформація щодо мутацій у декількох пацієнтів з аутизмом, синдромом Аспергера та затримкою психічного розвитку. Описано лише кілька випадків зв'язку NLGN4X з раком: Надмірна експресія NLGN4X була виявлена в стромальних пухлинах шлунково-кишкового тракту у дітей та молодих дорослих людей, в порівнянні з дорослими старшого віку. Тенасцин C (гексабрахіон) (IMA-TNC-001) Позаклітинний матрикс, що оточує клітини пухлин, відрізняється від позаклітинного матриксу в нормальних тканинах. Тенасцин-C (TNC) є білком позаклітинного матриксу, експресія якого підвищується в процесах, тісно зв'язаних з високою міграційною активністю, таких як розвиток ембріону, загоєння ран та неопластичні процеси. Крім того, TNC надмірно експресується в судинах пухлин, які мають високий проліферативний індекс, і це вказує на участь TNC в ангіогенезі новоутворень. В нормальному мозку людини експресія TNC визначається дуже рідко, в той час як в злоякісних гліомах він експресується у великій кількості. TNC-експресія може бути індукована гіпоксією, або TGF-бета1, що забезпечує механізм інвазії високозлоякісних гліом в здорову паренхиму, чи гастрином, який значною мірою модулює міграцію клітин GBM людини. Експресія TNC знижує тропоміозин-1 і таким чином дестабілізує актинові стресові волокна. Він додатково знижує експресію Wnt інгібітору Dickkopf1. Оскільки знижена експресія тропоміозину-1 та збільшена передача сигналів Wnt тісно зв'язані з трансформацією та пухлиногенезом, TNC специфічно модулює ці шляхи передачі сигналів для посилення проліферації клітин гліоми. Периваскулярне прокрашування TNC навколо кровоносних судин, які забезпечують пухлину, спостерігається в тканинах GBM, але рідше зустрічається в гліомах ступеню II і III за класифікацією МОЗ, і це означає, що інтенсивність TNC-прокрашування залежить від ступеню злоякісності пухлини; найсильніше прокрашування вказує на несприятливий прогноз. TNC також сприяє генерації ніші стволових клітин в субвентрикулярній зоні (SVZ), організуючи передачу сигналів фактору росту для прискорення розвитку нервових стволових клітин. Домінуючим ефектом TNC на клітини в SVZ є регуляція прогресування розвитку. TNC - найсильніший індуктор спрямованої міграції нервових стволових клітин (NSC) у людини. Отже, пухлиногенерований ECM (позаклітинний матрикс) створює сприятливе оточення для тропізму NSC в розсіяні пухлинні клітини. Нейрональна молекула клітинної адгезії (IMA-NRCAM-001) NRCAM (нейрональна молекула клітинної адгезії) – це нейрональна трансмембранна молекула клітинної адгезії з множинними імуноглобуліно-подібними доменами C2-типу та фібронектиновими доменами типу III. Вона бере участь в управлінні, рості та фасцикуляції нервових клітин, формуючи гомофільні, а також гетерофільні взаємодії з іншими молекулами IgCAM. Анкирін-зв'язуюча NRCAM підвищено експресується на ендотеліальних тканинах, які формують трубку, що вказує на її можливу роль у формуванні трубки та ангіогенезі. NRCAM є геном-мішенню комплексу β-катеніну та плакоглобуліну-LEF/TCF (фактору стимуляції лімфоїдних клітин/ Т-клітинного фактору), який сприяє онкогенезу. Ектодомен NRCAM може бути відділений від поверхні клітини металопротеазо-подібною активністю. Такий відділений домен здатний активувати різні шляхи передачі сигналів, посилює рухомість клітин та сприяє пухлиногенезу у мишей. NRCAM підвищено регулюється в анапластичних астроцитомах і тканинах пухлин GBM, в порівнянні з нормальним мозком, та підвищені рівні корелюються з інвазивними властивостями. Антисенсна РНК проти NRCAM зменшує пухлиногенну здатність клітин GBM у людини. мРНК- зв'язуючий білок 3 інсуліно-подібного фактору росту 2 (IMA-IGF2BP3-001) IGF2BP3 є членом сімейства білків, що зв'язують мРНК інсуліно-подібного фактору росту-II, який залучений до локалізації, оновлення і трансляційного контролю мРНК. Білок вміщує кілька KH (K-гомологічних)-доменів, які є важливими в РНК- зв'язуванні, і відомо про те, що вони беруть участь у синтезі та метаболізмі РНК. Експресія відбувається, переважно, в ході розвитку ембріону та була описана для деяких пухлин. Отже, IGF2BP3 вважається онкофетальним білком. Наявність високо транскрибованих рівнів IGF2BP3 в багатьох ракових тканинах, в порівнянні з контрольними, вказує на те, що білок IGF2BP3 може відігравати функціональну 15 UA 103202 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 роль в проліферації трансформованих клітин. Ця гіпотеза підкріплюється висновком, що єдина не злоякісна тканина людини, яка експресує транскрипт IGF2BP3, - це плацента, тканина, що характеризується ростом і проліферацією клітин. В науковій літературі немає конкретної інформації щодо експресії IGF2BP3 в GBM, але описано, що білок надмірно експресується в кількох інших злоякісних пухлинах. Наприклад, IGF2BP3 експресується в зразку пухлин у випадку світлоклітинного раку нирки, та його експресія асоціюється із запущеною стадією та ступенем первинних пухлин. Крім того, позитивна експресія IGF2BP3 асоціюється з підвищеним в 5-10 разів ризиком віддалених метастаз і на 42 %-50 % вищим ризиком смерті від раку нирки (RCС). Експресія IGF2BP3 також була визначена в злоякісній меланомі, в порівнянні з доброякісною родимкою, де експресія була відсутня, навіть у присутності диспластичних змін. У пацієнтів, хворих на плоскоклітинний рак стравоходу, T-клітини, специфічні до пептиду HLA-A*2402-обмеженого епітопу з IGF2BP3, можна було спостерігати в пухлино-інфільтруючих лімфоцитах (TIL), лімфоцитах реґіонарних лімфовузлів та лімфоцитах периферичної крові в 40 % усіх випадків. IGF2BP3 також в значній мірі експресується в карциномах підшлункової залози. В 2 дослідженнях, більше 90 % зразків тканин пухлин підшлункової залози продемонстрували експресію IGF2BP3 після імунного викрашування, в той час як тканини підшлункової залози без новоутворень були негативні на IGF2BP3. Крім того, експресія поступово збільшувалася разом із ступенем пухлини. Значне підвищення експресії IGF2BP3 також було виявлене у високо-злоякісних уротеліальних пухлинах, але він зазвичай не експресується в доброякісному уротелії або низько-злоякісних уротеліальних пухлинах. Більше того, у пацієнтів з IGF2BP3-позитивними пухлинами набагато нижча виживаність без прогресування та безрецидивна виживаність, ніж у пацієнтів з IGF2BP3-негативними пухлинами. BCAN - Бревікан (IMA-BCA-002) Бревікан (BCAN) - це мозко-специфічний член сімейства лектиканів хондроїтин-сульфатпротеогліканів. Доповідається про дві ізоформи BCAN: це повна ізоформа, яка виділяється у позаклітинний матрикс, та коротша ізоформа з послідовністю, яка прогнозує домен глікофосфатиділінозітолу (GPI). Виділена ізоформа в значній мірі експресується з народження до 8-річного віку та на момент досягнення віку в 20 років зменшується до низьких рівнів, які утримуються в нормальній корі головного мозку дорослої людини. Ізоформа GPI експресується на рівномірно низьких рівнях на протязі розвитку. BCAN належить до сімейства протеогліканів, зазвичай описуваних як бар'єрні молекули, які перешкоджають клітинній та нейритній рухомості в нервовій системі дорослих людей. In vivo, BCAN експресується навколо границь рострального міграційного потоку та є основним підвищено експресованим компонентом гліального рубця після травми нервової системи. BCAN демонструє різко підвищену регуляцію в гліомах, де може бути виявлена експресія, збільшена приблизно в сім раз в порівнянні з нормальними рівнями. Експресія визначається на інвазивних межах екпериментально індукованих пухлин та збільшується в пухлинах з високими інфільтративними профілями. Клінічно, підвищена експресія BCAN корелюється з поганою виживаністю пацієнтів з високо-злоякісними гліомами. На додаток до підвищеної експресії BCAN в гліомі, протеолітичний процесинг повномірного білку також може сприяти інвазії. Розщеплення BCAN металопротеазами сімейства ADAMTS є необхідним етапом в опосередкуванні його проінвазивного ефекту в гліомі. При генерації сайт-специфічної мутантної форми, яка є стійкою до розщеплення ADMATS, було показано, що "нерозщеплювана" форма BCAN не здатна посилювати інвазію клітин гліоми in vitro і прогресію пухлини in vivo. На молекулярному рівні, BCAN сприяє активації EGFR, збільшує експресію молекул клітинної адгезії та допомагає виділенню фібронектину. мРНК BCAN не була виявлена у зразках кори головного мозку дорослих людей, які померли без неврологічних ускладнень. Різко протилежним є той факт, що мРНК BCAN була визначена в кожному з 27 хірургічних зразків гліоми людини, і це означає, що BCAN міг би бути унікальним і селективним маркером гліоми. Підвищена активація BCAN в гліомі веде не тільки до взагалі збільшеної експресії, але й до гліомо-специфічної експресії диференційно глікозильованих ізоформ. Отже, B/bΔg є повномірним продуктом мРНК BCAN, що одержується шляхом неповного чи скороченого глікозилювання корового білку. B/bΔg експресується на дуже низьких рівнях протягом другої половини пренатального розвитку та в перші дні постнатального розвитку, зникає до виповнення одного року дитини та відсутній в нормальному мозку здорової людини, але визначається у зразках високо-злоякісної гліоми. В одному з досліджень продемонстрована присутність B/bΔg в кожному зразку високо-злоякісної гліоми ступеню 3 і 4; крім того, він являвся 16 UA 103202 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 причиною підвищення наполовину загальної надмірної експресії вище контрольних рівнів для нерозщепленого BCAN. Зразки, негативні до B/bΔg, відносилися до пацієнтів, у яких були діагностовані низько-злоякісні пухлини. Таким чином, ця експресія, специфічна до високозлоякісної гліоми, може представляти реактивацію ранніх програм розвитку, тобто, механізм, що зв'язаний із прогресуванням гліом. IMA-BCA-002 вміщує потенційну ділянку глікозилювання в межах своєї послідовності. Виявилося, що він в значній мірі імуногенний в порівнянні з іншим пептидом, який походить з BCAN (IMA-BCA-001), без ділянки глікозилювання. Крім того, описана селективна надмірна експресія BCAN в типі стовбурових клітин пухлин, одержаних з гліобластом, що демонструє найвищу плюріпотентність та онкогенність in vivo. Протоонкоген Met (рецептор фактору росту гепатоцитів) (IMA-MET-005) MET-протоонкоген c-Met кодує трансмембранний тирозин-кіназний рецептор, який має здатність модулювати проліферацію, диференціацію, рухливість, адгезію та інвазію клітин. Він активується фактором росту гепатоцитів (HGF). Передача сигналів c-Met бере участь в регенерації органів – як було продемонстровано для печінки та нирок, в ембріогенезі, гематопоезі, розвитку м'язів, а також в регулюванні міграції та адгезії зазвичай активованих B-клітин та моноцитів. Дослідження різних типів пухлин продемонстрували декілька механізмів активації c-Met, включаючи аутокринну петлю HGF/c-Met, активуючу точкові мутації, гібридний білок TPR-Met, а також нездатність розділити c-Met на α- та β-ланцюги. Конститутивна c-Met- активація шляхом фосфорилювання також виявилася важливим механізмом онкогенезу у випадках світлоклітинного раку нирки у людей. Крім того, багато досліджень вказують на участь надмірної експресії c-Met в злоякісній трансформації та інвазивності ракових клітин. c-Met сприяє багатофункціональній та потенційно онкогенній діяльності HGF. Зв'язуючись з рецептором, HGF індукує аутофосфорилювання c-Met та активує передачу сигналів по низхідній, включаючи шляхи, які відносяться до ras, фосфатидилінозітол- 3’-кінази, фосфоліпази C та активованої мітогенами протеїнкінази. Ген cMet експресується, переважно, в епітеліальних клітинах, та його надмірна експресія спостерігається в декількох злоякісних тканинах та клітинних лініях. Надмірна експресія c-Met, що часто індукується гіпоксією пухлини, призводить до конститутивної активації рецептору і корелюється з несприятливим прогнозом. Відключення ендогенного гену c-MET призводить до порушення виконання повної програми інвазивного росту in vitro, відсутності росту пухлини та зменшеному утворенню метастаз експерименту in vivo. Була описана надмірна експресія c-MET в GBM. c-Met корелюється зі ступенем гістологічної диференціації пухлини, що наводить на думку про утворення аутокринної петлі HGF/c-MET, а також прогресування астроцитарних пухлин мозку. Отже, HGF може проявляти дуже високу активність, що викликає міграцію/інвазію клітин GBM, які мають рецептор c-Met. Промотор c-Met вміщує ділянки зв'язування фактору-1, котрі індукуються гіпоксією, і було показано, що гіпоксія активує промотор c-Met та підвищує його експресію. Вважається, що приблизно половина з усіх GBM людини реагують на гіпоксію індукуванням c-Met, що може посилити стимулюючий вплив HGF на міграцію клітин пухлин та притягнути нервові стовбурові клітини до пухлини. c-Met та EGFR часто спільно експресуються в злоякісній астроцитомі. Було показано, що активізація ділянки фосфорилювання на рецепторі c-Met в значній мірі чутлива до рівнів EGFRvIII, що наводить на думку про взаємний вплив EGFRvIII та рецептору c-Met в гліобластомі. MET вважається маркером ракових стовбурових клітин в GBM. Ще одне дослідження показало селективну надмірну експресію MET в певному підтипі ракових стовбурових клітин, одержаних з GBM. Проміжні результати дослідження фази II серед пацієнтів з рецидивом GBM, із використанням AMG102, нейтралізуючого антитіла людини до HGF, наводять на думку, що у деяких пацієнтів захворювання може залежати від шляху передачі сигналів c-MET:HGF, оскільки з 18 пацієнтів, які проходили лікування, у 1 пацієнта спостерігалася часткова реакція, 1 пацієнт продемонстрував слабку реакцію, а у 2 пацієнтів захворювання було стабільним. Цікавим є факт існування певних доказів взаємодії передачі сигналів MET з Wnt/бетакатеніновим шляхом, що часто посилений у випадках раку товстої кишки. MET може активуватися Простагландином E2 (PGE2), і PGE2-активований c-Met асоціюється з β-катеніном та підвищує фосфорилювання тирозину, таким чином індукуючи інвазивність клітин колоректального раку. Останнім часом, була описана взаємна активація MET і бета-катеніну, що призводить до формування позитивного зворотнього зв'язку між цими двома ключовими учасниками колоректального пухлиногенезу. 17 UA 103202 C2 5 10 Рівень експресії мРНК c-Met в первинних пухлинах CRC (n=36) є важливим прогностичним маркером для інвазії на ранніх стадіях та регіонального метастазування, встановлюючи пряме співвідношення зі стадією колоректального раку. Інший аналіз експресії c-Met в 130 зразках CRC показав надмірну експресію (T/N > 2.0) c-Met в 69 % первинних CRC та значно вищі рівні c-Met в CRC з інвазією в кровоносні судини (P=0.04) та на запущеній стадії (P=0.04), що підтверджує роль c-Met в прогресуванні CRC та поширенні метастаз у людей. Ще в одному дослідженні 69 % та 48 % з 60 аденокарцином товстої кишки показали, відповідно, більші ніж в 2 рази та в 10 раз рівні мРНК c-Met, в порівнянні з суміжною нормальною слизовою оболонкою. Отже, підвищення сигналу c-Met є типовим на ранніх стадіях CRC, з навіть більшим вираженням в запущених випадках хвороби та при метастазуванні. Таблиця 4 Додаткові імуногенні пептиди, доцільні в композиції винаходу Ід.№ послідовності 9 10 11 PTP-003 PTP-005 CHI-001 AIIDGVESV KVFAGIPTV SLWAGVVVL PTPRZ1 PTPRZ1 CHI3L2 12 BIR-002 TLGEFLKLDRERAKN BIRC5 13 FLPSDFFPSV 16 (HBV-001) CDC42001 CDC42002 SPP1-001 17 18 19 20 14 15 15 20 25 30 35 Ід.номер пептиду Послідовність Символ гену Функція Зв'язується з MHC HLA-A*02 HLA-A*02 HLA-A*02 HLA-DR та HLA-A*02 контрольний пептид DDPSTIEKLAKNKQKP CDC42 HLA-DR NKQKPITPETAEKLARD CDC42 HLA-DR NGAYKAIPVAQDLNAPS SPP1 BIR-002a TLGEFLKLDRERAKD Сурвівін BIR-002b BIR-002c BIR-002d FTELTLGEF LMLGEFLKL EPDLAQCFY Сурвівін Сурвівін Сурвівін HLA-DR HLA-DR та HLA-A*02 HLA-A1 HLA-A2 HLA-B35 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 та SEQ ID NO: 16 розкриті в патенті WO 2007/028574, CDC42 (цикл клітинного ділення 42) – це білок, який бере участь в регуляції клітинного циклу. Була виявлена дуже висока експресія білку малої GTPase підсімейства Rho, що регулює шляхи передачі сигналів, які контролюють різні клітинні функції, включаючи морфологію, міграцію, ендоцитоз клітин та хід клітинного циклу. Також був визначений дуже високий рівень надмірної експресії CDC42 в гліобластомі. В патенті WO 2004/067023 описуються пептиди, обмежені MHC класу I, що були одержані з сурвівіну пухлино-асоційованих антигенів, та мають здатність зв'язуватися з молекулами HLA класу І з високою афінністю. Фосфопротеїн 1 (SPP1), що секретується, також відомий як кістковий сіало-протеїн I (BSP1), ранній активатор Т-лімфоцитів (ETA-1) та найчастіше "остеопонтін" (OPN), є продуктом гена людини, котрий також є консервативним у інших видів. Остеопонтін вважається важливим фактором в ремоделюванні кісток. Зокрема, дослідження підказують його роль в закріпленні остеокластів на мінеральному матриксі кісток. Органічна частина кістки становить близько 20 % сухої ваги та включає, крім остеопонтіну, колаген типу I, остеокальцин, остеонектін, кістковий сіало-протеїн та алкалін-фосфатазу. Колаген типу I становить 90 % маси білку. OPN зв'язується з кількома інтегриновими рецепторами, включаючи α4β1, α9β1 та α9β4, що експресуються лейкоцитами. Ці рецептори добре відомі відносно їхніх функцій в адгезії, міграції клітин та виживання в цих клітинах. Отже, програми досліджень зосереджуються на ролі OPN як посередника в цих реакціях. Остеопонтін експресується в ряді імунних клітин, включаючи макрофаги, нейтрофіли, дендритні клітини, T- та B-клітини, з варіабельною кінетикою. Є інформація про те, що OPN різними способами діє як імунний модулятор. По-перше, він має хемотактичні властивості, які сприяють мобілізації клітин на запальні ділянки. Він також функціонує як адгезивний білок, який 18 UA 103202 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бере участь у поєднанні клітин та загоєнні ран. До того ж, OPN сприяє активації клітин та продукуванню цитокінів, а також виживанню клітин, шляхом регуляції апоптозу. Активовані Т-клітини диференціюють у Th1-тип під впливом IL-12 та продукують цитокіни, включаючи IL-12 та IFNγ. OPN інгібує продукування Th2 цитокіну IL-10, що призводить до посиленої реакції Th1. OPN впливає на клітинно-опосередковану імунність та має Th1- цитокінні функції. Він збільшує продукування імуноглобулінів та проліферацію В-клітин. Недавні дослідження, проведені в 2008, наводять на думку, що OPN також індукує дегрануляцію мастоцитів. [Nagasaka A, Matsue H, Matsushima H, et al. (February 2008). "Osteopontin is produced by mast cells and affects IgE-mediated degranulation and migration of mast cells". Eur. J. Immunol. 38 (2): 489-99]. Вчені виявили, що IgE-опосередкована анафілаксія була значно знижена у OPNнокаутованих мишей, в порівнянні з мишами дикого типу. Роль OPN в активації макрофагів також була визначена в дослідженні раку, коли вчені виявили, що OPN-продукуючі пухлини здатні індукувати активацію макрофагів, в порівнянні з пухлинами, які не синтезували OPN [21]. OPN є важливим анті-апоптотичним фактором в багатьох обставинах. OPN блокує активаційно-індуковану загибель макрофагів і Т-клітин, а також фібробластів та ендотеліальних клітин, що піддаються впливу шкідливих факторів. OPN перешкоджає незапрограмованій загибелі клітин при запальному коліті. Той факт, що OPN взаємодіє з великою кількістю рецепторів на поверхні клітин і ці рецептори зустрічаються повсюдно, робить його активним учасником багатьох фізіологічних і патологічних процесів, включаючи загоєння ран, ремоделювання кісток, пухлиногенез, запалення, ішемію та імунні відповіді. Отже, маніпулювання рівнями OPN в плазмі може бути корисним в лікуванні аутоімунних захворювань, метастаз раку, остеопорозу та деяких форм стресу. Було показано, що OPN є чинником продукування IL-17; OPN надмірно експресується в різних видах ракових захворювань, включаючи рак легенів, рак молочної залози, колоректальний рак, рак шлунку, рак яєчників, меланому та мезотеліому; OPN сприяє як гломерулонефриту, так і тубулоінтерстиціальному нефриту; крім того, OPN виявлений в атеросклеротичних бляшках в артеріях. Таким чином, маніпулювання рівнями OPN в плазмі може бути корисним в лікуванні аутоімунних захворювань, метастаз раку, остеопорозу та деяких форм стресу. Рецепторо-подібна протеїн тирозин-фосфатаза, Zeta1 (PTPRZ1, PTP-ξ) PTPRZ1 є членом сімейства рецепторо-подібних протеїн тирозин-фосфатаз та кодує однопрохідний мембранний білок типу I з двома цитоплазматичними тирозин-протеїнфосфатазними доменами, доменом альфа-карбонової ангідрази та фібронектиновим доменом типу III. Експресія цього гену індукується в клітинах пухлин шлунку, пухлин молочної залози, в ремієльованих олігодендроцитах ушкоджень внаслідок множинного склерозу та та в клітинах нирки ембріону людини в умовах гіпоксії. І білок, і транскрипт надмірно експресуються в клітинах гліобластоми, сприяючи їхній гаптотактичній міграції, та геномній ДНК-ампліфікації в гліобластомі. Хітіназа 3-подібна 2 (CHI3L2) CHI3L2 була спочатку ідентифікована з хондроцитів та має підвищену експресію, наприклад, при остеоартриті. Хоча білок ще недостатньо добре характеризований, він, найвірогідніше, виділяється в екстрацелюлярний простір. Він часто описувався як антиген-мішень в ревматоїдному артриті. Експериментальна анти-ангіогенезна індукція трансфекцією siРНК (VEGF-A) клітинної лінії гліоми людини викликала підвищену регуляцію CHI3L2. Сурвівін (BIRC5) Експресія BIRC5 (сурвівіну), члена сімейства білків-інгібіторів апоптозу (IAP), підвищена в фетальних тканинах та в різних видах ракових захворювань людини. Передбачається, що сурвівін здатний регулювати клітинну проліферацію та загибель апоптотичних клітин. Дуже високі рівні експресії сурвівіну визначаються, зокрема, в гліобластомі. Існує думка, що надмірна експресія сурвівіну в гліомах мозку може грати важливу роль в злоякісній проліферації, анти апоптозі та ангіогенезі. Зокрема, для гліобластоми, але також і для інших пухлинних об'єктів, експресія сурвівіну була в значній мірі асоційована зі ступенем злоякісності (з найбільшою експресією сурвівіну в гліобластомі) та більш короткою загальною виживаністю в порівнянні з пацієнтами з сурвівін-негативними пухлинами. Коровий антиген вірусу Гепатиту B Імуногенні пептиди для корового білку HBc вірусу Гепатиту B (HBV) є добре відомими. Пептид з десяти амінокислот з HBc може бути обраний як позитивний контроль для визначення імунокомпетентності пацієнта та успішної вакцинації з використанням протиракових вакцин на основі цього винаходу. 19 UA 103202 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В переважному втіленні винаходу, фармацевтична композиція вміщує принаймні два пептиди, що включають амінокислотну послідовність відповідно до SEQ ID NO: 1 та амінокислотну послідовність відповідно до SEQ ID NO: 12 чи SEQ ID NO: 17. В переважному втіленні винаходу, фармацевтична композиція вміщує принаймні два пептиди, що включають амінокислотну послідовність відповідно до SEQ ID NO: 1 та амінокислотну послідовність відповідно до SEQ ID NO: 2 та/або SEQ ID NO: 17. В переважному втіленні винаходу, фармацевтична композиція вміщує принаймні два пептиди, що включають амінокислотну послідовність відповідно до SEQ ID NO SEQ ID NO: 3 та амінокислотну послідовність відповідно до SEQ ID NO: 2 та/або SEQ ID NO: 17. В переважному втіленні винаходу, фармацевтична композиція вміщує принаймні два пептиди, що включають амінокислотну послідовність відповідно до SEQ ID NO SEQ ID NO: 1 та амінокислотну послідовність відповідно до SEQ ID NO: 7 і додатково SEQ ID NO: 17. В переважному втіленні винаходу, фармацевтична композиція вміщує принаймні два пептиди, що включають амінокислотну послідовність відповідно до SEQ ID NO SEQ ID NO: 2 та амінокислотну послідовність відповідно до SEQ ID NO: 7 і додатково SEQ ID NO: 17. В переважному втіленні винаходу, фармацевтична композиція вміщує принаймні два пептиди, що включають амінокислотну послідовність відповідно до SEQ ID NO SEQ ID NO: 3 та амінокислотну послідовність відповідно до SEQ ID NO: 7 і додатково SEQ ID NO: 17. В ще більш переважному втіленні фармацевтична композиція вміщує принаймні ще один пептид, який включає амінокислотну послідовність, обрану з групи, що складається з послідовностей від SEQ ID NO: 2 до SEQ ID NO: 11 та від SEQ ID NO: 14 до SEQ IDNO: 20 та/або амінокислотну послідовність, котра є принаймні на 80 % ідентичною послідовності від SEQ ID NO: 2 до SEQ ID NO: 11 або від SEQ ID NO: 14 до SEQ ID NO: 20, та/або полінуклеотид, що вміщує нуклеїнову кислоту, яка кодує послідовності SEQ ID NO: 2 - SEQ ID NO: 11 або послідовності SEQ ID NO: 14 - SEQ ID NO: 20 чи варіант амінокислотної послідовності, та фармацевтично прийнятний носій. Інші переважні втілення винаходу вміщують принаймні 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 12, 13, 14, 15, 16, 17 або 18 пептидів, які включають амінокислотну послідовність, обрану з групи, що складається з послідовностей від SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO: 12 та від SEQ ID NO: 14 до SEQ ID NO: 20 та/або амінокислотну послідовність, яка є принаймні на 80 % ідентичною послідовності від SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO: 12 та/або полінуклеотид, що вміщує нуклеїнову кислоту, яка кодує послідовності SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 12 та SEQ ID NO: 14 - SEQ ID NO: 20 чи варіант амінокислотної послідовності, та фармацевтично прийнятний носій. Фармацевтична композиція може, крім того, вміщувати додаткові пептиди та/або наповнювачі для збільшення ефективности, як пояснюється нижче. Під терміном "варіант" даної амінокислотної послідовності автори винаходу мають на увазі, що бокові ланцюжки, наприклад, одного чи двох амінокислотних залишків змінюються (зокрема, шляхом заміни їх боковим ланцюжком іншого природно існуючого амінокислотного залишку чи якимось іншим боковим ланцюжком) таким чином, що пептид все ще здатний зв'язуватися з молекулою HLA, по суті, в такий же спосіб, як і пептид, що складається з даної амінокислотної послідовності. Наприклад, пептид може бути модифікований так, що він буде якнайменше зберігати, чи навіть поліпшувати, здатність взаємодіяти та зв'язуватися з прийнятною молекулою MHC, такою як HLA-A або -DR, та якнайменше зберігати, чи навіть поліпшувати, здатність генерувати активовані CTL, що можуть розпізнавати та знищувати клітини, котрі експресують поліпептид, вміщуючий амінокислотну послідовність, як визначено в аспектах винаходу. Як можна дізнатися з бази даних, окремі позиції пептидів, що зв'язуються з HLA-A, є типово якірними залишками, формуючими ключову послідовність, яка відповідає мотиву зв'язку ділянки зв'язування HLA. Ті амінокислотні залишки, що не суттєвими для взаємодії з T-клітинним рецептором, можуть бути модифіковані шляхом заміни іншою амінокислотою, введення якої не має значного впливу на реактивність Т-клітин та не виключає зв'язування із відповідним МНC. Отже, за винятком зазначеної умови, пептид винаходу може бути будь-яким пептидом (до цього терміну автори винаходу відносять олігопептид чи поліпептид), котрий включає амінокислотні послідовності або їхню частину чи варіант, що надається. Крім того, стосовно МНС-презентуючих пептидів (класу II) відомо, що ці пептиди складаються з "ключової послідовності", яка має певний HLA-специфічний амінокислотний мотив та, додатково, N- та/або C-термінальні подовження, які не втручаються у функцію ключової послідовності (тобто, вважаються не релевантними до взаємодії пептиду і T-клітини). N- та/або C-термінальні подовження можуть мати довжину, наприклад, від 1 до 10 амінокислот, відповідно. Ці пептиди можуть використовуватись безпосередньо для завантаження MHC 20 UA 103202 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 молекул класу II, або послідовність може клонуватись у вектори, згідно із наведеним нижче описом. Оскільки ці пептиди формують кінцевий продукт обробки більш крупних пептидів в межах клітини, також можуть використовуватися довші пептиди. Пептиди винаходу можуть мати будь-який розмір, але, як правило, вони можуть бути меншими, ніж 100 000, за молекулярною вагою, переважно, меншими, ніж 50 000, ще більш переважно меншими, ніж 10 000, більш переважно меншими, ніж 5 000, більш переважно меншими, ніж 2500 та, зазвичай, приблизно дорівнюючими приблизно від 1000 до 2000. Стосовно кількості амінокислотних залишків, пептиди винаходу можуть мати менше 1000 залишків, переважно менше, ніж 500 залишків, і ще більш переважно - менше 100 залишків. Відповідно, цей винахід також надає композиції пептидів та їхні варіанти, в яких пептид чи варіант має загальну довжину від 8 до 100, переважно від 8 до 30, та найбільш переважно від 8 та 17, а саме, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 або 16 амінокислот. Переважними є пептиди з ключовою послідовністю, обраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12 та SEQ ID NO: 14 - SEQ ID NO: 20 з подовженнями від 1 до 10 амінокислот на C-кінці та/або N-кінці, більш переважною є загальна довжина цих бокових амінокислот від 1 до 12, більш переважною – від 1 до 10, більш переважною – від 1 до 8, і ще більш переважною від 1 до 6, де бокові амінокислоти можуть розподілятися в будь-якому співвідношенні на C-кінці та N-кінці (наприклад, усі бокові амінокислоти можуть додаватися до одного кінця, чи амінокислоти можуть додаватися в рівних кількостях до обох кінців, чи в будьякому іншому співвідношенні), за умови, що пептид зберігає здатність зв'язуватися з молекулою HLA в такий же спосіб, як і зазначений пептид, відповідно до будь-якої з послідовностей SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12 та SEQ ID NO: 14 - SEQ ID NO: 20. Відповідно, варіанти, що індукують перехресне реагування T-клітин з пептидом винаходу, часто є варіантами з різною довжиною. Якщо пептид, більший, ніж приблизно 12 амінокислотних залишків, використовується безпосередньо для зв'язування з молекулою MHC класу II, переважно, щоб залишки, розташовані по краях основної ділянки зв'язування HLA, не мали значного впливу на здатність пептиду специфічно зв'язуватися з порожниною зв'язування MHC-молекули класу ІІ чи презентувати пептид в CTL. Однак, як вже зазначалося вище, перевага надається використанню більш крупних пептидів, особливо, коли вони кодуються полінуклеотидом, оскільки ці більш крупні пептиди можуть розділятися на частини відповідними антигенпрезентуючими клітинами. Крім того, фланкуючі амінокислоти також можуть зменшувати швидкість пептидної деструкції іn vivo, отже, кількість фактичного пептиду, доступного для CTL, є вищою, в порівнянні з пептидом без фланкуючих амінокислот. Також можливо, щоб епітопи MHC класу I, хоча вони мають, зазвичай, довжину 8-10 амінокислот, утворювались шляхом процесингу пептидів з більш довгих пептидів чи білків, які включають фактичний епітоп. Подібно епітопам MHC класу II, бажано, щоб бокові залишки подовжених прекурсорних пептидів по висхідній та/або по низхідній N- та C-кінця фактичного епітопу не завдавали значного впливу презентуванню пептиду в CTL та не маскували сайти протеолітичного розпаду, необхідного для утворення фактичного епітопу, опосередкованого процесингом подовженого пептиду. Переважними є пептиди з ключовою послідовністю, що складається з послідовностей SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 7 та SEQ ID NO: 9-SEQ ID NO: 11 з подовженнями від 1 до 10 амінокислот на C-кінці та/або N-кінці, більш переважною є загальна довжина цих фланкуючих амінокислот від 1 до 12, більш переважною - від 1 до 10, більш переважною - від 1 до 8, і ще більш переважною від 1 до 6, де фланкуючі амінокислоти можуть розподілятися в будь-якому співвідношенні на C-кінці та N-кінці (наприклад, усі бокові амінокислоти можуть додаватися до одного кінця, чи амінокислоти можуть додаватися в рівних кількостях до обох кінців, чи в будьякому іншому співвідношенні), за умови, що пептид зберігає здатність зв'язуватися з молекулою HLA в такий же спосіб, як і зазначений пептид, відповідно до будь-якої з послідовностей SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 7 та SEQ ID NO: 9 - SEQ ID NO: 11. Відповідно, цей винахід також пропонує пептиди та варіанти епітопів MHC класу I, які мають загальну довжину від 8 до 100, переважно від 8 до 30, та найбільш переважно від 8 до 18, а саме, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 або 17 амінокислот. Звичайно, пептид чи варіант, відповідно до цього винаходу, матимуть здатність зв'язуватися з молекулою MHC класу I чи II людини. Зв'язування пептиду чи варіанту з MHC-комплексом може бути перевірене за допомогою методів, добре відомих в цій галузі, наприклад, описаних в прикладах цього винаходу нижче або в довідковій літературі для різних алелей MHC класу II (наприклад, в роботах Vogt AB, Kropshofer H, Kalbacher H, Kalbus M, Rammensee HG, Coligan JE, Martin R; Ligand motifs of HLA-DRB5*0101 and DRB1*1501 molecules delineated from selfpeptides; J Immunol. 1994; 153(4):1665-1673; Malcherek G, Gnau V, Stevanovic S, Rammensee HG, 21 UA 103202 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Jung G, Melms A; Analysis of allele-specific contact sites of natural HLA-DR17 ligands; J Immunol. 1994; 153(3):1141-1149; Manici S, Sturniolo T, Imro MA, Hammer J, Sinigaglia F, Noppen C, Spagnoli G, Mazzi B, Bellone M, Dellabona P, Protti MP; Melanoma cells present a MAGE-3 epitope to CD4(+) cytotoxic T cells in association with histocompatibility leukocyte antigen DR11; J Exp Med. 1999; 189(5): 871-876; Hammer J, Gallazzi F, Bono E, Karr RW, Guenot J, Valsasnini P, Nagy ZA, Sinigaglia F; Peptide binding specificity of HLA-DR4 molecules: correlation with rheumatoid arthritis association;.J Exp Med. 1995 181(5):1847-1855; Tompkins SM, Rota PA, Moore JC, Jensen PE; A europium fluoroimmunoassay for measuring binding of antigen to class II MHC glycoproteins; J Immunol Methods. 1993;163(2): 209-216; Boyton RJ, Lohmann T, Londei M, Kalbacher H, Halder T, Frater AJ, Douek DC, Leslie DG, Flavell RA, Altmann DM; Glutamic acid decarboxylase T lymphocyte responses associated with susceptibility or resistance to type I diabetes: analysis in disease discordant human twins, non-obese diabetic mice and HLA-DQ transgenic mice; Int Immunol. 1998 (12):1765-1776). Додаткові N- та/або C-термінальні ділянки амінокислот, які не обов'язково формують частину пептиду, що функціонує як фактичний епітоп для молекул MHC, все ж таки можуть бути важливими для забезпечення ефективного введення пептиду, відповідно до цього винаходу, в клітини (див. вище). В одному з втілень цього винаходу, пептид цього винаходу є гібридним білком, який вміщує, наприклад, 80 N-термінальних амінокислот HLA-DR-антиген-асоційованого інваріантного ланцюгу (p33, надалі "Ii"), одержаного з NCBI, інвентарний номер в генному банку (GenBank) X00497 (Strubin, M., Mach, B. and Long, E.O. The complete sequence of the mRNA for the HLA-DR-associated invariant chain reveals a polypeptide with an unusual transmembrane polarity EMBO J. 3 (4), 869-872 (1984)). Переважними є фармацевтичні композиції, в яких пептиди мають загальну довжину від 8 до 100, переважно від 8 до 30 та більш переважно від 8 до 17 або 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 чи 16 амінокислот. Крім того, пептид чи варіант може бути додатково модифікований для поліпшення його стабільності та/або зв'язку із молекулами MHC, щоб викликати сильнішу імунну реакцію. Методи для такої оптимізації пептидної послідовності добре відомі в цій галузі та включають, наприклад, введення реверсованих пептидних зв'язків чи непептидних зв'язків. Таким чином, відповідно до іншого аспекту, винахід надає фармацевтичну композицію, в якій принаймні один пептид чи варіант включає непептидні зв'язки. В реверсованому пептидному зв'язку амінокислотні залишки не з'єднуються пептидними зв'язками (-CO-NH-), а пептидний зв'язок реверсується. Такі ретро-інверсивні пептидні міметики можуть вироблятися за методами, відомими в даній галузі, наприклад, описаними в роботі Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237, яка включена в даний документ шляхом посилання. Такий підхід включає формування псевдо-пептидів, які вміщують зміни із залученням основи, а не орієнтації бокових ланцюгів. Автори Meziere et al. (1997) показують, що для реакцій клітин MHC і T-клітин- хелперів зазначені псевдо-пептиди є прийнятними. Ретроінверсивні пептиди, які вміщують зв'язки NH-CO замість пептидних зв'язків CO-NH, набагато більш стійкі до протеолізу. Непептидний зв'язок - це, наприклад, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, CH(OH)CH2-, та -CH2SO-. Патент США 4,897,445 пропонує метод твердофазного синтезу непептидних зв'язків (-CH2-NH) в поліпептидних ланцюгах, що включає поліпептиди, синтезовані за допомогою стандартних процедур, та непептидний зв'язок, синтезований шляхом реакції аміноальдегіду та амінокислоти в присутності NaCNBH3. Пептиди, що включають послідовності, описані вище, можуть бути синтезовані з додатковими хімічними групами, присутніми на їхніх аміно- та/або карбоксильних кінцях, зокрема, для посилення стабільності, біологічної доступності та/або афінності пептидів. Наприклад, гідрофобні групи, такі як карбобензоксильні, данзильні чи t-бутилоксикарбонільні групи можуть додаватися до аміно-кінців пептидів. Подібним чином, на аміно-кінцях пептидів може розміщуватись ацетильна група чи 9-фторенілметокси-карбонільна група. До карбоксильних кінців пептидів може бути додана також, наприклад, гідрофобна група, tбутилоксикарбонільна чи амідо-група. Крім того, усі пептиди винаходу можуть бути синтезовані для зміни їхньої стеричної конфігурації. Наприклад, може використовуватися D-ізомер одного чи кількох амінокислотних залишків пептиду, а не звичайний L-ізомер. До того ж, принаймні один з амінокислотних залишків пептидів винаходу може замінюватись одним з добре відомих амінокислотних залишків не природного походження. Такі заміни можуть служити для підвищення стабільності, біологічної доступності та/або функції зв'язування пептидів винаходу. 22 UA 103202 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Подібним чином, пептид чи варіант винаходу може модифікуватися хімічно, шляхом реакції окремих амінокислот до чи після синтезу пептиду. Приклади таких модифікацій добре відомі в цій галузі та узагальнені, зокрема, в роботі R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005, яка включена в цей документ шляхом посилання. Хімічна модифікація амінокислот включає, без обмежень, модифікацію шляхом ацилювання, амідинування, піридоксилювання лізину, відновлювального алкілювання, тринітробензилювання аміногруп 2,4,6-тринітробензол-сульфоновою кислотою (TNBS), амідну модифікацію карбоксильних груп та сульфгідрильну модифікацію шляхом окиснення цистеїну надмурашиною кислотою в цистеїнову кислоту, формування похідних ртуті, утворення змішаних дисульфідів з іншими тіольними сполуками, реакцію з імідом малеїнової кислоти, карбоксиметилювання йодооцтовою кислотою чи йодоацетамідом та карбамоїлування цианатом при лужному pH, хоча способи модифікації не обмежуються наведеними тут. В цьому відношенні, досвідчений спеціаліст повинен звернутися до Глави 15 роботи Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2000), де викладена детальна методика відносно хімічної модифікації білків. Успішна модифікація PEG (поліетиленгліколем) терапевтичних білків та пептидів, що часто асоціюється з подовженням напів-періоду циркуляції при перехресному зшиванні білків з глютаральдегідом, поліетиленгліколь-діакрилатом та формальдегідом, використовується для приготування гідрогелів. Хімічна модифікація алергенів для імунотерапії часто досягається шляхом карбамоїлування з ціанатом калію. В цілому, пептиди та варіанти (принаймні, ті, що вміщують пептидні зв'язки між амінокислотними залишками) можуть бути синтезовані, наприклад, із використанням Fmocполіамідного способу синтезу пептидів твердої фази, як розкривається в роботі Lu et al (1981) J. Org. Chem. 46, 3433, та посиланнях на літературні джерела, наведених в ній. Очищення може виконуватися за допомогою будь-якого одного чи кількох методів, таких як рекристалізація, гель-хроматографія, іонообмінна хроматографія, хроматографія гідрофобної взаємодії та (зазвичай) зворотно-фазна високоефективна рідинна хроматографія із градієнтним розділенням, наприклад, ацетонітріл/ вода. Аналіз пептидів може виконуватися за допомогою тонкошарової хроматографії, електрофорезу, зокрема, капілярного електрофорезу, твердофазної екстракції (CSPE), зворотно-фазної високоефективної рідинної хроматографії, амінокислотного аналізу після гідролізу кислот та мас-спектрометричного аналізу аналізу із бомбардуванням прискореними атомами (FAB), а також мас-спектрометричного аналізу MALDI та ESI-Q-TOF. Ще один аспект винаходу пропонує нуклеїнову кислоту (наприклад, полінуклеотид), що кодує пептид чи варіант винаходу. Полінуклеотид, наприклад, може бути ДНК, кДНК, ПНК, СНК, РНК, чи їхньою комбінацією, одно- та/або двонитковою, природними чи стабілізованими формами полінуклеотидів, такими як, наприклад, полінуклеотиди з фосфоротіатним скелетом; він може вміщувати або не вміщувати інтрони, за умови, що полінуклеотид кодує пептид. Звичайно, тільки ті пептиди, що вміщують природно існуючі амінокислотні залишки, з'єднані природними пептидними зв'язками, кодуються полінуклеотидом. Інший аспект винаходу пропонує вектор експресії, здатний експресувати поліпептид, відповідно до винаходу. Вектори експресії для різних типів клітин добре відомі в цій галузі та можуть бути обрані без неналежного експериментування. В цілому, ДНК вводиться у вектор експресії, такий як плазміда, в належній орієнтації та з відповідною рамкою зчитування для експресії. При необхідності, ДНК може зв'язуватися з належними нуклеотидними послідовностями транскрипційного і трансляційного регуляторного контролю, що розпізнаються бажаним хазяїном, хоча такі контрольні елементи взагалі є доступними у векторі експресії. Вектор згодом вводиться хазяїну із використанням стандартних методик. За рекомендаціями ви можете звернутись, наприклад, до роботи Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Разом із тим, фармацевтична композиція в особливо переважному втіленні винаходу вміщує принаймні два пептиди, які включають амінокислотні послідовності відповідно до SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 12. Оптимальну кількість кожного пептиду, що включається у вакцину, та оптимальний режим дозування може визначити досвідчений спеціаліст без неналежного експериментування. Наприклад, пептид чи його варіант може бути підготовлений для внутрішньовенного (i.v.) введення, підшкірного (s.c.) введення, інтрадермального (i.d.) введення, внутрішньочеревного (i.p.) введення, внутрішньом'язового (i.m.) введення. Переважні способи введення пептиду - це s.c., i.d., i.p., i.m. та i.v. Переважними способами введення ДНК є i.d., i.m., s.c., i.p. та i.v. Можуть вводитись, наприклад, дози від 1 до 500 мг, 50 мкг та 1.5 мг, переважно від 125 мкг до 500 мкг, 23 UA 103202 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 пептиду чи ДНК, залежно від відповідного пептиду чи ДНК. Дози в цьому діапазоні успішно використовувались в попередніх дослідженнях (Brunsvig PF, Aamdal S, Gjertsen MK, Kvalheim G, Markowski-Grimsrud CJ, Sve I, Dyrhaug M, Trachsel S, Møller M, Eriksen JA, Gaudernack G;. Telomerase peptide vaccination: a phase I/II study in patients with non-small cell lung cancer; Cancer Immunol Immunother. 2006; 55(12):1553-1564; M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901, ASCO meeting 2007; Abstract No 3017). Фармацевтична композиція винаходу може бути складена таким чином, щоб вибір, число та/або кількість пептидів, присутніх у композиції, були специфічними для тканин, ракових захворювань та/або окремих пацієнтів. Наприклад, точний вибір пептидів може керуватися профілями експресії вихідних білків в даній тканині, щоб уникнути побічних ефектів. Вибір може залежати від специфічного виду раку, на який хворіє пацієнт, що проходить лікування, а також стану захворювання, попередніх режимів лікування, імунного статусу пацієнта і, звичайно, HLAгаплотипу пацієнта. Крім того, вакцина, згідно із винаходом, може вміщувати індивідуалізовані компоненти, відповідно до особистих потреб конкретного пацієнта. Прикладами є різні кількості пептидів, згідно із експресією відповідних TAA у конкретного пацієнта, небажаними побічними ефектами внаслідок особистої алергії чи інших режимів лікування, а також корегування для другого курсу після проходження першого циклу чи курсу лікування. Для того, щоб, наприклад, композиція використовувалася як вакцина проти GBM, пептиди, вихідні білки яких експресуються у великих кількостях в нормальних тканинах, уникаються в композиції винаходу чи присутні в невеликих кількостях. З іншої сторони, коли відомо, що пухлина пацієнта експресує великі кількості окремого білку, відповідна фармацевтична композиція для лікування цього випадку раку може презентуватися у великих кількостях, та/або може включатися більш ніж один пептид, специфічний для цього конкретного білку чи його шляху передачі сигналів. Досвідчений фахівець зможе обрати переважні комбінації імуногенних пептидів шляхом тестування, наприклад, генерації T-клітин in vitro, а також їхньої ефективності та загальної присутності, проліферації, афінності та розмноження окремих T-клітин для певних пептидів, і функціональності T-клітин, наприклад, аналізуючи утворення IFN-γ (див. також приклади нижче). Зазвичай, найбільш ефективні пептиди згодом комбінуються як вакцина в цілях, описаних вище. Прийнятна вакцина буде переважно вміщувати від 1 до 20 пептидів, більш переважно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 чи 20 різних пептидів, ще більш переважно 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13 або 14 різних пептидів та найбільш переважно 10, 11, 12, 13 або 14 різних пептидів. Довжина пептиду для використання в протираковій вакцині може бути будь-яким прийнятним пептидом. Зокрема, це може бути прийнятний 9-мерний пептид або прийнятний 8мерний чи 9-мерний, або 10-, 11-, 12-, 13-мерний, 14-мерний чи 15-мерний пептид. Пептиди більшої довжини також можуть використовуватись, але 9-мерні чи 10-мерні пептиди, як описано в доданих Таблицях 1 і 2, є переважними для пептидів MHC класу I, в той час як 12-15-мерні пептиди переважні для пептидів MHC класу II. Пептид(и) становить(становлять) протипухлинну чи протиракову вакцину. Вона може вводитись безпосередньо пацієнту в уражений орган чи системно, або застосовуватись ex vivo до клітин, виділених з пацієнта або клітинної лінії людини, що згодом вводяться пацієнту, чи використовуватись in vitro для обирання субпопуляції з імунних клітин, які виділяються з пацієнта і потім знов вводяться йому. Пептид може бути, по суті, чистим, або поєднаним з імуно-стимулюючим ад'ювантом (див. нижче) чи використовуватись в комбінації з імунно-стимулюючими цитокінами, або вводитись з належною системою доставки, наприклад, ліпосомами. Пептид також може поєднуватись з належним носієм, таким як гемоцианін лімфи равлика (KLH) або маннан (див. патент WO 95/18145 та роботу Longenecker et al. (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690,276-291). Пептид також може бути міченим, і бути гібридним білком чи гібридною молекулою. Очікується, що пептиди, послідовність яких надається в цьому винаході, стимулюють CD4 T-клітини або CD8 CTL. Однак, стимуляція більш ефективна у присутності підтримки, яка надається T-клітинами, позитивними до протилежного CD. Отже, для епітопів MHC класу II, котрі стимулюють CD4 Tклітини, гібридний партнер або частини гібридної молекули належним чином надають епітопи, що стимулюють CD8-позитивні T-клітини. З іншої сторони, для епітопів MHC Класу I, які стимулюють CD8 CTL, гібридний партнер або частини гібридної молекули належним чином надають епітопи, котрі стимулюють CD4-позитивні T-клітини. CD4- та CD8-стимулюючі епітопи добре відомі в цій галузі та включають епітопи, ідентифіковані в цьому винаході. 24 UA 103202 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фармацевтично прийнятні носії добре відомі; це, зазвичай, рідини, в яких формулюється активний терапевтичний препарат. Носій взагалі не додає формуляції ніякої фармакологічної функції, хоча він може забезпечити хімічну та/або біологічну стабільність, характеристики вивільнення, і таке інше. Зразки формуляцій можна знайти, наприклад, в роботі Alfonso R. Gennaro. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000, і вони включають розчини солей, воду, буферну воду, 0.3 %-гліцин, гіалуронову кислоту, декстрозу і тому подібне, але не обмежуються ними. Останнім часом було виявлено, що певні жирові емульсії, які багато років використовувалися для парентерального харчування хворих людей, також можуть бути носіями для пептидів. Двома прикладами таких емульсій є наявні у продажу жирові емульсії, відомі під назвами Інтраліпід та Ліпофундін. "Інтраліпід" - це зареєстрована торгова марка жирової емульсії для парентерального харчування фірми Kabi Pharmacia, Швеція, яка описана в Патенті США № 3,169,094. "Ліпофундін" - це зареєстрована торгова марка фірми B. Braun Melsungen, Німеччина. Обидві емульсії вміщують соєве масло, як жир (100 або 200 г в 1000 мл дистильованої води: 10 % чи 20 %, відповідно). Фосфоліпіди яєчного жовтка використовуються як емульгатори в Інтраліпіді (12 г/л дистильованої води), а яєчний лецитин – в Ліпофундіні (12 г/л дистильованої води). Ізотонічність є результатом додання гліцерину (25 г/л), як в Інтраліпіді, так і в Ліпофундіні. Для викликання імунної реакції, зазвичай необхідно включення ад'ювантів, що надають композиції більшої імуногенності. Тобто, в переважному втіленні винаходу фармацевтична композиція також вміщує принаймні один прийнятний ад'ювант. Ад'ювантами є речовини, котрі неспецифічно збільшують чи посилюють імунну реакцію (наприклад, імунні реакції, де посередниками виступають CTL і Т-клітини- хелпери (TH) на антиген, отже, вони вважаються доцільними в медикаменті цього винаходу. Прийнятні ад'юванти включають, без обмежень, 1018 ISS, солі алюмінію, Amplivax, AS15, БЦЖ, CP870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM фірми Mologen, GM-CSF, IC30, IC31, Іміквімод, ImuFact IMP321, інтерферон-альфа чи -бета, IS Patch, ISS (імуно-стимулюючі послідовності), імуностимулюючі комплекси ISCOM, JuvImmune, LipoVac, MF59, монофосфориловий ліпід A та інші нетоксичні похідні ліпополісахаридів (LPS), Монтанід IMS 1312, Монтанід ISA 206, Монтанід ISA 50V, Монтанід ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, векторну систему PepTel®, мікрочастинки PLG, резіквімод, SRL172, Віросоми та інші вірусоподібні частинки, YF-17D, VEGF trap, R848, бета-глюкан, Pam3Cys, стимулон QS21 Aquila (Aquila Biotech, Ворчестер, Масачусетс, США), який виділяється з сапоніну, мікобактеріальні екстракти та синтетичні імітатори стінок бактеріальних клітин, а також інші патентовані ад'юванти, наприклад, Ribi's Detox. Quil чи Superfos. Переважними є такі ад'юванти, як Іміквімод, Резіміквімод, неповний ад'ювант Фрейнда, інтерферон-альфа або GM-CSF. Кілька імунологічних ад'ювантів (наприклад, MF59), специфічних для дендритних клітин, та їхнє приготування, були описані раніше (Dupuis M, Murphy TJ, Higgins D, Ugozzoli M, van Nest G, Ott G, McDonald DM; Dendritic cells internalize vaccine adjuvant after intramuscular injection; Cell Immunol. 1998; 186(1):18-27; Allison AC; The mode of action of immunological adjuvants; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11). Також можуть застосовуватися цитокіни. Окремі цитокіни були прямо співвіднесені з впливом на міграцію дендритних клітин до лімфоїдних тканин (наприклад, TNF-α), прискорюючи перетворення дендритних клітин в ефективні антиген-презентуючі клітини для T-лімфоцитів (наприклад, GM-CSF, IL-1 та IL-4) (Патент США № 5,849,589, окремо включений в цей документ шляхом посилання в усій повноті) та діючи як імуно-ад'юванти (наприклад, IL-12) (Gabrilovich DI, Cunningham HT, Carbone DP; IL-12 and mutant P53 peptide-pulsed dendritic cells for the specific immunotherapy of cancer; J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418). Також доповідалося про те, що імуно-стимулюючі CpG-олігонуклеотиди посилюють ефект ад'ювантів у вакцинному складі. Теоретично, не будучи зв'язаними, CpG олігонуклеотиди діють шляхом активації природної (не здобутої) імунної системи за допомогою Toll-подібних рецепторів (TLR), переважно TLR9. Активація TLR9, ініційована CpG, посилює антигенспецифічні гуморальні та клітинні реакції на широкий спектр антигенів, включаючи пептидні чи білкові антигени, живі або знищені віруси, вакцини на основі дендритних клітин, аутологічні клітинні вакцини та полісахаридні кон'югати в профілактичних і терапевтичних вакцинах. Більш важливим є те, що ця активація посилює визрівання та диференціацію дендритних клітин, що в результаті збільшує активацію TH1-клітин та генерацію цитотоксичних T-лімфоцитів (CTL), навіть за відсутності допомоги CD4 T-клітин. Активація TH1, індукована стимуляцією TLR9, зберігається навіть у присутності вакцинних ад'ювантів, таких як солі алюмінію чи неповний ад'ювант Фрейнда (IFA), котрі зазвичай сприяють активації TH2. CpG-олігонуклеотиди демонструють навіть більшу ад'ювантну активність, коли формулюються або вводяться разом з іншими ад'ювантами чи в таких формуляціях, як мікрочастинки, нано-частинки, ліпідні емульсії 25 UA 103202 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або подібні формуляції, особливо необхідні для індукування сильної реакції, коли антиген відносно слабкий. Вони також прискорюють імунну реакцію та дозволяють зменшити дози антигену приблизно на два порядки, в порівнянні з реакціями антитіл на вакцину в повній дозі без CpG в деяких експериментах (Arthur M. Krieg, Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation, Nature Reviews, Drug Discovery, 2006, 5, 471-484). В Патенті США № 6,406,705 B1 описується комбіноване використання CpG-олігонуклеотидів, ад'ювантів, що не вміщують нуклеїнових кислот, та антигену для індукування антиген-специфічної імунної реакції. Наявним у продажу CpG TLR9-антагоністом є dSLIM (імуномодулятор з подвійно-нитчастим контуром) фірми Mologen (Берлін, Німеччина), котрий є переважним компонентом фармацевтичної композиції цього винаходу. Також можуть використовуватись інші TLR- зв'язувальні молекули, наприклад, TLR 7, TLR 8 та/або TLR 9, що зв'язані з РНК. Інші приклади прийнятних ад'ювантів включають, без обмежень, хімічно модифіковані CpG (наприклад, CpR, Idera), Poly(I:C) (наприклад, polyI:C12U), бактеріальні ДНК або РНК, відмінні від CpG, а також невеликі імуноактивні молекули та антитіла, такі як імідазокіноліни, циклофосфамід, сунітініб (sunitinib), бевакізумаб, целебрекс (celebrex), NCX-4016, сілденафіл (sildenafil), тадалафіл (tadalafil), варденафіл (vardenafil), сорафеніб (sorafinib), XL-999, CP547632, пазопаніб (pazopanib), ZD2171, AZD2171, іпілімумаб (ipilimumab), тремелімумаб (tremelimumab) та SC58175, котрі можуть діяти терапевтично та/або як ад'ювант. Кількості та концентрації ад'ювантів та добавок, прийнятих в контексті цього винаходу, можуть бути легко визначені досвідченим спеціалістом без неналежного експериментування. Переважними ад'ювантами є dSLIM, БЦЖ, OK432, іміквімод, резіміквімод, GM-CSF, інтерферон-альфа, PeviTer та JuvImmune або їхні комбінації. В переважному втіленні фармацевтичної композиції, відповідно до винаходу, ад'ювант обирається з групи, що складається з факторів стимулювання колоній, таких як Фактор Стимулювання Колоній Гранулоцитів-макрофагів (GM-CSF, сарграмостим), іміквімод, резіквімод та інтерферон-альфа. В переважному втіленні фармацевтичної композиції, відповідно до винаходу, ад'ювантом є іміквімод або резіміквімод. В переважному втіленні фармацевтичної композиції, відповідно до винаходу, ад'ювантом є комбінація GM-CSF та іміквімоду. Ця композиція використовується для парентерального введення, наприклад, підшкірного, інтрадермального, внутрішньом'язового, внутрішньочеревного або перорального введення. Для цього пептиди і додатково інші молекули розчиняються або суспендуються у фармацевтично прийнятному, переважно водному, носії. До того ж, композиція може вміщувати наповнювачі, такі як буферні елементи, зв'язувальні речовини, очисники, розріджувачі, ароматизатори, мастильні речовини та ін. Пептиди також можуть вводитись разом із імуностимулюючими речовинами, наприклад, цитокінами. Вичерпний перелік наповнювачів, які можуть використовуватись у такій композиції, наведений, наприклад, в книзі A. Kibbe, Handbook of rd Pharmaceutical Excipients, 3 Ed. 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press. Композиція може використовуватися для попередження, профілактики та/або терапії аденомних чи ракових захворювань, переважно CRC. Цитотоксичні T-клітини (CTL) розпізнають антиген у формі пептиду, зв'язаного з MHCмолекулою, а не неушкоджений інорідний антиген. Сама молекула MHC знаходиться на клітинній поверхні антиген-презентуючої клітини. Отже, активація CTL можлива тільки в тому випадку, якщо присутній тримерний комплекс пептидного антигену, MHC-молекули та АPC. Відповідно, імунна реакція може посилюватись, якщо для активації CTL використовується не тільки пептид, але також APC з відповідною молекулою MHC. Отже, у переважному втіленні фармацевтична композиція, відповідно до цього винаходу, додатково вміщує принаймні одну антиген-презентуючу клітину. Антиген-презентуюча клітина (чи клітина-стимулятор), як правило, має на своїй поверхні MHC-молекулу класу I або II та в одному з втілень винаходу вона переважно не здатна, сама по собі, завантажувати зазначену MHC-молекулу класу I або II обраним антигеном. Як описується більш детально нижче, MHC-молекула класу I або II може легко завантажуватись обраним антигеном in vitro. Переважно, клітина ссавців не має пептидного транспортера ТАР, чи має його знижений рівень або зменшену функцію. Відповідні клітини, в яких немає пептидного транспортера ТАР, включають T2, клітинну лінію, не здатну завантажувати пептиди людини, яка є доступною для придбання в American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Меріленд 20852, США, номер за каталогом CRL 1992; клітинні лінії без транспортеру TAP, такі як T2, можуть використовуватись як APC, та внаслідок відсутності TAP приблизно усі пептиди, презентовані MHC класу I, будуть пептидами, що вивчаються з метою зовнішнього завантаження порожніх 26 UA 103202 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 MHC-молекул класу I цих клітинних ліній, оскільки усі ефекти будуть чітко приписуватись використовуваним пептидам. Переважно, антиген-презентуючі клітини є дендритними клітинами. Відповідно, дендритні клітини є аутологічними дендритними клітинами, які імпульсним методом завантажуються антигенним пептидом. Антигенний пептид може бути належним антигенним пептидом, який викликає відповідну T-клітинну реакцію. Т-клітинна терапія із використанням аутологічних дендритних клітин, в які імпульсним методом завантажуються пептиди з пухлино-асоційованого антигену, розкривається в роботі Murphy et al. (1996) The Prostate 29, 371-380, та в роботі Tjua et al. (1997) The Prostate 32, 272-278. Отже, в переважному втіленні цього винаходу фармацевтична композиція, яка вміщує принаймні одну антиген-презентуючу клітину, імпульсним шляхом наповнюється чи завантажується пептидом, наприклад, за методом прикладу 4. Як альтернатива, антиген-презентуюча клітина вміщує компонент експресії, що кодує пептид. Полінуклеотид може бути будь-яким відповідним полінуклеотидом, та переважно, щоб він був здатний трансдукувати дендритні клітини, таким чином забезпечуючи презентування пептиду та стимуляцію імунітету. Зручним є те, що нуклеїнова кислота винаходу може бути включена у вірусний полінуклеотид чи вірус. Наприклад, показано, що дендритні клітини, трансдуковані аденовірусом, стимулюють антиген-специфічний протипухлинний імунітет відносно MUC1 (див. роботу Gong et al. (1997) Gene Ther. 4, 1023-1028). Подібним чином, можуть використовуватись системи на основі аденовірусів (див., наприклад, роботу Wan et al (1997) Hum. Gene Ther. 8, 1355-1363); і ретровірусні системи (Specht et al. (1997) J. Exp. Med. 186, 1213-1221 and Szabolcs et al. (1997). Крім того, можна використовувати перенос в дендритні клітини за допомогою кров'яних часток (Tuting et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707); також можна використовувати РНК (Ashley et al. (1997) J. Exp. Med. 186, 1177 1182). В цілому, фармацевтична композиція винаходу, яка вміщує (a) нуклеїнову кислоту(кислоти) винаходу, може вводитись способом, подібним до введення композиції з вмістом пептидів винаходу, наприклад, внутрішньовенного, внутрішньоартеріального, внутрішньочеревного, внутрішньом'язового, інтрадермального, внутрішньопухлинного, перорального, дермального, назального, букального, ректального, вагінального введення, введення шляхом вдихання або місцевого застосування. Внаслідок механізмів уникнення, в пухлині часто розвивається резистентність до препаратів, за допомогою яких вона лікується. Резистентність до ліків може наступити під час лікування; це проявляється в метастазах та в рецидивуючих пухлинах. Щоб уникнути такої резистентності, пухлину, зазвичай, лікують комбінацією препаратів, і наявність метастаз і рецидивів пухлини після періоду, вільного від хвороби, часто вимагає використання іншої комбінації. Отже, в одному з аспектів винаходу фармацевтична композиція вводиться в поєднанні з другим протираковим препаратом. Другий препарат може вводитись до, після чи одночасно з фармацевтичною композицією винаходу. Одночасне введення може, наприклад, досягатись змішуванням фармацевтичної композиції винаходу з другим протираковим препаратом, якщо їхні хімічні властивості є сумісними. Ще один спосіб одночасного введення – це введення композиції та протиракового препарату в той же день, незалежно від способу введення, таким чином, щоб фармацевтична композиція винаходу, наприклад, могла вводитися як ін'єкція, а другий протираковий препарат - перорально. Фармацевтична композиція та другий протираковий препарат також можуть вводитись протягом одного курсу лікування, але в різні дні та/або в ході роздільних курсів лікування. Ще один аспект цього винаходу пропонує метод для лікування чи попередження раку у пацієнта, котрий полягає у введенні пацієнту терапевтично ефективної кількості будь-якої з фармацевтичних композицій винаходу. Терапевтично ефективна кількість – це кількість, достатня для індукування імунної реакції, зокрема, активації субпопуляції CTL. Досвідчений фахівець може достатньо легко визначити, чи є кількість препарату ефективною, використовуючи стандартні імунологічні методи, наприклад, такі, що надані в прикладах цих специфікацій. Ще один спосіб моніторингу ефекту певної кількості фармацевтичної композиції – це спостерігання за ростом пухлини, що лікується, та/або її рецидивами. В особливо переважному втіленні цього винаходу фармацевтична композиція використовується як протиракова вакцина. Композиція, яка вміщує пептиди або нуклеїнові кислоти, що кодують пептид, також може вміщувати протипухлинну чи протиракову вакцину. Вона може вводитись безпосередньо пацієнту, в уражений орган, або системно, чи застосовуватися ex vivo до клітин, виділених у 27 UA 103202 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пацієнта чи клітинної лінії людини, котрі згодом вводяться пацієнту, або використовуватись in vitro для обирання субпопуляції з імунних клітин, які виділяються у пацієнта і потім знов вводяться йому. Композиція винаходу може використовуватись в методі лікування раку або як вакцина проти раку. Це може бути рак ротової порожнини та рак глотки, рак шлунково-кишкового тракту, рак товстої кишки, прямої кишки та ануса, рак дихальних шляхів, рак молочної залози, рак шийки матки, вагіни та вульви, рак матки та яєчника, рак статевих шляхів у чоловіків, рак сечовивідних шляхів, рак кістки та м'яких тканин, саркома Капоші, меланома шкіри, меланома ока, рак ока немеланомного характеру, рак мозку та центральної нервової системи, рак щитовидної залози та інших ендокринних залоз, лімфома Ходжкіна, не-хождкінська лімфома, мієлома, переважно, рак нирки, колоректальний рак, рак легенів, рак грудей, рак підшлункової залози, рак простати, рак шлунку, рак мозку, стромальні пухлини ШКТ або гліобластома, переважно, пухлини мозку та навіть ще більш переважно гліобластоми. В найбільш переважному втіленні методу лікування або вакцини, відповідно до винаходу, вакцина є протипухлинною вакциною з кількох пептидів для лікування GBM. Переважно, вакцина вміщує ряд пухлино-асоційованих пептидів, обраних з послідовностей від SEQ ID No. 1 до SEQ ID No. 12, котрі розташовані та ідентифіковані на клітинах первинних гліобластом. Цей ряд включає пептиди HLA класу I і класу II. Ряд пептидів може також вміщувати принаймні один пептид, такий як з корового антигену HBV, використовуваний як пептид позитивного контролю, що служить як імунний маркер для тестування ефективності інтрадермального введення. В одному з конкретних втілень, вакцина складається з 14 індивідуальних пептидів (згідно з послідовностями від SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO: 12) від приблизно 1500 мкг до приблизно 75 мкг, переважно від 1000 мкг до близько 175 мкг та більш переважно від приблизно 500 мкг до приблизно 600 мкг, і найбільш переважно – приблизно 578 мкг кожного пептиду, всі з яких можуть очищуватися за допомогою HPLC та іоно-обмінної хроматографії та мають форму білого чи жовтуватого порошку. Ліофілізат переважно розчиняється в гідрокарбонаті натрію та використовується для інтрадермальних ін'єкцій протягом 30 хвилин після відновлення при кімнатній температурі. Відповідно до цього винаходу, переважні кількості пептидів можуть варіюватися від приблизно 0.1 та 100 мг, переважно, від приблизно 0.1 до 1 мг, та найбільш переважно – від приблизно 300 мкг до 800 мкг на 500 мкл розчину. Термін "приблизно" тут означає +/- 10 процентів від даного значення, якщо не зазначено інше. Спеціаліст у цій галузі здатний відкорегувати фактичну кількість пептиду, який використовується, на основі кількох факторів, наприклад, імунного статусу індивідуального пацієнта та/або кількості TUMAP, що є присутньою в конкретному виді раку. Пептиди цього винаходу можуть бути надані в інших прийнятних формах (стерильні розчині та ін.) замість ліофілізату. Фармацевтичні композиції вміщують пептиди у вільній формі чи у формі фармацевтично прийнятної солі. Термін "фармацевтично прийнятна сіль", в тому виді, в якому він використовується тут, відноситься до похідної сполуки розкритих пептидів, в якій пептид модифікується шляхом створення кислої чи основної солі речовини. Наприклад, кислі солі готуються з вільної основи (як правило, де нейтральна форма лікарського засобу має нейтральну –NH2-групу), за участю реакції з прийнятною кислотою. Прийнятні кислоти для приготування кислих солей включають органічні кислоти, такі, наприклад, як оцтова кислота, пропанова кислота, гліколева кислота, піровиноградна кислота, щавлева кислота, яблучна кислота, малонова кислота, бурштинова кислота, малеїнова кислота, фумарова кислота, винна кислота, лимонна кислота, бензойна кислота, корична кислота, мигдальна кислота, метансульфокислота, етансульфокислота, pтолуолсульфокислота, саліцилова кислота та ін., а також неорганічні кислоти, наприклад, соляна кислота, бромисто-воднева кислота, сірчана кислота, азотна кислота, фосфорна кислота та ін. І навпаки, приготування основних солей кислотних компонентів, які можуть бути присутні на пептиді, здійснюється з використанням фармацевтично прийнятної основи, такої як гідроксид натрію, гідроксид калію, гідроксид амонію, гідроксид кальцію, триметиламін чи тому подібні. В особливо переважному втіленні, фармацевтичні композиції вміщують пептиди у виді солей оцтової кислоти (ацетати), амонію або соляної кислоти (хлориди). В іншому втіленні, фармацевтична композиція цього винаходу може включати цукри, цукрові спирти, амінокислоти, такі як гліцин, аргінін, глютамінова кислота та інші, як формувачі рамки. Цукри можуть бути моно-, ді- або трисахаридами. Такі цукри можуть використовуватись самостійно, а також в комбінації з цукровими спиртами. Приклади цукрів включають глюкозу, манозу, галактозу, фруктозу чи сорбозу як моносахариди, сахарозу, лактозу, мальтозу чи трегалозу як дисахариди, та рафінозу як трисахарид. Цукровий спирт може бути, наприклад, 28