Спосіб одержання вірусу курячої анемії (cav) у дволанцюговій формі, рекомбінантна нуклеїнова кислота (варіанти), діагностичний набір (варіанти), вакцинний препарат (варіанти), культура клітин (варіанти), спосіб

1 Способ получения вируса куриной анемии (CAV) в двухцепочечной форме, включающий стадии выделения ДНК с низким молекулярным весом из CAV-инфицированных клеток, фракционирования указанной ДНК с низким молекулярным весом на агарозе/этидиум бромиде, сравнения характера фракционирования указанного образца с характером фракционирования образца из аналогичной неинфицированной клетки, выделения ДНК, присутствующей только в инфицированной клетке, и проверки с помощью рестрикционного анализа, что эта ДНК является двухцепочечной 2 Рекомбинантная нуклеиновая кислота, включающая CAV-специфическую нуклеотидную последовательность, соответствующую, по крайней мере, CAV-специфической части нуклеотидной последовательности 2 0 0CC«^ О ^ (О ОСЛСТСАЯТАААСОЕАОАЛААТАОДТТТАТСОСАСЇАТС или нуклеотидную последовательность, гомологичную ей по крайней мере на 60%, полученную способом по п 1 3 Рекомбинантная нуклеиновая кислота по п 2, отличающаяся тем, что она включает CAVспецифическую нуклеотидную последовательность, соответствующую нуклеотидной последовательности, присутствующей в геноме CAV, причем указанная нуклеотидная последовательность кодирует, по крайней мере, часть белка CAV 4 Рекомбинантная нуклеиновая кислота по п 2, отличающаяся тем, что она дополнительно включает нуклеотидную последовательность, производную прокариотического или эукариотического вектора 5 Рекомбинантная нуклеиновая кислота по п 2, отличающаяся тем, что она дополнительно включает нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, отличный от белка CAV, или го 00 нуклеотидную последовательность, кодирующую часть такого белка, отличного от белка CVA 6 Рекомбинантная нуклеиновая кислота по любому из пп 2-5, отличающаяся тем, что она дополнительно включает нуклеотидную последовательность, не присутствующую в геноме CAV, имеющую регуляторную функцию 7 Рекомбинантная нуклеиновая кислота по любому из пп 2-6, отличающаяся тем, что ее дополнительно метят одним или более маркерами, пригодными для мечения нуклеиновых кислот, такими как радиоизотопы, молекулы ферментов, гаптены, флуоресцентные вещества, красители, пигменты и конкретные маркеры 8 Рекомбинантная нуклеиновая кислота по п 2, отличающаяся тем, что ее используют в качестве CAV-специфического зонда или праймера в способе обнаружения ДНК или РНК CAV 9 Рекомбинантная нуклеиновая кислота по любому из пп 2-7, отличающаяся тем, что ее используют для продукции белков 10 Рекомбинантная нуклеиновая кислота, включающая CAV-специфическую нуклеотидную последовательность, комплементарную, по крайней мере, CAV-специфической части нуклеотидной последовательности С^^ so с 26 АО^ЭвАИОТМСАССАССТСААОООАеГГвОАОвААПАТАТАМ'ГГГСОАСАТаЖЗМО п^кггш; ОСТАТОСССССМ1*ЄССССЄаАТСАТОіСсаСТАОТАС«ЇСООААаОЄАИ1СААОТССаС QCACTCAATAAACOCAQAAAATMATTTATaiCACTATC 1ЭДЗ или нуклеотидную последовательность, гомологичную ей, по крайней мере, на 60%, полученную способом по п 1 11 Рекомбинантная нуклеиновая кислота по п 10, отличающаяся тем, что она включает CAVспецифическую нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, присутствующей в геноме CAV, причем указанная нуклеотидная последовательность кодирует, по крайней мере, часть белка CAV 12 Рекомбинаятная нуклеиновая кислота по п 10, отличающаяся тем, что она дополнительно включает нуклеотидную последовательность, производную прокариотического или эукариотического вектора 13 Рекомбинантная нуклеиновая кислота по п 10, отличающаяся тем, что она дополнительно включает нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, отличный от белка CAV, или нуклеотидную последовательность, кодирующую часть такого белка, отличного от белка CAV 14 Рекомбинантная нуклеиновая кислота по любому из пп 10-13, отличающаяся тем, что она дополнительно включает нуклеотидную последовательность, не присутствующую в геноме CAV, имеющую регуляторную функцию 15 Рекомбинантная нуклеиновая кислота по любому из пп 10-14, отличающаяся тем, что ее метят одним или более маркерами, пригодными для мечения нуклеиновых кислот, такими как радиоизотопы, молекулы ферментов, гаптены, флуоресцентные вещества, красители, пигменты и конкретные маркеры 16 Рекомбинантная нуклеиновая кислота п 10, отличающаяся тем, что ее используют в качестве CAV-специфического зонда или праймера в способе обнаружения ДНК или РНК CAV 17 Рекомбинантная нуклеиновая кислота по любому из пунктов 10-15, отличающаяся тем, что ее используют для продукции белков 18 Диагностический набор для обнаружения ДНК или РНК CAV, содержащий рекомбинантную нуклеиновую кислоту по п 2 в качестве CAVспецифического зонда или праймера 19 Диагностический набор для обнаружения ДНК или РНК CAV, содержащий рекомбинантную нуклеиновую кислоту по п 10 в качестве CAVспецифического зонда или праймера 20 Вакцинный препарат живого вирусного вектора для иммунизации против CAV или другого патогена, причем указанный препарат содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту по любому из пп 2-7 21 Вакцинный препарат живого вирусного вектора для иммунизации против CAV или другого патогена, причем указанный препарат содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту по любому из пп 10-15 22 Культура клеток, включающая прокариотические или эукариотические клетки, в которой указанные клетки содержат рекомбинантную нуклеиновую кислоту по любому из пп 2-7 23 Культура клеток по п 22, способная экспрессировать, по крайней мере, один белок или часть белка, кодированного указанной рекомбинантной нуклеиновой кислотой 24 Культура клеток, включающая прокариотические или эукариотические клетки, в которой указанные клетки содержат рекомбинантную нуклеиновую кислоту по любому из пп 10-15 25 Культура клеток по п 24, способная экспрессировать, по крайней мере, один белок или часть белка, кодированного указанной рекомбинантной нуклеиновой кислотой 26 Способ получения диагностического набора для обнаружения CAV-специфических антител в иммуноанализе, включающий получение белка или его части с использованием рекомбинантной нуклеиновой кислоты по любому из пп 2-7 для продукции белка и включение полученного белка или его части в качестве реагента для связывания CAV-специфических антител 27 Способ получения диагностического набора для обнаружения CAV-специфических антител в имммуноанализе, включающий получение белка или его части с использованием рекомбинантной нуклеиновой кислоты по любому из пунктов 10-15 для продукции белка и включение полученного белка или его части в качестве реагента для связывания CAV-специфических антител Это изобретение является областью исследований генной инженерии (манипуляции гена) при помощи технологии рекомбинантной ДНК (РНК) диагностик и иммунизации/вакцинации Точнее, изобретение относится к обнаружению, клонированию и анализу последовательности ДНК генома Вируса Куриной Анемии (КАВ) и, посредством этого предположению возможных применений КАВ вирус, который был классифицирован не так давно, вызывает инфекционную анемию у цыплят Вирус впервые был выделен в Японии в 1979 году и получал такое имя потому, что вызывал серьезную анемию у молодых птенцов (luasa и др , 1979) Другими симптомами КАВ инфекции являются атрофия костного мозга и деструкция лимфоцитов в тимусе Повреждения найдены в селезенке и печени Наиболее подвержены однодневные птенцы У этих животных вялость, анорекция и протекающая анемия наблюдались через 4-7 дней посла прививки КАВ, и половина животных умирала между 2 и 3 неделями после инфицирования С повышением возраста природная резистентность также увеличивается При заражении птенцов в возрасте семи дней, они проявляют только текущую анемию после заражения, и при инфицировании 14-дневных животных анемия не следует Защита от КАВ и симптомов КАВ заболевания главным образом основывается на характере иммунных защитных механизмов (1989) разработал практически, достаточно эффективный метод предупреждения с помощью "контролированной экспозиции" с КАВ-инфицированными суспензиями печени несушек, таким образом потомство приобретало материнский иммунитет В Германии этот метод иммунизации использовался на практике, но, оказывается, он не совершенно свободен от риска Эксперименты па животных, проводимые в отдельных птицефермах с Central Diergentts Kundig (CDI) при Lekustad подтвердили защитную ценность материнских антител Здесь "контролированная, экспозиция" проводилась с КАВ, размноженным па тканевой культуре, Присутствие материнских антител против КАВ полностью предупреждало КАВ репликацию при заражении однодневных цыплят от таким образом вакцинированной матери животных КАВ симптомы тоже не наблюдались Такая пассивная защита была также достигнута у потомков иммунизированных плодов и также после вспрыскивания в специфически патоген-свободных (СПС) птенцов желтковых экс трактов Яиц с подобно иммунзицарованными плодами Пассивная защита, принимая во внимание КАВ инфекцию, с помощью введения КАВ антител, проводится до возраста 4 недели Позже, пассивная защита, как было найдено, будет недостаточной Эти эксперименты показали, что материнские антитела, получаемые вакцинацией матери животных, будут играть важную предупреждающую роль в практической ситуации Также экспериментально было продемонстрировано, что у птенцов, которые пережали КАВ инфекцию, наблюдается протекание истощения специфичной популяции лимфоцитов тимуса (leunssen и др 1989) Атрофия тимуса возможно вызвана иммунодепрессией вводимого КАВ, приводящей к тому, что специфические вакцинаций менее эффективны, например против Newcastle заболевания КАВ был выделен несколько раз в стаях с увеличенными потерями благодаря Marek's заболеванию, Gumbero's болезни (Infektion Bursal Disease Virus, IVDV, luasa и др , 1980) и у животных с Blue Wing заболеванием в ассоциации с ретровирусами (Engstrom 1988 a, Engstrom и др , 1988, б) В экспериментальных двойных инфекциях было показано усиление свойств КАВ, принимая во внимание другие куриные вирусы, например, Вирус Marek's .болезни, MDV De Boer и др , 1989 а/ Недавно мы наблюдали в наших собственных экспериментах резко усиленную реакцию после аэрозольной вакцинации одновременно вакцины Newcastle Болезни и КАЗ инфекции Следовательно, КАВ приводит к иммуноподавляющим и усиливающим эффектам при других вирусных инфекциях Эти свойства КАВ приводят к увеличению инцидента вспышек заразных заболеваний в практике Оказывается КАВ распространен во всем мире, Через некоторое время после начала исследования КАВ в Японии, выделение КАВ было осуществлено в Европе, а именно в Германии Von Bulow /1933/ и позже /Me Nulty с сотр /1990/ в Англии В Нидерландах первые выделения КАВ из материала из США, Израиля и Туниса были осуществлены De Boer с сотр /1988/ Имеющиеся литературные данные показывают, что выделения КАВ относятся к одному серотипу, но выделения КАВ нескольких областей были исследованы на внутреннее родство возможные отличия в патогенности/ Me Nulty с сотр, 1990/ Распространение КАВ внутри стаи вероятно, происходит путем инфицирования через испражнения и воздух Вертикальное перемещение вируса к потомству, тем не менее, также играет важную роль в КАВ эпидемиологии В различных странах наличие КАВ было доказано серологически В условиях тканевой культуры КАВ тяжело размножается До сих пор КАВ приводил только к цтиопатологичному эффекту в MDV трансформированных лимфобластоидных клеточных линиях лимфомы Мареса /MDCC-MSBI клетки/ или в трансформированных вирусом лейкемии лимфобластоидных клеточных линиях лимфоидного лейкоза 1104-Х5, Уиаза, 1983/ Недавнее изучение Todd с сотр /1990/ описывает вирусные частицы, имеющие диаметр 23,5нм, которые концентрируются при плотности 1,33-1,34г/мл в градиенте C5CI Вирус имеет один доминирующий полипептид /Мв 50,000/ и циклическую простую цепочку ДНК генома длиной 2,3 килобаз Два малых вируса, свиной цирковирус и вирус, ассоциированный с Psittacine Beak Feathe Disease сходны с КАВ кольцевой одноцепочечной ДНК, но имеют более маленький геном и более маленький диаметр вирусных частиц /Ritchie с сотр 1989, Tischer, с сотр, 1982/ В течение долгого времени считалось, что КАВ относится к парвовирусам Хотя большинство парвовирусов являются одноцепочечными ДНК-вирусами, они обладают линейной ДНК, большим геномом и вероятно также другой композицией вирусных полипептидов Общепринято, что клеточные компоненты, входящие в репликацию и транскрипцию вируса, функционируют только если ДНК имеет форму двойной спирали Вирус, имеющий кольцевую одноцепочечную ДНК может находиться в клетке в фазе двуцепочечной ДНК Данные исследователи использовали этот факт Данные изобретатели охарактеризовали двуцепочечную КАВ ДНК, имеющую длину 2,3 килобаз в КАВ инфицированных 1104-Х5 и MDCCMSBI клетках и клонировали ее в plC-20H ДНК была полностью секвенирована/Фиг 1/ В диагностическом тесте, при помощи меченной клонированной КАВ ДНК, КАВ нуклеиновые кислоты могли быть обнаружены в вирусе, печени и препаратах клеточной культуры Найдено, что клонированный КАВ имеет все биологические и патогенные свойства КАВ дикого типа, как в клеточной культуре, так и в тестах на животных В реакциях удлинения цепи полимеразой и экспериментах по гибридизации показано, что клонированный полный КАВ геном является типичным представителем КАВ дикого типа С помощью Нозерн-анализа с 32р-мечеными ДНК-пробелами было продемонстрировано, что все природные изоляты содержат молекулы ДНК размером 2,3кб Растрикционный анализ продемонстрировал, что клонированная КАВ ДНК соответствует ДНК при разных изолятах С помощью дот-блок анализа продемонстрировано, что дигоксигенин меченная клонированная с AV-ДНК специфично гибридизуется с ДНК различных изолятов данного таза В реакции удлинения цепи полимеразол, использующей олигонуклеотиды, последовательность которых происходит из последовавольности клонированного КАВ /Фиг 4/ КАВ ДНК специфически амплифицирована или узнана Настоящее изобретение дает, во-первых, рекомбинантную генетическую информацию в форме меченых или немеченых ДНК или РНК, содержащих специфические нуклеотидные последовательности Вируса Куриной Анемии /КАВ/, соответствующие или комплементарные нуклеотидной последовательности КАВ генома или его части Предпочитаемое воплощение настоящего изобретения содержит такую рекомбинантную генетическую информацию как включающую КАВ специфичную нуклеотидную последовательность соответствующую дли комплементарную нуклеотидной последовательности, показанной на Фиг 1, нуклеотидную последовательность, гомологичную ей, как минимум, на 60%, или ее часть Этот аспект изобретения включает нуклеиновую кислоту, выбранную из ДНК и РНК в разном возможном проявлении, т е , как в форме свободных ДНК и РНК, так и форме ДНК и РНК, упакованных каким-либо путем, т е , в белках или в вирусных частицах/ или связанных с другим образом, например, с носителем или с материалом, функционирующим как маркер/ ДНК может быть как одноцепочечной, так и двухцепочечной и быть как линейной, так и кольцевой Характеристикой рекомбинантной генетической информации, относящейся к данному изобретению, является присутствие в ней КАВспецифичной нуклеотидной последовательности С практической точки зрения эта КАВспецифичная последовательность необязательно должна охватывать весь геном КАВ, необходима только специфичная часть, которая полезна з большинстве случаев применения Первой предпочтительной возможностью является КАВ-специфичная нуклеотидная последовательность, соответствующая или комплементарная нуклеотидной последовательности кодирующей КАВ белок и, находящейся в КАВ геноме, или ее часть Рекомбинатная ДНК, содержащая такую кодирующую последовательность, может быть использована, например, при обнаружении и РНК КАВ в образцах, или, например, в процессе получения КАВ банков или их частей Термин "ее или его часть", в принципе, означает каждую часть, которая еще может быть обозначена как КАВ-специфичная На белковом уровне это будет эпитоп для наибольшего количества применений, т е антигенный детерминант, распознаваемый антителами Другая возможность состоит в том, что рекомбинантная генетическая информация, относящаяся к изобретению, включает КАВ-специфичную нуклеотидную последовательность, соответствующую или комплементарную нуклеотидной последовательности, обладающей регуляторной 10 функцией, находящуюся в КАВ геноме, или части ее Одним примером является использование элементов КАВ промотор/усилитель в комбинации с последовательностями, кодирующими другие белки, на КАВ, например, для возможности экспрессии таких же КАВ белков домашней птицы /цыплята/ и других животных, в которых регуляторные сигналы КАВ эффективны Как в вышеуказанном случае, так и, в основном, рекомбинантная генетическая информация, относящаяся и изобретению, может также содержать нуклеотидную последовательность, не содержащуюся в КАВ геноме Такая "нуклеотидная последовательность, но принадлежащая КАВ геному" может быть получена, например, из нуклеотидной последовательности, полученной из прокариотического или аукаритического вектора экспрессии Таким образом, изобретение включает возможность внедрения КАВ-специфичной последовательности в /вирусной или невирусной/ вектор, подходящий для экспрессии в аукаритических организмах или в плазмиду, подходящую для экспрессии в бактериях Более того, также возможно, чтобы рекомбинантная генетическая информация из так называемой "нуклеотидной последовательности, полученной не из КАВ генома", относящаяся к изобретению, включала нуклеотидную последовательность, не имеющуюся в КАВ-геноме, способную к регуляторной функции Тем не менее, "нуклеотидная последовательность, произведенная не из КАВ генома" может также содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, отличный от КАВ белка, например, если КАВ регуляторные сигналы используются для экспрессии такого же КАВ белка /или части его/ в хозяине, доступном дли КАВ вщру-са, пял еслирокомбанантную ДНК следует использовать для получения гибридного или слитого белка, в котором функции КАВ белка как носителя для эпитона не-КАВ белка или, наоборот, не КАВ белковые функции как носителя для эпитона КАВ белка Если рекомбинантную генетическую информацию, согласно изобретению, использует в процессе детектированиякомплементарных ДНК или РНК в образце, моют быть необходимо присутствие метки Метка, при использовании здесь, является маркером, подходящим для использования с ДНК или РНК, которая позволяет или помогает детектированию меченных ДНК или РНК Известно много типов маркеров, пригодных для этой цели, таких как радиоизотопы /например, 32Р/, молекулы ферментов /например, пероксидазы/, гаптены /биотин/, флюоресцентные вещества, краски пигменты /неорганический фосфор/, и особенные маркеры /например, частицы золота или селена/ Во-вторых, изобретение касается использований рокомбинантной генетической информации, как описано выше, особенно в диагностических целях, целях иммунизации и вакцинации, или для получения КАВ или не КАВ белков Более точно, это относится к, например, использованию рекомбинантной генетической информации в соответствии о изобретением, в качестве КАВ-специфичной пробы или затравки в процессе детектирования КАВ-ДНК или РНК, например, в процессе ДНК/РНК (лот-блоттинга, Южного блоттинга, Северного блоттинга, гибридизации in situ амплификации ДНК путем полимеразной цепной реакция Sl-картирования и удлинения траймера, изобретение также охватывает диагностический набор дли детектирования КАВ-ДНК или -РНК такими способами, как ДНК/РНК сложблоттинг, Южный блоттинг, Северный блоттинг, гибридизация in situ, аплификации ДНК путам полимеразной цепной реакции Slкартирования или удлинения праймеров, причем диагностический набор содержит генетическую рекомбинантную информацию, относящуюся к изобретению, как КАВ-специфичную пробу или затравку Дальнейшее имеет отношение к использованию рекомбипантной генетической информации, согласно изобретению, в качестве живой вирусной вакцины для защиты от КАВ и других патогенов, изобретение также ведет к расширению вакцинных препаратов для иммунизации против КАВ или других патогенов, которое заключается в том, что препарат содержит рекомбинантную генетическую информацию, в соответствии о изобретением, и дополнительно один или более носитель и добавку, пригодных для использования в живых вирусных вакцинах Также интересно использование рекомбинантной генетической информации, согласно изобретению, в качестве клонирующего вектора, т е , использование КАВ-ДНК в качестве "аукариотической плазмиды" для птичьих систем, в которых фрагменты гена введены в полный или почти полный КАВ геном Использование рекомбинантной генетической информации в соответствии с изобретением, в процессе получения КАВ белка, его части, или отличного от КАВ белка in vitro или in vivo трансляцией также включено в изобретение Тоже самое относится к прокариотическим или аукариотическим клеткам, содержащим рекомбинантную генетическую информацию, как описано выше и, в частности, к таким прокариотическим или аукариотическим клеткам, которые способны экспрессировать как минимум один белок или его часть, кодируемый рекомбинантной генетической информацией, соответствующей изобретению Эти различные возможности будут подробно описываться ниже в этом описании Следующий аспект изобретения касается КАВ белка или его части, полученных in vitro трансляцией рекомбинантной генетической информации, согласно изобретению, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую КАВ белок или его часть, также как и КАВ белок или его часть, полученные выделением из прокариотической или аукариотической клетки, содержащей рекомби 11 нантную генетическую информацию, в соответствии с изобретением, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую КАВ белок или его часть, и способную к экспрессии Белок согласно изобретению имеет широкое применение, в частности, использование КАВ белка или его части дли диагностики, иммунизации или вакцинации, или для продуцирования КАВ специфичных антидел Более конкретно, изобретение включает использование КАВ белка или его части, как описано выше, в качестве реагента, связывающего КАВспецифичные антитела в процессе иммуноанализа для детектирования КАВ-специфичных антител, например, при иммуноперексидазном окрашивании, Е I А или иимунофлуорисцентном анализе, и, соответственно, в диагностическом наборе для детектирования КАВ-специфичных антител в процессе иммуноанализа, такого как иммунопероксидазное окрашивание, Е I А или иммунофлуореоцентный анализ в котором диагностический набор содержит КАВ белок или его часть, в соответствии с изобретением и желательно один или более носителей и добавок, пригодных субединичный вакцины Изобретение также предусматривает использование КАВ белка или белковой части как описано выше в качестве субединицы вакцины осуществляющей защиту против КАВ так же хорошо, как приготовление вакцины против КАВ, которая содержит КАВ белок или белковую часть в соответствии с изобретением, и желательно один или более носителей и добавок, пригодных для субединичной вакцины Использование КАВ белка или его части, как описано выше, в процессе получения КАВспецифичных политональных или моноклональных антител, также входит к объем изобретения Все эти применения будут более детально описаны ниже Следующий аспектизобретения также относится к КАВ-специфичным антителам, продуцируемым с помощью КАВ белка или его части, как описано выше, также хорошо, как другое использование КАВ специфичных антител, например, для целей диагностики, иммунизации иди вакцинации, для препаративных целей Более конкретно, интересно использование КАВ-специфичных антител, в соответствии с изобретением, в качестве связавающих реагентов КАВ белка в процессе иммуноанализа для детектирования КАВ белка, з также в диагностическом наборе дли детектирования КАВ белка в процессе иммуноанализа, причем диагностический набор содержит КАВ-специфические антитела, в соответствии с изобретением реагентов, связывающих КАВ-белок Дальнейшим примером является использование КАВ-специфичных антител, в соответствии с изобретением, для пассивной иммунизации против КАВ инфекции, а также препаратов джя пассивной иммунизации против КАВ, причем препа 12 рат содержит КАВ-специфические антитела в соответствии с изобретением, и желательно, один или более носителей и добавок, пригодных для препаратов пассивной иммунизации Что касается препаративних применений, одним примером является использованием^ КАВспацифичиых антител в соответствии с изобретением в процессе выделения и/или очистки КАВ белка Изобретение иллюстрируется следующими примерами Анализы низкомолекулярной ДНК, выделенной из КАВ-инфицированных клеток КАВ геном, выделенный из очищенного вирусного препарата, является кольцевой одпоцепочечной ДНК, с длиной около 2300 баз /Told с сотр , 1990/, Мы ожидали, что КАВ-инфицированные клетки содержат дополнительно циклическую двухцепочечную КАВ-ДНК Двухцепочечная ДНК была разрезана рестриктазами и, следовательно, могла быть прямо клонирована, в отличии от одпоцепочечной ДНК С этой точки зрения было проверено, содержит ли низкомолекулярная фракция КАВ-инфицированных клеток ДНК продукт, который отсутствует в неинфицированных клетках Низкомолекулярная ДНК была выделена из КАВ-инфицированных МДСС-MSBI и 1104-Х5 клеток и из инфицированных найнфяцировапаых 1104-Хэ клеток ДНК были фракционирована на агарозо/атидий бромид ном геле Очень слабая полога ДНК, имеющая длину около 3 килобаз, обнаруживалась в геле Этот специфичный ДНКпродукт отсутствовал в ДНК, выделенной из неинфицированных клеток В последующем эксперименте было показано, что специфическая ДНК присутствуют только в КАВ-инфицированных клетках ДНК, выделенная из инфицированных клеток, была разделена по размерам на агарозном геле Была выделена ДНК, имеющая длину 2,7-3,5кб Эта ДНК фракция должна содержать специфическую вирусную ДНК дополнительно к другим клеточным ДНК Выделенная ДНК была радиоактивно мечена и гибридизована в Саузерн-блоттинге с низкомолекулярной ДНК из КАВ-инфицированных клеток и из неинфицированных клеток Зкб-продукта ДНК гибрид изируется в блоттинге с КАВинфицированными клетками, и отсутствует в блоттинге с ДНК из неинфицированных клеток Расстояние Зкб было определено с помощью ДНК маркеров, содержащих двухцепочечные линейные молекулы ДНК Поведение циклической двухцепочечной молекулы ДНК в агарозном геле отлично от поведения линейных ДНК фрагментов ДНК в Зкб из КАВ-инфицированных клеток должна иметь линейную форму, что в действительности составляет 2,3кб Если циклическая двухцепочечная ДНК переваривается рестриктазами, режущими только в одном месте ДНК молекулы, то должна образовываться линейная молекула ДНК, имеющая размер 13 2,3кб То, что это предположений верно, было продемонстрировано раздельно инкубацией низкомолекулярной ДНК, выделенной из КАВинфицированных 1104-Х5 клеток с шестью различными энзимами рестрикции /Bam HI, Eco RI, Hind III, Kpnl, Rstl и Xbal/ Низкомолекулярная ДНК, выделенная из КАВ-инфицированных 1104Х5 клеток и вышеуказанные фрагменты рестрикции, были гибридизованы с радиоактивно меченой ДНК, как описано выше Это показало, что обработка ферментами рестрикции Baml Eco RI, Pst I и Xba I приводит к образованию молекулы ДНК имеющей размер 2,3кб ДНК из неинфицированных клеток, инкубированная с Ват НІ не содержала такой ДНК продукт Фермент рестрикции Hind III разрезает ДНК в двух местах, тогда как Крп I не разрезает Из вышерассмотренных экспериментов можно заключить, что в низкомолекулярной ДНК КАВинфицированных клеток находится циклическая молекула ДНК в 2,3кб, которая отсутствует в неинфицированных клетках, и что она и есть геном КАВ в форме циклической молекулы ДНК Клонирование и субклонирование двухцепочечной КАВ-ДНК бактериальном векторе Низкомолекулярная ДНК из КАВинфицированных 1104-5Х клеток была отдельно инкубирована с Bam HI, Eco RI Pstl и Xbal ДНК разделялась на агарозном геле с низкой точкой плавления Из всех четырех препаратов была выделена молекула ДНК в 2,3кб Вектор клонирования plC-2OH был отдельно переварен теми не четтырьмя ферментами рестрикции, которые режут низкомолекулярную ДНК Линейный вектор был обработан кишечной щелочной фосфатовой теленка Каждый 2,3кб фрагмент ДНК лигирован к соответствующему рестрикционному сайту р С2ОН Продукты лигирования были перенесены в Е coli штамм HBIOI Все 4 клона дали плазмиды, содержащие вставленную ДНК, имеющую размер около 2,3кб Дальнейший рестрикционный анализ показал, что, как минимум, 7 плазмид содержат такой же ДНК-фрагмент Место интеграции вектора, тем не менее, отличается, так как используются различные ферменты для разрезания циклической молекулы При использовании ферментов Baml Eco RI, Pst I и Xba I была составлена рестрикционная карта всех четырех КАВ ДНК клонов Четыре "различные" КАВ ДНК-плазмиды были радиоактивно мечены и гибридизованы путем Саузерн-блоттинга с Bam HI - обработанной ДНК, выделенной из КАВ-инфицированных или КАВ неинфицированных клеток Все тестируемые клоны гибридизовались только с 2,3кб молекулой ДНК, присутствующей а ДНК КАВ- инфицированных клетках Биологическая активность двух КАВ ДНК клонов Два КАВ клона рІС-2ОН /КАВ Eco RI и plC-2OH /KAB-Ps+1 были обработаны ферментами рестрикции так, что КАВ ДНК была полностью выреза 14 на из вектора Линейные КАВ ДНК-молекулы были обработаны Т4-ДНК лигазой Линейные ДНК были, таким образам превращены в кольцевые Тзпэрь «клонированные» КАВ ДНК имели двухцепочечную кольцевую форму, также проявляемую КАВ ДНК дикого типа в инфицированных клетках MDCC-MSBI 1104-X5 клетки были трансфицированы "клонированными" кольцевыми КАВ ДНК Для клона рІС-2ОН /КАВ Eco RI очень четкий цитопатогенный эффект (ЦПЭ) был найден для клеток обоих видов Клон plC-2OH /KAB-Pst+1 проявлял четкий ЦПЭ в клетках MDCC-MSBI и менее четкий ЦПЭ в клетках 1104-Х5 Тем не менее, зэ супернатанты трансцидированных plC-2OH /KABPst 1104-X5 клеток проявляли ясный ЦПЭ в MDCC-MSBI клетках Трансфекция ДНК, выделенной из КАВ-инфицированных клеток, также ведет з четкому ЦПЭ в MDCC-MSBI клетках, хотя в 1104Х5 клетках наблюдали менее четкий ЦПЭ ЦПЭ не наблюдали после трансфекции MDCC-MSBI или 11С4-Х5 клеток ДНК PIC-2OH вектора Саузерн анализ показал, что в клеточных лизатах MDCC-MSBI и 1104-Х5 клеток, инфицированных вирусом, полученным клонированием КАВ ДНК, присутствовала КАВ ДНК Тест на нейтрализацию с MDCC-MSBI клетками показал, что ЦПЭ, вызванный клонированными ДНК в трансфицированных клетках, был результатом КАВ инфекции Нейтрализующие антитела, направленные против КАВ инфекции предотвращает ЦПЭ MDCC-MSBI клеток, инфицированных КАВ-потомками трансфицированных клеток Однодневных птенцов инъецировали внутримышечно супернатантом трансфицированных клеток У птенцов супернатанты вызывали те же клинические симптомы, что и КАВ дикого типа замедление роста, изменение костного мозга и уменьшение содержания гематокрита /анемия/, атрофия тимуса /истощение специфической популяции Т клеток/, и смертность Супернатанты клеток, трансфицированных вектором, не приводят к симптомам заболевания у контрольных птенцов Секвенирование двухцепочечной ДНК КАВ генома Полная двухцепочечная ДНК КАВ генома была полностью секвенирована методом Сангера /Sanger и сотр , 1977/ и методом Максама Гилберта С помощью праймеров секвенированиямзров МІЗ обратного секвенирования MI3 последовательность ДНК размером 2300 п о была определена для рІС-2ОН /КАВ (ВамНІ, Eco RI, Pstl и Xbal) клонов Затем КАВ геном был субклонирован ДНК последовательность для различных 5 субклонов ДНК КАВ генома была определена Методом Сангера с помощью МІЗ затравки /или методом Максама Гилберта Таким образом, последовательность ДНК обеих цепей КАВ генома была определена Длина КАВ (двухцепочечной) ДНК - 2319по Первое основание Есо Р1 сайта кольцевого КАВ генома пронумерован +1 Последовательность ДНК цепи, содержащая наибольшую открытую 15 рамку считывания показана на рис 1 и названа (+) цепью Состав оснований в этой цепи 25,5% аденина, 28,7% цитозина, 27,7% гуанина, 18,1% тими Компьютерное изучение возможной гомологии КАВ генома с уже известными вирусными последовательностями, показало, что эта ДНК прежде не была описана и не является частью ранее описанных групп вируса Первоначальная гипотеза о том, что КАВ является парвовирусом просуществовала недолго, до тех пор, дока последовательность и форма ДНК КАВ генома (кольцевая) не были изучены С помощью компьютерного изучения организация КАВ генома была охарактеризована Открытые рамки считывания, элементы промотора/усилителя, сигнал и сайт полиаденилирования, и "начало репликации" были предсказаны Рис 2 показывает предполагаемые открытые рамки считывания длиной 3006 для обеих ДНК цепей КАВ Рис 2а показывает открыто не рамки считывания, начиная с кодона АТГ АТГ кодон является наиболее часто используемым инициирующим кодоном для белков Замечено, что одна из двух ДНК цепей кодирует 3 белка, имеющих длину в 449 аминокислот (51,6 кДа), 216 аминокислот (24 кДа) л и в 121 аминокислоту (13,3 Todd с сотр (1990) обнцружил 50кД белок в очищенном КАВ Если используются все открытые рамки считывания, то около 80% вирусного генома транслируется Некоторые области даже дублируются Вполне возможно, что 3 открытые рамки считывания транслировались с I РНК Предполагаемый старт РНК молекулы находится в положении 354 и поли(А) добавление - в позиции 2317 Только поли(А) сигнал находится в позиции 2287 + цепи Маловероятно, чтобы открытые рамки считывания были использованы на другой ДНК цепи, так как эта цепь не содержит некоторые существенные регуляторные последовательности Рис 2Б и 2С показывают открытые рамки считывания, использующие, соответственно, ЦТГ и ГТГ стартовые кодоны Тем не менее, описано только несколько белков, для которых эти стартовые кодоны действительно используются (Напп с сотр , 1983) Компьютерные исследования сходства между отдельными КАВ белками и уже известными белками обнаружили только ограниченные области гомологии по последовательностям, присутствующим в программах Соответственно, трудно предположить, к какому типу белков относятся КАВ белки Относительно высокие показатели были получены для белков вирусного капсида, ДНК связывающих белков и коагулирующих кровь белков Результаты здесь не приводятся Экспрессия белков регулировалась промотор/усилитель элементами (Джонс, 1990) Эукаритический промотор имеет наиболее правое положение до старта транскрипции КАВ последовательность содержит до cap-сайта основные элементы ТАТА бокс, SPI бокс, и СААТ бокс Последовательность этих боксов прекрасно 16 соответствует описаниям для большинства аукаритических промоторов (Таблица 1) Вокруг позиции 285 могут быть сайты связывания для четырех различных факторов транскрипции CREB, Ml F, СТ и РЕА-1 Эукаритический ген также содержат элементы Энханера, детерминирующие длину эукаритического промотора Предполагаемые энханирные элементы локализованы между позициями 144 и 260 и представляют собой пять прямых повторов в 21 нуклеотид каждый Все повторы имеют 19 идентичных нуклеотидов Только последние 2 нуклеотида отличны Повтор 1 ддонтшон 2-му, 3-й равен 5-му Повтора 1, 2 и 3 локализованы рядом друг с другом, также как 4 и 5 Между 3 и 4 существует «щель» в 12 нуклеотидов Компьютерные изучение показало, что описанные энханиры (эукаритические) Но содержат все последовательности, найденные для вероятных энханирных элементов КАВ Все прямые повторы содержат АТФ элемент, который может быть включен в усиление транскрипции КАВ РНК Прямые повторы содержат дважды последовательность ЦАТЦЦ и дважды последовательность ЦАГЦЦ Последняя последовательность частично перекрывается с ЦААТ боксом Эти четыре последовательности имеют только 1 неправильное спаривание с ЦАЦЦЦ боксом, описанным для р-глобина (Табл 1) Рис 3 показывает, что приблизительно между позициями 55 135 и между позициями 2180 и 2270 в х-цепи ДНК присутствуют очень большие шпилечные структуры в (одноцепочечнои) форме ДНК КАВ Шпилечные структуры ДНК могут быть включены в репликацию КАВДЗК Шпильки между 2180 и 2270 могут присутствовать не только в КАВ ДНК, но также и в КАВ РНК и, вероятно, играют роль при стабилизации КАВ РНК Различные формы ДНК КАВ в инфицированных клетках Четыре различные КАВ ДНК - молекулы видим обнаруживаются в Саузерн-блоттинге препарата ДНК КАВ инфицированных клеток ДНК была гибридизована с радиоактивно меченной ДНК клона рІС-2ОН /КАВ Eco Rl KAB ДНК молекулы, с точки зрения их измеренных длин и форм в неденатурированном агарозном геле и чувствительности к S 1 нуклеазе, являются, соответственно, двухцепочечными открытыми кольцами (Зкб), суперскрученной двухцепочечной ДНК (2кб), кольцевой одноцепочечнои ДНК (0,8кб), и одноцепочечнои линейной ДНК (1,5кб) Иногда линейная двухцепочечная ДНК КАВ обнаруживается (2,3кб) Todd и сотр (1990) измерили длину 0,8кб для кольцевой одноцепочечнои ДНК, выполненной из КАВ на основе электрофоретической подвижности в неденатурированном агарозном геле Детекция КАВ ДНК в вирусных препаратах Полная ДНК была выделена из КАВ и очищена в соответствии с методом, описанным Von Bulow(1989) Препарат ДНК был проанализирован анализом по Саузерну о меченой КАВ ДНК про 17 бой, содержащей полную клонированную КАВ последовательность ДНК, выделенная из очищенного КАВ, содержит молекулу ДНК размером 0,8кб, определенную в неденатурированном агарозном геле В Саузерн-аналнзе ДНК, выделенной из очищенного КАВ, с олигонуклеотидами, полученными из клонированной КАВ ДНКпоследовательности, как пробы, было продемонстрировано, что вирус содержит отрицательную ДНК цепь Исходя из этого можно заключить, что одноцепочечная ДНК КАВ в капсиде является отрицательной цепью Саузерн-анализ ДНК из КАВ природных изолятов Препараты ДНК были приготовлены из КАВ культуры, полученной из цыплят из выводков, в которых болезнь Марека протекала по возрастающей ДНК препараты из КАВ культур, полученные в 12 компаниях в Нидерландах, были собраны неселективно из коллекции 60 образцов Только в одной компании проявилась более высокая смертность благодаря болезни Марека Более того, КАВ-изолят дня выделен из цесорки КАВ культуры, исследуемые нами, были получены, главным образом, после того, как атрофия тимуса была установлена при исследовании Для целей изучения степени сходства клонированной КАВ ДНК рІС-2ОН /КАВ Есо RI и ДНК различных природных КАВ изолятов MDCC-MSBI клетки были инфицированы выделенными недаммами КАВ Был дроведен Саузерн-анализ Все ДНК препараты содержали ДНК молекулы, которые специфично гибридизовались с 32р-меченной клонированной КАВ ДНК ДНК молекулы различных КАВ природных изолятов имеют длины, соответствующие размерам клонированного КАВ, и является двухцепочечными или одноцепочечными Саузерн-блоттинг прямо проведенный с тканевыми образцами-КАВ- инфицированных цыплят обнаружил содержание молекул ДНК, гибридизованных с меченным рІС-2ОН /КАВ Есо RI Рестрикционный анализ ДНК из КАВ природных изолятов Родство ДНК из различных КАВ природных изолятов с клонированным КАВ геномом было затем проверено с помощью рестрикционного анализа Препараты ДНК КАВ-изолятов и клонированная ДНК были по отдельности разрезаны семью ферментами рестрикции Для всех ДНК одинаково проводили разрезание ферментами Ват Н I, Bgl I, Sst I, и Xba I ДНК из большинства природных изолятов содержала два Accl сайта и/или два Hind III сайта, тогда как ДНК только нескольких изолятов содержала Есо RI сайт Фиг 5 суммирует карты ферментов рестрикции клонированного КАВ и различных природных изолятов Приходящееся на сайте рестрикционного фермента количество природных изолятов, содержащих этот сайт, указано в скобках Полимеразная цепная реакция (ПЦР) ДНК КАВ природных изолятов Олигонуклеотиды КАВ-1 и КАВ-2 (фиг 4), по 18 лученные из клонированной КАВ ДНКпоследовательности, были синтезированы Использование этих олигонуклеотидов в ПРЦ привело к специфичному детектированию ДНК КАВ в природных изолятах ДНК, выделенная из MDCCMSBI клеток, инфицированных различными КАВ изолятами, и ДНК, выделенная из неинфицированных клеток, была амплифицирована После амплификации ДНК была электрофоретически разделена по размерам на агароза/этидий бромидном геле Амплифицированная нить 186 п о л" е , теоретически ожидаемое значение/ была визуализована, во всех ДНК-образцах клеток, инфицированных различными КАВ-изолятами Эта специфическая нить не присутствует после амплификации ДНК, выделенной из неинфицированных клеток Амплифицированные ДНК-нити всех природных изолятов показали одинаковую скорость миграции в агарозном геле Этот результат подразумевает то, что большие вставки или делеции не происходят в этой части генома различных КАВ полевых изолятов Саузерн-анализ с 3 2 рмеченым олигонуклеотидом КАВ-3 /Рис 3/ показал, что амплифицированная 186 п о ДНК является КАВ-специфичной и что нет другой ДНК-нити, гибридизующейся с КАВ-3 пробой Была проверена чувствительность детекции КАВ ПЦР ДНК была выделена из КАВинфицированных клеток, разбавлена, амплифицирована и анализирована на агароза/этидиум бромидном геле После амплификации образцов, содержащих ДНК в количестве, соответствующем количеству ДНК в примерно 100 КАВинфицированных клеток, был обнаружен КАВспецифический ДНК-фрагмент 186 п о Тем не менее, если амплифицированная ДНК подвергается Саузерн-анализу с 3 р-меченой КАВ-3 ДНК, в количестве ДНК, соответствующем количеству ДНК из 1 клетки, была найдена четко видимая КАВ-спепифичная ДНК-нить КАВ ПЦР является высоко чувствительным детектирующим методом, который до сих пор специфичен для проверки КАВ изолятов Дот-блот анализ ДНК КАВ природных изолятов о дигоксигенинмеченными КАВ ДНК-пробами Дополнительно к ПЦР был разработан анализ по детектированию ДНК из КАВ природных изолятов Этот тест основан на использовании не радиоактивных проб КАВ ДНК-вставка клона рІС2ОН/ KAB-EcoRI была помечена N-dVTPдигоксигенином Препараты ДНК из MDCC-MSBI клеток, отдельно инфицированных различными КАВ-изолятами, были нанесены на фильтры и проанализированы по их способности гибридизоваться с дигоксигенин-меченной ДНК-пробой Препараты ДНК из MDCC-MSBI клеток, инфицированных различными КАВ-изоляиами, гибридизуются с дигоксигенин-меченой ДНК-пробой, тогда как ДНК из неинфицированных клеточных культур не гибридизуется Это тест, использующий не радиоактивно-меченую КАВ ДНК-пробу, следовательно, подходит для определения ДНК КАВ при 19 родных изолятов Применения ДНК КАВ последовательности, например, ДНК рІС2ОН/ KAB-EcoRI плазмиды ики ее хасти могут быть использованы для демонстрации RAB ДНК и/или РНК в препаратах, для последующего исследования в научных и диагностических целей ДНК может быть мечена радиоактивно или другим путем, например, биотином/дигоксигенинном С помощью ДНК/РНК слот-блоттинга, Саузерн/Нозерн анализов и гибридизации in vitro присутствие КАВ нуклеиновых кислот было установлено Части КАВ последовательностей, при использовании здесь, такие являются ДНК олигомерами Олигомеры, происходящие из КАВ последовательностей клона plC-2OH/ KAB-EcoRI можно использовать в "Полимеразной Реакции Цепи" для выявления очень низких концентраций КАВ ДНК/РНК ПЦР является высоко чувствительным методом, часто используемом для детекции вирусов Диагностические наборы, для проведения выше рассмотренных исследований, возможны в практике Для научных целей применение методик, подобных картированию и удлинению праймера с КАВ ДНК фрагментами, очень важно С помощью этих двух методов КАВ РНК может быть количественно определена и далее охарактеризована Олигомеры в антисмысловой конфигурации могут быть использованы для изучения функций гена Они могут также использоваться в качестве модели для изучения новых способов ингибирования вирусной репликации КАВ ДНК может быть использована как носитель в трансфекции для малых фрагментов гена, особенно, если патогенные свойства удалены делецией в КАВ геноме КАВ олигомеры в антисмысловой конфигурации могут быть экспрессированы в составе вирусных векторов, что дает возможность изучать КАВ репликацию иди другие функции гена in vivo или in vitro РНК КАВ ДНК фрагменты, клонированные в Sp6/T7 векторах, приводят к образованию РНК продуктов КАВ ДНК, полученные транскрипцией іn vitro, можно использовать дли синтеза КАВ белков in vitro/ in vivo Таким образом, РНК молекулы, например, в экстракте пшеничных зародышей, могут быть транслированы в белкил'рансляция in vitro/ КАВ белки, полученные трансляцией in vitro, могут быть затем использованы, например, для мечения антител, направленных против КАВ в сыворотке цыплят /смотри ниже/ КАВ РНК молекулы могут также быть перенесены в клетки путем микроинъекции, чтобы транслироваться там в белки Таким образом, эффекты КАВ белков могут быть изучены на клеточном уровне Также могут быть проанализированы белок/белок и/или белок/ДНК 20 взаимодействия КАВ ДНК также могут быть использованы как пробы для определения нуклеиновых кислот в препаратах Анализы могут быть проведены с помощью слот-блоттинга, Саузерн-, Нозерн-, и гибризационного анализа in situ Эти методы могут быть использованы для развития диагностических тестов для КАВ Белки Все КАВ белки могут быть экспрессированы в прокариотических или эукариотических системах Это требует, чтобы КАВ открытия с рамки считывания были клонированы в подходящем векторе экспрессии Для бактериальной системы существует вектор экспрессии, основанный на Т7 промоторе, подходящем для экспрессии КАВ открытых рамок считывания Бакуловирусная система, дрожжи и CHO-dhfr система являются возможными эукариотическими экспрессионными системами Вирусные векторы, такие как ретровирусные векторы, также могут быть использованы, КАВ белки или эпитопы, локализованные в них, могут быть использованы для обнаружения антител против КАВ Таким образом, КАВинфицированные цыплята могут быть обнаружены КАВ белки или эпитопы, локализованные в них, могут быть использованы в иммуноанализах, таких как имунопероксидазный ELISA и иммунофлуоресцентный анализы КАВ белки или эпитопы, локализованные в них, могут использоваться для обеспечения гуморального и/или клеточно связанного иммунитета против КАВ КАВ белки, полученные экспрессией в эукариотических или прокариотических системах вектор/хозяин, могут использоваться для получения субъединичных вакцин С помощью КАВ белков или их эпитопов можно получить КАВ специфичные антитела, что дает возможность обнаружить КАВ-белки э препаратах КАВ-инфицированных птенцов /смотри ниже/ Антитела В ряде инфекционных тестов на молодых птенцах можно было заключить, что материнские антитела могут обеспечивать эффективную пассивную защиту против КАВ инфекции Материнские антитела были перенесены в молодых птенцов естественным путем, а также через инъекцию только родившимся птенцам яичных желтковых экстрактов, содержащих КАВ антитела Пассивная защита от КАВ инфекции также достигается путем инъекции экстрактов яичных желтков из яиц несушек, которые были инфицированы прямо перед периодом вынашивания Вакцинация несушек КАВ белками, экспрессированными в одной или более экспрессионных системах, приводит и образованию материнских антител Молодые птенца этих несушек будут защищены от КАВ инфекции Диагностические тесты могут быть разработаны на основе антител против КАВ Как политональные, так и моноклональные антитела могут быть использованы С помощью КАВ 21 специфичных антител препараты могут быть проверены на присутствие КАВ белков Выше рассмотренные возможности применения КАВ антител в равной мере относятся как к антителам, полученным способами, описанными здесь, так и природным КАВ антителам Живые вирусные вакцины Обеспечение иммунной системы вирусными белками с помощью вектора живого вируса, вероятно, приводит к лучшему иммунному ответу, чем субъединичная вакцина Одна ила более КАВ открытых рамок считывания /полностью или частично/ могут быть клонированы в векторах живого вируса Для домашней птицы могут только использоваться живые вирусные векторы, что само по себе показывает хорошую репликацию в системе птиц Подходящими в качестве векторов для применения в цыплятах являются, например вирус оспы птиц, векторы ретровирусов, векторы герпес вируса, вирус герпеса птиц серотипа 1,2 и 3/ и вирус инфекционного ларинготрахеита и, возможно, также аденовирусы, такие как CELO Иммунизация вышеуказанными векторами живых вирусов защищает против КАВ и вирусов переносчиков С помощью одной и более делеций в КАВ геноме можно разработать вакцины, которые иммунизируют молодых птенцов от КАВ инфекции Делетированы должны быть патогенные детерминанты КАВ инфекции, но реплекативные и, следовательно, иммунизирующие свойства должны быть сохранены КАВ-геном может быть сам по себе пригодным в качестве живого вирусного вектора для экспрессии антигенов других вирусов Это требует, чтобы КАВ геном был изменен так, чтобы дополнительно или вместо КАВ белков «посторонние» вирусные белки экспрессировались КАВ векторы, следовательно, должны быть сконструированы так, чтобы имелась защита против «посторонних» вирусов исключительно, или также против КАВ, в зависимости от экспрессии вирусных белков с помощью рекомбинантного вектора в вакцинированном животном КАВ вакцины, полученные как субъединичная вакцина, делеционная вакцина или фрагмент гена в другом вирусном векторе, следует главным образом использовать для вакцинации несушек Тем не менее, вакцинация птенцов в юном возрасте, например, в комбинации с вакцинацией против болезни Марека, также входит в возможное использование изобретения Элементы энхансер/промотор Элементы КАВ промотора и энхансера могут быть клонированы в ДНК векторы Под контролем КАВ промотора/энхансера КАВ белки или "посторонние" белки могут быть экспрессированы как в клетках цыплят, так и в других клетках Возможно, КАВ промотор функционирует в клетках костного мозга В качестве модельной системы для генной терапии "посторонние" белки были экспрессированы in vitro в клетках костного 22 мозга с помощью КАВ элементов промотор/ энхансер, обычно в комбинации с ретровирусныыи векторами Генетически модифицированные клетки костного мозга могут затем трансплантироваться в костный мозг, в данном случае, цыпленка Для очень маленьких генных фрагментов КАВ геном также подходит для использования в качестве вектора КАВ элементы энхансер/промотор могут быть также активны в других организмах Указанные элементы могут быть также использованы в, например, мышиной системе в качестве модели для генной терапии Возможность использования полного или до существу полного генома КАВ в качестве вектора клонирования, т е как разновидности эукариотической плазмиды для систем птиц, реальна с точки зрения выявленной структуры КАВ генома Депонирование КАВ клона рІС-2ОН/ КАВEcoRI HBIOI клетки, трансформированные плазмидой plC-2OH/ KAB-EcoRI были депонированы в Центральном бюро культур в Баарне, Нидерланды, 7 сентября 1990 года, под номером CBS 361 90 Описание рисунков Рис 1 показывает нуклеотидную последовательность клонированной КАВ ДНК Полная длина - 2319 оснований, первый гуанин EcoRI - сайта обозначен под №1 Рис 2 показывает предполагаемые открытые рамки считывания, имеющие длину более 300 оснований для обеих цепей ДНК Предполагаемые открытые рамки считывания стартовых кодонов АТГ, ЦТГ и ГТГ показаны в рисунках 2А, 2Б, 2С, соответственно Рио 3 показывает предполагаемые шмилечные структуры КАВ генома, содержащие одноцепочечную ДНК Рис 4 показывает олигонуклеотиды, используемые в ПЦР Также показана ДНК последовательность и позиция олигонуклеотидов в КАВ геноме Положения нуклеотидов в КАВ геноме соответствует положениям нуклеотидов, как представлено на Рис 1 Рис 5 показывает карту рестрикции клонированной КАВ ДНК В скобках указано количество КАВ изолятов, содержащих соответствующий рестрикционный сайт в геноме Материалы и методы Клеточные культуры и вирусы КАВ изоляты были культивированы в трансформированных лимфобластоидных клеточных линиях из опухолей цыплят, индуцированных лейкозным вирусом птиц подгруппы А (1104-Х-5), или вирусом заболевания болезни Марека (MDCCMSBI) Клеточные культуры были инфицированы около 0,1-ІТСІ 50 на клетку Клетки собирали после двух дней Клетки были инфицированы вирусом клонированной КАВ ДНК, или природными изолятами КАВ-Сих-1, впервые выделенный в Германки из выводка цыплят, пострадавших от 23 болезни Марека (Von Bulow с сотр , 1983, 1985), был предоставлен доктором М С Me Nultu, Ветеринарная Исследовательская Лаборатория, Белфаст, Северная Ирландия В январе 1988 года доктор Дж П Розенбергер, Университет of Delaware, Newarb, США, передал нам два образца крови для определения вирулентности штамма Т1704, вызывающего болезнь Марека и его производного, MDV-Del-S, которое впервые пассировано в цыплятах Мы получили КАВ-Т-1704 и КАВDel-S изоляты из SDF-цыплят, инфицированных MDV-штаммом Т-1704 и его производным MDVDel-S Голландские КАВ изоляты были неселективно выбраны из 60 серий, которые все были культивированы в MDCC-MSBI клеточных культурах Полевой природный материал был поставлен I С Vamler Wijnciard, Gerondheidsdienst Brabant at Boxtlernl Nabc, главным образом, потому что атрофия тимуса была установлена в течение вскрытия КАВ изоляты, полученные из наших собственных SPF-выводков, были добавлены к сериям Выделение общей ДНК Вирусные и печеночные препараты были ресуспендированы в 20мМ Трио НСІ с рН 7,5, 2мМ ЭДТА, 0,2% СДС, 0,6мг/мл Протеинкиназы-К, и инкубированы в течение 1 часа при 37°С Препараты были экстрагированы системой фенол/хлороформ/изоамиловый спирт /25 241/, и ДНК осаждалась этанолом Осадок ДНК ресуспендировали в ЮОмкл J ОмМ Трио НСІ с рН 7,5,1 мМ ЭДТА Экстракция и анализ низкомолекулярной ДНК Низкомолякулярная ДНК была выделена из КАВ-инфицированных 1104-Х5 и MDCC-MSBI клеток и неинфицированных 1104-Х5 клеток, в соответствии с методом, описанным Hirt /1967/ ДНК разделяли на агарозных гелях и, после окрашивания о этидиум бромидом, прямо анализировали с помощью УФ света или блоттировали на фильтре в соответствии с методом, описанным Southern /1982/, Блоты были гибридизованы с праймированной 32р-меченой ДНК, выделенной из низкомолекулярной ДНК КАВ-инфицированных 1104-Х5 клеток, имеющей длину 2,7-3,5кб Клонирование КАВ ДНК Полный КАВ ДНК геном был клонирован в бактериальном векторе р С-2ОН Части КАВ ДНК генома были клонированы в векторе р С-19 Все этапы клонирования плазмид ДНК были проведены в основном, в соответствии о методами, описанными Maniatis с сотр /1982/ Анализ последовательности КАВ ДНК КАВ ДНК плазмиды были очищены в CsCIградиенте и путем Сефакрил S500 /фармация/ хроматографии Двухцепочечная ДНК была секвенирована с помощью Т7 ДНК полимеразы /фармация/, или с помощью Tag ДНК полимеразы /Промега/ Оба метода проводились согласно инструкциям, данным фирмами Фармация и Промега Олигонуклеотиды были обработаны Т4 нуклеотид киназой ("Фармации") 'Жесткие остановки" были сек 24 венированы согласно методу, описанному Максамом и Гилбертом /1977/ Образование кольцевой формы клонированного КАВ ДНК генома Юмкг плазмидной ДНК клонов, - содержащих полный ДНК геном, были переварены ферментом рестрикции так, что только КАВ ДНК вставка была отделена от вендора Т4 - ДНК лигазная обработка 2,3кб линейной молекулы КАВ ДНК привела к образованию циклической двухцепочечной КАВ ДНК Лигированные продукты анализировали на 0,8% агарозном геле ДЕАЕ - декстрановая трансфекция Для трансфекции 2мкг 1104-К5 и MDCC-MSBI клеток лигированной КАВ ДНК суспендировали дважды в 25мкл Милли-Q воды и смешивали с 260мкл TBS буфера К ДНК смеси добавляли 15мкгуже 10мг/мл ДЕАЕ декстрана и смесь инкубировали 30 минут при комнатной температуре 1104-Х5 клетки 50мм чашка тканевой культуры с 1-2x106 1104-Х5 клетками на чашку была промыта дважды TBS буфером TBS буфер полностью удаляли из клеточного монослоя, и добавляли ЗООмкл разбавленного раствора ДНК/ДЕАЕдекстран Клетки были инкубированы 30 минут при комнатной температуре Смесь ДЕАЕдекстран/ДНК была перенесена в 2мл 25%-ного раствора DMSO/TBS и клеточный монослой инкубировался 2 минуты при комнатной температуре Клетки промывали дважды TBS буфером, а затем добавили субстрат тканевой культуры /РРМІ 1640 или Е-МЕМ/ Клетки индуцировали при 37°С и 5% СО2 MDCC-MSBI клетки Около 2x106 MDCC-MSBI клеток центрифугировали при 1500об/мин в настольной центрифуге Среда была замещена 5мл ТВС буфера, и клетки осторожно ресуспендировали Стадию промывки повторяли Удалили весь ТБС буфер, осадок клеток осторожно ресуспендировали в ЗООмкл смеси ДЕАЕ-декстран/ ДНК и инкубировали при комнатной температуре 30 минут Добавляли 0,5мл 25% раствора DMSO/TBS и суспензию инкубировали 3 минуты при комнатной температуре Добавляли 5мл ТБС-буфера и центрифугировали при 1500об/мин в настольной центрифуге Супернатант удаляли и добавляли 50мл субстрата тканевой культуры Клетки, ресуспендировали и центрифугировали Клетки были помещены в 5мл среды для тканевой культуры и инкубированы при 37°С и 5% СОг, С целью контроля были использованы 2мкг plC-2OH плазмиды для трансфекции Тест на нейтрализацию MDCC-MSBI клетки инфицировали супернатантом MDCC-MSBI, a 1104-X5 клетки были трансфицированы клоном "КАВ ДНК" Было инфицировано около 2x104 клеток Содержание вируса в этом инокуляте не было точно известно До половины инфицированных клеточных культур к среде была добавлена политональная разбавленная 1 100 сыворотка с нейтрализующей активностью против КАВ 25 26 С целью контроля были взяты серии "ячеек" о КАВ-инфицированными клетками MSBI, причем к субстрату не была добавлена антисыворотка, направленная против КАВ КАВ инфекция однодневных птенцов Супернатенты КАВ ДНК и контрольная ДНК, трансфицированная MDCC-MSBI и 1104-Х5 клетками, были инъецированы внутримышечно однодневным птенцам Спустя 6 дней после инфекции были проведены аутопсия 5 птенцов на группу, после чего значение гематокрита и общий вес тела были измерены в первую очередь Для выделения вируса и иммуногистохимических исследований были собраны гепариновая кровь, тимус, и костный мозг Иммуногистохимическое исследование проводили с помощью пероксидазного окрашивания тимуса с использованием КАВспецифических моноклональных антител CV-I85 1 Через четырнадцать и двадцать восемь дней после инфицирования были проведена аутопия еще 5 птенцов, и все вышеуказанные анализы проводились Трис-НС /рН 8,3/, ЗмМ М С2, 0,01% сывороточного альбумина теленка, 200мкМ для каждого dNTP.iMKM для каждого олигонуклеотида и 2 единицы Tag-ДНК полимеразы /CETVS, США/, в ЮОмкл ДНК образцы были циклически инкубированы 30 раз при 93°С в течение минуты, при 55°0 в течение минуты, и при 72°С в течение 3 минут в Перкин/Элмер/ Цетус термическом диализаторе Одна десятая часть амплифицированной ДНК была прямо проанализирована на 2% агарозном/этидиум бромид ном геле, или Саузернблоттингом Использованная ДНК проба являлась олигонуклеотидом, меченным по концам 32 р в соответствии с Mamatis с сотр /1982/ Дот-Блоттинг Вставка КАВ ДНК в р10-20Н/КАВ-ЕсоР1 была помечена дигоксигенин-11 -dVTP/Boehnnger, Mannheim Германия/ в соответствии с протоколом поставщика Биомеченые РР фильтры были насыщены 1,5М NaCI и 0.15М цитратом натрия Образцы ДНК были ресуспендированы в ЮмМ Трио HCI /рН 7,5/ и 1 мМ ЭДТА, прокипячены в течение 3 минут, охлаждены на льду и нанесены на фильтр Фильтр сушили при комнатной температуре и инкубировали 30 минут при 65°С Фильтры гибридизовали с дигоксигенин меченой ДНК ДНК, меченую дигоксигенином, обнаруживали с помощью иммунологического окрашивания в соответствии с протоколом поставщика Полимеразная реакция цепи /ПЦР/ Олигонуклеотиды были синтезированы в синтезаторе циклон ДНК /Biosearch США/ Последовательность происходит от КАВ ДНК последовательности, показанной на рис 1 ПЦР была проведена с ДНК из КАВ-инфицированных и неинфицированных MDCC-MSBI клеток Конечная концентрация реагентов была 50мМ КС, 10мМ JC JD 35 Щ 50 і;ДАГГССС*Г 1ТнЄТТ»СТЛТ ТССДГСДСС* TTCTAGCCTC TAC4CAGAAA но пи *COWTCGCT ССДСТТССП ССССАГТССТ ССЛІ.С7АСА[: GGGGbTACbl CATtCGTACA ССССССССТС GCCCCCatC і ас ізо ТСЛГСССГДС ї 10 210 Ш Ш ІІй 260 270 Ї60 290 300 ГТСАСАААСА ССССПСССС THLMZCtCCC ТАССТСАССС СТЛСАССССС СТАССТСДСА СССААТСААА AGCTCCCACG ТТСССАААСТ ОЇССГПССА J50 ДААІССССЬЬ CCCAAGCCTC І С Т А Г А Т А П САССССЛСАТ J6U 1 >0 ЗВО 131} CtCA»CGtbt; TCCCLiGTGtA ТСС*ССКАА ССССССАСДА sea • іс і *за 410 440 на -IGO 4>а 4ео 4so CCCCCCCCJC СЬСССДСГСЛ АТСССССПТ АССССАСДСС CCCAACCTCG ССССЛСКСА СССИХСДСС СССАДСТАА[ ГТСАААІСАА СССТСТССАД S20 •, 10 СИАСЯ.ТАСТС САСССССАСС А Г С Л А С С С Т С (.10 6Щ 510 ПСДЄССАС 5*ч S50 590 S ТИ !вО 6DD СААСААСТТС АССССССТТС С А А А С С С С Т С А С Т С О С А С А САТССССАТТ ССТАТСССТС 690 &млдсАстд 650 слстстАГсо астстксг СССКААГСС ІСССССТКС СТТТСААСАА 740 750 760 ї 10 7ЬЧ І9С 100 АЇСААСССАА СССІСССТСС ААСААСССДТ CCTCCOCCt CfCCCAClAC *СССТАЛСС& АССТААіЛСД ААССПСАП вій CCCAAdCtCA CCACCCCHtC ААЛАҐ.СССТА Т А Д С А С Т С Т А 9ZO СССАССАССТ ACCAtllACIC 9 1ІМ CCJiGAGtCCC СА*(Л1СТСТ СТСААССТСА A A U L T T C t T tCTACCCTCA ФІГ. 1 27 що 28 іііо ГЛАССТСДС Liso ma ii?d ma uso ]jon ССССССАГСС CCCCTtACTT СЛТТССССАС СССТСТДААТ CACA*CCCCC С С - Ю Л Г Т О І 1110 Ш П L35O 1 Ш 13 ?Q 13ЄО li^Jll I'LOO tTCCCCTCCC СТЛСАССЛІС & Х А Г С С І С С А С А Г С С Ш Л ТДАТЫТЬДТ СШСССЫСЬ CAClCTTCtC Ь С Г Г С П Ї * Л И JO ИЗО НЮ 14Ї0 И60 И 70 ива Ц*1в TCACCCAAAC САСАТСЛССС КСЦАСАСАТ СС{ІГСССАТС птссссса сссдссгсп ССОСАСАП СААЛСССССТ ПСАССТССТ 1S1Q 15€й С С Г Т С А С С С С t t r C t C C A C T CTTCtCTCCC СКЛСМССС ЛТСАССССО1 С С А П С С П Д lS?o ива isoo 1500 ifinn ССТС* 1930 ічіа C7CCCCCTCC ССАСССДСАС CATCACCCI.C JOJO ПАССТАССС іозо joffj ТТСйСО-ІЯС TCTTTftCCCT їййй ;u7a jasa 2090 ;IOD CTACATACCC CCTbAACGAG CCCCTMTCA АСАСССДТСС АТССССДС7С СТЛСССйТСС J210 СГАҐГССССС її ю ССССССТААА ІІІО та и S O СССССССССС СГТАлАССЇС 2260 і ї 70 13SO 2Ї9Л йСАҐТСІССС ССЛОССССС ССТПАТЛТА «ЛСТСААГА ЛІАСДГГГАТ Фіг. 1 [продовження] 2 2 » В 33 IBIS хво ft** lt-JS Фіг. 2a Тїїї" Ф і г . 2b 1941 ЗО 29 « ця* iff UJ — t. Фіг. 2с G С G С G С G G Q G G С G A С С С С С С С T А ь т А Т А Т G С G С С Г I С С С А С G С G С С С С С С С & Т G G ] А С т д 2180 Фіг. За 2266 С С С С С С С G С G G G С Т 32 31 т т с с Я G С С С Т т с С G 3 С С G Г'й А Т А Т С С С 3 К Г G С Q G Т А 59 ЭЗ Фіг. ЗЬ С G Q С С С к 2 G GГ С с С С с С GС С с с с с с Gс т А А С G С 90 т А Фіг. Зс 33 34 360 3 SO 400 45а 470 CAU-L CRV-Э • > 520 Фіг. 4 ДеЙ-356 (20) Фіг. Б ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044)456-20-90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71