Трансгенна рослина кукурудзи mir604

1. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що містить SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4 або комплементи SEQ ID NO: 14. 2. Амплікон, який містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 1. 3. Рослина кукурудзи, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 1. 4. Рослина кукурудзи за п. 3, у якій після розщеплення геномної ДНК рослини рестриктазою KрnІ при гібридизації в строгих умовах з використанням специфічного для сry3А055 зонда утворюється одна відповідна сrу3А055 смуга гібридизації. 5. Рослина кукурудзи за п. 3, у якій після розщеплення геномної ДНК рослини рестриктазою KрnІ при гібридизації в строгих умовах з використанням специфічного для pmi зонда утворюється одна відповідна pmi смуга гібридизації. 6. Пара полінуклеотидних праймерів, яка включає перший полінуклеотидний праймер і другий полінуклеотидний праймер, які функціонують разом у присутності в зразку ДНК-матриці з варіанта кукурудзи MIR604, з утворенням амплікону, який є діагностичним для варіанта кукурудзи MIR604, де перша праймерна послідовність являє собою або є комплементарною до геномної послідовності рослини кукурудзи, які фланкують інсерційний сайт гетерологічної послідовності ДНК, яка вбудована в геном рослини кукурудзи варіанта кукурудзи MIR604, а друга полінуклеотидна праймерна послідовність являє собою або є комплементарною до гетерологічної послідовності ДНК, яка вбудова 2 (19) 1 3 94893 4 тоду ампліфікації нуклеїнової кислоти або гібридизації нуклеїнової кислоти. 11. Біологічний зразок за п. 10, який вибирають із групи, яка включає кукурудзяне борошно, кукурудзяне борошно великого помелу, кукурудзяний сироп, кукурудзяну олію, кукурудзяний крохмаль і зернові продукти, які повністю або частково складаються з побічних продуктів, отриманих з кукурудзи. 12. Екстракт, отриманий з рослини, тканини або насіння варіанта кукурудзи MIR604, що містить молекулу нуклеїнової кислоти відповідно до пункту 1 або її комплемент, де молекулу нуклеїнової кислоти можна виявляти в екстракті за допомогою методу ампліфікації нуклеїнової кислоти або гібридизації нуклеїнової кислоти. 13. Екстракт за п. 12, де зразок вибирають із групи, яка включає кукурудзяне борошно, кукурудзяне борошно великого помелу, кукурудзяний сироп, кукурудзяну олію, кукурудзяний крохмаль і зернові продукти, які повністю або частково складаються з побічних продуктів, отриманих з кукурудзи. 14. Спосіб одержання рослини кукурудзи, стійкої принаймні до кукурудзяного жука, який полягає в тому, що: (а) здійснюють опилення вручну першої батьківської рослини кукурудзи другою батьківською рослиною кукурудзи, де перша або друга батьківська рослина кукурудзи містить ДНК варіанта MIR604, одержуючи тим самим множину рослин покоління першої генерації; (б) відбирають рослину покоління першої генерації, за наявністю ДНК варіанта MIR604 способом за п. 7; (в) здійснюють самоопилення вручну рослини покоління першої генерації зі стадії (б), одержуючи тим самим множину рослин покоління другої генерації, та культивують насіння; (г) відбирають із рослин покоління другої генерації рослину, за наявністю ДНК варіанта MIR604 способом за п. 7; де рослина покоління другої генерації зі стадії (г) містить молекулу нуклеїнової кислоти відповідно до пункту 1. 15. Спосіб за п. 14, який додатково включає стадію зворотного схрещування рослини покоління другої генерації, що містить ДНК варіанта кукурудзи MIR604, із батьківською рослиною, у якої відсутня ДНК варіанта кукурудзи MIR604, з отриманням в результаті зворотного схрещування покоління рослини, яка має стійкість до зараження принаймні кукурудзяним жуком. 16. Набір для виявлення присутності в біологічному зразку нуклеїнових кислот MIR604, який містить принаймні одну молекулу нуклеїнової кислоти, яка являє собою або є комплементарною до молекули нуклеїнової кислоти за п. 1, що функціонує як ДНКпраймер або зонд, специфічний для варіанта кукурудзи MIR604. Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід загалом стосується галузі молекулярної біології рослин, трансформації рослин і селекції рослин. Більш конкретно винахід стосується стійких до комах трансгенних рослин кукурудзи, які містять новий трансгенний генотип, і способів виявлення присутності ДНК рослини кукурудзи в зразку й у композиціях. Передумови створення винаходу Шкідники рослин є основним чинником, який викликає втрати врожаю важливих сільськогосподарських культур в усьому світі. Щорічний збиток, заподіяний зараженням шкідниками крім ссавців, включаючи комах, становить у США приблизно 8 мільярдів доларів. Різні види кукурудзяного жука (CRW) вважаються шкідниками, які завдають найбільшої шкоди посівам кукурудзи. Важливими видами кукурудзяних жуків є західний кукурудзяний жук Diabrotica virgifera virgifera, північний кукурудзяний жук D. longicornis barberi, південний західний кукурудзяний жук D. undecimpunctata howardi і мексиканський кукурудзяний жук D. virgifera zeae. Для боротьби із кукурудзяним жуком в основному застосовують широкомасштабне внесення хімічних пестицидів. За допомогою цього методу можна досягати ефективного зниження чисельності кукурудзяного жука, однак такі хімічні агенти іноді також шкідливо впливають на корисні організми. Іншою проблемою, яка виникає при широкому застосуванні хімічних пестицидів, є розвиток стій кості в деяких ліній комах. Цю проблему можна частково вирішувати за допомогою різних використовуваних у сільськогосподарській практиці методів контролю чисельності шкідників, однак потреба в розробці альтернативних шляхів для боротьби зі шкідниками все зростає. Одним з таких альтернативних підходів є експресія чужорідних генів, які кодують інсектицидні білки в трансгенних рослинах. Цей підхід забезпечує ефективний захист від комах-шкідників, і трансгенні рослини, які експресують інсектицидні токсини, надходять у продаж, що дозволяє фермерам знижувати кількість застосовуваних хімічних інсектицидів. На експресію чужорідних генів у рослинах може впливати їх положення на хромосомі, що, імовірно, залежить від структури хроматину або близького розташування елементів регуляції транскрипції до сайту інтеграції (див., наприклад Weising і ін., «Foreign Genes in Plants», Ann. Rev. Genet. 22, 1988, стор. 421-477). Таким чином, загальноприйнятою практикою є одержання сотень різних варіантів і скринінг цих варіантів для виявлення одного варіанта, який має необхідні рівні й схеми експресії трансгену, придатні для комерційних цілей. Варіант, який має необхідні рівні й схеми експресії трансгену, можна застосовувати для інтрогресії трансгену в інші генетичні середовища за допомогою статевого ауткросингу за допомогою загальноприйнятих методів селекції. Потомство, отримане в результаті такого схрещування, збері 5 гає характеристики експресії вихідного трансформанту. Цю стратегію застосовують для гарантії надійної генної експресії у великій кількості сортів, які добре адаптовані до місцевих умов виростання. Важливо вміти виявляти присутність конкретного варіанта для того, щоб визначати чи містить потомство, отримане в результаті статевого схрещування, трансген, який представляє інтерес. Крім того, метод виявлення конкретного варіанта може бути корисний для виконання вимог регулювальних органів на стадії до надходження на ринок, необхідних, наприклад, для одержання дозволу на продаж і для мічення харчових продуктів, отриманих з рекомбінантних культурних рослин. Присутність трансгену можна виявляти за допомогою добре відомого методу виявлення нуклеїнових кислот, включаючи (але, не обмежуючись ними) термічну ампліфікацію (полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)) з використанням полінуклеотидних праймерів або ДНК-гібридизацію з використанням нуклеїнових кислот-зондів. Як правило, для простоти й однаковості реагентів і методологій, застосовуваних для виявлення конкретної конструкції ДНК, яку використовували для трансформації різних сортів рослин, ці методи виявлення, як правило, сфокусовані на часто застосовуваних генетичних елементах, наприклад промоторах, термінаторах і маркерних генах, оскільки в багатьох конструкціях ДНК кодувальна ділянка послідовності може нести внутрішні заміни. У результаті такі методи не можна застосовувати для виявлень відмінностей між конструкціями, які можуть відрізнятися тільки кодувальною послідовністю. Крім того, такі методи можуть виявитися неефективними при виявленні відмінностей між різними варіантами, насамперед, отриманими за допомогою однієї й тієї ж конструкції ДНК, якщо послідовність хромосомної ДНК, яка прилягає до вбудованої гетерологічної ДНК («фланкуюча ДНК»), не є відомою. Даний винахід стосується стійкого до комах трансгенного варіанта кукурудзи, у геном якого включений ген Cry3A055, описаний у публікації міжнародної заявки WO 03/018810 від 6 березня 2003 p., яка включена в даний опис як посилання, який кодує інсектицидний токсин Cry3A055, який можна застосовувати для боротьби з комахамишкідниками Diabrotica spp. У геном трансгенного варіанта кукурудзи включений також теярті, який кодує фермент фосфоманозоізомеразу (РМІ), який описаний в US 5767378, включеному в даний опис як посилання, який можна застосовувати як селектований маркер, цей ген дозволяє рослині утилізувати манозу як джерело вуглецю. Даний винахід стосується також нових виділених нуклеотидних послідовностей, унікальних для трансгенного варіанта кукурудзи, які застосовують для ідентифікації трансгенного варіанта кукурудзи й для виявлення нуклеїнових кислот трансгенного варіанта кукурудзи в біологічному зразку, а також набору, який містить реагенти, необхідні для виявлення вказаних нуклеїнових кислот у біологічному зразку. 94893 6 Короткий виклад суті винаходу Даний винахід стосується трансгенного варіанта кукурудзи, позначеного MIR604, який несе новий трансгенний генотип, який містить ген Cry3A055 і ген рті, які надають стійкість до комах і здатність утилізувати манозу як джерело вуглеводу відповідно, варіанта MIR604 кукурудзи і його потомства. Винахід стосується також трансгенних рослин кукурудзи, які несуть генотип, запропонований у винаході, насінного матеріалу трансгенних рослин кукурудзи, які несуть генотип, запропонований у винаході, і способів одержання трансгенної рослини кукурудзи, яка несе генотип, запропонований у винаході, шляхом схрещування інбредної рослини кукурудзи, яка несе генотип, запропонований у винаході, із цією ж або іншою лінією кукурудзи іншого генотипу. Трансгенні рослини кукурудзи, запропоновані у винаході, можуть мати практично всі морфологічні й фізіологічні характеристики відповідної ізогенної нетрансгенної рослини кукурудзи крім тих, які надають рослині кукурудзи новий генотип, запропонований у винаході. Даний винахід стосується також композицій і способів виявлення присутності нуклеїнових кислот варіанта MIR604 на основі послідовності ДНК рекомбінантних касет експресії, вбудованих у геном кукурудзи, які обумовлюють одержання варіанта MIR604, і геномних послідовностей, які фланкують інсерційний сайт. Варіант MTR604 можна характеризувати додатково шляхом аналізу рівнів експресії білків Cry3A055 і РМІ, а також шляхом оцінки ефективності у відношенні кукурудзяного жука. Таким чином, одним з об'єктів даного винаходу є виділена молекула нуклеїнової кислоти, яка містить принаймні 10 послідовно розташованих нуклеотидів гетерологічної послідовності ДНК, яка вбудована в геном рослини кукурудзи варіанта кукурудзи MOR.604, і принаймні 10 послідовно розташованих нуклеотидів геномної ДНК рослини кукурудзи, які фланкують інсерційний сайт гетерологічної послідовності ДНК, яка вбудована в геном рослини кукурудзи варіанта кукурудзи MIR604. Виділена молекула нуклеїнової кислоти відповідно до цього об'єкта може містити принаймні 20 або принаймні 50 послідовно розташованих нуклеотидів гетерологічної послідовності ДНК, яка вбудована в геном рослини кукурудзи варіанта кукурудзи MIR604, і принаймні 20 або принаймні 50 послідовно розташованих нуклеотидів геномної ДНК рослини кукурудзи, які фланкують інсерційний сайт гетерологічної послідовності ДНК, яка вбудована в геном рослини кукурудзи варіанта кукурудзи MIR604. Наступним об'єктом даного винаходу є виділена молекула нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, яка несе принаймні одну утворюючу пограничну послідовність (послідовність стику) варіанта MIR604, вибрану із групи, яка включає SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 2 і їх комплемента. Погранична послідовність забезпечує стик між касетами експресії, які містять гетерологічну ДНК, які вбудовані в геном кукурудзи, і ДНК геному кукурудзи, яка фланкує інсерційний сайт, і є діагностичною для варіанта MIR604. 7 Наступним об'єктом даного винаходу є виділена нуклеїнова кислота, яка зв'язує гетерологічну молекулу ДНК із геном рослини кукурудзи варіанта MIR604, що має послідовність, яка несе від приблизно 11 до приблизно 20 послідовно розташованих нуклеотидів, вибраних із групи, яка включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 і їх комплемента. Ще одним об'єктом даного винаходу є виділена молекула нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, яка включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 і їх комплемента. Наступним об'єктом винаходу є амплікон, який містить молекулу нуклеїнової кислоти, запропоновану у винаході. Ще одним об'єктом винаходу є праймери фланкуючої послідовності, призначені для виявлення варіанта MR604. Вказані праймери фланкуючої послідовності містять виділену нуклеотидну послідовність, яка несе принаймні 10-15 послідовно розташованих нуклеотидів, вибраних з нуклеотидів 1-801 SEQ ID NO: 3 (довільно позначена як 5'фланкуюча послідовність), або їх комплемента. В одному з варіантів цього об'єкта праймери фланкуючої послідовності вибирають із групи, яка включає SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 і їх комплемента. Згідно із ще одним об'єктом винаходу праймери фланкуючої послідовності містять виділену нуклеотидну послідовність, яка несе принаймні 10-15 послідовно розташованих нуклеотидів 507-1570 SEQ ID NO: 4 (довільно позначена в контексті даного опису як 3'-фланкуюча послідовність), або їх комплемента. В одному з варіантів цього об'єкта праймери фланкуючої послідовності вибирають із групи, яка включає SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 і їх комплемента. Наступним об'єктом винаходу є пари праймерів, які можна застосовувати, наприклад, для ампліфікації нуклеїнової кислоти. Такі пари праймерів включають перший праймер, який являє собою нуклеотидну послідовність, яка складається принаймні з 10-15 послідовно розташованих нуклеотидів, який являє собою або є комплементарним до однієї із вказаних вище геномних фланкуючих послідовностей (SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4), і другий праймер, який являє собою нуклеотидну послідовність, яка складається принаймні з 10-15 послідовно розташованих нуклеотидів гетерологічної ДІЖ, вбудованої в геном варіанта MIR604. Другий праймер переважно несе нуклеотидну послідовність, яка являє собою або є комплементарною до послідовності вставки, зв'язаною з послідовністю ДНК, яка фланкує рослинний геном, яка представлена в SEQ ID NO: 3 від нуклеотиду в положенні 802 до нуклеотиду в положенні 1310 і в SEQ ID NO: 4 від нуклеотиду в положенні 1 до нуклеотиду в положенні 506. Наступним об'єктом винаходу є способи виявлення в біологічному зразку присутності ДНК, яка відповідає варіанту MIR604. Такі способи поляга 94893 8 ють у тому, що: (а) приводять у контакт зразок, який містить ДНК, з парою праймерів, які при їх використанні в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти в сполученні з геномною ДНК із варіанта кукурудзи MIR604, продукують амплікон, який є діагностичним для варіанта кукурудзи MIR604; (б) здійснюють реакцію ампліфікації нуклеїнової кислоти, одержуючи тим самим амплікон; і (в) виявляють амплікон. В одному з варіантів цього об'єкта амплікон містить нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, яка включає SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, і SEQ ID NO: 4 і їх комплементи. Ще одним об'єктом винаходу є способи виявлення в біологічному зразку присутності ДНК, яка відповідає варіанту MIR604. Такі способи полягають у тому, що: (а) приводять у контакт зразок, який містить ДНК, із зондом, який гібридизується в строгих умовах з геномною ДНК варіанта кукурудзи MIR604 і не гібридизується в строгих умовах із ДНК контрольної рослини кукурудзи; (б) піддають зразок і зонд гібридизації в строгих умовах; і (в) виявляють гібридизацію зонда із ДНК. Наступним об'єктом винаходу є набір для виявлення нуклеїнових кислот варіанта MIR604 у біологічному зразку. У набір входить принаймні одна послідовність ДНК, яка містить полінуклеотидну послідовність достатньої довжини, яка являє собою або є комплементарною до SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4, де послідовності ДНК можна застосовувати в як праймери або зонди, які гібридизуються з виділеною ДНК варіанта MTR604, і які після ампліфікації або гібридизації з нуклеотидною послідовністю в зразку з наступним виявленням амплікону або гібридизації з послідовністю-мішенню, служать для діагностики присутності в зразку нуклеотидних послідовностей варіанта MIR604. У набір входять також інші матеріали, необхідні для здійснення методів гібридизації або ампліфікації нуклеїнових кислот. Іншим об'єктом даного винаходу є спосіб виявлення білка варіанта кукурудзи MIR604 у біологічному зразку, який полягає в тому, що: (а) екстрагують білок зі зразка тканини кукурудзи варіанта MIR604; (б) аналізують екстрагований білок за допомогою імунологічного методу з використанням антитіла, специфічного для інсектицидного білка або білка селектованого маркера, який продукується варіантом MIR604; і (в) виявляють зв'язування антитіла з інсектицидним білком або білком селектованого маркера. Наступним варіантом даного винаходу є біологічний зразок, отриманий з рослини, тканини або насіння кукурудзи варіанта MIR.604, де зразок містить нуклеотидну послідовність, яка являє собою або є комплементарною до послідовності, вибраної із групи, яка включає SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 2, і де послідовність можна виявляти в зразку за допомогою методу ампліфікації нуклеїнової кислоти або гібридизації нуклеїнової кислоти. В одному з варіантів цього об'єкта зразок вибирають із групи, яка включає кукурудзяне борошно, кукурудзяне борошно великого помелу, кукурудзяний сироп, кукурудзяну олію, кукурудзяний крохмаль і 9 зернові продукти, які повністю або частково складаються з побічних продуктів, отриманих з кукурудзи. Наступним об'єктом даного винаходу є екстракт, отриманий з рослини, тканини або насіння кукурудзи варіанта MIR604, що містить нуклеотидну послідовність, яка являє собою або є комплементарною до нуклеотидної послідовності, вибраної із групи, яка включає SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 2. В одному з варіантів цього об'єкта послідовність можна виявляти в екстракті за допомогою методу ампліфікації або гібридизації нуклеїнової кислоти. В іншому варіанті цього об'єкта зразок вибирають із групи, яка включає кукурудзяне борошно, кукурудзяне борошно великого помелу, кукурудзяний сироп, кукурудзяну олію, кукурудзяний крохмаль і зернові продукти, які повністю або частково складаються з побічних продуктів, отриманих з кукурудзи. Іншим об'єктом винаходу є рослини й насіння кукурудзи, які містять молекули нуклеїнових кислот, запропоновані у винаході. Ще одним об'єктом даного винаходу є спосіб одержання рослини кукурудзи, стійкої до зараження принаймні кукурудзяним жуком, який полягає в тому, що: (а) здійснюють статеве схрещування першої батьківської рослини кукурудзи із другою батьківською рослиною кукурудзи, де перша або друга батьківська рослина кукурудзи містить ДНК варіанта MIR604, одержуючи тим самим множину рослин покоління першої генерації; (б) відбирають рослину покоління першої генерації, яка має стійкість до зараження принаймні кукурудзяним жуком; (в) здійснюють самозапилення рослини покоління першої генерації, одержуючи тим самим множину рослин покоління другої генерації; (г) відбирають із рослин покоління другої генерації рослину, яка має стійкість до зараження принаймні кукурудзяним жуком; де рослини покоління другої генерації містять нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, яка включає SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 2. Наступним об'єктом даного винаходу є спосіб одержання насіння кукурудзи, який полягає в тому, що схрещують першу батьківську рослину кукурудзи із другою батьківською рослиною кукурудзи й збирають утворене насіння кукурудзи першої генерації, де перша або друга батьківська рослина кукурудзи являє собою інбредну рослину кукурудзи, запропоновану у винаході. Ще одним об'єктом даного винаходу спосіб одержання гібридного насіння кукурудзи, який полягає в тому, що: (а) саджають насіння першої інбредної лінії кукурудзи, запропонованої у винаході, і насіння другої інбредної лінії кукурудзи, яке має інший генотип; (б) культивують рослини кукурудзи із вказаної культури аж до цвітіння; (в) здійснюють емаскуляцію квіток рослин кукурудзи однієї з інбредних ліній кукурудзи; (г) дозволяють відбутися запиленню іншої інбредної лінії кукурудзи, і (д) збирають отримане в результаті гібридне насіння. Викладені вище й інші об'єкти винаходу стануть більш зрозумілими з наведеного нижче докладного опису винаходу. 94893 10 Опис послідовностей, наведених у переліку послідовностей SEQ ID NO: I: стик 5'-кінця геному - вставки. SEQ ID NO: 2: стик З'-кінця вставки - геному. SEQ ID NO: 3: послідовність 5'-кінця геному + вставки. SEQ ID NO: 4: послідовність З'-кінця вставки + геному. SEQ ID NO: 5:5'- фланкуюча вставку послідовність геному кукурудзи. SEQ ID NO: 6:3'- фланкуюча вставку послідовність геному кукурудзи. SEQ ID NO: 7-15: праймери 5'-фланкуючої послідовності, які застосовують згідно із даним винаходом. SEQ ID NO: 16-20: праймери промоторної послідовності MTL, які застосовують згідно із даним винаходом. SEQ ID NO: 21-28: праймери послідовності с/уЗА055, які застосовують згідно із даним винаходом. SEQ ID NO: 29-30: праймери послідовності ZmUbilnt, які застосовують згідно із даним винаходом. SEQ ID NO: 31-37: праймери послідовностірті, які застосовують згідно із даним винаходом. SEQ ID NO: 38: праймер послідовності NOS, який застосовують згідно із даним винаходом. SEQ ID NO: 39-46: праймери З'-фланкуючої послідовності, які застосовують згідно із даним винаходом. SEQ ID NO: 47-49: праймери й зонд cry3A055 TAQMAN. SEQ ID NO: 50-52: праймери й зоидрті TAQMAN. SEQ ID NO: 53-55: праймери й зонд ZmADH TAQMAN. SEQ ID NO: 56: зонд MIR604, який застосовують згідно із даним винаходом. SEQ ID NO: 57: послідовність правої пограничної ділянки. SEQ ID NO: 58: послідовність промотору MTL. SEQ ID NO: 59: послідовність гена cryА055. SEQ ID NO: 60: послідовність термінатора NOS. SEQ ID NO: 61: послідовність промотора ZmUblnt. SEQ ID NO: 62: послідовність гена pmi SEQ ID NO: 63: послідовність лівої пограничної ділянки. Короткий опис креслень На кресленнях показано: на фіг. 1 - ілюстрація рослинного експресійного вектора, позначеного як pZM26. На карті показаний сайт рестрикції КpnI, який застосовують для аналізу методом Саузерн-блотингу; на фіг. 2 - графічна карта, що ілюструє організацію елементів, які являють собою гетерологічні нуклеотидні послідовності, вбудовані в геном варіанта кукурудзи MIR604, і позначені відносні положення, у яких вбудовані нуклеотидні послідовності зв'язані з геномними послідовностями ДНК кукурудзи, які фланкують кінці вбудованих гетерологічних послідовностей ДНК. 1:5'-фланкуюча послідовність геному рослини (SEQ ID NO: 5); 2: права 11 погранична ділянка (SEQ ID NO: 57); 3: промотор MTL (SEQ ID NO: 58); 4: ген cry3A055 (SEQ ID NO: 59); 5: термінатор NOS (SEQ ID NO: 60); 6: промотор ZmUblNT (SEQ ID NO: 61); 7: ген pmi (SEQ ID NO: 62); 8: термінатор NOS (SEQ ID NO: 60); 9: ліва погранична ділянка (SEQ ID NO: 63); і 10:3'фланкуюча послідовність геному рослини (SEQ ID NO: 6). Визначення Наведені нижче поняття й опис методів подані для кращого розуміння даного винаходу і як посібник для звичайних фахівців у даній галузі при втіленні на практиці даного винаходу. Якщо не вказане інше, то застосовувані в описі поняття слід розглядати відповідно до їх загальноприйнятого значення, відомого звичайному фахівцеві у відповідній галузі. Визначення звичайних понять в галузі молекулярної біології можна знайти також в Rieger і ін., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5-е вид., вид-во Springer-Verlag: New York, 1994. У контексті даного опису поняття «ампліфікований» стосується створення множини копій молекули нуклеїнової кислоти або множини копій послідовності, комплементарній до молекули нуклеїнової кислоти, з використанням принаймні однієї з молекул нуклеїнової кислоти як матриці. Системи ампліфікації включають систему на основі полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), систему на основі лігазної ланцюгової реакції (ЛЦР), ампліфікацію на основі нуклеотидної послідовності (NASBA, фірма Cangene, Micicari, провінція Онтаріо), системи на основі Q-бета реплікази, систему ампліфікації на основі транскрипції (TAS) і ампліфікацію на основі заміщення ланцюга (SDA) (див., наприклад, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, під ред. D. H. Persing і ін.,, American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1993). Продукт ампліфікації називають амплікон. «Кодувальна послідовність» означає нуклеотидну послідовність, яка транскрибується з утворенням РНК, такої як мРНК, рРНК, тРНК, snPHK (М.я.РНК), смислова РНК або антисмислова РНК. Переважно потім РНК транслюється в організмі з утворенням білка. «Набір для виявлення» у контексті даного опису стосується набору, який застосовують для виявлення присутності або відсутності ДНК рослин варіанта MIR604 в образі, який містить нуклеотидні зонди й праймери, запропоновані в даному винаході, які специфічно гібридизуються в строгих умовах з послідовністю ДНК-мішенню, і інші матеріали, необхідні для здійснення методів гібридизації й ампліфікації нуклеїнових кислот. У контексті даного опису поняття трансгенний «варіант» стосується рекомбінантної рослини, отриманої шляхом трансформації за допомогою гетерологічної ДНК, наприклад, за допомогою касети експресії, яка містить ген, що представляє інтерес, і регенерації рослин з однієї рослинної клітини. Поняття «варіант» стосується вихідного трансформанту й/або потомству трансформанту, яке несе гетерологічну ДНК. Поняття «варіант» стосується також потомства, отриманого шляхом 94893 12 статевого ауткросингу трансформанту й іншої лінії кукурудзи. Навіть після повторного зворотного схрещування з рекурентним батьком (батьківська форма, з якою гібрид схрещується знову) вбудована ДНК і фланкуюча ДНК із трансформованого батька присутні в отриманому в результаті схрещування потомстві в тій же локалізації на хромосомі. Як правило, у результаті трансформації рослинної тканини одержують множину варіантів, кожний з яких несе вбудовану конструкцію ДНК у різних положеннях у геномі рослинної клітини. Конкретний варіант відбирають на основі експресії трансгену або інших необхідних ознак. Таким чином, «варіант MIR604», «MIR604» або «MIR604BapiaHT» у контексті даного опису позначає вихідний трансформант MIR604 і/або потомство трансформанту MIR604. «Касета експресії» у контексті даного опису означає молекулу нуклеїнової кислоти, яка здатна забезпечувати експресію певної нуклеотидної послідовності у відповідній клітині-хазяїні, і вона містить промотор, функціонально зв'язаний з нуклеотидною послідовністю, що представляє інтерес, яка функціонально зв'язана із сигналами термінації. Вона, як правило, містить послідовності, необхідні для правильної трансляції нуклеотидної послідовності. Касета експресії може містити також послідовності, які не є необхідними для забезпечення експресії нуклеотидної послідовності, що представляє інтерес, але які присутні у ній для створення придатних сайтів рестрикції для видалення касети з експресійного вектора. Касета експресії, яка містить нуклеотидну послідовність, яка представляє інтерес, може бути химерною, це означає, що принаймні один з її компонентів є гетерологічним відносно принаймні одного іншого її компонента. Касета експресії може являти собою також касету експресії, яка зустрічається в природних умовах, але яка була отримана в рекомбінантній формі, придатній для гетерологічної експресії. Однак, як правило, касета експресії є гетерологічною відносно хазяїна, тобто певна нуклеотидна послідовність касети експресії не зустрічається в природних умовах у клітині-хазяїні й повинна бути інтродукована в клітину-хазяїна або в предка клітини-хазяїна шляхом процесу трансформації, відомого в даній галузі. Експресія нуклеотидної послідовності в касеті експресії може знаходитися під контролем конститутивного промотору або індуцибельного промотору, який ініціює транскрипцію тільки тоді, коли клітину-хазяїн обробляють певним зовнішнім стимулом. У випадку багатоклітинного організму, такого як рослина, промотор також може бути специфічним відносно певної тканини або органа або стадії розвитку. Касету або її фрагмент, коли ними трансформують рослину, називають також «вбудована послідовність» або «послідовність-вставка». «Ген» означає певну ділянку, яка локалізована всередині геному і яка крім вищевказаної кодувальної нуклеотидної послідовності, містить інші, насамперед регуляторні нуклеотидні послідовності, відповідальні за контроль експресії, тобто за транскрипцію й трансляцію кодувальної ділянки. Ген може включати також інші 5'- і 3'- нетрансльо 13 вані послідовності й термінуючі послідовності. Можуть бути присутні також інші елементи, наприклад інтрони. Поняття «ген, який представляє інтерес», стосується будь-якого гена, який при перенесенні в рослину, надає рослині необхідні ознаки, такі як стійкість до антибіотиків, стійкість до вірусів, стійкість до комах, стійкість до хвороб або стійкість до інших шкідників, толерантність до гербіцидів, поліпшену поживну цінність, поліпшені характеристики з позицій промислової переробки або змінену репродуктивну здатність. «Ген, який представляє інтерес», може являти собою ген, який перенесений у рослини для виробництва в рослині ферментів або метаболітів, які мають комерційне значення. «Генотип» у контексті даного опису означає генетичний матеріал, успадкований від батьківських рослин кукурудзи, який не обов'язково весь експресується в рослинах кукурудзи - нащадках. Генотип MIR604 стосується гетерологічного генетичного матеріалу, яким трансформований геном рослини, а також генетичного матеріалу, який фланкує вбудовану послідовність. «Гетерологічна» нуклеотидна послідовність означає нуклеотидну послідовність, яка не зустрічається в природних умовах у клітині-хазяїні, у яку вона інтродукована, включаючи множинні копії, які не зустрічаються в природних умовах, нуклеотидної послідовності, яка зустрічається в природних умовах. «Гомологічна нуклеотидна послідовність» означає нуклеотидну послідовність, яка у природних умовах асоційована із клітиною-хазяїном, у яку вона інтродукована. «Функціонально зв'язана» стосується асоціації нуклеотидних послідовностей на одному фрагменті нуклеїнової кислоти так, що функція однієї впливає на функцію іншої. Наприклад, промотор функціонально зв'язаний з кодувальною послідовністю або функціональною РНК, коли він має здатність впливати на експресію кодувальної послідовності або функціональної РНК (тобто транскрипція кодувальної послідовності або функціональної РНК знаходиться під контролем промотору). Кодувальні послідовності у смисловій або антисмисловій орієнтації можуть бути функціонально зв'язані з регуляторними послідовностями. «Праймери» у контексті даного опису означають виділені нуклеїнові кислоти, яких «відпалюють» до комплементарного ланцюга ДНК-мішені шляхом гібридизації нуклеїнових кислот з одержанням гібриду праймеру й ланцюга ДНК-мішені, потім подовжують ланцюг ДНК-мішені за допомогою полімерази, такої як ДНК-полімераза. Пари або набори праймерів можна використовувати для ампліфікації молекули нуклеїнової кислоти, наприклад, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або інших загальноприйнятих методів ампліфікації нуклеїнової кислоти. «Зонд» означає виділену нуклеїнову кислоту, з якою зв'язана придатна мітка, яку виявляють, або репортерна молекула, така як радіоактивний ізотоп, ліганд, хемілюмінісцентний агент або фермент. У контексті опису даного винаходу такий 94893 14 зонд є комплементарним до ланцюга нуклеїнової кислоти-мішені, ланцюга геномної ДНК варіанта кукурудзи MR604. Геномну ДНК MIR604 можна одержувати з рослини кукурудзи або зі зразка, який включає ДНК із вказаного варіанта. Згідно із даним винаходом зонди включають не лише дезоксирибонуклеїнові або рибонуклеїнові кислоти, але також поліаміди або інші матеріали зонда, які специфічно зв'язуються з послідовністю ДНКмішені і які можна застосовувати для виявлення присутності послідовності ДНК-мішені. Праймери й зонди, як правило, складаються з 10 -15 або більшої кількості нуклеотидів. Праймери й зонди можуть складатися принаймні з 20 або більшої кількості нуклеотидів або принаймні з 25 або більшої кількості нуклеотидів або принаймні з 30 або більшої кількості нуклеотидів. Такі праймери й зонди специфічно гібридизуються з послідовністю-мішенню в строгих умовах гібридизації. Праймери й зонди, запропоновані в даному винаході, можуть мати послідовність, повністю комплементарну до послідовності-мішені, хоча за допомогою загальноприйнятих методів можна створювати зонди, які відрізняються від послідовності-мішені, але які зберігають здатність гібридизуватися з послідовностями-мішенями. Поняття «строгі умови» або «строгі умови гібридизації» стосуються умов, при яких зонд повинен гібридизуватися з послідовністю-мішенню в помітно більш високому ступені, ніж з іншими послідовностями. Строгі умови залежать від послідовності-мішені й повинні відрізнятися залежно від структури полінуклеотиду. Контролюючи строгість умов гібридизації й/або відмивання, можна ідентифікувати послідовності-мішені, які на 100% комплементарні до зонду (гомологічне зондування). В іншому варіанті строгість умов можна регулювати, забезпечуючи введення деяких помилкових спарювань у послідовності так, щоб виявляти більш низький рівень подібності (гетерологічне зондування). Більш довгі послідовності гібридизуються специфічно при більш високих температурах. Докладний посібник з гібридизації нуклеїнових кислот наведений в Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, частина І, розділ 2 «Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays», Elsevier: New York; і в Current Protocols in Molecular Biology, розділ 2, під ред. Ausubel і ін., вид-во Greene Publishing and Wiley-Interscience: New York (1995), а також в Sambrook і ін. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (5-е вид., вид-во Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Специфічність, як правило, визначається умовами відмивань після гібридизації, факторами, які мають вирішальне значення, є іонна сила й температура кінцевого розчину для відмивання. Як правило, вибирають дуже строгі умови гібридизації й відмивання, при яких температура приблизно на 5°С нижче, ніж кінцева температура плавлення (Тm) для конкретної послідовності при певній іонній силі й значенні рН. Тm означає температуру (при певній іонній силі й значенні рН), при якій 50% послідовностей-мішеней гібридизується з точно піді 15 браним зондом. Як правило, у строгих умовах зонд повинен гібридизуватися з підпослідовністюмішенню, але не гібридизуватися з іншими послідовностями. Прикладом строгих умов гібридизації на фільтрі методом Саузерн- або Нозерн-блотингу, для гібридизації комплементарних нуклеїнових кислот, які мають більше 100 комплементарних залишків, є застосування 50%-ного формаміду з 1 мг гепарину при 42°С, при здійсненні гібридизації протягом ночі. Прикладом дуже строгих умов відмивання є застосування 0Д5М NaCl при 72°С протягом приблизно 15 хв. Прикладом строгих умов відмивання є відмивання 0,2SSC (0,2-кратаого SSC) при 65°С протягом 15 хв. (опис SSC-буфера див. в Sambrook, нижче). Прикладом умов гібридизації, запропонованих у даному винаході, є гібридизації в 7% ДСН, 0,25М NaPO4, pH 7,2 при 67°С протягом ночі з наступними двома відмиваннями в 5% ДСН, 0,20М NaPO4, pH 7,2 при 65°С протягом 30 хвилин кожне відмивання й двома відмиваннями в 1% ДСН, 0,20 Μ NaPO4, pH 7,2 при 65°С протягом 30 хв кожне відмивання. Прикладом відмивання в умовах середньої жорсткості для дуплексів, які складаються, наприклад, більш ніж з 100 нуклеотидів, є застосування 1SSC при 45°С протягом 15 хв. Прикладом розслаблених умов відмивання для дуплексів, які складаються, наприклад, більш ніж з 100 нуклеотидів, є застосування 4- 6SSC при 40°С протягом 15 хв. Для зондів, які складаються приблизно з 10 50 нуклеотидів, строгі умови, як правило, включають концентрації солей, які відповідають менше ніж 1,0М концентрації іонів Na, як правило, приблизно від 0,01 до 1,0М концентрації іонів Na (абоінших солей) при рН від 7,0 до 8,3, при цьому температура, як правило, становить принаймні приблизно 30°С. Строгі умови також можуть бути отримані при додаванні дестабілізуючих агентів, таких як формамід. Як правило, величина відношення сигналу до шуму, дорівнює 2 (або вище) у порівнянні з виявленою при застосуванні неспорідненого зонда в конкретному досліді з гібридизації, свідчить про наявність специфічної гібридизації. Нуклеїнові кислоти, які не гібридизуються одна з одною у строгих умовах, ще є практично ідентичними, якщо білки, які вони кодують, є практично ідентичними. Це має місце, наприклад, у випадку, коли копію нуклеїнової кислоти створюють із використанням максимальної виродженості кодонів, що допускається генетичним кодом. Нижче наведені приклади наборів умов гібридизації/відмивання, які можуть застосовуватися для гібридизації нуклеотидних послідовностей, які практично ідентичні до нуклеотидних послідовностей, запропонованих у даному винаході, з якими проводиться порівняння: нуклеотидна послідовність, з якою проводиться порівняння, переважно гібридизується з нуклеотидною послідовністю, з якою проводиться порівняння, в 7%-ному додецилсульфаті натрію (ДСН), 0,5М NaPO4, 1 мМ ЕДТК при 50°С із відмиванням 2SSC, 0,1% ДСН при 50°С, переважно в 7%-ному додецилсульфаті натрію (ДСН), 0,5М NaPO4,1 мМ ЕДТК при 50°С із 94893 16 відмиванням 1SSC, 0,1% ДСН при 50°С, більш переважно в 7%-ному додецилсульфаті натрію (ДСН), 0,5М NaPO4,1 мМ ЕДТК при 50°С із відмиванням 0,5SSC, 0,1% ДСН при 50°С, ще більш переважно в 7%-ному додецилсульфаті натрію (ДСН), 0,5М NaPO4,1 мМ ЕДТК при 50°С із відмиванням 0,1SSC, 0,1% ДСН при 50°С, і ще більш переважно в 7%-ному додецилсульфаті натрію (ДСН), 0,5М NaPO4, 1 мМ ЕДТК при 50°С із відмиванням 0,1SSC, 0,1% ДСН при 65°С. Послідовності, запропоновані в даному винаході, можна виявляти з використанням вказаних вище умов. Для цілей, вказаних у винаході, застосовують строгі умови гібридизації. Поняття «трансформація» означає процес інтродукції гетерологічної нуклеїнової кислоти в клітину-хазяїн або організм. Зокрема, «трансформація» означає стабільну інтеграцію молекули ДНК у геном організму, що представляє інтерес. Поняття «трансформований»/«трансгенний»/«рекомбінантний» стосуються організму-хазяїна, такого як бактерія або рослина, у який інтродукована гетерологічна молекула нуклеїнової кислоти. Молекула нуклеїнової кислоти може бути стабільно інтегрована в геном хазяїна або молекула нуклеїнової кислоти може бути присутня також у вигляді позахромосомної молекули. Така позахромосомна молекула може мати здатність до самореплікації. Слід розуміти, що трансформовані клітини, тканини або рослини включають не лише кінцевий продукт процесу трансформації, але також і його трансгенне потомство. Поняття «нетрансформований», «нетрансгенний» або «нерекомбінантний» хазяїн стосуються організму дикого типу, наприклад, бактерії або рослини, яка не містить гетерологічної молекули нуклеїнової кислоти. У контексті даного опису поняття «трансгенний» стосується рослини, рослинної клітини або множини структурованих або неструктурованих рослинних клітин, об'єднаних за допомогою добре відомих методів генетичних маніпуляцій і інсерцій генів з послідовністю нуклеїнової кислоти, що відповідає гену, який представляє інтерес, у рослинному геномі, і, як правило, знаходиться в хромосомі клітинного ядра, мітохондрії або інших органелах, які містять хромосоми, у локусі, відмінному від присутнього звичайно в нативній рослині або рослинній клітині, або має більшу кількість копій у порівнянні з нативною рослиною або рослинною клітиною. Маніпуляції або інсерції вказаних нуклеотидних послідовностей для одержання трансгенних рослин відрізняються застосуванням мутацій, які зустрічаються в природних умовах, для одержання рослини, яка не зустрічається в природних умовах, або рослини з генотипом, який не зустрічається в природних умовах. Методи трансформації рослин і рослинних клітин добре відомі в даній галузі і являють собою, наприклад, електропорацію, мікроін'єкцію, опосередковувану Agrobacterium трансформацію й балістичну трансформацію. Застосовувана в даному описі номенклатура основ ДНК і амінокислот наведена в 37 C.F.R. § 1.822. 17 Докладний опис винаходу Даний винахід стосується генетично поліпшеної лінії кукурудзи, яка продукує інсектицидний білок Cry3A055 і фермент фосфоманозоізомеразу (РМІ), що дозволяє рослинам утилізувати манозу як джерело вуглецю. Винахід стосується насамперед трансгенного варіанта кукурудзи, позначеного MIR604, який несе новий генотип, а також композицій і способів виявлення нуклеїнових кислот цього варіанта в біологічному зразку. Винахід стосується також рослин кукурудзи, які несуть генотип MIR604, трансгенного насіння, отриманих рослин кукурудзи, і способів одержання рослини кукурудзи, яка несе геном MIR604, шляхом схрещування інбредної лінії кукурудзи, яка несе генотип MIR604, із цією ж або іншою лінією кукурудзи. Рослини кукурудзи, які несуть генотип MIR604, запропоновані у винаході, можна застосовувати для боротьби з комахами-шкідниками із ряду твердокрилих, включаючи західного кукурудзяного жука Diabrotica virgifera virgifera, мексиканського кукурудзяного жука D. virgifera zeae і північного кукурудзяного жука D. longicornis barberi. Рослини кукурудзи, які несуть генотип MIR604, запропоновані у винаході, можуть також утилізувати манозу як джерело вуглецю. Одним з варіантів здійснення даного винаходу є виділена молекула нуклеїнової кислоти, яка містить принаймні 10 або більше (наприклад 15, 20, 25 або 50) послідовно розташованих нуклеотидів гетерологічної послідовності ДНК, вбудованої в геном рослини кукурудзи варіанта кукурудзи MIR604, і принаймні 10 або більше (наприклад, 15,20,25 або 50) послідовно розташованих нуклеотидів геномної ДНК рослини кукурудзи, яка фланкує інсерційний сайт гетерологічної послідовності ДНК, вбудованої в геном рослини кукурудзи варіанта кукурудзи MIR604. Винахід стосується також нуклеотидних послідовностей, які містять 10 або більшу кількість послідовно розташованих нуклеотидів послідовності-вставки з варіанта MIR604 і принаймні один нуклеотид фланкуючої ДНК із варіанта MIR604, який прилягає до послідовностівставки. Такі нуклеотидні послідовності можна застосовувати для діагностики для варіанта MIR604. Ампліфікація нуклеїнової кислоти з геномної ДНК варіанта MIR604 приводить до одержання амплікону, який містить такі діагностичні послідовності. Іншим варіантом здійснення винаходу є виділена молекула нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, яка несе принаймні одну пограничну послідовність варіанта MIR604, що вибирають із групи, яка включає SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 2 і їх комплемента, де погранична послідовність забезпечує стик між гетерологічною касетою експресії, вбудованою в геном кукурудзи, і ДНК геному кукурудзи, яка фланкує інсерційний сайт, і яка є діагностичною для варіанта MTR604. Наступним варіантом здійснення даного винаходу є виділена нуклеїнова кислота, яка зв'язує гетерологічну молекулу ДНК із геном рослини кукурудзи варіанта кукурудзи MIR604, яка має послідовність, яка несе від приблизно 11 до приблизно 20 послідовно розташованих нуклеотидів, вибра 94893 18 них із групи, яка включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 і їх комплемента. Ще одним варіантом здійснення даного винаходу є виділена молекула нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, яка включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 і їх комплемента. Наступним варіантом здійснення винаходу є амплікон, який містить нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, яка включає SEQ ID NO: I, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 і їх комплемента. Ще одним варіантом здійснення винаходу є праймери фланкуючої послідовності, призначені для виявлення варіанта MIR604. Вказані праймери фланкуючої послідовності містять виділену нуклеотидну послідовність, яка несе принаймні 10-15 послідовно розташованих нуклеотидів, вибраних з нуклеотидів 1-801 в SEQ ID NO: 3 (довільно позначена як 5'-фланкуюча послідовність) або їх комплементів. В одному з аспектів цього варіанта здійснення винаходу праймери фланкуючої послідовності вибирають із групи, яка включає SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 і їх комплемента. Ще одним варіантом здійснення винаходу є праймери фланкуючої послідовності, які містять виділену нуклеотидну послідовність, яка несе принаймні 10-15 послідовно розташованих нуклеотидів з нуклеотидів 507-1570 SEQ ID NO: 4 (довільно позначена в контексті даного опису як З'фланкуюча послідовність) або їх комплемента. В одному з аспектів цього варіанта здійснення винаходу праймери фланкуючої послідовності вибирають із групи, яка включає SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 і їх комплемента. Ще одним варіантом здійснення даного винаходу є пара полінуклеотидних праймерів, яка складається з першого полінуклеотидного праймеру й другого полінуклеотидного праймеру, які функціонують разом у присутності в зразку ДНКматриці з варіанта кукурудзи MIR604 з утворенням амплікону, діагностичного для варіанта кукурудзи MIR604, де перша праймерна послідовність являє собою або є комплементарною до послідовності з геному рослини кукурудзи, яка фланкує інсерційний сайту гетерологічної послідовності ДНК, вбудованої в геном рослини кукурудзи варіанта кукурудзи MIR604, а друга полінуклеотидна праймерна послідовність являє собою або є комплементарною до гетерологічної послідовності ДНК, вбудованої в геном рослини кукурудзи варіанта кукурудзи MIR604. Відповідно до одного з аспектів цього варіанта здійснення винаходу перший полінуклеотидний праймер містить принаймні 10 послідовно розташованих нуклеотидів від положення 1 до положення 801 SEQ ID NO: 3 або їх комплемента. Згідно із ще одним аспектом цього варіанта здійснення винаходу перший полінуклеотидний праймер містить нуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID 19 NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, або їх комплемента. Згідно із ще одним аспектом цього варіанта здійснення винаходу перший полінуклеотидний праймер містить принаймні 10 послідовно розташованих нуклеотидів від положення 507 до положення 1570 SEQ ID NO: 4 або їх комплемента. Відповідно до наступного аспекту цього варіанта здійснення винаходу перший полінуклеотидний праймер містить нуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, або їх комплемента. Згідно із ще одним аспектом цього варіанта здійснення винаходу другий полінуклеотидний праймер містить принаймні 10 послідовно розташованих нуклеотидів SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, або їх комплемента. Відповідно до наступного аспекту цього варіанта здійснення винаходу другий полінуклеотидний праймер містить нуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 38, або їх комплемента. Згідно із ще одним аспектом цього варіанта здійснення винаходу перший полінуклеотидний праймер, який представлений в SEQ ID NO: 15, і другий полінуклеотидний праймер, який представлений в SEQ ID NO: 28, функціонують разом у присутності в зразку ДНК-матриці з варіанта кукурудзи MIR604 з утворенням амплікону, діагностичного для варіанта кукурудзи MIR604, як описано в прикладі 4. Відповідно до наступного аспекту цього варіанта здійснення винаходу перший полінуклеотидний праймер, який представлений в SEQ ID NO: 45, і другий полінуклеотидний праймер, який представлений в SEQ ID NO: 27, функціонують разом у присутності в зразку ДНК-матриці з варіанта кукурудзи MIR604 з утворенням амплікону, діагностичного для варіанта кукурудзи MIR604, як описано в прикладі 4. Природно, як добре відомо в даній галузі, можна одержати додаткову послідовність також знаходиться в геномній послідовності крім послідовності, яка фланкує будь-який кінець вбудованих гетерологічних послідовностей ДНК, для застосування як праймерної послідовності, яку можна використовувати в такій парі праймерів для амліфикації послідовностей, які є діагностичними для варіанта MIR604. У даному описі фраза «додаткова послідовність, яка також знаходиться в геномній послідовності, крім послідовності, яка фланкує будь-який кінець вбудованих гетерологічних послідовностей ДНК» стосується насамперед послідовного зміщення від кінців вбудованих гетерологічних послідовностей ДНК, точок, у яких вбудовані послідовності ДНК, прилягають до нативної геномної послідовності ДНК, і всередину геномної ДНК конкретної хромосоми, у яку вбудовані гетерологічні послідовності ДНК. Переважно праймерна послідовність, яка відповідає частині вбудованої послідовності або комплементарна до неї, повинна забезпечувати транскрипційне подовження утворюваного ланцюга ДНК або РНК у напрямку до найближчого стику фланкуючої послідовності. От 94893 20 же, праймерна послідовність, яка відповідає частині геномної фланкуючої послідовності або комплементарна до неї, повинна забезпечувати транскрипційне подовження утворюваного ланцюга ДНК або РНК у напрямку до найближчого стику фланкуючої послідовності. Праймерна послідовність може являти собою або може бути комплементарна до гетерологічної послідовності ДНК, вбудованої в хромосому рослини, або геномної фланкуючої послідовності. Фахівець у даній галузі може легко зрозуміти важливість того, чи повинна праймерна послідовність являти собою або бути комплементарною до вказаної вище послідовності у вбудованій гетерологічній послідовності ДНК або послідовності, представленій в SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4, залежно від природи продукту, який потрібно одержати, з використанням набору праймерів, призначених для ампліфікації конкретної фланкуючої послідовності, яка містить стик між геномною послідовністю ДНК і вбудованою гетерологічною послідовністю ДНК. Ще одним варіантом здійснення даного винаходу є спосіб виявлення в біологічному зразку присутності ДНК, яка відповідає варіанту MIR604, який полягає в тому, що (а) приводять у контакт зразок, який містить ДНК, із зондом, який гібридизується в строгих умовах з геномною ДНК варіанта кукурудзи MIR604 і не гібридизується в строгих умовах із ДНК контрольної рослини кукурудзи; (б) піддають зразок і зонд гібридизації в строгих умовах; і (в) виявляють гібридизацію зонда із ДНК. Відповідно до одного з об'єктів цього варіанта здійснення винаходу амплікон містить нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, яка включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 і їх комплемента. Наступним варіантом здійснення даного винаходу є спосіб виявлення присутності в біологічному зразку ДНК, яка відповідає варіанту MIR604, який полягає в тому, що (а) приводять у контакт зразок, який містить ДНК, із зондом, який гібридизується в строгих умовах з геномною ДНК варіанта кукурудзи MIR604 і не гібридизується в строгих умовах із ДНК контрольної рослини кукурудзи; (б) піддають зразок і зонд гібридизації в строгих умовах; і (в) виявляють гібридизацію зонда із ДНК. Виявлення можна здійснювати будь-якими методами, добре відомими в даній галузі, які включають (але, не обмежуючись ними) флуоресцентний, хемілюмінісцентний, радіологічний, імунологічний або інший методи. У випадку, коли потрібно застосовувати гібридизацію як засіб ампліфікації конкретної послідовності з одержанням амплікону, який є діагностичним для варіанта кукурудзи MIR604, то мається на увазі, що одержання й виявлення амплікону можна здійснювати будь-якими добре відомими методами, які дозволяють виявляти необхідну гібридизацію з послідовністюмішенню, коли використовують один зонд або праймер, або з послідовностями, коли використовують два або більшу кількість зондів або праймерів. Мається на увазі, що поняття «біологічний зразок» стосується зразка, який містить або може містити нуклеїнову кислоту, яка складається з 5-10 нуклеотидів, які знаходяться на будь-якій стороні 21 від сайту, у якому один або два кінці вбудованої гетерологічної послідовності ДНК контактують із геномною послідовністю ДНК всередині хромосоми, у яку вбудована гетерологічна послідовність ДНК, які позначені також як пограничні послідовності. Крім того, пограничні послідовності містять як мінімум два нуклеотиди: з них перший нуклеотид розташований всередині фланкуючої геномної ДНК, і він прилягає й ковалентно зв'язаний з першим нуклеотидом у вбудованій гетерологічній послідовності ДНК. І ще одним варіантом здійснення даного винаходу є набір для виявлення нуклеїнових кислот варіанта MIR604 у біологічному зразку, причому, у набір входить принаймні одна молекула нуклеїнової кислоти достатньої довжини, яка складається з послідовно розташованих нуклеотидів, гомологічна або комплементарна до нуклеотидної послідовності, вибраної із групи, яка включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, і SEQ ID NO: 4, яка функціонує як ДНК-праймер або зонд, специфічний для варіанта MIR604, і інші матеріали, необхідні для здійснення методів гібридизації або ампліфікації нуклеїнових кислот. Можна застосовувати різні методи виявлення, включаючи TAQMAN (фірма Perkin Elmer), термічну ампліфікацію, лігазну ланцюгову реакцію, Саузерн-гібридизацію, методи на основі ELISA і колориметричні й флуоресцентні методи виявлення. Зокрема, даний винахід стосується наборів для виявлення присутності послідовності-мішені, тобто принаймні одного зі стиків вбудованої ДНК із геномної ДНК рослини кукурудзи варіанта MIR604, у зразку, який містить геномну нуклеїнову кислоту з MIR604. У набір входить принаймні один полінуклеотид, який має здатність зв'язуватися із сайтом-мішенню, або практично прилягає до сайту-мішені, і принаймні один із засобів для виявлення зв'язування полінуклеотиду із сайтом-мішенню. Засоби для виявлення можуть бути флуоресцентними, хемілюмінісцентними, колориметричними або ізотопними й для виявлення зв'язування їх можна застосовуватися в сполученні принаймні з імунологічними методами. Мається на увазі також, що за допомогою набору можна виявляти присутність у зразку сайту-мішені, тобто принаймні одного зі стиків вбудованої ДНК із геномної ДНК рослини кукурудзи у варіанті MIR604, використовуючи переважно дві або більшу кількість полінуклеотидних послідовності, які разом мають здатність зв'язуватися з нуклеотидними послідовностями, які прилягають або розташовані всередині фрагмента довжиною приблизно 100 пар основ або всередині фрагмента довжиною приблизно 200 пар основ або всередині фрагмента довжиною приблизно 500 пар основ або всередині фрагмента довжиною приблизно 1000 пар основ послідовності-мішені, і які можна подовжувати в напрямку один до одного з одержанням амплікону, який містить принаймні один сайтмішень. Ще одним варіантом здійснення даного винаходу є спосіб виявлення білка варіанта MIR604 у біологічному зразку, який полягає в тому, що: (а) екстрагують білок зі зразка тканини кукурудзи варіанта MIR604; (б) аналізують екстрагований білок 94893 22 за допомогою імунологічного методу з використанням антитіла, специфічного для інсектицидного білка або білка селектованого маркера, який продукується варіантом MIR604; і (в) виявляють зв'язування антитіла з інсектицидним білком або білком селектованого маркера. Наступним варіантом здійснення даного винаходу є рослина кукурудзи або її частини, які несуть генотип трансгенного варіанта MIR604, де генотип містить нуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, або їх комплемента. В одному з аспектів цього варіанта здійснення винаходу рослина кукурудзи одержують із інбредних ліній кукурудзи CG5NA58, CG5NA58A, CG3ND97, CG5NA01, CG5NF22, CG4NU15, CG00685, CG00526, CG00716, NP904, NP948, NP934, NP982, NP991, NP993, NP2010, NP2013, NP2015, NP2017, NP2029, NP2031, NP2034, NP2045, NP2052, NP2138, NP2151, NP2166, NP2161, NP2171, NP2174, NP2208, NP2213, NP2222, NP2275, NP2276, NP2316, ВСТТ609, AF031, Н8431, 894, BUTT201, R327H, 2044ВТ і 2070ВТ. Однак фахівцеві в даній галузі повинно бути очевидно, що генотип MIR604 можна вбудовувати в рослину будьякого іншого сорту, яку можна запліднювати рослиною кукурудзи, включаючи види дикого маїсу, і таким чином, винахід не обмежений кращими інбредними лініями. Ще одним варіантом здійснення даного винаходу є рослина кукурудзи, яка містить принаймні першу й другу послідовності ДНК, зв'язані одна з одною з утворенням безперервної нуклеотидної послідовності, де перша послідовність ДНК знаходиться в пограничній послідовності й містить принаймні 11 послідовно розташованих нуклеотидів, вибраних із групи, яка включає нуклеотиди 792811 SEQ ID NO: 3; нуклеотиди 497-516 SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; і їх комплемента, де друга послідовність ДНК знаходиться в гетерологічній послідовності ДНК-вставки, вибраної із групи, яка включає SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 і їх комплементи; і де першу й другу послідовності можна застосовувати як нуклеотидні праймери або зонди для виявлення присутності в біологічному зразку нуклеотидних послідовностей варіанта кукурудзи MIR604. Відповідно до одного з аспектів цього варіанта здійснення винаходу нуклеотидні праймери застосовують у методі ампліфікації ДНК для ампліфікації послідовності ДНК-мішені з використанням як матриці ДНК, яку екстрагують із рослини кукурудзи, а рослину кукурудзи можна відрізняти від інших рослин кукурудзи, одержуючи амплікон, який відповідає послідовності ДНК, що містить SEQ ID NO: 1 або SEQ ID NO: 2. Рослини кукурудзи, запропоновані у винаході, додатково відрізняються тим, що розщеплення геномної ДНК рослини рестриктазою ΚpnI приводить до утворення однієї смуги гібридизації, що відповідає cry3А055, при використанні специфічного для cryЗА055 зонду при гібридизації в строгих умовах. Як приклад у даному описі використовують cryЗА055-зонд, що містить нуклеотидну послі 23 довність, представлену в SEQ ID NO: 56 або SEQ ID 59. Рослини кукурудзи, запропоновані у винаході, додатково відрізняються тим, що розщеплення геномної ДНК рослини рестриктазою Крпі приводить до утворення однієї смуги гібридизації, що відповідає pmi, при використанні специфічного для pmi зонда при гібридизації в строгих умовах. Як приклад у даному описі використовують pmi-зоид, який містить нуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 62. Одним з варіантів здійснення даного винаходу є рослина кукурудзи, якій генотип MIR604 надає стійкість до комах або здатність утилізувати манозу. Відповідно до одного з аспектів цього варіанта здійснення винаходу генотип, який надає рослині кукурудзи стійкість до комах, несе ген Cry3A055. Відповідно до іншого аспекту цього варіанта здійснення винаходу генотип, який надає рослині кукурудзи здатність утилізувати манозу, несе ген pmi. Ще одним варіантом здійснення даного винаходу є біологічний зразок, отриманий з рослини, тканини або насіння кукурудзи варіанта MIR604, де зразок містить нуклеотидну послідовність, яка являє собою або є комплементарною до послідовності, вибраної із групи, яка включає SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 2, і де послідовність можна виявляти в зразку за допомогою методу ампліфікації нуклеїнової кислоти або гібридизації нуклеїнової кислоти. Відповідно до одного з аспектів цього варіанта здійснення винаходу зразок вибирають із групи, яка включає кукурудзяне борошно, кукурудзяний сироп, кукурудзяну олію, кукурудзяний крохмаль і зернові продукти, які повністю або частково складаються з побічних продуктів, отриманих з кукурудзи. Наступним варіантом здійснення даного винаходу є екстракт, отриманий з рослини, тканини або насіння кукурудзи варіанта MIR604, який містить нуклеотидну послідовність, яка являє собою або є комплементарною до послідовності, вибраної із групи, яка включає SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 2. Відповідно до одного з аспектів цього варіанта здійснення винаходу послідовність виявляють в екстракті за допомогою методу ампліфікації нуклеїнової кислоти або гібридизації нуклеїнової кислоти. Відповідно до одного з аспектів цього варіанта здійснення винаходу зразок вибирають із групи, яка включає кукурудзяне борошно, кукурудзяний сироп, кукурудзяну олію, кукурудзяний крохмаль і зернові продукти, які повністю або частково складаються з побічних продуктів, отриманих з кукурудзи. І ще одним варіантом здійснення даного винаходу є спосіб одержання рослини кукурудзи, стійкої до зараження принаймні кукурудзяним жуком, який полягає в тому, що: (а) здійснюють статеве схрещування першої батьківської рослини кукурудзи із другою батьківською рослиною кукурудзи, де перша або друга батьківська рослина кукурудзи містить ДНК варіанта MR604, одержуючи тим самим множину рослин покоління першої генерації; (б) відбирають рослину покоління першої генерації, яка має стійкість до зараження принаймні кукурудзяним жуком; (в) здійснюють самозапилення 94893 24 рослини покоління першої генерації, одержуючи тим самим множину рослин покоління другої генерації; (г) відбирають із рослин покоління другої генерації рослину, яка має стійкість до зараження принаймні кукурудзяним жуком; де рослини покоління другої генерації містять нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, яка включає SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 2. Наступним варіантом здійснення даного винаходу є спосіб одержання гібридного насіння кукурудзи, який полягає в тому, що: (а) саджають насіння першої інбредної лінії кукурудзи, яке містить нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, яка включає SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 і SEQ ID NO: 4, і насіння другої інбредної лінії кукурудзи, яке має інший генотип; (б) культивують рослини кукурудзи із вказаної культури аж до цвітіння; (в) здійснюють емаскуляцію квіток рослин кукурудзи однієї з інбредних ліній кукурудзи; (є) здійснюють статеве схрещування двох різних інбредних ліній один з одним і (д) збирають отримане в результаті гібридне насіння. Відповідно до одного з аспектів цього варіанта здійснення винаходу перша інбредна лінія являє собою материнську форму. Відповідно до іншого аспекту цього варіанта здійснення винаходу перша інбредна лінія являє собою батьківську форму. Даний винахід стосується також гібридного насіння, отриманого за допомогою вказаного способу, і гібридних рослин, вирощених із насіння. Фахівцеві в даній галузі повинно бути очевидно, що трансгенний генотип, запропонований у даному винаході, можна вбудовувати шляхом селекції в інші лінії кукурудзи, які несуть інші трансгенні генотипи. Наприклад, інбредну лінію кукурудзи, яка несе трансгенний генотип, запропонований у даному винаході, можна схрещувати з інбредною ліній кукурудзи, яка несе трансгенний генотип стійкого до лускокрилих варіанта Bt11, відомого в даній галузі, одержуючи насіння кукурудзи, яке містить як трансгенний генотип, запропонований у винаході, так і трансгенний генотип Bt11. Прикладами інших трансгенних варіантів, які можна схрещувати з інбредною лінією, запропонованою в даному винаході, є толерантні до гліфосату варіанти GA21 і NK603, толерантний до гліфосату/стійкий до комах із ряду лускокрилих варіант MON802, стійкий до лускокрилих варіант DBT418, стійкий до лускокрилих варіант DAS06275-8, варіант MS3, який має чоловічу стерильність, толерантний до фосфінотрицину варіант В16, стійкий до комах із ряду лускокрилих варіант M0N 80100, толерантні до фосфінотрицину варіанти Т14 і Т25, стійкий до комах із ряду лускокрилих варіант 176 і стійкий до твердокрилих варіант MON863, всі ці варіанти відомі в даній галузі. Очевидно, що можна одержувати інші комбінації з використанням трансгенного генотипу, запропонованого у винаході, і таким чином, ці приклади не слід розглядати як такі, що обмежують обсяг винаходу. Фахівцеві в даній галузі також повинно бути очевидно, що трансгенне насіння кукурудзи, яке несе трансгенний генотип, запропонований у даному винаході, можна обробляти різними призначеними для обробки насіння хімічними агентами, 25 такими як інсектициди для посилення або синергетичного підвищення інсектицидної активності білка Cry3A055. Наприклад, трансгенне насіння кукурудзи можна обробляти інсектицидом Cruiser®, який надходить у продаж. Таку комбінацію можна застосовувати для розширення спектру активності й підвищення ефективності експресованого білка й хімічного агента. Селекція Трансгенний генотип, запропонований у даному винаході, можна вбудовувати в інбредну або гібридну лінію кукурудзи за допомогою відомих у даній галузі методів селекції. Метою селекції рослин є об'єднання в одному сорті або гібриді різних необхідних ознак. Для польових культур ці ознаки можуть являти собою стійкість до комах і хвороб, толерантність до гербіцидів, жаро- і посухостійкість, зниження часу дозрівання культури, більш високу врожайність і поліпшену агрономічну якість. При механічному збиранні врожаю багатьох культур велике значення має однорідність характеристик рослини, таких як проростання й створення травостою, швидкість росту й висота рослини й качана. Польові культури запліднення з використанням кращого для рослини методу запилення. Рослина є самопильною, якщо пилок однієї квітки переноситься на цю ж або іншу квітку цієї рослини. Рослина є перехреснозапильною, якщо пилок потрапляє із квітки іншої рослини. Рослини, які пройшли самозапилення й відібрані відносно типу протягом багатьох поколінь, стають гомозиготними практично за всіма генними локусами і утворюють однорідну популяцію чистого отриманого в результаті селекції потомства. Схрещування двох різних гомозиготних ліній дозволяє одержувати однорідну популяцію гібридних рослин, які можуть бути гетерозиготними за багатьма генними локусами. Схрещування двох рослин, кожна з яких є гетерозиготною за декількома генними локусами, повинне приводити до одержання популяції гібридних рослин, які є генетично різними й не можуть бути однорідними. Кукурудзу можна запилювати як з використанням самозапилення, так і перехресного запилення. У кукурудзи існують відмінні одна від одної чоловічі й жіночі квітки, розташовані в волоті й качані відповідно. Природне запилення в кукурудзи відбувається, коли вітер переносить пилок з волоті на сукупність тичинкових стовпчиків (шовк), які виступають над верхівкою качанів. Надійний метод контролю чоловічої фертильності в рослини дає можливість поліпшувати селекцію рослин. Це є особливо важливим для створення гібридів кукурудзи, основою яких є певний варіант системи чоловічої стерильності. Існує декілька шляхів контролю чоловічої фертильності, які доступні селекціонерам, такі як: ручна або механічна емаскуляція (або кастрація), цитоплазматична чоловіча стерильність, генетична чоловіча стерильність, гаметоциди й т.п. Гібридне насіння кукурудзи одержують, як правило, за допомогою системи чоловічої стерильності, що передбачає ручну або механічну кастрацію. У поле висаджують альтернативні смужки 94893 26 інбредних ліній кукурудзи й у рослин однієї з інбредних ліній (материнська форма) видаляють шовк, який несе пилок. За умови достатньої ізоляції від джерел чужорідного пилку інших рослин кукурудзи качани кастрованої інбредної лінії можуть запилювати тільки іншою інбредною лінією (батьківська форма) і в результаті отримане насіння є гібридним і з нього повинні утворюватися гібридні рослини. Трудомісткий і часто ненадійний процес кастрації можна виключити шляхом застосування різноманітних методів додання генетичної чоловічої стерильності, відомих у даній галузі, кожний з яких має свої власні переваги й недоліки. Ці методи засновані на застосуванні різних підходів, таких як вбудовування в рослину гена, який кодує цитотоксичну субстанцію, зв'язану зі специфічним для тканини чоловічої статевої системи промотором, або антисмислової системи, у якій виявлений ген, який має вирішальне значення для фертильності, і він є антисмисловим для вбудованого в рослину гена [див.: Fabinjanski і ін„. ЕРО 89/3010153.8 публікація № 329308 і заявку РСТ РСТ/СА90/00037, опубліковану як WO 90/08828]. Створення інбредних ліній кукурудзи Застосування інбредних ліній із чоловічою стерильністю є одним зі шляхів одержання гібридів кукурудзи. Методи селекції рослин, які відомі в даній галузі і які застосовують у програмі селекції рослин кукурудзи включають (але, не обмежуючись ними), рекурентну селекцію, зворотне схрещування, селекцію на базі родоводу, селекцію, посилену за допомогою поліморфізму рестрикційних фрагментів, селекцію, посилену за допомогою генетичних маркерів, і трансформацію. Для створення гібридів кукурудзи в програмі селекції рослин кукурудзи потрібно, у цілому, створення гомозиготних інбредних ліній, схрещування цих ліній і оцінка гібридів. Методи селекції на базі родоводу й рекурентної селекції використовують для створення інбредних ліній з відібраних популяцій. Програми селекції рослин кукурудзи засновані на об'єднанні генетичних зворотних схрещувань не менше двох або більшої кількості інбредних ліній або різних інших джерел зародкової плазми в призначені для селекції пули, з яких одержують нові інбредні лінії шляхом самозапилення й добору необхідних фенотипів. Нові інбредні лінії схрещують із іншими інбредними лініями й оцінюють гібриди, отримані в результаті цих схрещувань, виявляючи тих з них, які мають комерційний потенціал. Селекція рослин і створення гібридів при втіленні на практиці програми селекції рослин кукурудзи, являють собою дорогі і потребуючі більших часових витрат процеси. Селекцію на базі родоводу починають зі схрещування двох генотипів, кожний з яких може мати одну або декілька необхідних ознак, які відсутні в іншого, або які комплементарні один до одного. Якщо дві вихідні батьківські форми зовсім не несуть необхідних ознак, то для селекції популяції можна використовувати інші джерела. У методі селекції на базі родоводу здійснюють самозапилення найбільш перспективних рослин і відбирають покоління, які несуть необхідні ознаки. У на 27 ступних поколіннях гетерозиготний стан переходить у гомозиготні лінії в результаті самозапилення й відбору. Як правило, при здійсненні на практиці селекції на базі родоводу проводять самозапилення й наступний відбір 5 або більшої кількості поколінь: F1F2; F2F3; F3F4; F4F5; і т.д. Відбір на основі рекурентної селекції, наприклад, зворотне схрещування, можна застосовувати для поліпшення інбредної лінії й гібриду, створеного з використанням цих інбредних ліній. Зворотне схрещування можна використовувати для перенесення конкретної необхідної ознаки з однієї інбредної лінії або джерела в іншу інбредну лінію, у якій ця ознака відсутня. Це можна здійснювати, наприклад, шляхом першого схрещування найбільш перспективної інбредної лінії (рекурентний батько) з донорською інбредною лінією (нерекурентний батько), яка несе відповідний(і) ген(и), що кодує(ють) ознаку, що представляє інтерес. Потім здійснюють зворотне схрещування потомства, отриманого в результаті цього схрещування, з найбільш перспективним рекурентним батьком з наступним відбором отриманого потомства відносно необхідної ознаки, яка повинна бути перенесена від нерекурентного батька. Після одержання за допомогою зворотного схрещування 5 або більшої кількості поколінь із відбором за необхідною ознакою потомство повинне бути гомозиготним за локусом, який контролює переносиму ознаку, але повинне нагадувати найбільш перспективного батька практично за всіма іншими генами. Потім здійснюють самозапилення останнього отриманого від зворотного схрещування покоління з одержанням чистого отриманого в результаті селекції потомства за геном(ами), що підлягає(ють) перенесенню, який(і) переносять. Гібрид, створений з інбредних ліній, який містять ген(и), що підлягає(ють) перенесенню, є практично таким же, що й інбредні лінії, у яких відсутній(і) ген(и), що підлягає(ють) перенесенню. Елітні інбредні лінії, які являють собою чисті отримані в результаті селекції гомозиготні інбредні лінії, можна також застосовувати як вихідні лінії для селекції або як популяції-джерела, з яких створюють інші інбредні лінії. Такі інбредні лінії, отримані з елітних інбредних ліній, можна створювати за допомогою методів селекції на базі родоводу й рекурентної селекції, які описані вище. Наприклад, коли селекцію за допомогою зворотного схрещування використовують для створення цих виведених ліній у програмі селекції рослин кукурудзи, то елітні інбредні лінії можна застосовувати як батьківську лінію або вихідний матеріал або популяції-джерела, і вони можуть служити або батьком-донором, або рекурентною батьківською формою. Створення гібридів кукурудзи Один отриманий схрещуванням гібрид кукурудзи створюють шляхом схрещування двох інбредних ліній, кожна з яких має генотип, комплементарний до генотипу іншого. Гібридне покоління першої генерації позначають як F1. При створенні комерційних гібридів у програмі селекції рослин кукурудзи розглядаються тільки гібридні рослини 94893 28 F1. Переважно F1-гібриди є більш сильними в порівнянні інбредними батьками. Гібридна сила або гетерозис може проявлятися в цілому ряді полігенних ознак, включаючи посилений вегетативний ріст і підвищену врожайність. Створення гібриду кукурудзи в рамках програми селекції рослин кукурудзи включає три стадії: (1) відбір рослин із груп з різною зародковою плазмою для початкових схрещувань із метою селекції; (2) самозапилення відібраних рослин, отриманих у результаті схрещування з метою селекції, протягом декількох поколінь із одержанням серій інбредних ліній, які хоча й відрізняються один від одного, передають ознаку потомству й мають високу однорідність; і (3) схрещування відібраних інбредних ліній с різними інбредними лініями з одержанням гібридного потомства (F1). У процесі процесу інбридингу в кукурудзи зростає сила ліній. Сила зберігається, коли дві різні інбредні лінії схрещують із одержанням гібридного потомства (F1). Важливим наслідком гомозиготності й гомогенності інбредних ліній є те, що гібриди двох певних пар інбредних ліній завжди є однаковими. Після того, як інбредні лінії, які дають найбільш перспективний гібрид, ідентифіковані, гібридне насіння можна відтворювати необмежено протягом строку, поки підтримується гомогенність інбредних батьків. Більша частина гібридної сили, характерної для F1-гібридів, губиться в наступному поколінні (F2). У результаті насіння гібридів не використовують як посадковий матеріал. Отримання гібридного насіння потребує елімінації або інактивації пилку, який утворюється на материнській формі. Неповне видалення або інактивація пилку служить причиною можливого самозапилення. Це отримане в результаті небажаного самозапилення насіння може бути ненавмисно зібране й упаковане разом з гібридними насіннями. Після посадки насіння можна ідентифікувати й відбирати ці отримані в результаті самозапилення рослини. Ці отримані в результаті самозапилення рослини повинні бути генетично еквіваленті до материнської інбредної лінії, яку застосовують для одержання гібриду. Як повинно бути очевидно фахівцю в даній галузі, вище викладені лише деякі різні шляхи, за допомогою яких можна одержувати інбредну лінію, запропоновану у винаході, з тих, які можна застосовувати для інтрогресії трансгенного генотипу, запропонованого у винаході, в інші лінії кукурудзи. Наведені вище приклади подані лише як ілюстрація, можна використовувати й інші шляхи. Приклади Нижче винахід докладно проілюстрований на прикладах. Ці приклади наведені лише з метою ілюстрації й не обмежують обсягу винаходу, якщо не вказане інше. У них використовуються стандартні методи рекомбінантної ДНК і молекулярного клонування, описані в Current Protocols in Molecular Biology, під ред. Ausubel, John Wiley and Sons, Inc. (1994); J. Sambrook і ін., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3-є вид., Cold Spring Harbor, NY: вид-во Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); і в T.J. Silhavy, M.L. Berman і L.W. 29 Enquist, Experiments with Gene Fusions, вид-во Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984). Приклад 1. Трансформація й відбір варіанта MR604 Варіант MIR604 одержували за допомогою опосередковуваної Agrobacterium трансформації інбредної лінії кукурудзи (Zea mays) Al 88. Ембріогений калюс типу-І трансформували загалом відповідно до методу, описаного в Negrotto і ін. [Plant Cell Reports 19,2000, crop. 798-803, 2000], публікація включена в даний опис як посилання, використовуючи ДНК-фрагмент із плазміди pZM26 (фіг. 1). pZM26 містить нуклеотидну послідовність, яка несе тандем касет експресії. Перша касета експресії містить послідовність промотору MTL (US 6018099), функціонально зв'язану з кодувальною послідовністю, Cry3A055, яка додатково функціонально зв'язана з З'-кінцем термінатора транскрипції нопалінсинтази й послідовністю поліаденілування. Друга касета експресії містить промотор убікітину з кукурудзи (ZmUbilnt) [Christensen і ін., РМВ 18, 1992, с 675], функціонально зв'язаний з кодувальною послідовністю, pmi, яка додатково функціонально зв'язана з З'-кінцем термінатора транскрипції нопалінсинтази й послідовністю поліаденілування. Незрілі ембріони вирізали з 8 - 12денних качанів і промивали свіжим середовищем для підготовки до трансформації. Ембріони змішували із суспензією клітин Agrobacterium, які несуть трансформаційний вектор pZM26, інтенсивно перемішували протягом 30 с і давали інкубуватися протягом ще 5 хв. Надлишок розчину Agrobacterium видаляли аспірацією й потім ембріони переносили в чашки, які містять неселективне культуральне середовище. Ембріони культивували разом із Agrobacterium, що залишилися, при 22°С протягом 2-3 днів у темряві. Ембріони переносили в культуральне середовище, доповнене тикарциліном (100 мг/мл) і нітратом срібла (1,6 мг/л) і інкубували в темряві протягом 10 днів. Ембріони, які продукують ембріогенний калюс, переносили в культуральне середовище, що містить манозу. Отримані в результаті регенерації проростки тестували за допомогою ПЛР-аналізу TAQMAN® (див. приклад 2), визначаючи присутність як гена рті, так і гена Cry3A055, а також відсутність гена, який обумовлює стійкість до антибіотика спектиноміцину (spec). Рослини, позитивні щодо обох трансгенів і негативні щодо гена spec, переносили в теплицю для подальшого культивування. Позитивні варіанти ідентифікували й піддавали скринінгу за допомогою біологічних аналізів з використанням комах, тобто кукурудзяного жука. У варіантів, які мають інсектицидну дію, визначали кількість копій за допомогою TAQMAN-аналізу. Основою для вибору варіанта MIR604 для подальшого аналізу служила наявність однієї копії трансгенів, достатній рівень експресії білка, визначений за допо 94893 30 могою ELISA, і висока інсектицидна активність у відношенні кукурудзяного жука. Рослини варіанта MIR604 популяції То піддавали зворотному схрещуванню з інбредною лінією кукурудзи CG00526, створюючи популяцію Т1. Рослинам популяції Т1 давали самозапилюватися для створення покоління Т2 і цей процес повторювали, створюючи покоління Т3. Потомство Т3рослин застосовували для ідентифікації гомозиготних (конвертованих) родин. Інбредну MIR604конвертовану лінію CG00526 схрещували з іншими елітними інбредними лініями, одержуючи застосовувані в подальших дослідженнях гібриди. Приклад 2. Виявлення MR604 за допомогою TAOMAN-ПЛР TAQMAN-аналіз здійснювали в основному відповідно до методу, описаного в Ingham і ін. [Biotechniques, 31, 2001, стор. 132-140], публікація включена в даний опис як посилання. У цілому, метод полягає в наступному: геномну ДНК виділяли з листя трансгених і нетрансгенних рослин кукурудзи, використовуючи набір для екстракції геномної ДНК Puregene® (фірма Gentra Systems, Міннеаполіс, шт. Мінесота) у цілому відповідно до інструкції виробника, за винятком того, що всі стадії здійснювали в 1,2-мілілітрових 96-лункових планшетах. Висушений дебрис ДНК ресуспендували в ТЕ-буфері (10 мМ Трис-НСІ, рН 8,0,1 мМ ЕДТК). TAQMAN-ПЛР здійснювали в 96-лункових планшетах. Для ендогенного контролю генів кукурудзи створювали праймери й зонди, специфічні для гена алкоголь-дегідрогенази (adh) Zea mays (Genbank, реєстраційний № AF044295). Фахівцеві в даній галузі повинно бути очевидно, що як ендогенні контролі можна застосовувати інші гени кукурудзи. Реакції здійснювали в декількох повторах для одночасної ампліфікації генів Cry3A055 і adh або pmi і adh. Для кожного зразка створювали майстер-суміш, об'єднуючи 20 мкл екстрагованої геномної ДНК із 35 мкл 2TAQMAN Universal PCR Master Mix (фірми Applied Biosystems), доповненої праймерами до кінцевої концентрації кожного 900 нМ, зондами до кінцевої концентрації кожного 100 нМ і водою до кінцевого об'єму 70 мкл. Цю суміш розподіляли на 3 повтори по 20 мкл кожна в 96лункові планшети для ампліфікації й запечатували оптично прозорою термоплівкою для покриття (фірма Marsh Bio Products). ПЛР здійснювали з використанням пристрою АВІ Prism 7700, застосовуючи наступні параметри ампліфікації: 2 хв при 50°С і 10 хв при 95°С, потім 35 циклів по 15 із при 95°С і 1 хв при 60°С. Результати TAQMAN-аналізу продемонстрували, що варіант MIR604 мав одну копію гена Cry3A055 і одну копію тенарті. Приклади прийнятних застосовуваних комбінацій послідовностей праймерів/зондів, наведені нижче: 31 Приклад 3. Виявлення MIR604 за допомогою Саузерн-блотингу Застосовувану для аналізу методом Саузерн-блотингу геномну ДНК виділяли з об'єднаної листової тканини 10 рослин, що представляють собою отриману в результаті 6 зворотних схрещувань (ВС6) генерацію MIR604, використовуючи в цілому метод, описаний в Thomas і ін. [Theor. Appl. Genet. 86, 1993, стор. 173-180], публікація включена в даний опис як посилання. Всі рослини, застосовувані для виділення ДНК, індивідуально аналізували за допомогою TAQMAN-ПЛР (відповідно до методу, описаного в прикладі 2) для підтвердження присутності однієї копії гена Cry3A055 і теиарті. Для одержання негативних сегрегантних контролів ДНК виділяли з об'єднаної листової тканини 5 рослин, які представляють собою ВС4-генерацію варіанта MIR604. Ці рослини, застосовувані як негативні сегрегантні контролі, аналізували індивідуально за допомогою TAQMAN-ПЛР, і за даними аналізу вони виявилися негативними з погляду присутності гена Cry3A055і гени рт, але, як і очікувалося, виявилися позитивними відносно внутрішнього контролю, тобто ендогенного гена adh кукурудзи. Аналіз методом Саузерн-блотингу здійснювали за допомогою загальноприйнятих для молекулярної біології методів. Геномну ДНК (7,5 мкг) розщеплювали за допомогою рестриктази КрпІ, яка має єдиний сайт розпізнавання в Т-ДНК-вставці MIR604 із плазміди pZM26 (фіг. 1). Цей підхід дозволяє визначати кількість копій елементів, що відповідають специфічному застосовуваному для Саузерн-блотингу зонду, який був вбудований в MIR604. Це привело до утворення однієї смуги гібридизації на одну копію елемента, який присутній в MIR604. Після електрофорезу на агарозному гелі й лужному переносі на мембрану типу Nytran® здійснювали гібридизацію з використанням специфічних для елемента повнорозмірних отриманих за допомогою ПЛР зондів. Зонд, застосовуваний для Саузерн-блотів cry3А055 ірті, містив нуклеотидні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 58 і SEQ ID NO: 61 відповідно. Зонди мітили 32 за допомогою Р шляхом довільного примування з використанням системи Rediprime™ II (фірма Amersham Biosciences, каталожний № RPN1633). 94893 32 Застосовували наступні строгі умови гібридизації: 1-2 мільйона cpm/мл додавали до середовища PerfectHyb (фірма Sigma), доповненого 100 мкг/мл ДНК тимуса теляти (фірма Invitrogen), який попередньо витримували при 65°С. Попередню гібридизацію проводили в такому ж розчині, що описаний вище, при такій же температурі протягом ночі або протягом принаймні 1 год. Гібридизацію проводили при 65°С протягом 3 год із наступним дворазовим відмиванням в 2SSC, 0,1% ДСН протягом 20 хв при 65°С і дворазовим відмиванням в 0,1SSC, 0,1% ДСН протягом 20 хв при 65°С. У кожний аналіз методом Саузерн-блотингу включали 3 контрольні зразки: (1) ДНК із негативного (нетрансформованого) сегреганту, застосовуваного для ідентифікації будь-яких ендогенних послідовностей Zea mays, що може перехресно гібридизуватися зі специфічним для елемента зондом; (2) ДНК із негативного сегреганту, у який інтродукована розщеплена за допомогою KpnI плазміда pZM26 у кількості, що дорівнює одній копії в перерахунку на довжину зонда, для демонстрації чутливості експерименту з погляду виявлення однієї копії гена у геномі Zea mays, і (3) розщеплена за допомогою KрnI плазміда pZM26 у кількості, що дорівнює одній копії в перерахунку на довжину зонда, як позитивний контроль гібридизації, а також для демонстрації чутливості методу експерименту. Дані гібридизації підтвердили результати, отримані за допомогою TAQMAN-ПЛР про те, що MIR604 містить по одній копії гена Cry3A055 і гени pmi і що MIR604 не містить яких-небудь послідовностей каркаса вектора, які присутні в pZM26. Як і очікувалося для обох Cry3A055- pmi-зондів розщеплення за допомогою KpnI приводило до одержання однієї смуги гібридизації правильного розміру, що свідчить про наявність по одній копії кожного гена у варіанті MIR604. Крім того, встановлено, що відсутня гібридизація із зондом для каркаса, що свідчить про відсутність яких-небудь послідовностей каркаса вектора pZM26, включених в MR604 у процесі трансформації. Приклад 4. Секвенування Т-ДНК-вставки 33 Визначали нуклеотидну послідовність повної трансгенної ДНК-вставки, яка присутня у варіанті MIR604, для підтвердження повної цілісності вставки, послідовності функціональних елементів і для виявлення будь-яких замін індивідуальних пар основ. МIR604-вставку ампліфікували за допомогою ПЛР із використанням ДНК, отриманої з ВС5генерації, у вигляді двох індивідуальних фрагментів, які перекриваються. Кожний фрагмент ампліфікували за допомогою одного полінуклеотидного праймеру, гомологічного до геномних послідовностей рослини, які фланкують MIR604-вставку, і одного полінуклеотидного праймеру, гомологічного до гену cry3А055. Для створення 5'-фрагмента перший полінуклеотидний праймер, гомологічний до 5'-фланкуючої послідовності, тобто 5'S1 (SEQ ID NO: 15), об'єднували із другим полінуклеотидним праймером, гомологічним до ДНК, вбудованої в ген cry3A055, тобто 5'AS1 (SEQ ID NO: 28). Для створення З'-фрагменти перший полінуклеотидний праймер, гомологічний до 3'-фланкуючої послідовності, тобто 9268AS (SEQ ID NO: 45), об'єднували із другим полінуклеотидним праймером, гомологічним до ДНК, вбудованої в ген Cry3A055, тобто 5161S (SEQ ID NO: 27). Для ПЛР-ампліфікації застосовували ПЛРсистему Expand High Fidelity (фірма Roche, каталожний № 1732650) і наступні параметри ампліфікації: 2 хв при 94°С протягом 1 циклу, потім 10 циклів по 15 із при 94°С, 30 із при 55-65°С і 5 хв при 68°С, потім 20 циклів по 15 із при 94°С, 30 із при 55-65°С і 5 хв+5 з/цикл при 72°С, потім один цикл 7 хв при 72°С. Амплікон, отриманий у результаті ПЛРампліфікації з використанням SEQ ID NO: 15 і SEQ ID NO: 28, містив послідовність 5'- стику (SEQ ID NO: 1). Амплікон, отриманий у результаті ПЛРампліфікації з використанням SEQ ID NO: 45 і SEQ ID NO: 27, містив послідовність З'-стики (SEQ ID NO: 2). Кожний секвенований фрагмент клонували індивідуально у векторі pCR® -XL-TOPO (фірма Invitrogen, каталожний №. К4700-20) і три різні клони кожного фрагмента ідентифікували й секвенували. Секвенування здійснювали за допомогою аналізатора ABI3730XL, використовуючи хімічний аналіз на основі АВІ BigDye® 1.1 або Big Dye 3.1 дГТФ (для багатих на GC матриць). Аналіз послідовностей здійснювали за допомогою пакета програм Phred, Phrap і Consed, отриманих з Університету Вашингтона, і здійснювали при частоті появи помилок менше 1 на 10000 основ (Ewing і Green, 1998). Кінцеву консенсусну послідовність визначали, об'єднуючи дані про послідовності шести індивідуальних клонів (по три для кожного фрагмента, який підлягає секвенуванню), для створення однієї консенсусної послідовності MIR604-вставки. Для додаткового підтвердження будь-яких індивідуальних відмінностей пар основ між MIR604вставкою й плазмідою pZM26 за допомогою вказаного вище методу ампліфікували невеликі (приблизно 300-500 пар основ) ПЛР-продукти, специфічні для будь-яких ділянок, у яких відмінності пар основ були виявлені в початковій консенсусній послідовності. Для всіх передбачуваних відмінностей пар основ в MIR604-вставці безпосереднє сек 94893 34 венування ПЛР-продукту показало наявність індивідуальних чітких піків, які відповідають всім розглянутим парам основ, що свідчить про те, що ці відмінності, імовірно, присутні в MIR604-вставці. Порівняльний аналіз первинної структури здійснювали за допомогою програми Clustal з наступними параметрами: зчитувальна матриця blosum55, штраф за відкриття пролому 15, штраф за подовження пролому 6.66 (Thompson і ін., Nucleic Acids Research, 22, 1994, ее. 4673-4680). Дані, отримані для консенсусної послідовності Т-ДНК-вставки MIR604, продемонстрували повну цілісність вставки й те, що у вставці зберігалася послідовність функціональних елементів, яка передбачалася для pZM26. Аналіз послідовності дозволив виявити деяке вкорочення кінців правої пограничної ділянки (RB) (SEQ ID NO: 57) і лівої пограничної ділянки (LB) (SEQ ID NO: 62) Т-ДНКвставки в процесі трансформації, за допомогою якої одержували варіант MIR604. RB-ділянки ТДНК-вставки вкоротилася на 44 пари основ, а LBкінець Т-ДНК-вставки вкоротився на 43 пари основ. Ці делеції не впливали на ефективність ТДНК-вставки, і цей феномен раніше описаний для опосередковуваної Agrobacterium трансформації [Tinland і Hohn, Genetic Engineering, 17,1995. стор. 209-229]. Крім того, виявлені три заміни пар основ у Т-ДНК-вставці MIR604. Одна зміна відбулася всередині промотору MTL, тобто регуляторної ділянки, яка не кодує білок. Дві інші зміни виявлені в кодувальній послідовності pmi і привели до двох амінокислотних замін; валін у положенні 61 замінений аланіном (V61A) і глутамін у положенні 210 замінений гістидином (Q210H). Аланін і валін обидва являють собою аліфатичні амінокислоти, їх заміна являє собою консервативну заміну. Заміна глутаміну на гістидин являє собою заміну кислотного залишку на основний залишок. Приклад 5. Аналіз фланкуючих послідовностей ДНК Геномну послідовність ДНК кукурудзи, яка фланкує гетерологічну ДНК, вбудовану в геном рослини кукурудзи варіанта MR604, одержували за допомогою методу OmniPlex™, описаного в цілому в Kamberov і ін. [Proceedings of SPIE, 4626, 2002, стор. 1-12], публікація включена в даний опис як посилання. 5'- і 3'-фланкуючі послідовності й пограничні послідовності підтверджували за допомогою стандартних ПЛР-аналізів. 5'-фланкуючу послідовність і пограничну послідовність підтверджували з використанням першого набору полінуклеотидних праймерів, послідовності яких представлені в SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 або SEQ ID NO: 13, які об'єднували із другим набором полінуклеотидних праймерів, послідовності яких представлені в SEQ ID NO: 16 або SEQ ID NO: 17.3'фланкуючу послідовність і пограничну послідовність підтверджували з використанням першого набору полінуклеотидних праймерів, послідовності яких представлені в SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 або SEQ ID NO: 44, які об'єднували із другим набором полінуклеотидних праймерів, послідовності 35 яких представлені в SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 або SEQ ID NO: 36. Як повинно бути очевидно фахівцю в даній галузі, для підтвердження фланкуючих послідовностей і пограничних послідовностей можна використовувати інші праймерні послідовності. Встановлено, що MIR604-вставка фланкувалась на правій пограничній ділянці (5'-фланкуюча послідовність) геномною послідовністю рослини кукурудзи, представленою в SEQ ID NO: 5, і фланкувалась на лівій пограничній ділянці (3'фланкуюча послідовність) геномною послідовністю рослини кукурудзи, представленою в SEQ ID NO: 6. Послідовність 5'-стику представлена в SEQ ID NO: 1. Послідовність 3'-стику представлена в SEQ ID NO: 2. Приклад 6. Виявлення білка MIR604 за допомогою ELISA Для оцінки рівня експресії білків Cry3A055 (субстанція, яка має інсектицидну активність) і фосфоманозоізомерази (РМІ) (селектований маркер) у рослинах варіанта MIR604 концентрацію білка Cry3A055 і РМІ визначали за допомогою ELISA у декількох рослинних тканинах і в цілих рослинах на чотирьох стадіях росту (утворення кільця, цвітіння, зрілість насіння і зів'янення) двох гібридних (MR604-B і MIR604-C) і однієї інбредної лінії (MIR604-A). Гібриди варіанта MIR604 були гемізиготними за трансгенами, а інбредна лінія була гомозиготною за трансгенами. Цілі рослини і їх окремі частини (крім пилку) перетворювали в тонкоподрібнений порошок шляхом обробки або в кавомолці, або в блендері, або в дробарці типу Grindomix™ (фірма Brinkmann Instruments; Уестбурі, шт. Нью-Йорк, США), за допомогою ступки й товкачика або млина або шляхом сполучення цих пристроїв. Всю обробку здійснювали в присутності або сухого льоду, або рідкого азоту. Зразки добре перемішували до гомогенного стану. Зразок тканини всієї рослини або відповідний більш дрібний зразок зберігали для аналізу, залишаючи зразок достатнього розміру для збереження в архіві резервних зразків рослинної тканини. Визначали масу кожного зразка в сухому стані (у відсотках) і оброблені зразки зберігали при температурі приблизно -80°С до ліофілізації. Екстрагували свіжу тканину (крім пилку й силосу) і зразки всієї рослини. Для кожного аналізованого зразка аліквотну кількість (1,0 г) порошкоподібного свіжого матеріалу поміщали в 15мілілітрову поліпропіленову пробірку, суспендували в 3 мл буфера для екстракції [50 мМ CAPS, 0,1 Μ NaCl, 2 мМ ЕДТК, 1 мМ дитіотреїтол, 1 мМ4-(1аміноетил)бензолсульфоніл фторид НСІ, 1 мМ лейпептин, рН 10] і екстрагували з використанням гомогенізатора Autogizer® (фірма Tomtek; Хамдем, шт. Коннектикут, США). Після центрифугування протягом 15 хв при 10000 g при 4°С супернатант використали для аналізу Cry3A055 і РМІ за допомогою ELISA. Після обробки йодацетамідом відповідно до методу, описаного в НІН і Straka (1988), кількість загального білка в екстрактах визначали за допомогою системи ВСА™ Protein Assay 94893 36 Reagent (фірма Pierce; Рокфорд, шт. Іллінойс, США). Екстракти пилку готували суспендуванням пилку в співвідношенні 1:30 (мас/об.) у буфері для екстракції. Після витримування протягом 30 хв на льоді суспензії пилку дезінтегрували, пропускаючи тричі через динамометричний елемент Френча приблизно при 15000 фунтів/кв. дюйм із наступним центрифугуванням при 14000 g протягом 5 хв при 4°С. Для аналізу Cry3A055 і РМІ за допомогою ELISA використовували описані вище супернатанти. Кількість загального білка визначали відповідно до описаного вище методу. Екстракти силосу готовили, суспендуючи силос у співвідношенні 1:25 (мас/об.) в 2х буфері для екстракції. Після витримування протягом 30 хв на льоді суспензії силосу екстрагували, використовуючи гомогенізатор Brinkmann Polytron® (фірма Brinkmann; Уестбурі, шт. Нью-Йорк, США). Супернатанти, отримані після центрифугування протягом 15 хв при 10000 g при 4°С використовували для аналізу Cry3A055 і РМІ за допомогою ELISA. Кількість загального білка визначали відповідно до описаного вище методу. Кількісна оцінка Cry3A055 В екстрактах, отриманих за допомогою описаного вище методу, кількісно визначали Cry3A055 за допомогою ELISA (Tijssen, 1985), використовуючи очищені за допомогою імуноафінної хроматографії кролячі поліклональні антитіла до Cry3A055 і очищені за допомогою імуноафінної хроматографії козячі поліклональні антитіла до Btt (нативний CryЗА з Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis). Визначали нижню межу кількісної оцінки при використанні подвійного сендвіч-ELISA на основі найнижчої концентрації чистого референс-білка, що знаходиться у лінійній ділянці стандартної кривої, максимального об'єму контрольного екстракту, який можна аналізувати без урахування фонового рівня й відповідної маси зразка в даній аліквоті. Рівні білка Cry3A055, які піддаються кількісній оцінці, виявляли у всіх отриманих з рослин варіанта MIR604 тканинах крім пилку. У більшості випадків результати виражали у вигляді середніх значень для зразків, взятих у п'ятьох повторах. Для силосу аналізували один зразок; тому середнє значення не розраховували. Рівні в контрольних зразках були нижче за межу кількісної оцінки для всіх стадій розвитку й тканин. Для всіх стадій розвитку середні рівні Cry3А055, визначені в листі, коріннях і цілих рослинах становили приблизно 3-23 мкг/г свіжої маси (4 - 94 мг/г сухої маси), приблизно 2-14 мкг/г свіжої маси (7 - 62 мкг/г сухої маси) і приблизно 0,9 -11 мкг/г свіжої маси (3 - 28 мкг/г сухої маси) відповідно. Середні рівні Cry3А055 у зернах на стадії зрілості насіння і на стадії зів'янення становили приблизно 0,6 -1,4 мкг/г свіжої маси (0,8 - 2,0 мкг/г сухої маси). Середні рівні Cry3А055 у листі, виміряні в тканині шовку на стадії цвітіння виявилися нижче за нижню межу кількісної оцінки (LOQ),