Спосіб визначення хромосомних порушень у дітей та підлітків, хворих на ювенільний ревматоїдний артрит

Реферат: Спосіб визначення хромосомних порушень у дітей та підлітків, хворих на ювенільний ревматоїдний артрит, шляхом проведення генетичного дослідження частоти та спектра хромосомних порушень. У хворих здійснюють забір крові із ліктьової вени у кількості 0,5 мл і проводять цитогенетичний аналіз препаратів хромосом, отриманих із культури лімфоцитів периферичної крові хворих, із застосуванням методів забарвлення за CTG-технікою. При виявленні 4-15 % хромосомних порушень на 100 клітин визначають осіб високого генетичного ризику щодо ювенільного ревматоїдного артриту. UA 102093 U (12) UA 102093 U UA 102093 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до ревматології та генетики, і може бути використана для визначення осіб високого ризику щодо хромосомної нестабільності серед дітей та підлітків, хворих на ювенільний ревматоїдний артрит (ЮРА). Ювенільний ревматоїдний артрит - одне з найбільш розповсюджених і тяжких за клінічним перебігом запальних захворювань суглобів дитячого віку, розповсюдженість якого коливається в різних країнах від 0,02 % до 5,0 %. Надзвичайну стурбованість викликає той факт, що вже через 5-10 років близько 20 % хворих стають інвалідами, а середня тривалість життя хворих менша на 10-15 років порівняно з частотою хвороби серед населення. У формуванні та розвитку ЮРА приймають участь багаточисельні фактори. Але особлива роль відводиться генетичним характеристикам, що підтверджується підвищеною частотою виявлення ревматичних захворювань у родичів хворого і монозиготних близнюків (більшою схильністю жіночої статі), а також асоціацією ревматоїдного артриту з певними локусами антигенів гістосумісності HLA, які дитина успадковує від своїх батьків. Разом з тим, при наявності схожих генетичних факторів найбільш вагомий вплив на ризик та тяжкість захворювання мають кліматичні умови та проживання в місті. Відомий спосіб виявлення нестабільності геному хворих на ЮРА за допомогою оцінки мікроядер в бінуклеарних лімфоцитах крові в умовах цитохалазинового блока (Аналог: Оценка нестабильности генома у больных ювенильным ревматоидным артритом / Макарова Т.П. [и др.] // Практическая медицина. - 2013. - № 1 (66). - С. 132-135). Недоліком цього методу є те, що він дає можливість оцінити лише рівень хромосомних мутацій без урахування каріотипу та інших структурних порушень хромосом. Відомий спосіб виявлення нестабільності геному у хворих на ревматичні захворювання за допомогою цитогенетичного обстеження клітин кісткового мозку (Аналог: Cytogenetic abnormalities and therapy-related myelodysplastic syndromes in rheumatic disease / McCarthy C.J. [et al.] // Arthritis & Rheumatism. – 1998. - Vol. 41, № 8. - P. 319-330). Недоліком цього способу є той факт, що для аналізу використовують клітини кісткового мозку, а процедура забору біологічного матеріалу надзвичайно складна і болісна для дитини. Найбільш близьким за технічною суттю до корисної моделі, що заявляється, є спосіб визначення рівня та типів хромосомних аберацій у синовіальних фібробластах хворих на ревматоїдний артрит, остеоартроз та інші хвороби суглобів із застосуванням диференційного GTG-техніки забарвлення (Прототип: Kinne R.W. Mosaic chromosomal aberrations in synovial fibroblast of patients with rheumatoid arthritis, osteoarthritis, and other inflammatory joint diseases / R.W. Kinne [et al] // Arthritis Res. - 2001. – № 3(5). – P. 319-330). Недоліком цього методу є проведення цитогенетичного дослідження у синовіальних фібробластах, що є складним у виконанні для практичної охорони здоров'я, потребує тривалого часу для проведення методики, має значні економічні витрати. В основу корисної моделі поставлена задача створення такого способу оцінки виявлення осіб високого ризику щодо порушень хромосомного апарату у дітей та підлітків, хворих на ЮРА, при якому шляхом проведення генетичного дослідження можна визначити наявність спадкової обтяженості та оцінити загальний рівень та типи хромосомних порушень. Поставлена задача може бути вирішена шляхом використання цитогенетичного обстеження хворих на ЮРА із застосуванням методів гомогенного та диференційного G-забарвлення препаратів хромосом лімфоцитів периферичної крові, яке проводять з метою виявлення особливостей каріотипу, рівня та типів хромосомних порушень. Цитогенетичне обстеження хворих на ЮРА дозволяє у більш ранні строки виявляти носіїв структурних порушень хромосом та проводити їм своєчасну терапію, що мінімізуватиме ризик виникнення онкологічних ускладнень ЮРА, а також негативних наслідків у майбутньому репродуктивному житті. Перспективність використання цитогенетичного методу зумовлена тим, що біологічним матеріалом є периферична кров, забір якої не спричиняє негативного враження на хвору дитину, цей метод може використовуватися незалежно від віку людини, він не потребує значних економічних витрат. Суть способу полягає в тому, що у хворих дітей та підлітків проводять забір крові із ліктьової вени у кількості 0,5 мл, яку додають у флакон з поживним середовищем для каріотипування РВМАХ Karyotyping Medium ("Gibco") і культивують у термостаті при t+37 °C протягом 72 годин. За 2 години до закінчення культивації проводять зупинку мітозів за допомогою колхіцину в кінцевій концентрації 0,1 мкг/мл. На наступному етапі клітини крові гіпотенізують, потім проводять фіксацію препаратів розчином етилового спирту (96 °) та льодяної оцтової кислоти у концентрації 3:1. Суміш наносять на предметне скло і висушують над полум'ям горілки. Ідентифікацію хромосом здійснюють на гомогенно забарвлених барвником Гімза препаратах та за GTG-технікою. 1 UA 102093 U 5 10 15 20 При вивченні частоти і спектра хромосомних порушень у хворих на ЮРА аналізують 100 метафазних пластинок. Враховують всі структурні аберації хроматидного (одиночні фрагменти, делеції), хромосомного (парні фрагменти, розриви по центромері, кільцеві хромосоми, дицентричні хромосоми, обміни) та геномного (передчасне розходження центромер, поліплоїдні клітини, ендоредуплікація) типів. Використовують методику цитогенетичного дослідження за Т.Е. Зеровою-Любимовою, Н.Г. Горовенко (2003). Матеріалом для цитогенетичного аналізу слугують препарати хромосом, отримані з культури лімфоцитів периферичної крові хворих. Дітей та підлітків, хворих на ювенільний ревматоїдний артрит, у котрих виявляється підвищений рівень (4-15 %) хромосомних аберацій, відносять до групи високого генетичного ризику щодо нестабільності стану хромосомного апарату, їм потрібно проводити адекватне лікування, яке спричинятиме елімінацію ушкоджених ділянок хромосом (призначення препаратів фолієвої кислоти, вітамінів групи В, тощо). Для визначення прогностичної значущості рівня хромосомних порушень у дітей та підлітків, хворих на ЮРА, при віднесенні їх до групи високого ризику застосовують методику послідовної процедури Вальда з визначенням інформативності ознак за допомогою критерію Кульбака. За допустиму помилку при прогнозуванні захворювання приймали 5,0 % поріг. Прогностичними критеріями хромосомних порушень є спадкова обтяженість щодо ревматичного артриту та рівень хромосомних аберацій від 4 до 6 % (ПК=+5,3; Інф.=3,4), але найбільше значення має рівень порушень хромосом від 7 до 15 % (ПК=+11,4; Інф.=3,4) (див. таблицю). Таблиця Прогностичні критерії хромосомної нестабільності у пробандів, хворих на ЮРА (бали) Ознака Спадкова обтяженість щодо РА Частота ХА на 100 клітин 25 30 35 40 45 50 Градація є немає 4-6 7-15 ПК +7,5 -2,5 +5,3 +11,4 Інформативність 7,5 3,4 Запропонований спосіб дозволяє своєчасно провести профілактичні заходи і тим самим мінімізувати спадкову обтяженість для майбутнього покоління. Клінічний приклад 1. Хвора Світлана І., 13 років (історія хвороби № 1781), госпіталізована до відділення кардіоревматології з діагнозом: ювенільний ревматоїдний артрит, поліартикулярний варіант, активність І ст. Супутній діагноз: алергічний риніт, період нестійкої ремісії. Дівчинка звернулась зі скаргами на періодичні артралгії і незначну набряклість у дрібних суглобах кистей, променезап'ястних, колінних і гомілковостопних суглобах. Періодичний головний біль, метеозалежність. Дівчинка народилась від другої вагітності, яка перебігала фізіологічно, без ускладнень, з вагою 3100 г. Пологи у матері - фізіологічні. До року психомоторний розвиток відповідав віковим нормам. Гострі респіраторні захворювання діагностувалися часто. Об'єктивно: на момент обстеження дівчинки стан здоров'я задовільний, вага - 40,4 кг, зріст 147 см. Шкіряні покрови і слизові чисті, блідо-рожеві. В легенях везикулярне дихання. Тони серця ритмічні. Живіт м'який, безболісний. Печінка виступає з під краю реберної дуги. Селезінка пальпується. Клінічні аналізи крові та сечі - у нормі. Біохімічний аналіз: сіалові кислоти - 130 од. (норма до 220 од.), сіромукоїди - 0,182 од. (норма 0,130-0,260 од.), глікопротеїди - 0,282 од. (норма 0,3000,380 од.); загальний білірубін - 13,5 мкмоль/л (норма 8,5-20,5 мкмоль/л); прямий - 2,3 мкмоль/л (норма 0-5,1 мкмоль/л); непрямий - 8,8 мкмоль/л (норма до 16 мкмоль/л); холестерин -4,7 ммоль/л (норма 3,9-5,2 ммоль/л); бета-ліпополісахарид - 7,0 г/л (норма 3-4,5 г/л); АЛТ - 11 Е/л (норма до 30 Е/л); ACT-13 Е/л (норма до 30 Е/л). Імунологічні показники: С-реактивний білок (СРБ) - негативний (норма); АСЛ-0 - негативний, (до 250 од.); ревматоїдний фактор (РФ) - негативний (норма); комплемент - 0,42 у.о. (норма 0,88-1,41 у.о.); ЦІК - 1,6 г/л (норма 0,71-1,96 г/л); ЦІК конст. - 0,92 г/л (норма 0,81-1,60 г/л); Ig G13,38 г/л (норма 8,5-16,6 г/л); Ig А - 1,52 г/л (норма 1,3-2,86 г/л); Ig M-0,89 г/л (норма 0,90-1,80 г/л). На рентгенографії явищ синовіїту немає, синовіальна оболонка не змінена, синовіальна рідина однорідна, суглобова щілина збережена, суглобові поверхні кісток не змінені. Структура 2 UA 102093 U 5 10 15 20 25 30 35 40 хряща гомогенна, поверхня рівна. Променезап'ястні суглоби - праворуч явища бурсита. Тазостегновий і гомілковостопний суглоби - без особливостей. За даними генеалогічного аналізу: у матері - поліартрит. Спадковість щодо ревматичних захворювань - обтяжена. Дані цитогенетичного обстеження: каріотип дівчинки - 46,ХХ; рівень хромосомних порушень - 5 % (парні фрагменти - 1 %; одиночні фрагменти -2 %; розрив по центромері - 1 %; передчасне розходження хромосом - 1 %). Результат цитогенетичного аналізу відповідає фізіологічному стану хворої дівчинки, адже в даному випадку захворювання триває 7 років, процес перебігає повільно, загальний стан здоров'я задовільний. Клінічний діагноз: ювенільний ревматоїдний артрит, поліартикулярний варіант, активність І ст. Алергічний риніт, період нестійкої ремісії. Клінічний приклад 2. Хворий Владислав К., 16 років (історія хвороби № 1409), госпіталізований до клінічного відділення зі скаргами на біль і нетривале набрякання п’ястнофалангових суглобів, правих променезап'ястних суглобів, плечового і ліктьового. Біль в лівому колінному суглобі. Із анамнезу життя: хлопчик народився від першої вагітності із загрозою переривання і стрімких пологів, з вагою 3300 г. До року психомоторний розвиток відповідав віковим нормам. До 3-х років не хворів застудними захворюваннями. Перенесені захворювання: часті бронхіти, 2 пневмонії; операції - пластика сечового міхура (в 6 і 12 років); в 12 років - гастрит. Об'єктивно: на момент обстеження стан здоров'я хлопчика задовільний, шкіряні покрови чисті, в легенях везикулярне дихання, тони серця приглушені, живіт м'який, трохи болісний. Печінка і селезінка не пальпуються. Клінічні аналізи крові та сечі - у нормі. Біохімічний аналіз: сіалові кислоти - 197 од. (норма до 220 од.), сіромукоїди - 0,232 од. (норма 0,130-0,260 од.), глікопротеїди - 0,400 од. (норма 0,3000,380 од.); загальний білірубін -13,3 мкмоль/л (норма 8,5-20,5 мкмоль/л); прямий - 2,2 мкмоль/л (норма 0-5,1 мкмоль/л); непрямий - 11,1 мкмоль/л (норма до 16 мкмоль/л); холестерин -5,1 ммоль/л (норма 3,9-5,2 ммоль/л); бета-ліпополісахарид - 6,6 г/л (норма 3-4,5 г/л); АЛТ – 34 Е/л (норма до 30 Е/л); ACT-20 Е/л (норма до 30 Е/л). Імунологічні показники: СРБ - 12; АСЛ-0 - негативний (норма до 250 од.); РФ - 384; комплемент -1,15у.о. (норма 0,88-1,41 у.о.); ЦІК - 1,03 г/л (норма 0,71-1,96 г/л); ЦІК конст.-1,13 г/л (норма 0,81-1,60 г/л); Ig G-8,12 г/л (норма 8,5-16,6 г/л); Ig А - 1,63 г/л (норма 1,3-2,86 г/л); Ig M-0,90 г/л (норма 0,90-1,80 г/л). На рентгенограмі в прямій проекції визначається помірне збільшення в об'ємі периартикулярних м'яких тканин проксимальних міжфалангових суглобів II і III пальців обох кистей. Помірний епіфізарний остеопороз костей зап'ястя з наявністю поодиноких дрібних кистоподібних просвітлень. Рентгенівські суглобові щілини збережені. За даними клініко-генеалогічного аналізу - спадковість обтяжена по батьківській лінії. При проведенні цитогенетичного аналізу встановлено каріотип - 46,XY. Рівень хромосомних порушень склав 15 % (11 % - одиночні фрагменти; 1 % - парні фрагменти; 3 % - поліплоїдні клітини). Високий рівень хромосомних ушкоджень в лімфоцитах периферичної крові хворого хлопчика відповідає стану його здоров'я, адже на момент обстеження хвороба тривала 3 місяці, активність процесу II ст. з швидко прогресуючим перебігом. Клінічний діагноз: ювенільний ревматоїдний артрит, суглобова форма, активність II ст., сіропозитивний, швидко прогресуючий перебіг. Супутній діагноз: хронічний тонзиліт. Ефективність запропонованого способу складає 70,0 %. 45 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 50 Спосіб визначення хромосомних порушень у дітей та підлітків, хворих на ювенільний ревматоїдний артрит, що здійснюють шляхом проведення генетичного дослідження частоти та спектра хромосомних порушень, який відрізняється тим, що у хворих здійснюють забір крові із ліктьової вени у кількості 0,5 мл і проводять цитогенетичний аналіз препаратів хромосом, отриманих із культури лімфоцитів периферичної крові хворих, із застосуванням методів забарвлення за CTG-технікою і при виявленні 4-15 % хромосомних порушень на 100 клітин визначають осіб високого генетичного ризику щодо ювенільного ревматоїдного артриту. 55 Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3