Штам мікроміцету cylindrocarpon obtusiuscuilum imb f-100061 для отримання регуляторів росту рослин з біозахисним ефектом

Реферат: Винахід належить до штаму мікроміцету Cylindrocarpon obtusiuscuilum IMB F-100061, призначений для отримання регуляторів росту рослин з біозахисним ефектом. UA 104260 C2 (12) UA 104260 C2 UA 104260 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнології, сільськогосподарській мікробіології, а саме до способу отримання препаратів природного походження, що мають широкі регуляторні властивості, в тому числі, підвищення імунітету рослин за рахунок активізації генів стійкості, які сприяють підсиленню виробітку ендогенних si/mi PI IK комплементарних до мРНК патогенів та шкідників, і являються складовою частиною імунної системи рослин. Екологічна ситуація в світі за широкого використання хімічних засобів захисту рослин, добрив, порушення сівозмін, зміни кліматичних умов в багатьох регіонах призвела до значної адаптації збудників хвороб та шкідників до сучасних пестицидів, а в багатьох випадках порушення біорізномаїття мікрофлори та фауни ґрунту, що викликає цілу низку проблем в рослинництві - бактеріози, нематоди, зниження імунної системи рослин, в тому числі, мутагенна дія залишкових кількостей пестицидів в ґрунтах і рослинах. Тому отримання полікомпонентних регуляторів росту рослин шляхом мікробіологічного синтезу має переваги перед хімічними продуктами так як дозволяє отримувати природні сполуки у певному "взятими у природи" співвідношенні компонентів біосинтезу, які мають переваги "м'якої" дії у збалансованому полікомпонентному складі продуктів життєдіяльності мікроорганізмів - продуцентів мають значні переваги перед хімічними регуляторами та очищеними мікробними продуктами типу фітогормонів. Застосування регуляторів росту у сільськогосподарському виробництві особливо у підвищенні урожайності рослин, стійкості до стресів різної природи, до хвороб та шкідників в даний час не відповідає реальним потребам аграріїв частково від недостатності ефективних і економічно доступних препаратів. Відомі способи отримання біопрепаратів, в основу яких покладено культивування мікроорганізмів із подальшим суспензуванням їх біомаси у воді, або фізіологічному розчині (авт. св. СССР № 1423550, № 1555320, № 1698242, № 1699990, № 1712348, РСТ87/06796. ЧССР. № 256150, США № 4818530, Японія: 3.62-20163). Однак ці способи використовують монокультури і дають препарати, що регулюють розвиток певного виду рослин на конкретному етані онтогенезу. В основу винаходу поставлено задачу створення доступного способу отримання полікомпонентних регуляторів росту рослин з біозахисним ефектом, в якому за рахунок біотехнологічного вирощування штаму мікроскопічного грибу у оптимальних для нього умовах та подальшого виділення продуктів метаболізму, з подальшим додаванням біопрепарату актофіт в певних співвідношеннях з отриманням синергійного біозахисного ефекту забезпечується простота отримання препаратів широкого спектру дії, недорогих до застосування і реальних до масштабування у виробництві. Поставлена задача вирішується тим, що в способі отримання регуляторів росту із біозахисним ефектом передбачається культивування мікроорганізмів у рідкому середовищі і з подальшим вилученням продуктів метаболізму. Згідно винаходу культивують штам мікроскопічного гриба в умовах аерації при температурі 25 °С в стаціонарних умовах судин - 30 діб, в біореакторі - 7 діб із подальшим екстрагуванням продуктів метаболізму 65 % етанолом при об'ємному співвідношенні компонентів: культуральне середовище - спирт 2,5:1. До отриманого екстракту додають біопрепарат актофіт в об'ємі 5-25 % (спиртовий екстракт продуктів життєдіяльності ґрунтових грибів Streptomyces avermitylis) ретельно перемішують та визначають біологічну активність препаратів Regoplant і Stimpo. Приклади виконання способу: Спосіб виконують наступним чином: культивують штам Cylindrocarpon obtusiuscuilum (Sass.) U. Braun 680. Він має наступні характеристики: штам ізольовано із кореня женьшеню Боярської дослідної станції Національного університету біоресурсів і природокористування. Штам ідентифікований в інституті мікробіології і вірусології м. Д. К. Заболотного НАМ України у відділі фізіології та систематики мікроміцетів (Курченко І. М. та Наконечна Л. Т.). Мікроскопічний гриб Cylindrocarpon obtusiuscuilum (Sass.) U. Braun (Compedium of Soil Fungi, Second edition) належить до родини Nestriaccae, порядку Hypcreales, підкласу Hypocromycetidac, класу Sordariomycetes, підвідділу Pezizomycotina, відділу Ascomycota та задепонований 27.12.2012 під номером зберігання ІMB F-100061. Культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні особливості штаму. Штам мікроскопічного гриба Cylindrocarpon obtusiuscuilum ІMB F-100061 добре росте на природних (сусло-агар, картопляно-глюкозний, агаризоване середовище Сабуро) та синтетичних середовищах (агаризоване середовище Чапека). Колонії на картопляно-глюкозному агарі ростуть обмежено, від 2 см в діаметрі на 3-ю добу культивування до 4,5 см на 7-у добу росту. С початку білі, прозорі (3-тя доба) до пухнасто-повстистих на 5-у добу, та до повстисто-тяжистих на 7-му добу і далі. Забарвлення колонії від білого до біло-кремового з крапельками прозорого ексудату на поверхні міцелію. Край колоній рівний з прозорим міцелієм. Реверзум колонії забарвлений у відтінки від блідо-оранжевого до коричневого. На сусло-агарі колонії білі впродовж всього 1 UA 104260 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 періоду росту, реверзум червоно-коричневих відтінків. Конідієносці у вигляді бокових стеригм, іноді розгалужених гілочок, які несуть одну або рідко дві стеригми розміром 9,6-12,03,0-4,0 мкм. На сусло-агарі міцелій утворює тяжі. В клітинах міцелію також дуже багато включень жирової природи. Конідії на стеригмах утворюються послідовно, базипетально, ланцюжків не утворюють. Мікроконідії відсутні, макрокапідії безбарвні, циліндричні, на кінчиках заокруглені, прямі, іноді можуть бути зігнуті, з 0-3 але частіше з однією перегородкою. Розмір конідії досягає 20-352,54,8 мкм. Хламідоспори верхівкові та інтеркалярні 9,6-12,8 мкм в діаметрі, рясно утворюються після 5-ї добі росту, спочатку прозорі, потім до червоно-коричневих, гладенькі, шароподібні до грушоподібних, одиночні або в ланцюжках. На середовищі Сабуро колонії щільно-пухнасті, білі, дуже компактні, реверзум червоно-коричневого кольору. Спороношення утворюється на 7-у добу, спостерігаються одиночні конідії циліндричної формі 24,0-32,03,8 мкм. Конідії в масі з однією перегородкою. В міцелії спостерігається багато включень жирової природи. На мінеральному середовищі Чапіка ріст колоній задовільний - від 1,5 см в діаметрі на 3-ю добу до 5,0-5,5 см на 7-у добу культивування. Колонія біла, павутинисто-пухнаста, реверзум безбарвний. На 7-у добу росту колонія стає повстистою, реверзум безбарвний до світлокоричневого. Спороношення утворюється вже на 3-ю добу. Розмір та форма конідій така, як на картопляно-глюкозному агарі. В умовах глибинного культивування при температурі 25 °С на мінеральному середовищі з 7-ма різними вуглеводами, як єдиним джерелом вуглецю (глюкоза, арабіноза, мальтоза, сахароза, галактоза, лактоза та крохмаль) на 6-ту добу росту штам Cylindrocarpon obtusiuscuilum ІМВ F-100061 накопичував біомасу в межах 0,01-0,18 г/л, причому в порівнянні з глюкозою найкращим джерелом вуглецю були сахароза, крохмаль та мальтоза. Найменшою виявилася біомаса на середовищах з арабінозою та галактозою. Проведено первинну санітарно-гігієнічну оцінку даного штаму. Мікробіоологічними дослідженнями внутрішніх органів дослідних тварин через 20 діб після початку досліду показано, що пероральне введення суспензій спор клітин культури у досліджених концентраціях не спричиняє інвазії мікроміцетів у внутрішні органи тварин. Не виявлені ретрокультури у печінці та нирках. Доведено, що даний штам не інвазійний, не десеменує і не розмножується в організмі дослідних тварин - білих мишей. Таким чином штам гриба Cylindrocarpon obtusiuscuilum ІМВ F-100061 згідно отриманих результатів у гострих дослідах на безпородних білих мишах належить до групи авірулентних мікроорганізмів не здатних до інвазії у внутрішні органи досліджених теплокровних тварин. Летальні дози культури Cylindrocarpon obtusiuscuilum ІМВ F-100061 не досягнуті і перевершують LD50 per os більше 2 та LD50 в/ч більше 2,5 млн. спор на мишу. Фізіологічні властивості штаму. Штам росте на дефіцитному по азоту середовищу і є олігонітротолерантним мікроорганізмом. На середовищі з низьким вмістом азоту синтезує невелику кількість сполук білкової природи. Розвиток штаму покращується і прискорюється при додаванні в середовище легко доступних форм азотного живлення: нітратного, амонійного, органічного. В процесі росту в залежності від складу живильного середовища в більший чи меншій ступені воно підкислюється до рН 5,8-3,5. Реакція середовища лишається без змін рН 7,0 при вирощуванні штаму на глюкозо-аспарагіновому середовищі. Склад рекомендованого середовища (г/л): глюкоза - 10,0; аспарагін - 0,02; калій Н2РО4 0,9; K2НРО4 - 0,3; MgSO4 - 0,1; K2SO4 - 0,1; MnSO4 - 0,02; FeSO4 - 0,02; CuSO4 - 0,2; вода деіонізована - 1,0 л; рН - 7,0. Мікроміцет Cylindrocarpon obtusiuscuilum ІМВ F-100061 вирощують на вищенаведеному живильному середовищі у стаціонарних умовах культиваторів ємністю 750 мл на протязі 30 діб, а в промисловому біореакторі в умовах аерації на протязі 7 діб культивування. Культуральне середовище по завершенню інкубації слизоподібне, безкольорове або слабо-кремовате медузоподібне утворення. Після описаної раніше екстракції продуктів метаболізму етиловим спиртом і додаванням в склад препарату актофіту отримують нові регулятори росту рослин з біозахисним ефектом Regoplant і Stimpo в залежності від вмісту складових полікомпонентних формуляцій із більшим біозахисним ефектом Regoplant і повільним біозахисним ефектом Stimpo. Після визначення біологічної активності препаратів шляхом пророщування насіння озимої пшениці у водному розчині препарату при співвідношенні 1:10 000, визначають активність у процентах по довжині коріння проростків за впливу регуляторів росту по відношенню до контролю, який має бути не менше 20 % і отримають готові продукти для подальшого використання. На нові полікомпонентні регулятори росту рослин із біозахисним ефектом розроблені і затверджені технічні умови: 1. регулятор росту рослин Regoplant ТУ У 24.231168762-006:2012; 2. регулятор росту рослин Stimpo ТУ У 24.2-31168762-005:2012. 2 UA 104260 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 Штам мікроміцету Cylindrocarpon obtusiuscuilum IMB F-100061 для отримання регуляторів росту рослин з біозахисним ефектом. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3