Спосіб виготовлення антигену для серологічної діагностики бруцельозу тварин в ра, рзк, ртзк

Реферат: Спосіб виготовлення антигену для серологічної діагностики бруцельозу тварин в РА, РЗК, РТЗК включає вирощування виробничого штаму Brucella abortus 19, змивання бакмаси бруцел фенілізованим фізрозчином, інактивацію бак маси. Вирощування виробничого штаму Brucella abortus 19 проводять на щільному середовищі МППГГА, інактивацію бакмаси проводять нагріванням, та додатково проводять стабілізацію антигену за температури (2-8) °С, 9 3 стандартизацію антигену за стандартом каламутності до концентрації 40×10 КУО/см з використанням Національної Anti-Вruсеllа abortus сироватки. UA 107685 U (12) UA 107685 U UA 107685 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до ветеринарної імунології та мікробіології зокрема до методики виготовлення антигену для серологічної діагностики бруцельозу тварин. Відомий метод отримання бруцельозного антигену, де застосовують штам Brucella abortus 19 та бруцельозний бактеріофаг Тб (патент SU 1713592 А від 23.02.1992 p.). Бруцельозний бактеріофаг адсорбують на бруцелах із розрахунку 10-100 фагових корпускул на 1 КУО впродовж 22-24 год. за 2-4 °C. Потім завис бактерій із адсорбованим фагом центрифугують, готують суспензію із концентрацією 100 млрд. КУО/мл на 0,5 %-му карболінізованому фізіологічному розчині. Отримання такого антигену є тривалим та складним процесом, вимагає напрацювання великої кількості бактеріальної маси бруцел та наявності коштовного специфічного бактеріофагу. Існує також метод отримання антигену з штаму Brucella abortus 19, що включає культивування бруцел в "глибинних умовах" на рідкому поживному середовищі із регуляцією парціального тиску розчиненого в середовищі кисню, видалення та концентрацію бактеріальних клітин шляхом ультрафільтрації на волокнах та інактивацію бруцел шляхом нагрівання (патент RU 2163141 від 20.02.2001 p.). Даний спосіб тривалий, вимагає спеціального обладнання, в процесі ультрафільтрації втрачається частина бакмаси і існує ризик контамінації її банальною мікрофлорою. Найбільш близьким за технічною суттю є спосіб отримання бруцельозного антигену з штаму Brucella abortus 19, що включає отримання розплодки на щільному поживному середовищі, наступне культивування бруцел в рідкому поживному середовищі, концентрування та очищення бакмаси на ультрафільтраційній установці та інактивацію антигену в біореакторі за температури 80 °C впродовж 60 хв (патент RU 2085212 С1 від 27.07.1997р. "Способ изготовления единого бруцеллезного антигена для PA, РСК и РДСК"). Це рішення може бути прототипом. Але цей метод дуже трудомісткий, тому що передбачає культивування в різних середовищах та концентрацію бакмаси в два етапи. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб для серологічної діагностики бруцельозу тварин в РА, РЗК, РТЗК, який включає вирощування виробничого штаму Brucella abortus 19, змивання бакмаси бруцел фенілізованим фізрозчином, інактивацію бакмаси, шляхом вирощування виробничого штаму Brucella abortus 19 на щільному середовищі МППГГА, інактивації бакмаси нагріванням, та додаткового проведення стабілізації антигену за температури (2-8)°С, стандартизації антигену за стандартом каламутності до концентрації 9 3 40×10 КУО/см з використанням Національної Anti-Brucella abortus сироватки, що відповідає сучасним міжнародним вимогам. Спосіб виконується таким чином. Розплодку штаму Brucella abortus 19 вирощують на середовищі МППГТА впродовж 72 год. за температури (37±0,5)°С. Культуру перевіряють на типовість росту (візуально та шляхом мікроскопії мазків), а також на відсутність дисоціації та наявність типових антигенних властивостей (із стандарними позитивною та негативною сироваткою). Розплодкою засівають матраци із МППГГА, культивують 72 год. за температури (37±0,5)°С. Змивають стерильним 0,5 % фенолізованим фізіологічним розчином (рН 7,0-7,2). Інактивують за температури (80±1)°С протягом 1 год. Контроль повноти інактивації бактерійної суспензії здійснюють шляхом висіву на середовища МППГГА і МППГГБ. Суспензію інактивованих клітин витримують впродовж 10 діб за 9 температури (4-8)°С. Антиген стандартизують стерильним фізрозчином до концентрації 40×10 3 КУО/см . Активність антигену перевіряють в ПРА із Національною Anti-Brucella abortus сироваткою (ННЦ "ІЕКВМ"). Антиген визнається активним, якщо в розведенні 1:10 він дає 50 % аглютинації (++) із Anti-Brucella abortus сироваткою в титрі 1:500. Приклад 1. Експериментальну серію бруцельозного антигену, виготовленого за методикою, що заявляється, було перевірено на активність та специфічність із антигену в РА із сироватками з "Набору позитивної бруцельозної та негативної контрольних сироваток" ТУУ 46.15.274; "Набору компонентів для серологічної діагностики ієрсиніозів тварин" ТУУ 46.15.091 та сироватки діагностичної сальмонельозної адсорбованої монорецепторної для ΡА (09). Результати наведено в таблиці 1. Встановлено, що антиген є активним, в робочому розведенні (1:10) він показує аглютинацію на ++++ із контрольною позитивною сироваткою в титрі 1:400. Специфічність антигену підтверджується наявністю аглютинації із гомологічною сироваткою та відсутністю аглютинації із негативною контрольною та гетерологічними сироватками. Приклад 2 1 UA 107685 U 5 10 Активність та специфічність експериментальної серії бруцельозного антигену було також перевірено в РЗК із сироватками з "Набору позитивної бруцельозної та негативної контрольних сироваток" ТУУ 46.15.274. Результати наведено в таблиці 2. Встановлено, що антиген є активним, в розведеннях від 1:50 до 1:200 він дає аглютинацію на ++++ із позитивною бруцельозною сироваткою в титрі 1:80. Специфічність антигену підтверджується відсутністю аглютинації із негативною сироваткою. Таким чином, розроблений нами спосіб виготовлення антигену для серологічної діагностики бруцельозу тварин є простим у виконанні, не потребує коштовного лабораторного обладнання та дозволяє отримати активний та специфічний діагностичний засіб. Запропонований спосіб знайде широке впровадження в біотехнологічній промисловості для виготовлення антигену для прижиттєвої діагностики бруцельозу сільськогосподарських, домашніх та диких тварин. Таблиця 1 Результати визначення активності та специфічності бруцельозного антигену в РА з контрольними комерційними сироватками Титр сироваток Найменування сироваток 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 Позитивна бруцельозна ++++ ++++ ++++ +++ + сироватка Негативна бруцельозна сироватка Ієрсиніозна сироватка серовар O:3 Ієрсиніозна сироватка серовар O:6.30 Ієрсиніозна сироватка серовар O:9 Сальмонельозна сироватка монорецепторна 09 Таблиця 2 Результати визначення активності та специфічності бруцельозного антигену в РЗК із контрольними комерційними сироватками Титр позитивної бруцельозної сироватки Розведення Негативна антигену сироватка 1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:50 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ + 1:100 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++ + 1:150 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ + 1:200 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ Контроль без антигену 15 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 Спосіб виготовлення антигену для серологічної діагностики бруцельозу тварин в РА, РЗК, РТЗК, який включає вирощування виробничого штаму Brucella abortus 19, змивання бакмаси бруцел фенілізованим фізрозчином, інактивацію бакмаси, який відрізняється тим, що вирощування виробничого штаму Brucella abortus 19 проводять на щільному середовищі МППГГА, інактивацію бакмаси проводять нагріванням, та додатково проводять стабілізацію антигену за температури (2-8) °С, стандартизацію антигену за стандартом каламутності до концентрації 9 3 40×10 КУО/см з використанням Національної Anti-Вruсеllа abortus сироватки. 2 UA 107685 U Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3