Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Винахід належить способу одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування Acinetobacter calcoaceticus IMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії, причому як джерело вуглецю використовують рідкі 2+ парафіни, а в експоненційній фазі росту у середовище вносять 0,15-0,20 мМ Сu . UA 107971 C2 (12) UA 107971 C2 UA 107971 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання мікробних поверхнево-активних речовин, які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти і нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловостях. Відомий спосіб одержання метаболітів з поверхнево-активними і емульгувальними властивостями за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С21N 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4.] Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі попередників синтезу і факторів росту, а також невисокий вихід цільового продукту від субстрату (до 48 %). Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Acinetobacter calcoaceticus IMB В-7241 [Пат. 53109 UA, МПК - С21R 1/38. Спосіб одержання поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Антонюк С.І., Щербина О.В. Опубл. 27.09.2010, Бюл. 18]. Недоліком цього способу є недостатньо висока концентрація синтезованих поверхневоактивних речовин. В основу винаходу поставлено задачу створення нового способу одержання ПАР, який підвищує синтез поверхнево-активних речовин. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю та енергії. Згідно з винаходом як джерело вуглецю використовують рідкі парафіни, а в експоненційній фазі росту у середовище вносять 0,15-0,20 2+ мМ Сu . Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Використання як джерела вуглецю рідких парафінів і 2+ внесення в експоненційній фазі росту у середовище 0,15-0,2 мМ Сu дає змогу підвищити умовну концентрацію ПАР в 1,75-1,8 разів (до 7,35-7,56). Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO-0,35; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; КН2РО4-0,14; MgSO4 × 7H2O-0,1; FeSO4 × 7H2O-0,001, pH 6,8-7,0. Як джерело вуглецю і енергії використовують рідкі парафіни у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру A. calcoaceticus IMB В-7241 з експоненційної фази (48 год. росту), вирощену на рідкому середовищі наведеного вище складу з 0,5 % (об'ємна частка) рідких парафінів. Кількість посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. Катіони міді (0,15-0,2 мМ) вносять у середовище у вигляді 0,1 М розчину CuSO4 × 5H2O у середині експоненційної фази росту A. calcoaceticus IMB В-7241. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 30 °C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу підвищити умовну концентрацію поверхневоактивних речовин в 1,75-1,8 разів (до 7,35-7,56). Приклад 1. Залежність синтезу ПАР A. calcoaceticus IMB В-7241 від моменту внесення катіонів міді у середовище з рідкими парафінами Культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO-0,35; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; КН2РО4-0,14; MgSO4 × 7H2O-0,1; FeSO4 × 7H2O-0,001, pH 6,8-7,0. Як джерело вуглецю і енергії використовують рідкі парафіни у концентрації 2 % (об'ємна частка). На початку процесу культивування, в середині 2+ експоненційної (48 год.) і стаціонарній фазі (72 год.) росту бактерій у середовище вносять Сu у концентрації 0,05 і 0,1 мМ. Катіони міді вносять у середовище у вигляді 0,1 М розчину CuSO4 × 5H2O. Як посівний матеріал використовують культуру A. calcoaceticus IMB В-7241, вирощену до середини експоненційної фази росту на рідкому середовищі з 0,5 % (об'ємна частка) рідких парафінів. Концентрація посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 30 °C упродовж 120 год. Біомасу визначають за оптичною густиною клітинної суспензії з наступним перерахунком на суху біомасу за калібрувальним графіком. Синтез ПАР оцінюють за показником умовної концентрації ПАР. Цей показник визначають як ступінь розведення вільної від клітин культуральної рідини у точці збільшення поверхневого натягу на кривій залежності поверхневого натягу від значення розведень. Абсциса точки перетину кривої відповідає значенню умовної концентрації ПАР та виражається в безрозмірних одиницях. 1 UA 107971 C2 Показники росту і синтезу ПАР залежно від моменту внесення і концентрації катіонів міді наведено у табл. 1. Таблиця 1 Ріст і синтез ПАР А. calcoaceticus IMB В-7241 залежно від моменту внесення катіонів міді 2+ Момент внесення Сu у 2+ Концентрація Сu , мМ середовище з рідкими парафінами 0,05 На початку процесу 0,1 0,05 Експоненційна фаза 0,1 0,05 Стаціонарна фаза 0,1 Без міді 0 Без міді (прототип, джерело 0 вуглецю етанол) 5 10 15 20 Біомаса, г/л ПАР* 1,0±0,05 0,6±0,03 0,8±0,02 0,9±0,04 0,8±0,04 0,8±0,04 0,9±0,04 3,5±0,17 3,5±0,17 5,8±0,29 6,8±0,34 4,3±0,21 4,4±0,22 3,1±0,15 1,2±0,06 4,2±0,21 Як свідчать дані, наведені у табл. 1, у разі внесення 0,1 мМ катіонів міді у середовище в експоненційній фазі росту A. calcoaceticus IMB В-7241 показник умовної концентрації ПАР підвищується в 1,6 разу порівняно з вирощуванням бактерій згідно з прототипом і у 2,2 разу порівняно з показниками на середовищі з рідкими парафінами без міді. Приклад 2. Вплив концентрації катіонів міді на синтез ПАР за умов росту A. calcoaceticus IMB В-7241 на рідких парафінах Культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO-0,35; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; КН2РО4-0,14; MgSO4 × 7H2O-0,1; FeSO4 × 7H2O-0,001, pH 6,8-7,0. Як джерело вуглецю і енергії використовують рідкі парафіни у концентрації 2 % (об'ємна частка). В експоненційній фазі росту бактерій (48 год.) у середовище 2+ вносять Сu у концентрації 0,1-0,3 мМ. Катіони міді вносять у середовище у вигляді 0,1 М розчину CuSO4 × 5H2O. Як посівний матеріал використовують культуру A. calcoaceticus IMB В7241, вирощену до середини експоненційної фази росту на рідкому середовищі з 0,5 % (об'ємна частка) рідких парафінів. Концентрація посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 30 °C упродовж 120 год. Визначення біомаси і умовної концентрації ПАР здійснюють як описано у прикладі 1. Показники росту і синтезу ПАР залежно від концентрації міді наведено у табл. 2. Таблиця 2 Ріст і синтез ПАР A. calcoaceticus IMB В-7241 залежно від концентрації катіонів міді 2+ Концентрація Сu , мМ 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0 25 30 Біомаса, г/л 0,9±0,04 0,9±0,04 0,9±0,04 0,8±0,02 0,8±0,02 0,9±0,04 ПАР* 6,8±0,34 7,35±0,36 7,56±0,37 5,2±0,26 5,7±0,29 3,1±0,15 Отже, оптимальною концентрацією катіонів міді, що забезпечує максимальне підвищення умовної концентрації ПАР у разі внесення у середовище з рідкими парафінами в експоненційній фазі росту, є 0,15-0,2 мМ. Збільшення концентрації катіонів міді до 0,25-0,3 мМ супроводжується зниженням показника умовної концентрації ПАР. Приклад 3. Вплив катіонів міді на активність алкангідроксилази А. саlcoaceticus IMB В-7241 Культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO-0,35; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; КН2РО4-0,14; MgSO4 × 7H2O-0,1; FeSO4 × 7H2O-0,001, pH 6,8-7,0. Як джерело вуглецю і енергії використовують рідкі парафіни у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту, вирощену на середовищі наведеного вище складу з 0,5 % рідких 2 UA 107971 C2 5 10 15 парафінів. Концентрація посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 30 °C упродовж 48 год. (експоненційна фаза) і 72 год. (стаціонарна фаза). Культуру, отриману після вирощування штаму IMB В-7241 на рідкому поживному середовищі з рідкими парафінами, обробляли гексаном для видалення залишків субстрату, після чого відділяли клітини бактерій фільтруванням під вакуумом на лійці Бюхнера. Послідовно + промивали осад клітин на паперовому фільтрі (під вакуумом) гексаном і 0,05 М К -фосфатним + буфером, рН 7,0. Відмиті клітини суспендували в 0,05 М К -фосфатному буфері, рН 7,0, і руйнували ультразвуком (22 кГц) 4 рази по 60 с при 4 °C на апараті УЗДН-1 (Росія). Дезінтеграт центрифугували (12000 g, 30 хв, 4 °C), осад обробляли, надосадову рідину використовували як безклітинний екстракт. Для отримання безклітинних екстрактів використовували клітини з експоненційної фази росту. Активність алкангідроксилази (КФ 1.14.15.3) визначали спектрофотометрично за окисненням НАДФН при 340 нм з використанням н-гексадекану як донора електронів. При вивченні впливу 2+ катіонів міді на активність алкангідроксилази в реакційну суміш вносили 0,01; 0,05 і 0,1 мМ Сu у вигляді 5 % розчину CuSO45H2O. Дані про активність алкангідроксилази за наявності різних концентрацій катіонів міді наведено у табл. 3. Таблиця 3 Залежність активності алкангідроксилази A. calcoaceticus IMB В-7241 від концентрації катіонів міді Концентрація Сu у реакційній Активність алкангідроксилази, нмольхв-1мг-1 білку у фазі росту суміші, мМ експоненційній стаціонарній 0 1923±96 769±38 0,01 5769±288 870±43 0,05 5769±288 1154±57 0,10 3846±192 1538±76 2+ 20 25 Дані, наведені у табл. 3, засвідчують, що катіони міді є активаторами алкангідроксилази у A. calcoaceticus IMB В-7241, що й зумовлює позитивний вплив цих катіонів на синтез ПАР. Отже, внесення в експоненційній фазі росту штаму IMB В-7241 у середовище з рідкими 2+ парафінами, 15-0,2 мМ Сu дає змогу підвищити (порівняно з прототипом) умовну концентрацію ПАР в 1,75-1,8 разів (до 7,35-7,56). ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 30 Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування Acinetobacter calcoaceticus IMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії, який відрізняється тим, що як джерело вуглецю використовують рідкі парафіни, а в 2+ експоненційній фазі росту у середовище вносять 0,15-0,20 мМ Сu . Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3