Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Винахід належить до способу одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування Acinetobacter calcoaceticus IMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і 2 % етанолу як джерела вуглецю і енергії, причому як посівний матеріал використовують культуру із стаціонарної фази росту, вирощену на середовищі з етанолом і 0,12+ 0,5 мМ Сu . Спосіб дає змогу підвищити умовну концентрацію поверхнево-активних речовин в 1,5-1,7 раза (до 7,0). UA 98570 C2 (12) UA 98570 C2 UA 98570 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання мікробних метаболітів з емульгувальними властивостями (емульгаторів), які можуть бути використані для очистки довкілля від нафти і нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловостях. Відомий спосіб одержання метаболітів з поверхнево-активними і емульгувальними властивостями за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С 21 N 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4]. Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі попередників синтезу і факторів росту, а також невисокий вихід цільового продукту від субстрату (до 48 %). Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Acinetobacter calcoaceticus IMB В-7241 [Пат. 53109 UA, МПК - С 21 R 1/38. Спосіб одержання поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Антонюк С.І., Щербина О.В. Опубл. 27.09.2010, Бюл. 18]. Недоліком цього способу є недостатньо висока концентрація синтезованих поверхневоактивних речовин. В основу винаходу покладено задачу створення нового способу одержання ПАР, який підвищує синтез поверхнево-активних речовин. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і 2 % етанолу як джерела вуглецю і енергії. Згідно винаходу як посівний матеріал використовують культуру із стаціонарної фази росту, вирощену на середовищі з 2+ етанолом і 0,1-0,5 мМ Сu . Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Використання посівного матеріалу із стаціонарної фази 2+ росту, вирощеного на середовищі з етанолом і 0,1-0,5 мМ Сu , дає змогу підвищити умовну концентрацію ПАР в 1,5-1,7 раза (до 7,0). Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO - 0,35; NaCl - 1,0; Na2HPO4 - 0,6; KН2РО4 - 0,14; MgSO4×7H2O - 0,1; FeSO4×7H2O - 0,001, pH 6,8-7,0. Як джерело вуглецю і енергії використовують етанол у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру A. calcoaceticus IMB В-7241 із стаціонарної фази (120 год. росту), вирощену на рідкому середовищі наведеного вище складу з 2,0 % (об'ємна частка) 2+ етанолу і 0,1-0,5 мМ Сu . Катіони міді вносять у середовище для одержання інокуляту у вигляді 0,1 М розчину CuSO4×5H2O у середині експоненційної фази росту A. calcoaceticus IMB В-7241. Кількість посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об./хв.) при 30 °С упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу підвищити умовну концентрацію поверхневоактивних речовин в 1,5-1,7 раза (до 7,0). Приклад 1. Ріст A. calcoaceticus IMB В-7241 і синтез ПАР за наявності у середовищі культивування катіонів міді Культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO - 0,35; NaCl - 1,0; Na2HPO4 - 0,6; КН2РО4 - 0,14; MgSO4×7H2O - 0,1; FeSO4×7H2O - 0,001, pH 6,8-7,0. Як джерело вуглецю і енергії використовують етанол у концентрації 2 % (об'ємна частка). На початку процесу культивування, в середині 2+ експоненційної (48 год.) і стаціонарній фазі (72 год.) росту бактерій у середовище вносять Сu у концентрації 0,1-0,5 мМ. Катіони міді вносять у середовище у вигляді 0,1 М розчину CuSO4×5H2O. Як посівний матеріал використовують культуру A. calcoaceticus IMB В-7241, вирощену до кінця експоненційної фази росту на рідкому середовищі з 1,0 % (об'ємна частка) етанолу. Концентрація посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об./хв.) при 30 °С упродовж 120 год. Біомасу визначають за оптичною густиною клітинної суспензії з наступним перерахунком на суху біомасу за калібрувальним графіком. Синтез ПАР оцінюють за показником умовної концентрації ПАР. Цей показник визначають як ступінь розведення вільної від клітин культуральної рідини у точці збільшення поверхневого натягу на кривій залежності 1 UA 98570 C2 5 10 15 20 поверхневого натягу від значення розведень. Абсциса точки перетину кривої відповідає значенню умовної концентрації ПАР та виражається в безрозмірних одиницях. Показники росту і синтезу ПАР залежно від моменту внесення і концентрації катіонів міді наведено у табл. 1. Як свідчать дані, наведені у табл. 1, за присутності катіонів міді у середовищі культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 знижується як рівень біомаси, так і показник умовної концентрації ПАР порівняно з вирощуванням бактерій на середовищі без міді, причому така закономірність 2+ спостерігається незалежно від моменту внесення Сu . Разом з тим слід зазначити, що у міру підвищення концентрації міді від 0,1 до 0,5 мМ показник ПАР* підвищується, хоча й 2+ залишається нижчим, ніж під час вирощування штаму IMB В-7241 за відсутності Сu . Приклад 2. 2+ Синтез ПАР після пересіву вирощених за наявності Сu клітин A. calcoaceticus IMB В-7241 на середовище без міді Культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NН2)2СО - 0,35; NaCl - 1,0; Na2HPO4 - 0,6; KН2РО4 - 0,14; MgSO4×7H2O - 0,1; FeSO4×7H2O - 0,001, pH 6,8-7,0. Як джерело вуглецю і енергії використовують етанол у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з стаціонарної фази росту (120 год. росту), вирощену за присутності 0,1-0,5 мМ катіонів міді, які вносили у середовище на початку культивування, в експоненційній і стаціонарній фазі росту (варіанти обробки міддю - див. табл. 1). Концентрація посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об./хв.) при 30 °С упродовж 120 год. Таблиця 1 Ріст і синтез ПАР A. calcoaceticus IMB В-7241 на середовищі з різною концентрацією катіонів міді 2+ Момент внесення Сu середовище На початку процесу Експоненційна фаза Стаціонарна фаза Без міді (прототип) 25 30 у 2+ Концентрація Сu , мМ Біомаса, г/л ПАР* 0,1 0,3 0,5 од 0,3 0,5 0,1 0,3 0,5 0 1,0±0,05 0,6±0,03 0,3±0,01 0,8±0,02 0,9±0,04 1,0±0,05 0,8±0,04 0,8±0,04 0,9±0,04 1,2±0,06 3,5±0,17 3,5±0,17 3,7±0,18 2,8±0,14 3,2±0,16 3,9±0,19 2,3±0,11 3,4±0,17 4,0±0,20 4,2±0,21 Визначення біомаси і умовної концентрації ПАР здійснюють як описано у прикладі 1. Показники росту і синтезу ПАР на середовищі без міді наведено у табл. 2. Отже, після пересіву на середовище без міді клітин A. calcoaceticus IMB В-7241, вирощених за присутності катіонів цього металу, спостерігається підвищення показника умовної концентрації ПАР, який досягає максимального значення (6,3-7,0) за такої попередньої обробки 2+ клітин Сu : внесення 0,1-0,5 мМ катіонів міді у середовище в середині експоненційної фази росту. 2 UA 98570 C2 Таблиця 2 Показники росту і синтезу ПАР A. calcoaceticus 2+ 2+ IMB В-7241 після обробки Сu (пересів на середовище без Сu ) 2+ Варіант обробки Сu 2+ Момент внесення Сu у 2+ Концентрація Сu , мМ середовище 0,1 На початку процесу 0,3 0,5 0,1 Експоненційна фаза 0,3 0,5 0,1 Стаціонарна фаза 0,3 0,5 Без міді 0 5 10 15 Біомаса, г/л ПАР* 0,4±0,02 0,4±0,02 0,4±0,02 1,0±0,05 0,8±0,04 0,5±0,02 1,0±0,05 0,9±0,04 0,8±0,04 1,2±0,06 4,5±0,22 4,0±0,20 4,0±0,20 7,0±0,35 6,8±0,34 6,3±0,31 4,8±0,24 5,0±0,25 5,0±0,25 4,2±0,21 Приклад 3. Вплив способу підготовки інокуляту на синтез ПАР A. calcoaceticus IMB В-7241 Культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO - 0,35; NaCl - 1,0; Na2HPO4 - 0,6; KН2РО4 - 0,14; MgSO4×7H2O - 0,1; FeSO4×7H2O - 0,001, pH 6,8-7,0. Як джерело вуглецю і енергії використовують етанол у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з кінця експоненційної (60-66 год.) і стаціонарної (120 год.) фази росту, вирощену на середовищі 2+ наведеного вище складу з 0,05-0,6 мМ Сu . Катіони міді у середовище для одержання інокуляту вносять в середині експоненційної фази росту (48 год.). Концентрація посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об./хв.) при 30 °С упродовж 120 год. Визначення умовної концентрації ПАР здійснюють як описано у прикладі 1. Дані синтезу ПАР A. calcoaceticus IMB В-7241 за використання інокуляту різної якості наведено у табл. 3. 3 UA 98570 C2 Таблиця 3 Синтез A. calcoaceticus IMB В-7241 залежно від способу підготовки інокуляту 2+ Фаза росту інокуляту Концентрація Сu Кінець експоненційної Стаціонарна Кінець експоненційної (прототип) 5 у середовищі для одержання інокуляту, мМ 0 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0 ПАР* 4,0±0,20 4,2±0,21 4,1±0,20 4,1±0,20 4,2±0,20 4,3±0,22 4,3±0,22 4,0±0,20 3,9±0,20 4,6±0,23 7,0±0,35 6,8±0,34 6,8±0,34 6,5±0,32 6,3±0,31 4,5±0,22 4,2±0,21 Дані, наведені у табл. 3, засвідчують, що тільки використання інокуляту ізстаціонарної фази 2+ росту, вирощеного на середовищі, що містить 0,1-0,5 мМ Сu , дає змогу суттєво (в 1,5-1,7 раза) підвищити умовну концентрацію поверхнево-активних речовин порівняно з прототипом. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування Acinetobacter calcoaceticus IMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і 2 % етанолу як джерела вуглецю і енергії, який відрізняється тим, що як посівний матеріал використовують 2+ культуру із стаціонарної фази росту, вирощену на середовищі з етанолом і 0,1-0,5 мМ Сu . Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4