Спосіб визначення частки функціонально активних клітин у складі епітеліальних пухлин товстої кишки

Реферат: Спосіб визначення частки функціонально активних клітин у складі епітеліальних пухлин товстої кишки включає визначення низки параметрів, які характеризують форму і розміри ядра клітини, та здійснення розподілу клітин на морфо-функціональні типи: з функціональними ядрами, у стані апоптозу, у стані мітозу, старіючі. Пухлинні клітини рангують за вмістом ДНК у ядрі з кроком де 1=2с (диплоїдні), виходячи з площі перерізу і вмісту ДНК та обчислюють індекс нормальності ядра пухлинних клітин. UA 108521 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ ЧАСТКИ ФУНКЦІОНАЛЬНО АКТИВНИХ КЛІТИН У СКЛАДІ ЕПІТЕЛІАЛЬНИХ ПУХЛИН ТОВСТОЇ КИШКИ UA 108521 U UA 108521 U 5 10 15 20 25 30 35 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме до патологічної анатомії та гістології, та призначена для визначення частки функціонально активних клітин у складі епітеліальних пухлин товстої кишки за об'єктивними ознаками стану ядер функціонально активних клітин (домінуючий пул, що визначає потенції пухлини) і таких, що зазнали патологічних змін та є нежиттєздатними. Відомий спосіб каріометрії на цифрових гістологічних зображеннях ґрунтується на можливості візуального сприйняття інформації фахівцем-гістологом [1]. Однак, використання цього способу має певні труднощі. Діагностичні можливості таких досліджень обмежені, оскільки органи зору людини, за психофізичними законами Вебера-Фехнера та Стівенса, сприймають зміни в медичних зображеннях лише в логарифмічній прогресії. Проблемним питанням візуального підходу є обмеженість його діагностичної ефективності, суттєва залежність від досвіду та психоемоційного стану самого лікаря, і те, що при рутинній клінічній практиці це займає багато часу [2]. За прототип вибрано спосіб морфометричної оцінки стану ядер клітин (Nuclear Morphometric Analysis (NMA): screening of senescence, apoptosis and nuclear irregularities / E.C. Filippi-Chiela, M.M. Oliveira, B. Jurkovski [et al.] // PLoS ONE.-2012. - Vol. 7, № 8. - P. e42522), за яким визначають низку параметрів, що характеризують форму і розміри ядра клітини та здійснюють розподіл клітин на морфо-функціональні типи: з функціональними ядрами, у стані апоптозу, у стані мітозу, старіючі та інші. Позитивним у прототипі є те, що спосіб дозволяє ідентифікувати клітини з інтерфазними ядрами, а також клітини у стані поділу, використовуючи тільки морфологію ядра без застосування спеціальних методів, а також визначити клітини, що зазнали патологічних змін ядра. Недоліком прототипу є його обмежена придатність та незручність для застосування в рутинній морфологічній діагностиці. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення частки функціонально активних клітин у складі епітеліальних пухлин товстої кишки шляхом розділення цих клітин за питомим вмістом ДНК у ядрі на три різні функціональні групи: з умовно нормальними ядрами (функціонально активні, життєздатні); з ядрами в стані хроматолізу; з гіперхромними ядрами (у стані пікнозу), що дасть можливість виділити частину функціонально активних клітин у складі епітеліальних пухлин товстої кишки. Поставлена задача вирішується наступним чином: На препаратах, забарвлених за Ейнарсоном, визначають вміст ДНК в ядрах клітин та вимірюють площу перетину ядра. Дослідна вибірка клітин пухлини поділяють на N рангів (R), з кроком, що дорівнює середньому вмісту ДНК у ядрах лімфоцитів: R1 - до 1, R2-1-2, R3-2-3, і так далі. На основі цього обчислюють індекс нормальності ядра кожної клітини (Ni ) : Ni  40 NDNA i  NArea R , (1) NDNA R  NArea i де: Ni - індекс нормальності ядра досліджуваної клітини, NDNA i - вміст ДНК у ядрі досліджуваної клітини, NDNA R - середній вміст ДНК у ранзі R, до якого належить клітина, NAreai - площа перетину ядра досліджуваної клітини, NAreaR - середнє значення площі перерізу ядра у ранзі R, до якого належить клітина. 45 Значення NDNA R , NAreaR обчислювали емпірично для кожного рангу на основі загальної вибірки пухлинних клітин 133 пухлин. R 1 2 3 4 5 6 6+ NAreaR NDNA R 26,1 33,5 40,8 47,8 53,9 59,2 65,3 0,82 1,52 2,41 3,35 4,39 5,24 6,52 1 UA 108521 U Значення Ni , які відповідали б нормальним ядрам, були вибрані напівемпіричним шляхом і 5 10 15 20 25 30 встановлені у межах: 1±0,2. Для вибірки клітин з нормальними показниками Ni було обчислено середнє значення оптичної щільності ядра, середньоквадратичне відхилення і на основі цього мінімальне та максимальне значення, що дозволило розширити можливості Ni . До клітин Nn були віднесені клітини, середня оптична щільність ядер яких лежала у межах між мінімумом і максимумом, які були обчислені на попередньому кроці. Ядра зі щільністю понад нормальний діапазон (вище максимуму) були віднесені до Np (що зазнали пікнозу: велика оптична щільність одночасно з низькими показниками площі перетину). Клітини з ядрами, які мали оптичну щільність нижче мінімального значення визначеного діапазону, були віднесені до Nl (що зазнали хроматолізу). Прикладом конкретного виконання способу є визначення відносної частки трьох різних груп за питомим вмістом ДНК в епітеліальних пухлинах товстої кишки. Дослідження були проведені на біопсійному матеріалі або матеріалі вилученому після оперативного втручання у 10 пацієнтів з епітеліальними пухлинами товстої кишки. Отриманий матеріал фіксували в забуференому 10 % формаліні з рН 7,4 та ущільнювали у парафін із застосуванням гістіопроцесора Histos-5 (Milestone, Italy). З отриманих блоків виготовляли гістологічні зрізи товщиною 5 мкр за допомогою мікротома Microm HM325 (Thermoscientific, Germany). Зрізи забарвлювали гематоксиліном і еозином для загальної оцінки пухлини, галоціанін-хромовим галуном за Ейнарсоном (рН 1,62, 37 °C, 24 год.) для виявлення вмісту нуклеїнових кислот (НК) у клітинах, що досліджували. Для кожного випадку частину зрізів обробляли РНК-азою для екстракції РНК. Отримані препарати вивчали та фотографували за допомогою мікроскопа Nikon Eclipse 80i з камерою DS-5SMc/L2 за стандартизованих умов. На отриманих зображеннях з препаратів, забарвлених галоціанін-хромовим галуном (збільшення мікроскопа ×400, 1280×960 пікселів RGB), у 30 клітинах кожної пухлини, за допомогою системи аналізу зображення ImageJ 1,46, визначали: площу перерізу ядра клітини (NArea), питому оптичну щільність ядра клітини (NDM), інтегративну оптичну щільність ядра клітини (NIntDen), а також розраховували вміст у ньому сумарної кількості нуклеїнових кислот (NNA) і ДНК (NDNА). Для кожної клітини за формулою (1) обчислювали індекс нормальності ядра (з урахуванням рангу). На основі Ni для кожної пухлини обчислювали діапазон NDM для клітин з життєздатними ядрами, відповідно до клітин, що потрапляли у цей діапазон, відносили до групи клітин з нормальними ядрами, вище діапазону - до клітин з гіперхромними ядрами (пікнозом), нижче - до групи клітин з ядром, що зазнали хроматолізу. Фактичну кількість клітин у кожній групі було переведено у відсоткову кількість (табл. 1). 35 Таблиця 1 № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 40 45 NDM 105,93 87,41 107,61 62,73 72,01 88,59 107,18 81,71 101,74 100,63 Міn 83,55 72,14 74,76 61,47 50 75,45 80,9 62,21 76,39 82,66 Мах 128,31 102,69 140,46 64 94,01 101,73 133,46 101,22 127,09 118,6 Nn, % 80 93,33 96,67 13,33 66,67 36,67 86,67 76,67 70 43,33 Np, % 16,67 3,33 0 6,67 0 63,33 6,67 20 23,33 56,67 Nl, % 3,33 3,33 3,33 80 33,33 0 6,67 3,33 6,67 0 Наведені дані можна розглядати як відображення концепції клональної еволюції пухлин та демонструвати поступове набуття домінування в аденокарциномах товстої кишки клону(ів) з ефективними системами життєзабезпечення і, можливо, зі стабілізованим геномом. З набуттям клональної еволюції отримує максимум субстрату для реалізації відбору і зі складу пухлини елімінуються нежиттєздатні морфо-функціональні типи пухлин. Разом з тим, з клітинного різноманіття виділяються такі, що мають спотворений генотип, який забезпечує високу проліферативну активність зі збереженням систем життєзабезпечення та втратою специфічних функцій інтегрування у тканинні комплекси та є основою для виникнення стійких клонів, здатних до необмеженого існування. Визначення частки функціонально-активних клітин пухлини дає можливість уточнити стадію її розвитку та ступінь злоякісного потенціалу клітин пухлини. 2 UA 108521 U Таким чином, запропонований спосіб дозволяє відрізняти життєздатні морфо-функціональні типи пухлинних клітин від нежиттєздатних, з використанням лише двох параметрів - вмісту ДНК та площі поперечного перерізу ядра клітини. Перевагами методу є його простота у застосуванні. 5 10 Джерела інформації: 1. Автандилов Г.Г. Диагностическая медицинская плоидометрия / Г.Г. Автандилов. - М.: Медицина, 2006.-192 с. 2. Nonlinear analysis of digital images and Doppler measurements for trophoblastic tumor / V. Orel, T. Kozarenko, K. Galachin [et al.] // Nonlinear Dynamics Psychol. Life Sci.-2007. - Vol. 11, № 3. - P. 309-331. 3. Nuclear Morphometric Analysis (NMA): screening of senescence, apoptosis and nuclear irregularities. / E.C. Filippi-Chiela, M.M. Oliveira, B. Jurkovski [et al.] // PLoS ONE. - 2012. - Vol. 7, № 8. - P. e42522 (прототип). ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 Спосіб визначення частки функціонально активних клітин у складі епітеліальних пухлин товстої кишки, що включає визначення низки параметрів, які характеризують форму і розміри ядра клітини, та здійснення розподілу клітин на морфо-функціональні типи: з функціональними ядрами, у стані апоптозу, у стані мітозу, старіючі, який відрізняється тим, що пухлинні клітини рангують за вмістом ДНК у ядрі з кроком де 1=2с (диплоїдні), виходячи з площі перерізу і вмісту ДНК та обчислюють індекс нормальності ядра пухлинних клітин (Ni ) для кожного рангу за формулою: Ni  25 NDNA i  NArea R , NDNA R  NArea i де: Ni - індекс нормальності ядра досліджуваної клітини, NDNA i - вміст ДНК у ядрі досліджуваної клітини, NDNA R - середній вміст ДНК у ранзі R, до якого належить клітина, NAreai - площа перетину ядра досліджуваної клітини; 30 клітини зі значенням Ni у межах: 1±0,2, вважаються функціонально активними у складі епітеліальних пухлин товстої кишки. Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3