Штам streptomyces albus – продуцент комплексу антибіотичних речовин і комплекс антибіотичних речовин, що має протигрибкову дію

Реферат: Винахід належить до біотехнологічної промисловості. Запропоновано новий штам Streptomyces albus, який продукує комплекс антибіотичних речовин, що має протигрибкову дію. Штам Streptomyces albus UN 44 депонований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України під реєстраційним номером Streptomyces albus IMB Ас-5030. UA 109568 C2 (12) UA 109568 C2 UA 109568 C2 5 10 15 20 25 30 Винахід належить до біотехнологічної промисловості, а саме до культури роду Streptomyces виду Streptomyces albus і може бути використаний при отриманні нового антибіотика, придатного для використання як кормової добавки при лікуванні тварин. Найбільш близьким є штам Streptomyces recifensis var. lyticus (реіндентифікований як Streptomyces albus) IMB Ac-5001, продукуючий комплекс літичних ферментів [UA, патент України на винахід № 34119, опубліковано 15.02.2001]. Відомий штам дозволяє здійснювати біосинтез ферментного комплексу, який використовується як субстанція для виділення клітинних структур та для отримання ферментних препаратів, що застосовуються в різних галузях промисловості і медицині як антисептик побутового, ветеринарного, косметичного, медичного та промислового призначення. Відсутні відомості щодо здатності відомого штаму до синтезу антибіотичних речовин. Задачею винаходу є створення нового штаму Streptomyces albus, що здатний продукувати антибіотичну речовину, придатну для використання як основа ветеринарних та медичних препаратів. Задачею винаходу є створення нового антибіотика протигрибкової дії. Поставлена задача вирішується штамом Streptomyces albus UN 44 - продуцентом комплексу антибіотичних речовин, названого нами стрептофунгін, що має протигрибкову дію, депонований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України під реєстраційним номером Streptomyces albus IMB Ас-5030. Поставлена задача вирішується штамом Streptomyces albus UN 44 - продуцентом комплексу антибіотичних речовин, названого нами стрептофунгін, що має протигрибкову дію, депонований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України під реєстраційним номером Streptomyces albus IMB Ас-5030. Культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні ознаки культури. Штам Streptomyces albus UN 44 одержують в результаті ступінчастого індукованого мутагенезу при послідовній обробці суспензії спор вихідної культури штаму Streptomyces 2 recifensis var. lyticus IMB Ac-5001 ультрафіолетовим випромінюванням в дозі 240 Дж/м та азотистою кислотою (0,5 М NaNO2) протягом 50 хвилин. Вирощування здійснюють при температурі 28±1 °C та перемішуванні при швидкості до 220 об/хв. впродовж 48-72 годин на рідкому середовищі Чапека або іншому середовищі. Оптимальне рН середовища 6,5±1. Характер росту штаму Streptomyces albus UN 44 на різних середовищах та морфологія органів плодоношення показані у Таблиці 1. Таблиця 1 Морфологія органів плодоношення штаму Streptomyces albus UN при 44 вирощуванні на різних середовищах Середовище культивування Характер росту Повітряний Субстратний Розчинний Форма Форма спор та міцелій міцелій пігмент спороносців спосіб утворення овальні гладкі, прямі чи утворюються Агар Чапека задовільний блідо-білий безбарвний немає трохи шляхом хвилясті фрагментації овальні гладкі, прямі чи дуже утворюються Вівсяний агар білий безбарвний немає трохи добрий шляхом хвилясті фрагментації овальні гладкі, прямі чи Мінеральний утворюються добрий білий безбарвний немає трохи агар Гаузе шляхом хвилясті фрагментації овальні гладкі, прямі чи Органічний дуже білий до утворюються безбарвний немає трохи агар Гаузе добрий кремового шляхом хвилясті фрагментації овальні гладкі, Глюкозосвітлопрямі чи утворюються аспарагіновий задовільний сірий 3 безбарвний немає трохи шляхом агар жовтуватим хвилясті фрагментації 1 UA 109568 C2 Продовження таблиці 1 Сусло-агар 5 10 15 20 25 30 35 40 45 добрий світлокавовий безбарвний немає прямі чи трохи хвилясті овальні гладкі, утворюються шляхом фрагментації Наприкінці вирощування в середовищі утворюється непрозора густа міцеліальна маса жовтувато-оливкового кольору з легким запахом дусту. Клітини штаму формуються у вигляді гіф діаметром 0,7-0,9 мкм. Як зазначено у Таблиці 1, спороносці короткі трохи хвилясті, мало розгалужені. Спори овальні, гладкі, утворюються шляхом фрагментації. Забарвлення повітряного міцелію коливається від білого до світлокавового, субстратний міцелій майже безбарвний. Добре розвинутий повітряний міцелій утворюється на більшості вказаних у Таблиці 1 середовищах. Штам Streptomyces albus UN 44 ідентифікували за результатами генетичного аналізу, морфології та фізіолого-біохімічних ознак батьківського та отриманого штаму. Для короткострокового зберігання (до 2-х місяців) штам Streptomyces albus UN 44 підтримується на середовищі агар Гаузе органічний або середовищі Чапека при температурі 4 °C. Довготривале зберігання штаму Streptomyces albus UN 44 можливе у вигляді ліофілізованої спорової суспензії, запаяної у ампулах при температурі 4 °C. Захисне середовище під час висушування - глюкоза. Штам Streptomyces albus UN 44 на 3-4 добу продукує комплекс літичних ферментів з широким спектром бактеріолітичної активності щодо грампозитивних та частини грамнегативних мікроорганізмів. В ході вивчення біологічних властивостей, нами було встановлено, що на 4-5 добу штам Streptomyces albus UN 44 продукує комплекс антибіотичних речовин - стрептофунгін, що має протигрибкову дію. Крім того, штам Streptomyces albus UN 44 здатен розріджувати желатин, створоджувати молоко, відновлювати нітрати в нітрити. Не виявляє тирозиназної активності. Для росту мікроорганізмів штам Streptomyces albus UN 44 здатен використовувати: глюкозу, галактозу, фруктозу, ксилозу, арабінозу, мальтозу, маніт. Слабко використовує: лактозу, дульцит, інозит, сахарозу, рамнозу. Не зброджує: сорбіт. Генетичні та інші особливості штаму. Штам є мутантом. Стійкість до антибіотиків та ауксотрофність не вивчалися. Стрептофунгін, що має протигрибкову дію, являє собою комплекс антибіотичних речовин аліфатичної будови, бактерицидної дії, синтезованих штамом Streptomyces albus UN 44. Характеристика стрептофунгіну визначається антагоністичною активністю штаму Streptomyces albus UN 44. Антагоністичну активність штаму Streptomyces albus UN 44 визначали методом радіальних штрихів, використовуючи агаризовене стрептоміцетне середовище Гаузе. Чашки Петрі засівали культурою Streptomyces albus 2435 і ставили на пророщування протягом 5 діб в термостат при температурі 28 °C. Після цього методом радіальних штрихів підсівали тест-штами 5 мікроорганізмів (концентрація 1*10 кл/мл), чашки Петрі ставили на 24 год. в термостат (t=37 °C). Вимірювали зони затримки росту. Для дослідження антагоністичної активності Streptomyces albus UN 44 використовували міжнародні референс-штами тест-мікроорганізмів з Української колекції мікроорганізмів (Інститут мікробіології і вірусології НАН України). Дані тест-штами мікроорганізмів є загально прийнятими у світовій практиці для оцінки антимікробної дії антибіотичних сполук і включені в Фармакопеї країн світу. Антагоністична активність штаму Streptomyces albus UN 44 показана у Таблиці 2. Таблиця 2 Антагоністична активність штаму Streptomyces albus UN 44 № п/п 1 Тест-штами Грампозитивні Bacillus subtilis ATCC 6633 Зона затримки росту, мм 0 2 UA 109568 C2 Продовження таблиці 2 2 3 4 5 6 7 9 5 10 15 20 25 Bacillus cereus ATCC 11778 Staphylococcus aureus ATCC 6538 Kocuria (Micrococcus) varians ATCC 9341 Грамнегативні Escherichia coli ATCC 25922 Proteus vulgaris ATCC 6896 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Дріжджі Candida albicans ATCC 10231 0 0 10 0 0 0 15 Для отримання стрептофунгіну - препарату комплексу антибіотичних речовин, з культуральної рідини штаму Streptomyces albus UN 44 вирощеної на 4-5 день виділяють біомасу центрифугуванням, висушують і фасують у пакети. Концентрація комплексу антибіотичних речовин стрептофунгіну у готовому препараті - 50-60 мг/г. У такому вигляді препарат може бути застосований у ветеринарії. Нешкідливість та безпечність штаму Streptomyces albus UN 44 для теплокровних тварин підтверджено "Висновком щодо дослідження вірулентності штаму Streptomyces albus UN 44" Інституту мікробіології і вірусології НАНУ від 27.05.2013 р. Для отримання очищеного препарату проводять екстрагування антибіотику з біомаси етиловим спиртом. Одержаний комплекс антибіотичних речовин активний щодо дріжджів та частини грампозитивних культур. Приклад Вихідну культуру штаму Streptomyces albus UN 44, вирощену на поживному середовищі: глюкоза - 6,0; соєве борошно дезодороване - 8,0; NaCl-14,0; К2НРО4×3Н2О - 2,0; СаСl2-4,5; MgSO4×7H2O-5,8; MnCl2×4 H2O-0,04; пропінол Б-400 0,014 л; рН 7,8-8,2, вносять до поживного середовища для біосинтезу стрептофунгіну штамом Streptomyces albus UN 44 у ферментаторі. Склад поживного середовища для біосинтезу штаму Streptomyces albus UN 44: соєве борошно - 8,0; крохмаль картопляний гідролізований - 10,0; NaCl-14,0; К2НРО4×3Н2О - 2,0; MgCl2-2,2; СаСl2-2,0; МnСl2×4Н2О - 0,04; пропінол Б - 400; рН 7,8-8,2. Культуру вирощували при температурі 28 °C та перемішуванні при швидкості 220 об/хв. впродовж 4 доби у ферментері (V=1000 л, при аерації 0,4×Vпов/Vcep, Vпов - об'єм повітря, Vcep - об'єм середовища). Центрифугуванням відокремлюють біомасу. Одержану біомасу висушують і очищують. Одержаний антибіотик стрептофунгін характеризується: активний щодо дріжджів - Candida albicans, активний щодо частини грампозитивних культур - Kocuria (Micrococcus) varians. Концентрація комплексу антибіотичних речовин стрептофунгіну у готовому препараті - 58 мг/г. Таким чином, запропонований Streptomyces albus UN 44 є продуцентом стрептофунгіну: комплексу антибіотичних речовин, що мають протигрибкову дію. 30 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 35 1. Штам Streptomyces albus - продуцент комплексу антибіотичних речовин, що має протигрибкову дію, депонований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України під реєстраційним номером Streptomyces albus IMB Ас-5030. 2. Комплекс антибіотичних речовин, що має протигрибкову дію, синтезований штамом Streptomyces albus, депонованим в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України під реєстраційним номером Streptomyces albus IMB Ас-5030. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3