Штам streptomyces avermitilis – продуцент авермектинів, речовин антипаразитарної дії

Штам Streptomyces avermitilis, який утворює авермектини – речовини антипаразитарної дії, і депонований у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України під реєстраційним номером ІМВ Ac-5015. Винахід відноситься до галузі біотехнології отримання біологічно активних речовин мікробіологічним шляхом, а саме - до виробництва антипаразитарних препаратів на основі авермектинів. Відомі зарубіжні штами Streptomyces avermitilis продуценти авермектинів: ВНИИСХМ-54 (утворює в середньому 1500мкг авермектинів в 1мл етанольного екстракту з міцелію), ВКПМS1440 (2350мкг/мл), АТСС 31271 (до 500мкг/мл) [1-3]. В Україні донедавна був відсутній вітчизняний штам, здатний синтезувати авермектини. Streptomyces avermitilis 1MB (УКМ) Ac 2161 був виділений з чорнозему типового малогумусного, зареєстрований в Депозитарії 1MB НАН України під номером Ас 5006 і запатентований в Україні у 2001 році [4]. Він здатний утворювати весь комплекс авермектинів, що складається з чотирьох мажорних фракцій А1, А2, В1 і В2. Недоліком даного штаму є досить низька біосинтетична активність - всього 30-75мкг авермектинів в 1мл етанольного екстракту з міцелію. В результаті природнього добору та спрямованої селекції за допомогою УФопромінення було відібрано для подальшої роботи варіант Stm. avermitilis УКМ Ac 2161 під робочим номером 288 із здатністю утворювати до 120мкг/мл авермектинів [5]. Мета винаходу - отримати новий штам Stm. avermitilis з достатньо високою авермектинсинтезуючою активністю, який можна буде. запропонувати вітчизняній мікробіологічній промисловості в якості продуцента авермектинів. Мета була досягнена отриманням штаму Stm avermitilis 1130, що утворює в середньому 1600мкг авермектинів в 1мл етанольного екстракту з міцелію (в межах мінливості від 900 до 2300мкг/мл). Вміст авермектинів групи В складає 45%. Запропонований штам було отримано шляхом спрямованої селекції за допомогою N-метил-Nнітро-N-нітрозогуанідіну. Відбір активних варіантів проводили за двома показниками: а) за здатністю варіантів до утворення усього комплексу авермектинів та б) за здатністю варіантів до синтезу авермектинів В1 і В2. (19) UA (11) 69639 (13) C2 (21) 2003109795 (22) 31.10.2003 (24) 15.08.2006 (46) 15.08.2006, Бюл. № 8, 2006 р. (72) Іутинська Галина Олександрівна, Козирицька Валентина Євгенівна, Валагурова Олена Володимирівна, Муквич Микола Семенович, Білявська Людмила Олексіївна, Петрук Тетяна Вікторівна (73) ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім.Д.К.Заболотного НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ 3 69639 Штам Stm. avermitilis 1130 в цілому зберіг усі типові ознаки материнського штаму УКМ Ас 2161. Основні з них наводимо нижче. Мікроморфологічні ознаки штаму 1130 В умовах поверхневого розвитку на агаризованих середовищах (рН6,8-7,4; температура 28°С) утворює спорофори у вигляді невеликих спіралей до 3-5 завитків, які при суцільному рості з віком розташовуються так тісно, що мають вигляд клубочків. Оболонка спор гладка. Макроморфологічні ознаки штаму 1130 (за тих же умов росту) На протязі перших семи діб росту окремі колонії плоскі на вигляд і зазвичай мають невеликі розміри (3-5СМ у діаметрі, а іноді менше); з віком (7-14 діб) колонії збільшуються у діаметрі до 10СМ. В центрі колоній з'являється підвищення, на схилах якого спостерігається більш-менш виразна складчастість. При суцільному рості складчастість або бугорчастість проявляється лише по краях росту. Культуральні ознаки штаму 1130 На картопляно-глюкозному агарі (КГА) ріст добрий. Субстратний міцелій (CM) з віком змінюється від буруватого кольору до темнокоричнюватого з червонуватим відтінком. Повітряний міцелій (ПМ) теж добре розвинений. У 7-добовому віці вій має білувато-сіре забарвлення 4 з коричнюватим відтінком; у 14-добовому віці білий відтінок зникає, проте до забарвлення додається слабкий жовтуватий відтінок. Розчинний пігмент (РП) відсутній. На вівсяному агарі ріст досить непоганий. CMкоричнюватий (в молодому віці більш світлий, з віком темнішає). ПМ розвинений трохи слабше в порівнянні зкгА. У 7-добовому віці він сірого кольору; з віком - сіро-коричнюватий. РП відсутній. На мінеральному середовищі Гаузе-1 ріст загалом непоганий. СМ у молодому віці безбарвний, а з віком стає коричнюватий зі слабким червонуватим відтінком. ПМ спочатку (4 доби) відсутній, проте з віком поступово з'являється; у 14-добовому віці він слабо розвинутий, сіруватий. РП відсутній. На органічному середовищі Гаузе-2 ріст теж загалом непоганий. CM-світлувато-буруватий з жовтуватим відтінком. ПМ у молодому віці (4 доби) майже відсутній (з рідкими острівцями білого нальоту). У 7-14-добовому віці площа під ПМ збільшується, а він набуває білувато-сіруватого забарвлення. РП відсутній. Фізіолого-біохімічні властивості штаму 1130 При вище вказаних умовах розвитку фізіологобіохімічні ознаки штаму 1130 дещо відрізняються від властивостей материнського штаму У KM Ac 2161. Нижче наводимо порівняльні дані. Таблиця Фізіолого-біохімічні властивості штамів 1130 та У KM Ac 2161 Показник Утилізація джерел вуглецю Утворення меланіну Розрідження желатину Пептонізація молока Коагуляція молока Гідроліз крохмалю Відновлення нітратів Утворення H2S Руйнування клітковини Відношення до антибіотиків Ас2161 1130 Добре росте на: глюкозі, арабінозі, ксилозі, рафінозі; Добре росте на глюкозі, рамнозі, сахарозі, слабо росте на рамнозі, інозиті, маніті, сорбіті; не росте на сахарозі, інозиті; не росте на арабінозі, ксилозі, фруктозі, целюлозі фруктозі, маніті, целюлозі Утворює Утворює Розріджує добре Розріджує середньо Пептонізує середньо Не пептонізує Не коагулює Не коагулює Гідролізує добре Гідролізує середньо Відновлює до аміаку Відновлює до аміаку Не утворює Не утворює Не руйнує Не руйнує Чутливий до ерітроміцину, Чутливий до ерітроміцину, неоміцину, неоміцину, гентаміцину, гентаміцину, канаміцину та ампіциліну; канаміцину та тетрацикліну. слабо чутливий до тетрацикліну. Не чутливий до ампіциліну. Як видно з таблиці, різниця між штамами полягає перш за все у їх відношенні до джерел вуглецю та антибіотиків. Крім того, штам 1136 втратив здатність до пептонізації молока і трохи послабив активність стосовно желатину та крохмалю. Умови отримання штаму 1130 Для досліду використовували спори 10добової культури Stm. avermitilis 288 накгА. З поверхні середовища їх змивали 20%-ним розчином гліцерину, струшували 30хв на Шютельапараті і фільтрували через ватно-марлевий фільтр. Титр спор становив 1,8 108 КУО (колонієутворювальні одиниці) в 1мл. Спори обробляли нітрозогуанідіном в концентрації 2мг/мл на протязі 90сек. Після обробки суспензію спор висівали на вівс яний агар з мікроелементами (ІSP-3) і вирощували на протязі 14 діб при 28°С. Штам Stm. avermitilis 1130 як продуцент авермектинів можна охарактеризувати слідуючими прикладами. Приклад 1 Здатність Stm. avermitilis 1130 синтезувати авермектини в умовах поверхневого вирощування 5 Для отримання посівного матеріалу штам вирощували протягом 14 діб при 28°С на середовищі ІSP-3 слідуючого складу (г/л): вівсяні пластівці 20,0; розчин мікроелементів (FeSО4(7Н2О 0,1; МnСl2(4Н2O 0,1; ZnSO4(7Н2О 0,1 в 100мл дистильованої води) 1 мл/л; агар-агар 15,0; рН7,2. Для визначення здатності штаму синтезувати авермектини його вирощували на протязі 10 діб у пробірках зкгА при 28°С (у трьох повторностях). Згодом до кожної пробірки з культурою вносили по 5мл етилового спирту і за допомогою бактеріального шпателя знімали ПМ. Отриману суспензію залишали на 30хв для екстрагування авермектинів, а потім фільтрували через фільтрувальний папір. СкладкгА (г/л): очищена картопля 200 (відвар); СаСО3 3,0; глюкоза 20,0; агар-агар 15,0; рН7,2. Якісний склад авермектинів визначали методом тонкошарової хроматографії (TIIIX). Екстракти авермектинів наносили по 10мкл на хроматографічні сілікогелеві пластинки Sorbfil (АО "Сорбполимер", Россия) і розгоняли в системі гексан:ацетон:етанол (56:24:4). Обробку хроматограм проводили 0,75%-вим розчином марганцевокислого калію. За контроль правив стандартний розчин авермектинів "Аверсектин С" для хроматографії (НПО "Фармбиомед", Россия). Кількісний вміст авермектинів визначали колориметричним методом з використанням орцину [6]. Рівень біосинтетичної активності оцінювали по сумарній кількості авермектинів в 1мл етанольного екстракту з міцелію. За даними ТШХ, Stm. avermitilis 1130 утворював усі чотири мажорних компоненти авермектинів: А1, А2, В1 та В2. Сумарна кількість авермектинів сягала 300мкг/мл. Приклад 2 Здатність Stm. avermitilis 1130 синтезувати авермектини в умовах глибинного культивування В дослідах використовували маточну культуру, яку вирощували протягом доби на рідкому, середовищі слідуючого складу (г/л): соєве борошно 15,0; дріжджі сухі 5,0; глюкоза 20,0; рН6,2. Ферментаційне середовище (г/л): соєве борошно 16,0; дріжджі сухі 4,0; крохмаль розчинний 23,0; СаСО3 4,0; К2НРО4 1,0; глюкоза 60,0; рН6,2. Штам вирощували на качалках при 240об/хв в колбах об'ємом 500мл у 50мл ферментаційного середовища з додаванням 2% маточної культури. Біосинтетичну здатність перевіряли у 7-добових культур. Після закінчення процесу ферментації з колб відбирали проби по 10мл. Міцелій в пробах осаджували шляхом центрифугування, при 3000 обертів/хв на протязі 10хв. Надосадову рідину зливали, міцелій заливали дистильованою водою, 69639 6 охолодженою до 7-10°С, після чого його знову осаджували центрифугуванням за тих же умов. До вологого осаду додавали 10мл етанолу, перемішували і проводили екстракцію протягом 20хв. Екстракти відокремлювали від міцелію центрифугуванням за тих же умов. Встановлення автентичності авермектинів та визначення компонентного складу авермектинового комплексу здійснювали за допомогою метода високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) на приборі Beckman System Gold. Захисна предколонка - Ultrasphere ODS довжиною 4,5СМ і діаметром 4,6мм; аналітична колонка - ODS довжиною 25СМ і діаметром 4,6мм; розмір зерен наповнювача 5 мікрон; система розгонки - етанол:ацетонітрил:вода (55:22,5:22,5). Швидкість потоку елюата 0,7мл/хв; об'єм проби 20мкл. Сумарний вміст авермектинів, визначений колориметричним методом, коливався від 900 до 2300мкг/мл. За даними ВЕРХ, вміст авермектинів групи В у авермектиновому комплексі складав 45%. Штам Streptomyces avermitilis 1130 зберігається в Українській колекції мікроорганізмів при Інституті мікробіології та вірусології ПАНУ під номером Ас 2179 та зареєстрований в Депозитарії ІMB НАНУ під номером Ас 5015. Література: 1. Дриняев В.А., Бережин Н.Е., Кругляк Е.Б. и др. Штамм актиномицета Streptomyces avermitilis ВПИИСХМ-54- продуцент авермектинов// Пат. 2054483 RU, Int. С1. С 12Р 1/06.-Опубл. 20.02.1996. 2. Даниленко В.Н., Миронов В.А., Сергеева А.В., Курмиева И.Б. Способ получения авермектинов, штамм Streptomyces avermitilis продуцент авермектина//Пат. 2098483 RU, Int. C1. 6 12Р 1/06.-Опубл. 10.12.97. 3. Burg R.W., Miller B.M., Baker E.E. et al. Avermectins, new family of potent anthelmintic agents: producing organism and fermentation // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 1979. -15, N 3. -P. 361-367. 4. Ісаєнко B.M., Іутинськиг.О., Чугуй В.О. та ін. Штам актиноміцета Streptomyces avermitilis ІMB Ac 2161, який продукує авермектини //Пат. 34390UA. Int. С1. С 12Р 9/00, 19/62. - Опубл. 15.02.2001. 5. Петрук Т.В., Козирицька B.C., Валагурова О.В. та ін. Спонтанна та індукована мінливість Streptomyces avermitilis - продуценту авермектинів // Наукові записки Тернопільського педуніверситету (в друці). 6. Мосин В.А., Дриняев В.А., Мирзаевм.Н. Авермектины: колориметрический метод определения в культуральной жидкости Streptomyces avermitilis и кристаллических препаратах // Биотехнология. - 1993..-№ 1.-С.9-12. 7 Комп’ютерна верстка О. Чепелев 69639 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601