Спосіб кріоконсервування культури клітин аденокарциноми ерліха

Реферат: Спосіб кріоконсервування культури клітин аденокарциноми Ерліха передбачає заморожування клітин в асцитичній рідині зі швидкістю 1 °С/хв до -80 °С, від -80 °С до -196 °С зі швидкістю 300400 °С/хв, і відігрівання на водяній бані при 40-41 °С. Після відігрівання проводять стабілізацію культури клітин шляхом трикратного культивування in vivo, кожне по 7 діб. UA 107907 U (12) UA 107907 U UA 107907 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі кріобіології і кріомедицини і може бути використана для дослідження ефективності протипухлинних препаратів. Дослідження ефективності протипухлинних препаратів традиційно проводять на експериментальних моделях з індукцією пухлинного процесу. Однією з таких є культура клітин аденокарциноми Ерліха (АКЕ), що перевивається. Для підтримки культури клітин АКЕ, як постійної лінії, зазвичай використовують періодичну їх перевивку. Однак у цьому випадку не виключене порушення генетичного профілю клітин, що перевиваються. Тому використання в експериментальній онкології постійних культур пухлинних клітин пов'язано з необхідністю їхнього зберігання в низькотемпературних банках. При цьому дуже важливо забезпечити збереження в АКЕ функціонального потенціалу стовбурових ракових клітин (СРК), які відповідають за ініціацію онкопроцесу, викликають рецидиви і мають множинну лікарську резистентність. Відомий спосіб кріоконсервування культури клітин АКЕ, який включає заморожування зі швидкістю 2 °C/хв до -180 °C у кріозахисному середовищі, що містить DMEM з 20 % фетальною сироваткою телят і 6 % гліцеролом, і відігрівання на водяній бані при температурі 37 °C [1]. Недоліком даного способу є низька схоронність клітин (54,1±1,5 %). Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб кріоконсервування культури клітин АКЕ, відповідно до якого клітини заморожують в асцитичній рідині зі швидкістю 1 °C/хв до 80 °C, від -80 °C до -196 °C зі швидкістю 300-400 °C/хв. Відігрівання проводять на водяній бані при 40-41 °C. Схоронність клітин після відігрівання становить 75,0±10 % [2]. Недоліком способу є зміна структурно-функціональних характеристик СРК в АКЕ після відігрівання, що не дає можливості одержання адекватних результатів при використанні їх у дослідницькій практиці. В основу корисної моделі поставлено задачу вдосконалити відомий спосіб кріоконсервування культури клітин АКЕ таким чином, щоб забезпечити збереження структурнофункціональних характеристик СРК в АКЕ на рівні нативу. Ця задача вирішується тим, що в способі кріоконсервування культури клітин АКЕ, який передбачає заморожування клітин в асцитичній рідині зі швидкістю 1 °C/хв. до -80 °C, від -80 °C до -196 °C зі швидкістю 300-400 °C/хв., і відігрівання на водяній бані при 40-41 °C, відповідно до корисної моделі, після відігрівання проводять стабілізацію культури клітин шляхом трикратного культивування in vivo, кожне по 7 діб. Стабілізація культури клітин АКЕ після відігрівання дозволяє наблизити структурнофункціональні характеристики СРК у культурі клітин АКЕ до рівня нативних. Приклад здійснення способу Нативні клітини АКЕ, отримані у мишей лінії Balb/c на 7 добу культивування in vivo, кріоконсервували в асцитичній рідині зі швидкістю 1 °C/хв до -80 °C, від -80 °C до -196 °C зі швидкістю 300-400 °C/хв. Відігрівали на водяній бані при 40-41 °C протягом 45-50 с, при постійному шутелюванні ампул, до зникнення твердої фази. Відігріті клітини АКЕ стабілізували шляхом трикратного культивування in vivo у перитоніальній порожнині (ПП) мишей, кожне протягом 7 діб, поки вони не здобували структурно-функціональні ознаки нативних клітин АКЕ. Перед кожним культивуванням in vivo проводили атестацію проліферативної активності СРК в АКЕ. Для вивчення структурно-функціональних характеристик СРК різного ступеня hi + диференціювання (CD44 та CD44 /CD24 ) після кріоконсервування оцінювали вміст цих клітин у культурі АКЕ, а також час подвоєння (Td) в процесі їхнього культивування in vivo. Вивчення вмісту СРК різного ступеня диференціювання у культурі клітин АКЕ проводили на проточному цитофлуориметрі FACS Calibur ("Becton Dickinson", США). Облік і аналіз результатів здійснювали за допомогою програми WinMDi 2.9. Час подвоєння кількості різного рівня диференціювання СРК визначали за формулою: Td=Т(logNf-log0)·3,3219, де Т - час культивування клітин (год.) 3,3219 - коефіцієнт перекладу log в ln; N0 -початкова кількість клітин; Nf - кінцева кількість клітин. Вміст клітин загальної популяції культури клітин АКЕ після кожного наступного культивування in vivo у ПП визначали методом світлової мікроскопії в камері Горяєва. Статистичну обробку експериментальних даних проводили по методу Стьюдента-Фішера за допомогою програми Statistica 7.0, (Stat Soft Іnс), адаптованої до поставлених завдань. Результати наведені в Таблиці. hi Як видно з Таблиці, вміст найбільш канцерогенної субпопуляції СРК (CD44 ) після кріоконсервування без стабілізації знижувався. Після другого циклу культивування тривалістю у hi 7 діб вміст клітин CD44 підвищувався, але усе ще залишався вірогідно нижче значень натива. 1 UA 107907 U hi 5 10 15 20 Тільки після третього циклу культивування АКЕ кількість CD44 клітин була такою ж, як і до кріоконсервування, тобто на рівні натива. + Після кріоконсервування без стабілізації спостерігалося збільшення вмісту CD44 /24 клітин у порівнянні з нативом. Протягом першого і другого циклів культивування in vivo кількість + CD44 /24 клітин мала тенденцію збільшуватися. Лише після третього циклу in vivo кількість + клітин CD44 /24 знижувалася до значень натива. Загальний вміст клітин у суспензії АКЕ після кріоконсервування без стабілізації був низьким. Після першого циклу культивування кріоконсервованих клітин in vivo загальний вміст клітин культури АКЕ в ПП був різко зниженим у порівнянні з нативом. Після закінчення 2-го циклу культивування кількість клітин у ПП досягала максимальних значень і стабілізувалася до рівня нативної культури лише після третього циклу культивування in vivo. Судячи з показника Td, кріоконсервування значно змінювало проліферативну активність СРК. Після першого циклу культивування культури клітин АКЕ показник Td був досить високим + hi відносно показників нативної культури як для CD44 /24 , так і для CD44 клітин. Після другого циклу 7-добового культивування показник Td для обох популяцій вірогідно зменшувався. Тільки після третього циклу культивування проліферативна активність СРК максимально наближалася до нативних значень. Таким чином, отримані дані свідчать про те, що після кріоконсервування без стабілізації (прототип) СРК у культурі клітин АКЕ за своїм структурно-функціональним характеристикам hi значно відрізняються від нативних клітин. Кількість клітин з маркерами, які властиві СРК (CD44 + і CD44 /24 ) не відрізняються від відповідних значень нативних АКЕ. Таблиця Структурно-функціональні характеристики культури клітин АКЕ після кріоконсервування (М±m, n=5) Показник Об'єм асцитичної рідини, мл Загальний вміст клітин в 8 ПП, n·10 Вміст + CD44 /24 клітин, % hi Вміст CD44 клітин, % Час подвоєння + CD44 /24 клітин, год. Час подвоєння hi CD44 , год. Без стабілізації (прототип) Строки стабілізації культури перші 7 діб другі 7 діб треті 7 діб Нативна культура (контроль) 1,5±0,11* 3,1±0,22 3,5±0,25 3,5±0,24 2,63±0,18* 1,2±0,08 7,65±0,05* 3,5±0,65 3,5±0,71 7,41±0,51* 5,02±0,35* 7,07±0,4* 4,10±0,33 4,80±0,33 0,11±0,007* 0,03±0,002* 0,07±0,005* 0,36±0,02 0,38±0,017 7,0±0,98* 3,9±0,27* 3,1±0,23 2,8±0,16 10,8±0,76* 6,1±0,43* 3,2±0,22 2,9±0,17 * результати мають достовірні відмінності з нативною культурою, р