Спосіб біоконверсії лігноцелюлозних відходів переробки олійних культур з використанням дереворуйнівного базидіоміцету laetiporus sulphureus (bull.) murrill

Реферат: Спосіб біоконверсії лігноцелюлозних відходів переробки олійних культур включає вирощування дереворуйнівного базидіоміцету Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill. Спосіб включає основні технологічні прийоми: вирощування посівного міцелію (інокулюму) чистої культури робочого штаму гриба; подрібнення, зволоження до 65-75 % і стерилізацію субстрату; інокуляцію і твердофазне культивування міцелію гриба на субстраті; грануляцію і сушіння готового продукту. UA 110849 U (54) СПОСІБ БІОКОНВЕРСІЇ ЛІГНОЦЕЛЮЛОЗНИХ ВІДХОДІВ ПЕРЕРОБКИ ОЛІЙНИХ КУЛЬТУР З ВИКОРИСТАННЯМ ДЕРЕВОРУЙНІВНОГО БАЗИДІОМІЦЕТУ LAETIPORUS SULPHUREUS (BULL.) MURRILL UA 110849 U UA 110849 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, мікології і екології та може бути використана в галузях сільського господарства і харчовій промисловості, зокрема при переробці різних видів рослинної сировини і її відходів у кормові добавки. На сьогодні лігноцелюлозні відходи не підлягають повторному використанню, спалюються або викидаються без переробки, що є екологічно небезпечним способом утилізації. Для дереворуйнівних базидіальних грибів (ксилотрофів) характерним субстратом є деревина та різноманітні рослинні залишки, які містять лігноцелюлозу [7]. Забезпечення тваринництва надійною кормовою базою є актуальним завданням його розвитку. Збільшити кількість кормів, покращити їх якість дозволяє біоконверсія рослинних відходів шляхом збагачення білком і іншими речовинами грибного походження за рахунок розвитку на них ксилотрофів [6]. Одним із шляхів біоконверсії таких відходів в збагачений грибними речовинами корм - мікорм (МК) є твердофазна ферментація (ТФФ) базидіоміцетів [2]. Суть твердофазної ферментації полягає у культивуванні соматичних структур міцеліальних дереворуйнівних грибів на подрібнених лігноцелюлозних субстратах. Проводяться дослідження, спрямовані на вивчення механізмів розщеплення лігноцелюлози дереворуйнівними грибами, оскільки передбачається, що пізнання цих механізмів може відкрити шляхи для розробки екологічно чистих енергозберігаючих біотехнологій переробки деревини і різних рослинних відходів [7]. Відомі способи утилізації рослинних відходів виробництва пальмової олії за допомогою їхньої переробки у лігноцелюлозне борошно з подальшим його використанням для одержання рідкого і твердого палива [8]. Способи розроблено для іншого виду сировини, не містять технології біоконверсії. Проведено огляд сучасних досягнень у галузі переробки вторинної лігноцелюлозної сировини, показано перспективи використання цієї сировини як добрива. Наведено результати досліджень з розробки методу компостування гідролізного лігніну і тирси, оцінки якості готового продукту [2]. В огляді не наводяться технології біоконверсії лігноцелюлозних відходів з використанням штамів базидіоміцетів. Найбільш близьким аналогом за технічною суттю і результату, що можна досягти, є спосіб вирощування гриба глива [5]. Спосіб включає приготування і термообробку лігноцелюлозних відходів сільського господарства і лісопереробки, засів міцелію в субстрат в перфоровані пакети з прорізами. Після засіву міцелію в субстрат на перфорований пакет надягають другий пакет з мікроперфорацією діаметром 0,1-0,3 см на відстані 10-15 см на час інкубаційного періоду і при появі перших зачатків плодових тіл знімають другий пакет. Спосіб розроблено для інших видів гриба і сировини. В основу корисної моделі поставлена задача, що полягає у розробці способу твердофазної ферментації ксилотрофів на лігноцелюлозних відходах переробки олійних культур (ЛВОК: лушпиння соняшника, ріпаку тощо) з метою отримання мікорму, який відрізняється від найближчого аналога видом гриба та субстратом. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб біоконверсії лігноцелюлозних відходів переробки олійних культур з використанням дереворуйнівного базидіоміцету Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill, згідно з корисною моделлю, включає основні технологічні прийоми: вирощування посівного міцелію (інокулюму) чистої культури робочого штаму гриба; подрібнення, зволоження до 65-75 % і стерилізацію субстрату; інокуляцію і твердофазне культивування міцелію гриба на субстраті; грануляцію і сушіння готового продукту. Вибір ТФФ пояснюється тим, що ферментація у ферментерах відрізняється більш високими енергетичними витратами на приготування живильного середовища, аерацію, перемішування культуральної рідини, відділення та зневоднення біомаси, що є визначальними факторами собівартості кінцевого продукту, які обмежують його виробництво. Ще один фактор, що обмежує виробництво - вартість сировини, також пояснює вибір лігноцелюлозних відходів переробки олійних культур [2]. Обґрунтовані перспективи біотехнологічного використання ксилотрофа Laetiporus sulphureus, який виявив високі біосинтетичні властивості: має вміст каротиноїдів в міцелії - до 5,13 мг/ г та у культуральному фільтраті - до 0,13 мг/ мл на 12-ту добу при культивуванні на глюкозо-пептонному середовищі [4]. Приклад конкретного виконання. Етап 1. Отримання суспензії посівного міцелію. Міцелій робочого штаму Ls-08 гриба Laetiporus sulphureus вирощують на сусло-агарі (СА, 4° за Баллінгом) та підтримують методом пересівів [3]. Для отримання інокулюму, 10-ти денні міцеліальні культури на СА в об'ємі 5×5 мм асептично переносять і культивують в колбах Ерленмейєра ємністю 250 мл протягом 12 діб на рідкому глюкозо-пептонному середовищі (ГПС) об'ємом 100 мл наступного складу (г/ л): глюкоза 1 UA 110849 U 5 10 15 20 25 30 35 40 - 10; пептон - 3; КH2РО4-0,6; К2НРО4-0,4; MgSO4 × 7Н2О - 0,5; СаСl2-0,05; ZnSO4 × 7Н2О - 0,001 і дистильована вода - до 1л. Початкова рН середовища після стерилізації 6,5±0,2. Термін культивування складає 12 діб при 27,5 °C і перемішуванні. Оптимальний режим культивування визначено експериментально. Етап 2. Подрібнення і зволоження лігноцелюлозних відходів. Лігноцелюлозні відходи переробки олійних культур механічно подрібнюють до оптимальних розмірів часток субстрату 4±2 мм. Отриманий субстрат зволожують водопровідною водою у співвідношенні 1:4 вагових частин відповідно до вологості 65-75 %. Така обробка забезпечує збільшення поверхні часток субстрату і кращий доступ зростаючого міцелію та екзоферментів до джерел живлення: інтенсивного руйнування, перетравлення і перетворення лігноцелюлозного субстрату у МК. Етап 3. Стерилізація субстрату. Лігноцелюлозний субстрат переносять у культиваційні ємності в кількості, відповідній до поставленої задачі культивування. Ємності або безпосередньо сировину поміщають в автоклав і стерилізують протягом 40-60 хв. (залежно від об'єму субстрату) при 121±2 °C. При великих об'ємах можливе застосування пастеризації вологої сировини паром при 100 °C протягом 1-2 год. Частки субстрату при цьому значно збільшуються за рахунок зміни внутрішньої структури. Етап 4. Інокуляція і вирощування міцелію гриба Laetiporus sulphureus на субстраті. Після стерилізації, субстрат поміщають в стерильний бокс, пасивно охолоджують і інокулюють у розрахунку 3:1 міцеліальної суспензії. Термін культивування (заростання субстрату) становить 7-10 діб при 27,5±2 °C. Зважають на те, що температура культивування впливає на собівартість продукту і підвищується на 1-2 °C усередині шару субстрату. За час ТФФ субстрат наскрізь пронизується пишним і повстьоподібним міцелієм без спороношення. Етап 5. Готовий продукт. Для подальшого зберігання та використання, отриманий продукт гранулюють і сушать у сухоповітряних шафах при температурі 70±5 °C. Аналіз даних хімічного складу лігноцелюлозних відходів переробки олійних культур і отриманого мікорму показує наступне. В МК у порівнянні з вихідним субстратом зріс вміст протеїну в 1,8-2,0 разу, в т. ч. вміст білка, що перетравлюється - в 2,2-2,9 разу. Скоротився в 1,5-1,9 разу вміст клітковини; кількість безазотистих екстрактивних речовин (БЕР) зросла в 1,21,5 разу. За рахунок наявності в ГПС збільшився вміст таких важливих мікроелементів харчування, як кальцію - в 1,4-1,6 разу і фосфору - в 1,1-1,3 разу. Суттєво зріс вміст каротиноїдів в МК - від слідів до 3,5-4,1 мг/ г. Разом з цим, значно зменшилася в 1,9-2,1 разу наявність рослинних олій у МК, що можна пояснити споживанням культурою гриба та значною леткістю при нагріванні субстрату. Для характеристики біологічної якості, застосована методика хімічного еквіваленту зіставлення складу незамінних амінокислот дослідного і ідеального протеїну. Використовували шкалу, яка рекомендована об'єднаним експертним комітетом ФАО/ВОЗ [6]. Амінокислота, що має мінімальний амінокислотний еквівалент, обмежує біологічну цінність протеїну. Кількісний вміст амінокислот і протеїну у субстраті та мікорму визначали за допомогою амінокислотного аналізатора, наприклад моделі LG-5001, гідроліз-кислотний. S – вимогливий рівень вмісту амінокислот ідеального протеїну, С - вміст амінокислоти в протеїні зразка. Таблиця Амінокислотний еквівалент протеїнів мікорму (МК) і лігноцелюлозних відходів переробки олійних культур (лвок) № з/п 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Амінокислота Ізолейцин Лейцин Лізин Метіонін+Цистеїн Фенілаланін+Тирозин Треонін Триптофан * Валін Всього: S, мг/ г 40 70 55 35 60 40 10 50 360 МК С1, мг/ г 38,56±1,55 38,98±1,19 41,97±2,13 76,33±2,18 96,84±1,36 33,98±0,89 33,57±1,49 360,23 С1/S х 100 % 96,37 55,70 76,30 218,0 161,35 84,97 67,16 C2, мг/ г 22,10±2,85 41,58±2,13 28,52±0,44 30,60±1,34 38,87±1,67 31,54±1,34 27,59±1,09 220,80 лвок C2/S х 100 % 55,25 59,41 51,80 87,42 64,76 78,85 55,16 Примітка: «*» амінокислота, вміст якої не визначали; «_» значення мінімального амінокислотного еквівалента, котрий обмежує біологічну цінність протеїну. 2 UA 110849 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Біологічна цінність протеїну досліджених зразків лігноцелюлозних відходів переробки олійних культур і мікорму суттєво різниться. Вміст таких незамінних амінокислот як метіонін, цистеїн, фенілаланін і тирозин значно перевищує вимогливий рівень вмісту амінокислоти в ідеальному білку, а вміст ізолейцину і треоніну впритул наближається до нього. Кількість цих амінокислот в ЛВОК тільки на 60-80 % відповідає вимогам стандарту ФАО/ ВОЗ. Загальна сума амінокислот мікорму в 1,6 разу більша ніж у лігноцелюлозних відходах. Цінність протеїну мікорму обмежується вмістом лейцину і дорівнює 55,7 %, чим незначно перевищує протеїн пшениці, цінність якого знаходиться в межах 53-55 %. Біологічна цінність протеїну ЛВОК обмежується вмістом лізину і знаходиться на рівні 51,8 %. Для цього протеїну характерна незбалансованість амінокислотного складу, що також знижує біологічну цінність. Таким чином, запропонований спосіб біоконверсії лігноцелюлозних відходів переробки олійних культур шляхом вирощування на них дереворуйнівного базидіоміцету Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill дозволяє переробити різні види рослинної сировини і її відходи у кормові добавки зі збільшеним вмістом цінних протеїнів і біологічно активних речовин грибного походження, що веде до спрощення, екологізації і здешевлення виробництва. Джерела інформації: 1. Бакай СМ. Биотехнология обогащения кормов мицелиальным белком. - К.: Урожай, 1987.168 с. 2. Беловежец Л.А. Перспективные способы переработки вторичного лигноцеллюлозного сырья / Л.А. Беловежец, И.В. Волчатова, С.А. Медведева. //Химия растительного сырья. -2010. № 2. -С. 5-16. 3. Бухало А.С. Культивирование съедобных и лекарственных грибов. Практические рекомендации / Под общ. ред. А.С. Бухало; Н.А. Бисько, Э.Ф. Соломко, В.Т. Билай, НЛО. Митропольская, Н.Л. Поединок, А.А. Гродзинская, О.Б. Михайлова. - К.: ІБ, 2004. - 120 с. 4. Велигодська А.К. Порівняльна характеристика загального вмісту каротиноїдів у деяких видів базидіальних грибів / А.К. Велигодська, О.В. Федотов // Мікробіологія і біотехнологія. Одеса: ОНУ ім. 1.1. Мечнікова, 2012. - №. 4(20). – С. 84-101. 5. Патент 2284099 России. Способ выращивания гриба вешенка. / A.M. Кудря A.M., В.В.Стрельников. Заявка 2005102954/12, от 07.02.2005, МПК А01G1/04 (2006.01), 27.09.2006. (прототип) 6. Справочник по качеству кормов / Под ред. А.А. Омельяненко. К.: Урожай, 1985.-С. 176178. 7. Eriksson K.-B., Blanchette R.A., Ander P. Microbial and enzymatic degradation of wood and wood components. Berlin, Heidelberg: Springier-Verlag, 1990. 8. Patent WO2012049530A1. Method for utilizing the waste from palm oil production by processing it into lignocellulose powder to be further used for liquid and solid fuel production. / O.V. Golyazimova (Bershak), K…G. Korolev, O.I. Lomovsky. Заявка PCT/IB2010/003403 от 12.10.2010, 19.04.2012. 9. Wasser S.P. Medicinal mushroom Science: History, Current Status, Future Trends, and Unsolved problems / S.P. Wasser //Jnt. J. Med. Mush. -2010.-12 (1).-P. 1-16. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 Спосіб біоконверсії лігноцелюлозних відходів переробки олійних культур, який включає вирощування дереворуйнівного базидіоміцету Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill, який відрізняється тим, що включає основні технологічні прийоми: вирощування посівного міцелію (інокулюму) чистої культури робочого штаму гриба; подрібнення, зволоження до 65-75 % і стерилізацію субстрату; інокуляцію і твердофазне культивування міцелію гриба на субстраті; грануляцію і сушіння готового продукту. 50 Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3