Штам соматичних структур дереворуйнівного базидіоміцету laetiporus sulphureus (bull.) murrill ls-08 – продуцент каротиноїдів

Реферат: Штам соматичних структур дереворуйнiвного базидіоміцету Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill Ls-08 - продуцент каротиноїдів. UA 83041 U (12) UA 83041 U UA 83041 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до мікробіологічної промисловості і стосується нового штаму базидіоміцетів, який може бути використаний для одержання каротиноїдів. Каротиноїди, натуральні пігменти, полієнові ізопреноїди терпенового ряду, які широко розповсюджені в живій природі. До їх біосинтезу здатні рослини, гриби і деякі тварини та мікроорганізми. Для каротиноїдів виявлено низку лікарських властивостей, зокрема антиоксидантну, радіопротекторну, антиканцерогенну, імуномодулюючу та інші. Зростаючий попит на ці пігменти обумовлює пошук потенційних джерел їх отримання з розширенням номенклатури біологічних агентів, в тому числі, за рахунок грибних організмів [2,11,12]. Актуальність пошуку продуцентів природних каротиноїдів пояснюється тим, що застосовувані синтетичні барвники та мінеральні пігменти, в більшості випадків, мають канцерогенну дію на організм людини та тварин [5]. Каротиноїди є природними органічними пігментами, що синтезуються організмами різних систематичних груп. Зокрема відомі види мікроорганізмів, які використовуються для промислового отримання каротиноїдів - Blakeslea trispora, Sporobolomyces pararoseus, Phaffia rhodozyma, Rhodotorula aurantiaca та Rh. glutinis [2, 3, 6, 11]. Недостатність та вибірковість даних щодо каротиногенезу базидіоміцетів, не дозволяють всебічно судити про можливість їх використання як продуцентів цих речовин. Відомий штам дріжджів Rhodosporidium diobovatum МКПМ Y-3158 - продуцент каротиноїдів. Культивують цей штам на живильному середовищі, що містить джерела вуглецю, азоту та мінеральні солі. Отримують біомасу, що містить каротиноїди в кількості 3000-4000 мкг/г сухої біомаси, в тому числі - каротину 2500-3500 мкг/г, тобто до 90 % [10]. Не надаються дані щодо вмісту каротиноїдів в культурах базидіоміцетів, культури дріжджів можуть викликати професійні захворювання обслуговуючого персоналу при їх використанні в якості продуцентів в мікробіологічній промисловості. Відомий штам дріжджів Rhodotorula glutinis МКПМ У-2210 продуцент каротиноїдів. Вміст каротиноїдів 3000-4000 мкг/г [8]. Не надаються дані щодо вмісту каротиноїдів в культурах базидіоміцетів, культури дріжджів можуть викликати професійні захворювання обслуговуючого персоналу при їх використанні як продуцентів в мікробіологічній промисловості. + Найбільш близьким аналогом є пара штамів гриба Blakeslea trispora КР 74 і КР 86" продуцентів бета-каротину. Вміст каротиноїдів 190 мг/100 мл середовища [9]. Не надаються дані щодо вмісту каротиноїдів в культурах базидіоміцетів, культури нижчих грибів можуть викликати професійні захворювання обслуговуючого персоналу при їх використанні як продуцентів в мікробіологічній промисловості. В основу корисної моделі поставлено задачу отримання нового штаму соматичних структур ксилотрофного базидіоміцету Laetiporus sulphureus (Bull.) Мurr., який відрізняється від найближчого аналога видовою приналежністю та високим вмістом каротиноїдів в міцелії - до 5,13 мг/г та у культуральному фільтраті - до 0,13 мг/мл на 12-ту добу культивування на глюкозопептонному середовищі. Поставлена задача вирішується тим, що інтродукований штам Laetiporus sulphureus Ls-08, згідно з корисною моделлю, має високий вміст каротиноїдів в міцелії та культуральному фільтраті при поверхневому культивуванні на глюкозо-пептонному середовищі при 27,5 °C протягом 12-ти діб. Інтродукований штам Ls-08 макроскопічного гриба Laetiporus sulphureus (Bull.) Murr має наступні характеристики. Систематичне положення об'єкта дослідження [13]. Царство: Fungi Відділ: Basidiomycota Підвідділ: Agaricomycotina Клас: Agaricomycetes Підклас: Agaricomycetidae Порядок: Polyporales Родина: Polyporaceae Рід: Laetiporus Вид: Laetiporus sulphureus Штам Ls-08 Laetiporus sulphureus отримано за загальноприйнятим методом виділення чистих культур базидіоміцетів з дикорослих плодових тіл [1], що були зібрані на деревині ушкодженого листяного дерева Salix alba - верба біла в Краснолиманському лісництві Донецької області у 2008 році. Плодові тіла знаходилися на деревині в черепичастими групами, у вигляді каплеподібних наростів, мали розмір 50-200 мм, напівкруглі, оранжеві або сірчано-жовті, з 1 UA 83041 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 рожевим відтінком, гіменофор трубчастий, сірчано-жовтий, пори дрібні. М'якуш м'який, м'ясистий, жовтуватий. Чисту міцеліальну культуру штаму Ls-08 підтримують на агаризованому незахміленому пивному суслі (4° за Баллінгом) шляхом пересівів кожні 5-6 місяців. Культурально-морфологічні ознаки. Для дослідження культурально-морфологічних ознак штам Ls-08 культивували на агаризованому незахміленому пивному суслі (СА) і картопляноглюкозному агарі (КГА) в чашках Петрі, та на рідкому глюкозо-пептонному живильному середовищі (ГПС) в поверхневій культурі. На агаризованому середовищі міцелій розповсюджується рівномірно, міцелій належить до порошковидного типу за класифікацією Дж. Сталперса [14]. Колонія гриба має круглу форму, більш щільна в центрі. Колір молодої колонії світлий, з віком, на 7-12 добу, починаючи з центра колонії, забарвлюється до світло-жовтого, жовтувато-охряного кольору, на 12-15 добу виділяючи жовтогарячий ексудат. На застосованих для культивування живильних середовищах, міцелій має специфічний грибний запах. На ГПС в поверхневій культурі через 5-8 діб утворюється міцеліальна плівка з грибним ароматом. Зміна забарвлення повітряного міцелію від білого до світло-жовтого відбувається протягом 3-5 діб, жовтогарячого - протягом 6-12 діб. Мікроскопічні дослідження свідчать, що гіфи гриба гілчасті, звивисті, з початку їх розгалуження дихотомічне, вони тісно сплітаються між собою. Добре спостерігаються стінки і численні перегородки гіф. Перегородки утворюються як в місцях появи пряжок, так і між клітинами без пряжок. Апекси характеризуються гомогенною структурою протоплазми. Ширина гіф становить 6-9 мкм, довжина клітин - від 20 до 80 мкм i більше. З часом, у віці 5 діб і більше, в клітинах міцелію з'являються вакуолі та жирові включення. Фізіолого-біохімічні ознаки. Аероб. Росте при температурі 22-3 0 °C. Оптимум рН живильного середовища 3-5 од. За інтенсивністю росту - накопичення абсолютно сухої біомаси (АСБ) та біосинтетичними показниками, найкращими джерелами вуглецевого живлення є глюкоза, рафіноза, фруктоза, сахароза, ксилоза, мальтоза, лактоза, крохмаль, целюлоза, лігнін. Відношення до джерел азоту: для росту використовує пептон, аспарагінову та глютамінову кислоти, сечовину. Приклад конкретного виконання 1. Порівняння каротиногенезу деяких штамів базидіоміцетів. Культивування штамів проводять в колбах Ерленмейєра поверхневим методом на ГПС. Готують ГПС наступного складу, г/л [1]: глюкоза 10,0 пептон 3,0 KН2РО4 0,6 K2НРО4 0,4 0,5 MgSO47H2O СаСl2 0,05 0,001 ZnSO47H2O дистильована вода до 1 літра. Характеристики ГПС наступні: співвідношення C:N дорівнює 13:1, а рН - 6,7 од. Підготовлене живильне середовище розливають по 50 мл в колби ємністю 250 мл та стерилізують в автоклаві при 126±2 °C протягом 45 хвилин. Кислотність середовища після стерилізації складає 6,5±0,2 од. Інокулюмом слугують 10-ти денні міцеліальні культури штамів на СА. Термін культивування складає 12 діб при оптимальній для росту обраних штамів базидіоміцетів температурі 27,5 °C. Оптимальний режим культивування визначено експериментально. Після закінчення терміну культивування, міцелій при 5±1 °C відділяють від культуральної рідини шляхом фільтрування, отримуючи культуральний фільтрат (КФ). Отриманий міцелій додатково підсушують на фільтрувальному папері і охолоджують до 1±0,5 °C. Підготовлений міцелій гомогенізують шляхом розтирання в охолодженій ступці, отримуючи гомогенат міцелію. Водневий показник КФ встановлюють потенціометричним методом, наприклад на рН-метрі "рН-150МИ". Накопичення АСБ міцелію визначають ваговим методом. Для цього міцелій висушують у відкаліброваних бюксах при 105 °C до постійної маси та зважують [4]. Визначення вмісту каротиноїдів проводять у ацетонових витяжках мікологічного матеріалу (міцелій і КФ) спектрофотометричним методом та розраховують за формулою Ветштейна [7]. Досліди проводять у трикратній повторності. Отримані експериментальні дані обробляють з використанням Microsoft Excel та пакету програм для проведення статистичної обробки результатів біологічних експериментів. 2 UA 83041 U Результати вивчення рівня каротиногенезу деяких штамів базидіоміцетів представлені в табл. 1. Таблиця 1 Динаміка накопичення каротиноїдів в міцелії та культуральному фільтраті деяких штамів базидіоміцетів порядку Polyporales Штам Fomes fomentarius Ff-09 Fames fomentarius Ff1201 Fomes fomentarius T-10 Laetiporus sulphureus Ls09 Laetiporus sulphureus Ls08 Trametes hirsuta Th-11 Trichaptum biforme Tb-11 5 10 15 20 25 30 35 40 Міцелій, мг/г КФ, мг/мл Термін культивування, доба 6 9 12 6 9 0,13±0,02 0,34±0,01 0,95±0,11 0,05±0,01 0,07±0,01 12 0,09±0,02 1,15±0,52 2,06±0,23 3,02±0,34 0,04±0,01 0,06±0,02 0,11±0,01 0,45±0,04 0,75±0,12 1,05±0,05 0,06±0,01 0,12±0,03 0,08±0,04 1,81±0,07 2,98±0,16 4,34±0,05 0,04±0,01 0,06±0,01 0,07±0,02 1,76±0,23 3,07±0,17 5,13±0,05 0,06±0,01 0,08±0,03 0,13±0,01 0,08±0,03 0,07±0,01 0,14±0,02 0,15±0,02 0,11±0,03 0,10±0,04 0 0 0 0 0 0 Для досліджених штамів порядку Polyporales характерне максимальне накопичення каротиноїдів в міцелії на 12 добу росту. Винятком тут є штами Т. hirsuta Th-11 і Т. biforme Tb-11, де такий максимум спостерігається на 9-ту добу росту. Максимальний вміст каротиноїдів в міцелії, серед поліпоральних грибів, зафіксовано для виду L. sulphureus з найбільшим значенням близько 5,13 мг/г у штаму Ls-08. Щодо вмісту каротиноїдів в КФ, то для більшості штамів максимальний вміст цих речовин зафіксовано на 12-ту, а штаму F. fomentarius Τ-10 - на 9-ту добу культивування. Найвищий рівень накопичення каротиноїдів у КФ спостерігався у штаму L. sulphureus Ls-08, який мав максимальний вміст каротиноїдів на 12-ту добу культивування 0,13 мг/ мл. Не зареєстровано вміст каротиноїдів в КФ штамів Т. hirsuta Th-11 та Т. biforme Tb-11. Таким чином, запропонований штам Ls-08 їстівного базидіального гриба Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill є активним продуцентом каротиноїдів та накопичує їх у міцелії і культуральний рідині та може бути використаний в промисловому грибівництві та одержання каротиноїдів в мікробіологічній промисловості. Штам Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill Ls-08 зберігається в колекції культур шапинкових грибів кафедри фізіології рослин Донецького національного університету та переданий для зберігання у Колекцію культур шапинкових грибів Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України (ІВК). Джерела інформації:, які використані при складанні заявки 1. Бисько Н.А. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре/ Η.Α. Бисько, А.С. Бухало, С.П. Вассер и др. - К.: Наук. думка, 1988.-144 с. 2. Буценко Л.М. Технології мікробного синтезу лікарських засобів/ Л.М. Буценко, Ю.М. Пенчук, Т.П. Пирог. -К.: НУХТ, 2010.-323 с. 3. Гесслер Н.Н. Участие β-каротина в антиоксидантной защите грибной клетки./ Н.Н.Гесслер, А.В. Соколов, Т.А. Белозерская// Прикладная биохим. и микробиол. 2003. - Τ 39. № 4, - С. 427-429. 4. Дудка И.А. Методы экспериментальной микологии. Справочник./ И.А. Дудка, С.П. Вассер, И.А. Элланская. - К.: Наук. думка, 1982.-550 с. 5. Зерщикова Т.А. Эколого-гигиеническая оценка синтетических и натуральных красителей в разнообразных напитках Текст.// Т.А. Зерщикова, Л.П. Флоринская// Успехи современного естествознания, 2010. - № 3 - С. 124-125. 6. Камінська Μ. Каротинсинтезуючі дріжджі Phaffia rhodozyma/ M. Камінська, Л. Сологуб// Вісник Львів. ун-ту. Сер. біол., 2004. - Вип. 37. - С. 3-12. 7. Мусиенко М.М. Спектрофотометрические методы в практике физиологии, биохимии и экологии растений/ М.М. Мусиенко, Т.В. Паршикова, П.С Славный. - К.: Фитосоциоцентр, 2001.200 с. 3 UA 83041 U 5 10 15 20 8. Патент 2103350 Российской Федерации Штамм дрожжей Rhodotorula glutinis - продуцент каротиноидов/ Авчиева П.Б., Буторова И.А., Вустин М.М., Синеокий С.П. Заявка 96112874/13, от 27.06.1996, МПК (2006.01), кл. C12N 1/16, С12Р 23/00 Бюл. № 3, від 27.01.1998. 9. Патент 2177505 Российской Федерации Пара штаммов гетероталличного гриба Blakeslea + trispora КР 74 і КР 86 продуцирующая бета-каротин/ Кунщикова И. С, Казарян Р.В., Кудинова С.П., Кунщикова Е.А. Заявка 2011119634/10, от 15.12.2000, МПК (2006.01), кл. С12Р 23/00, C12N 1/14, C12N 1/14, C12R 1/645 Бюл. № 12, від 27.12.2001. (прототип) 10. Патент 2399659 Российской Федерации Штамм дрожжей Rhodosporidium diobovatum продуцент каротиноидов/ Вустин М.М., Великая Μ.Α., Синеокий С.П. Заявка 2009126300/10, от 10.07.2009, МПК (2006.01), кл. C12N 1/16, С12Р 23/00 Бюл. № 3, від 27.01.2010. 11. Пирог Т.П. Загальна мікробіологія/ Т.П. Пирог. -К.: НУХТ, 2010.-623 с. 12. Феофилова Е.П. Каротиноиды грибов: биологические функции и практичесоке использование/ Е.П. Феофилова// Прикладная биохимия и микробиология, 1994. - Т. 30, № 2. С. 181-195. 13. Kirk P.M. Ainsworth & Bisby's Dictionary of the fungi. 9th ed./ P.M. Kirk, P.F. Cannon, J.C. David, J.A. Stalpers-Wallingford, CAB International, 2001.-655 p. 14. Stalpers J.A. Identification of wood-inhabiting Aphyllophorales in pure culture/ Baarn: Centraalbureau voor Schimmelcultures, 1978.-248 p. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Штам соматичних структур дереворуйнiвного базидіоміцету Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill Ls-08 - продуцент каротиноїдів. Комп’ютерна верстка С. Чулій Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4