Штам соматичних структур дереворуйнівного базидіоміцету laetiporus sulphureus (bull.) murrill ls-0912 – продуцент каротиноїдів

Реферат: Штам соматичних структур дереворуйнівного базидіоміцету Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill Ls-0912 - продуцент каротиноїдів. UA 83047 U (12) UA 83047 U UA 83047 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до мікробіологічної промисловості і стосується нового штаму базидіоміцетів, який може бути використаний для одержання каротиноїдів. Каротиноїди, як речовини антиокисної дії, знайшли широке застосування в різних галузях промисловості та сільського господарства, зокрема їх використовують як промислові харчові барвники, компоненти вітамінного корму тварин, в медичній практиці - для лікування уражених шкірних покривів тощо [2, 11]. Актуальність пошуку продуцентів природних каротиноїдів пояснюється тим, що застосовувані синтетичні барвники та мінеральні пігменти, в більшості випадків, мають канцерогенну дію на організм людини та тварин [5]. Каротиноїди є природними органічними пігментами, що синтезуються організмами різних систематичних груп. Зокрема, відомі види мікроорганізмів, які використовуються для промислового отримання каротиноїдів - Blakeslea trispora, Sporobolomyces pararoseus, Phaffia rhodozyma, Rhodotorula aurantiaca та Rh. glutinis [2, 3, 6, 11]. Недостатність та вибірковість даних щодо каротиногенезу базидіоміцетів, не дозволяють всебічно судити про можливість їх використання як продуцентів цих речовин. Відомий штам дріжджів Rhodosporidium diobovatum МКПМ Y-3158 - продуцент каротиноїдів. Культивують цей штам на живильному середовищі, що містить джерела вуглецю, азоту та мінеральні солі. Отримують біомасу, що містить каротиноїди в кількості 3000-4000 мкг / г сухої біомаси, в тому числі-каротину 2500-3500 мкг / г, тобто до 90 % [10]. Не надаються дані щодо вмісту каротиноїдів в культурах базидіоміцетів, культури дріжджів можуть викликати професійні захворювання обслуговуючого персоналу при їх використанні як продуцентів в мікробіологічній промисловості. Відомий штам дріжджів Rhodotorula glutinis МКПМ У-2210 продуцент каротиноїдів. Вміст каротиноїдів 3000-4000 мкг\г [8]. Не надаються дані щодо вмісту каротиноїдів в культурах базидіоміцетів, культури дріжджів можуть викликати професійні захворювання обслуговуючого персоналу при їх використанні як продуцентів в мікробіологічній промисловості. Найбільш близькиою за технічною суттю і досяжністю результату є пара штамів гриба + Blakeslea trispora КР 74 і КР 86" - продуцентів бета-каротину. Вміст каротиноїдів 190 мг\100 мл середовища [9]. Не надаються дані щодо вмісту каротиноїдів в культурах базидіоміцетів, культури нижчих грибів можуть викликати професійні захворювання обслуговуючого персоналу при їх використанні як продуцентів в мікробіологічній промисловості. В основу корисної моделі поставлена задача отримання нового штаму соматичних структур ксилотрофного базидіоміцету Laetiporus sulphureus (Bull.) Murr., який відрізняється від найближчого аналога видовою приналежністю та високим вмістом каротиноїдів в міцелії - до 3,56 мг/ г та у культуральному фільтраті - до 0,15 мг/ мл на 12-ту добу культивування на глюкозо-пептонному середовищі. Поставлена задача вирішується тим, що інтрадукований штам Laetiporus sulphureus Ls-0912, згідно з корисною моделлю, має високий вміст каротиноїдів в міцелії та культуральному фільтраті при поверхневому культивуванні на глюкозо-пептонному середовищі при 27,5 °C протягом 12 діб. Інтродукований штам Ls-0912 макроскопічного гриба Laetiporus sulphureus (Bull.) Murr має наступні характеристики. Систематичне положення об'єкта дослідження [12]. Царство: Fungi Відділ: Basidiomycota Підвідділ: Agaricomycotina Клас: Agaricomycetes Підклас: Agaricomycetidae Порядок: Polyporales Родина: Polyporaceae Рід: Laetiporus Вид: Laetiporus sulphureus Штам Ls-0912 Laetiporus sulphureus отримано за загальноприйнятим методом виділення чистих культур базидіоміцетів з дикорослих плодових тіл [1], що були зібрані на деревині ушкодженого листяного дерева Salix alba - верба біла в м. Донецьку у 2012 році. Плодові тіла знаходилися на деревині в черепичастими групами, у вигляді краплеподібних наростів, мали розмір 50-200 мм, напівкруглі, оранжеві або сірчано-жовті, з рожевим відтінком, гіменофор трубчастий, сірчано-жовтий, пори дрібні. М'якуш м'який, м'ясистий, жовтуватий. Чисту міцеліальну культуру штаму Ls-0912 підтримують на агаризованому незахміленому пивному суслі (4° по Баллінгу) шляхом пересівів кожні 5-6 місяців. 1 UA 83047 U 5 10 15 20 25 Культурально-морфологічні ознаки. Для дослідження культурально-морфологічних ознак штам Ls-0912 культивували на агаризованому незахміленому пивному суслі (СА) і картопляноглюкозному агарі (КГА) в чашках Петрі, та на рідкому глюкозо-пептонному живильному середовищі (ГПС) в поверхневій культурі. На агаризованому середовищі міцелійрозповсюджується рівномірно, міцелій належить до порошковидного типу за класифікацією Дж. Сталперса [13]. Колонія гриба має круглу форму, більш щільна в центрі. Колір молодої колонії світлий, з віком, на 7-12 добу, починаючи з центра колонії, забарвлюється до світло-жовтого, жовтувато-охряного кольору, на 12-15 добу виділяючи жовтогарячий ексудат. На застосованих для культивування живильних середовищах, міцелій має специфічний грибний запах. На ГПС в поверхневій культурі через 5-8 діб утворюється міцеліальна плівка з грибним ароматом. Зміна забарвлення повітряного міцелію від білого до світло-жовтого відбувається протягом 3-5 діб, жовтогарячого - протягом 6-12 діб. Мікроскопічні дослідження свідчать, що гіфи гриба гілчасті, звивисті, з початку їх розгалуження дихотомічне, вони тісно сплітаються між собою. Добре спостерігаються стінки і численні перегородки гіф. Перегородки утворюються як в місцях появи пряжок, так і між клітинами без пряжок. Апекси характеризуються гомогенною структурою протоплазми. Ширина гіф становить 6-9 мкм, довжина клітин - від 20 до 80 мкм і більше. З часом, у віці 5 діб і більше, в клітинах міцелію з'являються вакуолі та жирові включення. Фізіолого-біохімічні ознаки. Аероб. Росте при температурі 22-3 0 °C. Оптимум рН живильного середовища 3-5 од. За інтенсивністю росту - накопичення абсолютно сухої біомаси (АСБ) та біосинтетичними показниками, найкращими джерелами вуглецевого живлення є глюкоза, рафіноза, фруктоза, сахароза, ксилоза, мальтоза, лактоза, крохмаль, целюлоза, лігнін. Відношення до джерел азоту: для росту використовує пептон, аспарагінову та глютамінову кислоти, сечовину. Приклад конкретного виконання 1. Порівняння каротиногенезу деяких штамів базидіоміцетів. Культивування штамів проводять в колбах Ерленмейєра поверхневим методом на ГПС. Готують ГПС наступного складу, г/ л [1]: Глюкоза пептон KН2РО4 K2НРО4 MgSO4  7H2O СаCl2 ZnSO4  7H2O дистильована вода 10,0 3,0 0,6 0,4 0,5 0,05 0,001 до 1 літра. 30 35 40 45 50 Характеристики ГПС наступні: співвідношення C:N дорівнює 13:1, а рН -6,7 од. Підготовлене живильне середовище розливають по 50 мл в колби ємністю 250 мл та стерилізують в автоклаві при 126±2 °C протягом 45 хвилин. Кислотність середовища після стерилізації складає 6,5±0,2 од. Інокулюмом слугують 10-денні міцеліальні культури штамів на С А. Термін культивування складає 12 діб при оптимальній для росту обраних штамів базидіоміцетів температурі 27,5 °C. Оптимальний режим культивування визначено експериментально. Після закінчення терміну культивування, міцелій при 5±1 °C відділяють від культуральної рідини шляхом фільтрування, отримуючи культуральний фільтрат (КФ). Отриманий міцелій додатково підсушують на фільтрувальному папері і охолоджують до 1±0,5 °C. Підготовлений міцелій гомогенізують шляхом розтирання в охолодженій ступці, отримуючи гомогенат міцелію. Водневий показник КФ встановлюють потенціометричним методом, наприклад на рН-метрі "рН-150МИ". Накопичення АСБ міцелію визначають ваговим методом. Для цього міцелій висушують у відкаліброваних бюксах при 105 °C до постійної маси та зважують [4]. Визначення вмісту каротиноїдів проводять у ацетонових витяжках мікологічного матеріалу (міцелій і КФ) спектрофотометричним методом та розраховують за формулою Ветштейна [7]. Досліди проводять у трикратній повторності. Отримані експериментальні дані обробляють з використанням Microsoft Excel та пакету програм для проведення статистичної обробки результатів біологічних експериментів. Результати вивчення рівня каротиногенезу деяких штамів базидіоміцетів представлені в табл. 2. 2 UA 83047 U Таблиця 2 Динаміка накопичення каротиноїдів в міцелії та культуральному фільтраті деяких штамів базидіоміцетів порядку Polyporales Штам Міцелій, мг/г КФ, мг/ мл Термін культивування, доба 6 9 12 6 9 12 0,13±0,02 0,34±0,01 0,95±0,11 0,05±0,01 0,07±0,01 0,09±0,02 1,15±0,52 2,06±0,23 3,02±0,34 0,04±0,01 0,06±0,02 0,11±0,01 0,45±0,04 0,75±0,12 1,05±0,05 0,06±0,01 0,12±0,03 0,08±0,04 Fomes fomentarius Ff-09 Fomes fomentarius Ff-1201 Fomes fomentarius T-10 Laetiporus sulphureus Ls1,95±0,11 2,17±0,45 3,56±0,04 0912 Trametes hirsuta Th-11 0,08±0,03 0,14±0,02 0,11±0,03 Trichaptum biforme Tb-11 0,07±0,01 0,15±0,02 0,10±0,04 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0,12±0,03 0,15±0,04 0,14±0,02 0 0 0 0 0 0 Для досліджених штамів порядку Polyporales характерне максимальне накопичення каротиноїдів в міцелії на 12 добу росту. Винятком тут є штами Т. hirsuta Th-11 і Т. biforme Tb-11, де такий максимум спостерігається на 9 добу росту. Максимальний вміст каротиноїдів в міцелії, серед поліпоральних грибів, зафіксовано для виду L. sulphur eus з найбільшим значенням близько 3,56 мг/ г у штаму Ls-0912. Щодо вмісту каротиноїдів в КФ, то для більшості штамів максимальний вміст цих речовин зафіксовано на 12, а штаму F. fomentarius T-10 - на 9 добу культивування. Найвищий рівень накопичення каротиноїдів у КФ спостерігався у штаму L. sulphureus Ls-0912, який достовірно не залежав від терміну культивування і коливався в межах від 0,12-0,15 мг/ мл. Не зареєстровано вміст каротиноїдів в КФ штамів Т. hirsuta Th-11 та Т. biforme Tb-11. Таким чином, запропонований штам Ls-0912 їстівного базидіального гриба Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill є активним продуцентом каротиноїдів та накопичує їх у міцелії і культуральний рідині, та може бути використаний в промисловому грибівництві та одержання каротиноїдів в мікробіологічній промисловості. Штам Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill Ls-0912 зберігається в колекції культур шапинкових грибів кафедри фізіології рослин Донецького національного університету. Джерела інформації: 1. Бисько Н.А. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре / Н.А. Бисько, А.С. Бухало, СП. Вассер и др. - Киев: Наук, думка, 1988.-144 с. 2. Буценко Л.М. Технології мікробного синтезу лікарських засобів / Л.М. Буценко, Ю.М. Пенчук, Т.П. Пирог. - К.: НУХТ, 2010.-323 с. 3. Гесслер Н.Н. Участие Б-каротина в антиоксидантной защите грибной клетки. / Н.Н.Гесслер, А.В. Соколов, Т.А. Белозерская //Прикладная биохим. и микробиол. 2003. - Т 39. № 4, - с.427-429. 4. Дудка И.А. Методы экспериментальной микологии. Справочник. / И.А. Дудка, СП. Вассер, И.А. Элланская. - К.: Наук, думка, 1982.-550 с. 5. Зерщикова Т.А. Эколого-гигиеническая оценка синтетических и натуральных красителей в разнообразных напитках Текст. // Т.А. Зерщикова, Л.П. Флоринская // Успехи современного естествознания, -2010.-№3.-С. 124-125. 6. Камтсъка М. Каротинсинтезуючі дріжджі Phaffia rhodozyma IM. Камінська, Л. Сологуб // Вісник Львів, ун-ту. Сер. біол., 2004. - Вип. 37. - С.3-12. 7. Мусиенко М.М. Спектрофотометрические методы в практике физиологии, биохимии и экологии растений / М.М. Мусиенко, Т.В. Паршикова, П.С Славный. - К.: Фитосоциоцентр, 2001.200 с. 8. Патент 2103350 Российской Федерации Штамм дрожжей Rhodotorula glutinis - продуцент каротиноидов / Авчиева П.Б., Буторова И.А., Вустин М.М., Синеокий СП. Заявка 96112874/13, от 27.06.1996, МПК (2006.01), кл. C12N1/16, С12Р23/00 Бюл. № 3, від 27.01.1998. 9. Патент 2177505 Российской Федерации Пара штаммов гетероталличного гриба Blakeslea + trispora КР 74 і КР 86" продуцирующая бета-каротин/ Кунщикова И. С, Казарян Р.В., Кудинова СП., Кунщикова Е. А. Заявка 2011119634/10, от 15.12.2000, МПК (2006.01), кл. С12Р23/00, C12N1/14 C12N1/14, C12R1:645 Бюл. № 12, від 27.12.2001. (найближчий аналог) 10. Патент 2399659 Российской Федерации Штамм дрожжей Rhodosporidium diobovatum продуцент каротиноидов/ Вустин М. М, Великая М. А., Синеокий СП. Заявка 2009126300/10, от 10.07.2009, МПК (2006.01), кл. C12N1/16, С12Р23/00 Бюл. № 3, від 27.01.2010. 3 UA 83047 U 5 11. Пирог Т.П. Загальна мікробіологія / Т.П. Пирог. - К.: НУХТ, 2010.-623 с. 12. KirkP.M. Ainsworth & Bisby's Dictionary of the fungi. 9th ed. / P.M. Kirk, P.F. Cannon, J.C. David, J.A. Stalpers-Wallingford, CAB International, 2001.-655 p. 13. Stalpers J.A. Identification of wood-inhabiting Aphyllophorales in pure culture / Baarn: Centraalbureau voor Schimmelcultures, 1978.-248 p. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 Штам соматичних структур дереворуйнівного базидіоміцету Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill Ls-0912 - продуцент каротиноїдів. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4