Живильне середовище для культивування штаму ls-0912 laetiporus sulphureus (bull.) murrill – продуценту каротиноїдів

Реферат: Живильне середовище для культивування штаму Ls-0912 Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill продуценту каротиноїдів містить вуглецевмісний компонент, пептон, калій фосфорнокислий однозаміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, кальцій хлористий, цинк сірчанокислий і воду. Як вуглецевмісний компонент використовують фруктозу. UA 91401 U (54) ЖИВИЛЬНЕ СЕРЕДОВИЩЕ ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ ШТАМУ LS-0912 LAETIPORUS SULPHUREUS (BULL.) MURRILL - ПРОДУЦЕНТУ КАРОТИНОЇДІВ UA 91401 U UA 91401 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до біотехнології і може бути використана у науково-дослідних і промислових мікологічних лабораторіях для одержання каротиноїдів на основі культивування штамів-продуцентів. В останні роки спостерігається зростаючий інтерес до пізнання різних аспектів біології та біосинтетичної активності вищих грибів відділу Basidiomycota. Це обумовлено, в першу чергу, розширенням сфери їх практичного використання [1, 2]. Ксилотроф, збудник бурої гнилі, Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill, визнаний продуцент каротиноїдів в плодових тілах, є цікавим у цьому відношенні, особливо в плані мікробіологічного використання [10]. Каротиноїди є одними з затребуваних біологічних речовин у різних галузях промисловості та медицині. Це натуральні пігменти, полієнові ізопреноїди терпенового ряду, які широко розповсюджені в живій природі. До їх біосинтезу здатні рослини, гриби і деякі мікроорганізми. Для каротиноїдів виявлено низку лікарських властивостей, зокрема антиоксидантну, радіопротекторну, антиканцерогенну, імуномодулюючу та інші [3, 9]. Отже, пошук нових продуцентів цих речовин та оптимізація умов їх культивування є одним з важливих напрямків розвитку сучасних мікології і біотехнології [1, 2]. Відомий спосіб індукції перекисного окиснення ліпідів штаму 167 Agrocybe aegerita (Brig.) Fayod., що включає культивування при 27,5 °C на глюкозо-пептонному середовищі та визначення рівня перекисного окиснення ліпідів в міцелії та культуральному фільтраті, штам 167 культивують на модифікованому глюкозо-пептонному середовищі з сахарозою, яке містить компоненти у наступних концентраціях, г/л: сахароза - 8; пептон - 5; KН2РО4-0,8; K2НРО4-0,6; MgSO4×7Н2О - 0,5; СаСl2-0,05; ZnSO4×7Н2О - 0,001; дистильована вода - до 1 літра [6]. Спосіб розроблено для іншого виду базидіоміцетів та в ньому не розглядається біосинтез каротиноїдів. Відомий спосіб отримання збагаченої селеном біомаси міцелію штаму Laetiporus sulphureus BKM-F-4276D, який передбачає культивування штаму на капустяному середовищі, що містить глюкозу в кількості 2 %, молочну сироватку в кількості 1 %, з додаванням селеніту натрію в концентрації 15-25 мг/л [5]. Не надаються дані про можливості використання цього живильного середовища для індукції продукування каротиноїдів міцелієм Laetiporus sulphureus. Найбільш близьким за технічною суттю і досяжності результату є живильне середовище для культивування штаму 167 Agrocybe aegerita (Brig.) Fayod - продуцента пероксидази, яке включає сахарозу, пептон, калій фосфорнокислий однозаміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, кальцій хлористий, воду і цинк сірчанокислий, натрій хлористий при наступному співвідношенні компонентів г/ л: сахароза - 12; пептон - 5; KН2РО40,4; K2НРО4-0,2; MgSO4×7Н2О - 0,5; СаСl2-0,05; ZnSO4×7Н2О - 0,001; дистильована вода - до 1 літра [7]. Не надаються данні про можливості використання цього живильного середовища для культивування штамів базидіоміцетів - продуцентів каротиноїдів. В основу корисної моделі поставлена задача модифікації глюкозо-пептонного середовища для вирощування штаму Ls-0912 Laetiporus sulphureus - продуценту каротиноїдів, в якому шляхом оптимізації концентрацій компонентів досягають значного підвищення вмісту каротиноїдів, які можуть бути використані в біотехнології, медицині, фармацевтичній, хімічній, харчовій та інших галузях промисловості. Поставлена задача вирішується тим, що живильне середовище для вирощування штаму Ls0912 Laetiporus sulphureus - продуценту каротиноїдів, яке включає вуглецевмісні речовини, пептон, калій фосфорнокислий однозаміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, кальцій хлористий, цинк сірчанокислий і воду, згідно корисної моделі, в якості вуглецевмісної речовини використовують фруктозу при наступних співвідношеннях, тіл: фруктоза - 12; пептон - 5; KН2РО4-0,6; K2НРО4-0,4; MgSO4×7Н2О - 0,5; СаСl2-0,05; ZnSO4×7Н2О 0,001; дистильована вода - до 1 літра. Запропоноване живильне середовище є новим тому, що воно не відоме з рівня складу живильного середовища та об'єкту дослідження. Приклад конкретного виконання 1. Для дослідження динаміки росту та каротиногенезу штаму Ls-0912 Laetiporus sulphureus готують вихідне глюкозо-пептонному середовищі (ГПС) наступного складу, г/л: глюкоза 10 пептон 3 KН2РО4 0,6 K2НРО4 0,4 MgSO4×7H2O 0,5 СаСl2 0,05 ZnSO4×7H2O 0,001 дистильована вода до 1 літра [1]. 1 UA 91401 U 5 10 15 Живильне середовище розливають по 50 мл в конічні колби Ерленмейєра на 250 мл, стерилізують в автоклаві при 121±2 °C протягом 40 хвилин. Кислотність середовища після стерилізації становить 6,3±0,3 рН. Середовище, після охолодження, інокулюють шматочком міцелію розміром 5×5 мм. Інокулюмом є чиста культура штаму Ls-0912, яка росла 7-10 діб на 4° за Баллінгом агаризованому суслі (СА) або на картопляно-глюкозному агарі (КГА) [1]. Штам Ls-0912 культивують протягом 12 днів при температурі 27,5±0,1 °C. Вміст каротиноїдів у міцелії і культуральному фільтраті (КФ) та ростові показники накопичення біомаси і рН КФ фіксують на 6, 9 і 12-ту добу культивування штаму Ls-0912. Вміст каротиноїдів визначають за стандартною методикою Ветштейна [4], яка базується на вимірі екстинкції за допомогою фотоелектроколориметра, наприклад КФК-2, при довжині хвилі 440 нм в кюветі на 10 мм. Статистичну обробку експериментальних даних проводять за методом дисперсійного аналізу, порівняння середніх арифметичних - за методом Дункана [8]. Дані динаміки росту та вмісту каротиноїдів в міцелії та культуральному фільтраті штаму Ls0912 наведені в табл. 1. Таблиця 1 Динаміка росту та вмісту каротиноїдів в міцелії та культуральному фільтраті штаму Ls-0912 Laetiporus sulphureus Термін культивування, доба 6 9 12 20 25 30 35 Біомаса, г/л рН КФ 0,56±0,04 1,13±0,06 1,98±0,07 6,12 6,02 5,76 Вміст каротиноїдів, мг/г (мл) Міцелій КФ 1,95±0,11 0,12±0,03 2,17±0,45 0,15±0,04 3,56±0,04 0,14±0,02 Дані досліду (табл. 1) свідчать про наступне. Досліджуваний штам Ls-0912 накопичує біомасу протягом усього терміну ферментації з максимумом у 1,98 г/ л на 12-ту добу росту. Цей показник у 1,75 рази вище за такий на 9-ту добу росту і в 3,5 рази - на 6-ту. Таким чином, спостерігається уповільнення накопичення біомаси в кінці терміну ферментації цього штаму. рН КФ змінюється в процесі росту штаму Ls-0912 у бік підкислення до 5,76 од. на 12-ту добу. Визначення рівня накопичення каротиноїдів в міцелії і КФ дозволяє говорити про наступне. Максимум цього показника у міцелії спостерігається на 12-ту добу і досягає 3,56 мг/г. Накопичення каротиноїдів у КФ зафіксовано на рівні 0,12-0,15 мг/мл і достовірно не залежало від терміну культивування. Приклад конкретного виконання 2. Дослідження впливу джерел вуглецевого живлення на каротиногенез штаму Ls-0912 Laetiporus sulphureus. Для вивчення впливу джерел вуглецевого живлення на каротиногенез штаму Ls-0912 Laetiporus sulphureus беруть 10 вуглецевмісних сполук, таких як: моносахариди - ксилоза, глюкоза, фруктоза, дисахариди - сахароза, лактоза; полісахариди - крохмаль; насичені дикарбонові кислоти - бурштинова кислота; гідроксикарбонові кислоти - яблучна кислота; одноатомні спирти - маніт, дульцит в еквіваленті за вмістом вуглецю в перерахунку на його вміст в глюкозі. Вміст каротиноїдів в міцелії та КФ визначають на 12 добу культивування за прикладом конкретного виконання 1. Результати дослідження наведені в табл. 2. 2 UA 91401 U Таблиця 2 Вплив джерел вуглецевого живлення на каротиногенез штаму Ls-0912 Laetiporus sulphureus № з/п 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 5 10 15 20 Хімічна сполука рН КФ 1,52±0,05 1,98±0,07 2,28±0,03 2,02±0,04 1,24±0,02 1,16±0,03 1,55±0,01 1,42±0,09 0,39±0,01 0,25±0,01 Ксилоза Глюкоза Фруктоза Сахароза Лактоза Крохмаль Маніт Дульцит Бурштинова к-та Яблучна к-та Біомаса, г/л 5,73 5,76 5,35 5,60 5,91 6,05 6,12 6,32 4,99 5,18 Вміст каротиноїдів, мг/ г (мл) Міцелій КФ 2,33±0,11 0,10±0,01 3,56±0,04 0,14±0,02 4,38±0,12 0,21±0,04 3,67±0,13 0,15±0,01 2,55±0,08 0,09±0,01 3,05±0,03 0,08±0,02 1,04±0,04 0,06±0,01 0,96±0,02 0,07±0,01 0,38±0,04 0 0,40±0,01 0 Дані табл. 2. показують, що джерела вуглецевого живлення вірогідно впливають синтез каротиноїдів штаму Ls-0912 Laetiporus sulphureus. Максимальне значення цього показнику в міцелії та КФ на 12-у добу культивування зафіксували в культурах, що росли на живильному середовищі з фруктозою на рівні 4,38 мг/г та 0,21 мг/мл відповідно. Дещо нижчий вміст каротиноїдів зафіксована в КФ та міцелії культури, що росла на живильному середовищі із сахарозою. Зафіксовані максимуми збігаються з максимальним накопиченням біомаси, що становить 2,28 г/л, на середовищі з фруктозою та дещо нижче - з сахарозою. Приклад конкретного виконання 3. Оптимізація складу живильного середовища для росту та синтезу каротиноїдів штаму Ls-0912 Laetiporus sulphureus. З метою підвищення каротиногенезу штаму Ls-0912, згідно поставленої задачі, модифікації 4 вихідного ГПС проводять за методом повного факторного експерименту (ПФЕ-2 ) [5]. Варіювання (λ) вмісту у живильних середовищах фруктози і пептону - факторів x1, х2 складає 2 г/л, a KH2PO4 i K2НРО4 - факторів х3 і х4-0,2 г/ л, інші компоненти мають постійну концентрацію (табл. 3). Фруктоза, як вуглецевмісний компонент ГПС була обрана внаслідок найвищого вмісту каротиноїдів в міцелії та КФ при культивуванні штаму Ls-0912 (приклад конкретного виконання 2). Всі операції з приготування живильних середовищ; культивуванню штаму Ls-0912 та визначенню рівня накопичення біомаси та каротиноїдів проводять за прикладом конкретного виконання 1. Штам Ls-0912 культивують упродовж 12 діб при температурі 27,5 °C. Таблиця 3 Склад модифікацій ГПС № середовища x1 (фруктоза) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 8 12 8 12 8 12 8 12 8 12 Фактори х2 x3 х4 (пептон) (KH2PQ) (К2НРО4) Вміст у живильному середовищі, г/ л 1 0,4 0,2 1 0,4 0,2 5 0,4 0,2 5 0,4 0,2 1 0,8 0,2 1 0,8 0,2 5 0,8 0,2 5 0,8 0,2 1 0,4 0,6 1 0,4 0,6 25 3 Взаємодія факторів 1 x1 х2 x1x2 x3 x1x3 х2x3 x1x2x3 х4 x1x4 UA 91401 U Продовження таблиці 3 Склад модифікацій ГПС № середовища x1 (фруктоза) 11 12 13 14 15 16 17 (контроль) 8 12 8 12 8 12 10 Фактори х2 x3 х4 (пептон) (KH2PQ) (К2НРО4) Вміст у живильному середовищі, г/ л 5 0,4 0,6 5 0,4 0,6 1 0,8 0,6 1 0,8 0,6 5 0,8 0,6 5 0,8 0,6 3 0,6 0,4 Взаємодія факторів х2x4 x1x2x4 x3x4 x1x3x4 x2x3x4 x1x2x3x4 0 Показники росту та каротиногенезу штаму Ls-0912 Laetiporus sulphureus на модифікованих ГПС представлено в табл. 4. 5 Таблиця 4 Накопичення біомаси та каротиногенез штаму Ls-0912 Laetiporus sulphureus на модифікованих ГПС № середовища 15 Біомаса, г/л 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 (контроль) 10 pH КФ 6,69 5,44 5,56 5,30 6,47 5,52 5,60 5,41 6,06 5,51 5,66 5,24 6,05 5,52 5,47 5,12 5,35 1,40±0,14 2,27±0,02 2,06±0,16 2,34±0,04 1,52±0,15 1,76±0,03 1,88±0,04 2,31±0,01 1,94±0,09 2,01±0,12 2,13±0,10 2,44±0,13 1,65±0,02 2,08±0,04 2,03±0,02 2,87±0,05 2,28±0,03 Вміст каротиноїдів, мг/ г (мл) Міцелій КФ 1,99±0,11 0,11±0,03 3,95±0,12 0,19±0,01 3,75±0,03 0,21±0,01 4,56±0,06 0,25±0,02 2,60±0,02 0,10±0,02 3,59±0,09 0,17±0,03 3,95±0,05 0,17±0,01 4,48±0,08 0,24±0,02 2,92±0,07 0,09±0,01 4,07±0,11 0,15±0,02 4,30±0,07 0,19±0,03 4,78±0,23 0,22±0,01 2,81±0,15 0,12±0,01 3,35±0,03 0,17±0,02 3,42±0,05 0,16±0,01 5,25±0,14 0,28±0,03 4,38±0,12 0,21±0,04 Дані досліду (табл. 4.) свідчать про наступне. Найбільше накопичення біомаси на 12-ту добу культивування штаму Ls-0912 спостерігалося на живильних середовищах № 16, 12, 4 та 8 в порядку убування. Ці чотири середовища мали максимальний вміст фруктози та пептону, середовище № 16 також мало максимальний вміст КН2РО4 та К2НРО4. Мінімальне накопичення біомаси зафіксовано при рості на середовищі № 1, де був найменший вміст факторів х 2, х3 і х4, а вміст фруктози був на стандартному рівні. Максимальний рівень накопичення каротиноїдів як у міцелії, так і в культуральному фільтраті, відмічено у культурах, що росли на середовищах № 16, 12, 4 і 8, що відповідає пікам найвищого накопичення біомаси. Також всі ці середовища були близькими за складом, та характеризувалися високим вмістом фруктози та пептону, вміст калію фосфорнокислого одно- і двозаміщеного варіює. рН культурального фільтрату з рН0=6,57 змінюється в межах від 6,69 (середовище № 1) до 5,12 (середовище № 16). 4 UA 91401 U 5 10 15 20 25 30 35 Отже, живильне середовище № 12 є найбільш придатним для росту - накопичення біомаси та синтезу каротиноїдів і перевищує контрольні показники у 1,26 та у 1,20 (міцелій) і 1,33 (КФ) рази відповідно. Модифіковане глюкозо-пептонне середовище, що містить, тіл: фруктозу - 12; пептон - 5; КН2РО4-0,8; К2НРО4-0,6; MgSO4×7Н2О - 0,5; СаСl2-0,05; ZnSO4×7Н2О - 0,001 та дистильовану воду - до 1 літра дозволяє вести культивування штаму Ls-0912 Laetiporus sulphureus, направлене на отримання міцеліальної біомаси і каротиноїдів, що спрощує і здешевлює їх виробництво. Джерела інформації: 1. Бухало А.С. Культивирование съедобных и лекарственных грибов. Практические рекомендации / Под общ. ред. А.С. Бухало; Н.А. Бисько, Э.Ф. Соломко, В.Т. Билай, Н.Ю. Митропольская, Н.Л. Поединок, А.А. Гродзинская, О.Б. Михайлова. - К.: ІБ, 2004. - 120 с. 2. Буценко Л.М. Технології мікробного синтезу лікарських засобів / Л.М. Буценко, Ю.М. Пенчук, Т.П. Пирог. - К.: НУХТ, 2010. - 323 с. 3. Гесслер Н.Н. Участие β-каротина в антиоксидантной защите грибной клетки. / Н.Н. Гесслер, А.В. Соколов, Т.А. Белозерская // Прикладная биохим. и микробиол. 2003. Т 39. № 4. с. 427-429. 4. Мусиенко М.М. Спектрофотометрические методы в практике физиологии, биохимии и экологии растений / М.М. Мусиенко, Т.В. Паршикова, П.С. Славный. - К.: Фитосоциоцентр, 2001. - 200 с. 5. Патент 241628 России. Способ ферментативного получения каротиноидов / Хирасава Казуаки, Цукобура Акира, Сатоу Хироси, Ята Тецухиса. Заявка 2011119634/10 от 16.10.2009, МПК С12Р23/00, (2006.01), Бюл. № 5 от 17.05.2011. 6. Патент 66659 України. Спосіб індукції перекисного окиснення ліпідів штаму 167 Agrocybe aegerita (Brig.) Fayod / Федотов О.В. Чайка О.В., Фоменок Д.В., Гербутова А.В. Заявка № u201108067, від 29.06.2011, МПК (2011.01), кл. A01G7/00, А01Н15/00 Бюл. № 1, від 10.01.2012. 7. Патент 67443 України. Живильне середовище для культивування штаму 167 Agrocybe aegerita (Brig.) Fayod - продуцента пероксидази / Федотов О.В., Волошко Т.Є. Заявка № u201107921, від 23.06.2011, МПК (2006.01), кл. С 12N9/54,A23C 19/032 Бюл. № 4, від 27.02.2012 (прототип). 8. Приседський Ю.Г. Статистична обробка результатів біологічних експериментів / Ю.Г. Приседський. - Донецьк: Кассиопея, 1999. - 210 с. 9. Сааков B.C. Альтернативные пути биосинтеза каротиноидов у Procaryota и Eucaryota // Докл. АН России. - 2003. - Т. 392. - № 6. - С. 825-831. 10. Ribeiro В. Do Bioactive Carotenoids Contribute to the Color of Edible Mushrooms? / B. Ribeiro P. Guedes de Pinho, P. B. Andrade, C. Oliveira, A. César, S. Ferreira, P. Baptista, P. Valentão // The Open Chemical and Biomedical Methods Journal. - 2011. - № 4 - P. 14-18. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 45 Живильне середовище для культивування штаму Ls-0912 Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill продуценту каротиноїдів, яке містить вуглецевмісний компонент, пептон, калій фосфорнокислий однозаміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, кальцій хлористий, цинк сірчанокислий і воду, яке відрізняється тим, що як вуглецевмісний компонент використовують фруктозу при наступному співвідношенні компонентів, г/л: фруктоза 12 пептон 5 KН2РО4 0,6 K2НРО4 0,4 MgSO4×7H2O 0,5 СаСl2 0,05 ZnSO4×7H2O 0,001 дистильована вода до 1 літра. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5